Đột biến gen P53 và biểu hiện protein P53, MDM2, KI67, MMP9 trong ung thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam

24

Đồng biểu hiện quá mức các protein trên liên quan với tiên
lượng xấu gồm: liên quan giữa p53/Ki67, p53/MMP9,
Ki67/MMP9 với độ mô học; giữa p53/MMP9 với di căn hạch,
với tình trạng tái phát; giữa p53/MMP9, Ki67/MMP9,
MDM2/MMP9 với tình trạng không đáp ứng xạ trò và với thời
gian sống còn ngắn.

Như vậy, đột biến gen p53 và biểu hiện quá mức protein
p53, MDM2, Ki67, MMP9 thường hiện diện trong trong ung
thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam. Biểu hiện quá mức
protein p53, Ki67, MMP9 và đồng biểu hiện quá mức những
protein này thường liên quan với các yếu tố tiên lượng xấu.

Kiến nghò:

Dựa vào các kết quả của nghiên cứu này, chúng tôi xin có
một số kiến nghò sau:

- Khảo sát hóa mô miễn dòch để cung cấp những thông tin
đònh hướng điều trò. Ví dụ, các thông tin về biểu hiện của
protein p53, Ki67, MMP9 giúp các nhà lâm sàng trong việc
cân nhắc chỉ đònh xạ trò, phối hợp các mô thức điều trò và
tiên lượng bệnh.

- Tiếp tục nghiên cứu về sinh học ung thư để có cơ sở thiết
lập các phác đồ điều trò (theo các biểu hiện hóa mô miễn
dòch, sinh học phân tử, v.v…) mang lại hiệu quả điều trò cao
cho mỗi người bệnh ung thư.

1
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Đặt vấn đề

Ung thư niêm mạc miệng (UTNMM) là một trong mười loại ung
thư thường gặp nhất ở người. Việc chọn lựa điều trò chủ yếu dựa
vào xếp hạng lâm sàng TNM. Tuy nhiên, đây chưa phải là yếu tố
tiên lượng thỏa đáng. Dưới 50% bệnh nhân sống không quá 5 năm.
Gần đây, những tiến bộ rất nhanh trong lónh vực sinh học phân tử đã
giúp phát hiện ra nhiều gen liên quan ung thư, ứng dụng để tìm ra
những yếu tố dự đoán diễn tiến ung thư và điều trò.

Đột biến gen p53 thường xảy ra trong UTNMM và dẫn đến biểu
hiện quá mức protein p53. Tuy nhiên, ở một số nước có thói quen
nhai trầu phổ biến, biểu hiện quá mức protein p53 thường gặp
nhưng chủ yếu do biểu hiện quá mức protein MDM2.

UTNMM có đặc điểm sinh sản tế bào quá mức, xâm lấn mạnh
và thường di căn hạch. Hiện nay, Ki67 được xem là chất đánh dấu
sinh học về sự sinh sản của tế bào, Matrix Metalloproteinase
(MMP) được xem là chất đánh dấu sinh học về sự xâm lấn và di
căn của ung thư.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về sinh học phân tử trong ung thư
chỉ mới bắt đầu. Chưa có nghiên cứu về đột biến gen p53, về biểu
hiện của protein MDM2, Ki67, MMP9. Thực hiện nghiên cứu này
chúng tôi mong muốn đạt các mục tiêu sau:

1. Xác đònh tỉ lệ đột biến gen p53 trong UTNMM.

2. Xác đònh tỉ lệ biểu hiện quá mức của protein p53, MDM2,
Ki67, MMP9 trong UTNMM.

3. Phân tích sự liên quan giữa biểu hiện của protein p53,
MDM2, Ki67, MMP9 với độ mô học, di căn hạch, đáp ứng xạ
trò, tái phát và tiên lượng sống còn toàn bộ trong UTNMM.

2
2. Tính cấp thiết của đề tài

UTNMM có xuất độ và tử suất vẫn còn cao. Việc phát hiện
các yếu tố sinh học phân tử trong ung thư đã và đang góp phần cải
thiện chẩn đoán, điều trò và tiên lượng. Vì vậy, việc nghiên cứu về
những đặc điểm sinh học phân tử của UTNMM ở người Việt Nam
là cần thiết, đúng hướng và có tính khoa học, để làm sáng tỏ
nguyên nhân, diễn tiến sinh học của ung thư và mở ra hướng ứng
dụng điều trò thích hợp nhất cho mỗi người bệnh ung thư.

3. Những đóng góp mới của luận án

1. Áp dụng PCR-SSCP, giải trình tự chuỗi DNA để chẩn đoán
đột biến gen p53; áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dòch để chẩn đoán
sự bất thường của protein p53, MDM2, Ki67, MMP9.

2. Đây là công trình đầu tiên trong nước phát hiện một số biến
đổi sinh học phân tử về đột biến gen p53, biểu hiện quá mức protein
MDM2, Ki67, MMP9 trong UTNMM ở người Việt Nam.

3. Chứng tỏ một số đặc điểm phân tử có liên quan với sự tiến
triển của UTNMM ở người Việt Nam. Khảo sát hóa mô miễn dòch
của protein p53, Ki67, MMP9 có thể cung cấp thêm một số thông
tin về đặc điểm sinh học của bướu, giúp các bác só lâm sàng có
thêm cơ sở đánh giá tiên lượng và chọn lựa điều trò thích hợp.

4. Bố cục của luận án

Luận án gồm 130 trang. Ngoài phần mở đầu và kết luận còn có
bốn chương, bao gồm: tổng quan 28 trang, đối tượng và phương
pháp nghiên cứu 14 trang, kết quả 42 trang, bàn luận 41 trang. Có
35 bảng, 6 biểu đồ, 34 hình, 156 tài liệu tham khảo (21 tài liệu tiếng
Việt, 1 tài liệu tiếng pháp, 134 tài liệu tiếng Anh).

23



Qua khảo sát 110 trường hợp ung thư niêm mạc miệng, có
thể đưa ra những kết luận sau:

1. Đột biến gen p53 trong UTNMM: Đột biến gen p53 chiếm
44,4% trong 18 trường hợp UTNMM, thường xảy ra nhất tại
exon 8 và đa số là đột biến sai nghóa.

2. Biểu hiện của protein p53, MDM2, Ki67, MMP9 trong
UTNMM: Biểu hiện quá mức của protein p53 chiếm 75,5%,
của protein Ki67 là 67,3%, của protein MMP9 là 56,4% và
của protein MDM2 là 36,4% trong đó có 26,4% đồng biểu
hiện quá mức với protein p53.

3. Sự liên quan giữa biểu hiện của protein p53, MDM2,
Ki67, MMP9 và các đồng biểu hiện với diễn tiến của
UTNMM:

Biểu hiện protein p53 dương tính thường gặp ở những
bệnh nhân trên 60 tuổi, ở những bướu có độ mô học cao,
bướu có di căn hạch, bướu có tăng biểu hiện Ki67, nhưng
không liên quan với các yếu tố lâm sàng khác. Biểu hiện
protein MDM2 dương tính thường gặp ở những bướu có độ
mô học thấp, biểu hiện protein Ki67 dương tính tăng ở những
bướu có độ mô học cao và không liên quan với các yếu tố
lâm sàng. Biểu hiện protein MMP9 dương tính liên quan với
các yếu tố tiên lượng xấu theo thứ tự: bướu không đáp ứng xạ
trò, thời gian sống còn ngắn, bướu tái phát, bướu có độ mô
học cao, bướu có di căn hạch.
KẾT LUẬN

22

* p53, MDM2, Ki67: Bất kể mô thức điều trò, nhiều nghiên cứu
(Stoll 2000, Huang 2001) và nghiên cứu này không thấy sự liên
quan giữa tiên lượng với biểu hiện p53, MDM2, Ki67. Ngược lại,
một số nghiên cứu cho rằng tiên lượng xấu liên quan với biểu hiện
quá mức p53, không biểu hiện MDM2, tăng biểu hiện Ki67.

* MMP9: Trong bốn yếu tố phân tử khảo sát, kết quả cho thấy biểu
hiện MMP9 có nhiều hứa hẹn là yếu tố dự đoán tiên lượng. Sự liên
quan này cóù thể do sự ảnh hưởng rõ của MMP9 đối với di căn hạch
– một trong những yếu tố quan trọng nhất cho tiên lượng xấu trong

UTNMM. Theo y văn, biểu hiện quá mức MMP9 trong ung thư đầu
cổ là một yếu tố dự đoán tiên lượng bất lợi, thường đồng nghóa với
tỉ lệ sống còn thấp, thời gian sống còn ngắn (Yorioka 2002, Impola
2004, Ruokolainen 2004, Katayama 2004).

Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng cho đến nay vẫn chưa có sự
nhất quán giữa các nghiên cứu về giá trò dự đoán diễn tiến
UTNMM của p53, MDM2, Ki67, MMP9. Một trong những lý do
chính là hóa mô miễn dòch không phải là xét nghiệm khảo sát chức
năng. Nghiên cứu này phát hiện một trường hợp đột biến tại vò trí
ghép nối giữa exon và intron, dẫn tới dừng phiên mã và dòch mã tại
vò trí này. Protein p53 sản xuất ra ngắn hơn và bò mất chức năng,
nhưng vì không bền vững nên không thể phát hiện được qua hóa
mô miễn dòch.

Do vậy, cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa về sinh học phân tử
ung thư để nhanh chóng ứng dụng trong dự đoán diễn tiến ung thư
giúp chọn lựa điều trò chính xác nhất, cũng như ứng dụng điều trò
bằng những liệu pháp sinh học đặc hiệu như liệu pháp nhắm trúng
đích (phân tử), liệu pháp gen.


3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh học của ung thư niêm mạc miệng

Tần suất UTNMM thay đổi tùy theo mỗi quốc gia, từ 2%
đến 45%. Xuất độ chuẩn theo tuổi của UTNMM tại Hà Nội năm
1998 ở nam giới là 0,8/100.000 và ở nữ giới là 0,3/100.000, cùng

đứng hàng thứ mười. Tại TPHCM, xuất độ này ở nam giới là
3,1/100.000 đứng hàng thứ sáu và ở nữ giới là 2,7/100.000.

Hơn 95% bệnh nhân trên 40 tuổi. Tỉ lệ nam/nữ là 1,05/1
(Bệnh viện Ung bướu TPHCM, 1993-1996). Vò trí thường gặp nhất
là lưỡi (2/3 trước).

UTNMM liên quan đến một số yếu tố sau: thói quen hút
thuốc lá, uống rượu, nhai trầu, nhiễm HPV, nhiễm Candida, bức xạ
mặt trời, chấn thương do răng hay hàm giả, các tổn thương tiền ung
thư gồm hồng sản, bạch sản, xơ hóa dưới niêm mạc, liken phẳng.

Về bệnh học, gồm carcinôm tế bào gai (90-95%), carcinôm
tuyến nước bọt phụ, tuyến nhầy (5-6%), mêlanôm ác (1%), sarcôm.
Độ mô học tăng dần từ trước ra sau. Carcinôm tế bào gai diễn tiến
chủ yêáu là xâm lấn tại chỗ và di căn hạch. Các dạng lâm sàng
thường gặp là dạng chồi sùi, dạng loét và dạng ăn cứng.

Chẩn đoán qua khám lâm sàng, sinh thiết, các kỹ thuật tế
bào học, các phương tiện chẩn đoán hình ảnh y khoa, v.v… Chẩn
đoán xác đònh dựa trên kết quả giải phẫu bệnh.

Về điều trò, các mô thức tiêu chuẩn hiện nay có khả năng
điều trò khỏi là phẫu thuật (cắt rộng bướu, nạo hạch cổ) và xạ trò,
đơn thuần hay kết hợp. Vai trò của hóa trò còn hạn chế.

Tiên lượng sống còn 5 năm thấp (dưới 50%), nguyên nhân
chính là do phát hiện bệnh trễ.

4

21
không phụ thuộc vào protein p53, Ki67, MDM2, tương tự kết quả
của một số nghiên cứu (Valente 1994, Dijkema 2000).
1.2. Đặc điểm sinh học phân tử của ung thư niêm mạc miệng

Quá trình sinh ung thư ở niêm mạc miệng là một quá trình
nhiều bước, với sự tham gia của nhiều gen.

* MMP9: UTNMM biểu hiện quá mức MMP9 thường ít đáp ứng
với xạ trò. Kết quả nhất quán với kết quả sự liên quan giữa biểu
hiện quá mức MMP9 với tiên lượng xấu trong nghiên cứu này.

1.2.1. p53
Đột biến gen đè nén bướu p53 thường gặp nhất trong ung thư ở
người. Trong UTNMM, tỉ lệ đột biến gen p53 phát hiện qua PCR-
SCCP là 5,4–67%, tỉ lệ biểu hiện quá mức protein p53 phát hiện
qua nhuộm hóa mô miễn dòch là 11–100%. Biểu hiện quá mức
protein p53 có thể liên quan với tiên lượng xấu.

4.2.4. Về dự đoán tái phát

* p53, MDM2, Ki67: Tái phát không liên quan với biểu hiện p53,
MDM2, Ki67. Điều này phù hợp nhận đònh của nhiều nghiên cứu.


* MMP9: Nghiên cứu của Ruokolainen (2004) và nghiên cứu này
cho thấy bướu biểu hiện MMP9 dương tính dễ bò tái phát hơn bướu
biểu hiện MMP9 âm tính. Có thể chính sự tăng hoạt động của
MMP9 đã giúp các tế bào bướu lan tràn nên việc điều trò khó khăn

và khả năng tái phát cao.
1.2.2. MDM2
Protein p53 và protein MDM2 trong tế bào liên quan với nhau
theo vòng phản hồi tự điều hòa p53-MDM2. Tỉ lệ biểu hiện quá
mức MDM2 trong UTNMM là 20–95,6%, thường cao ở một số nước
phổ biến thói quen nhai trầu như Myanmar (72,5%), Đài Loan
(69,3%). Kết quả của các nghiên cứu về sự liên quan giữa biểu
hiện MDM2 với tiên lượng ung thư thì mâu thuẫn nhau.

4.2.5. Về dự đoán tiên lượng sống còn


Kết quả khẳng đònh TNM, độ mô học vẫn cần thiết và có giá trò
tiên lượng để chọn lựa điều trò. Tuy nhiên, thiết nghó mặc dù di căn
hạch liên quan rõ với tiên lượng, nhưng khi đã thấy di căn hạch
trên lâm sàng thì việc điều trò dù tích cực cũng đã trễ để cứu sống
bệnh nhân. Chính vì vậy, chúng tôi đồng ý với quan niệm của
nhiều tác giả hiện nay cho rằng cần phải khảo sát những yếu tố
tiên lượng mới, đặc biệt là những yếu tố phân tử, để dự đoán diễn
tiến của ung thư sớm hơn, chính xác hơn.
1.2.3. Ki67
Protein Ki67 chỉ hiện diện trong các giai đoạn hoạt động của
chu trình tế bào. Các nghiên cứu đều ghi nhận có sự tăng biểu hiện
Ki67 trong ung thư. Bướu có tỉ lệ Ki67 cao ít thuận lợi về tiên lượng.
Tuy nhiên, giá trò tiên lượng của Ki67 hiện vẫn còn đang bàn cãi.

1.2.4. Các matrix metalloproteinase (MMP)

Trong hơn 23 loại MMP đã biết, MMP9 (collagenase nhóm IV
92 kDa/gelatinase B) phá hủy chủ yếu collagen nhóm IV của màng

đáy, và nhiều loại chất nền khác như collagen nhóm I, II và elastin.
Biểu hiện quá mức MMP9 thường gặp trong 50-60% các trường hợp
UTNMM, liên quan với di căn hạch và với tiên lượng xấu.
* Đột biến gen p53: Theo Mineta (1998), đột biến gen p53 trong
ung thư đầu cổ liên quan với sự thất bại xạ trò, với tiên lượng xấu.
Trong nghiên cứu này, đột biến gen p53 không liên quan với tiên
lượng, tương tự kết quả của Ahomadegbe (1995).


20
và di căn. Có thể vì vậy, ung thư biểu hiện quá mức MMP9 thường
có độ ác tính cao. Sự liên quan này đã được tìm thấy bởi nhiều tác
giả (de Vicente 2005) và trong nghiên cứu này.

4.2.2. Về dự đoán di căn hạch

* p53: Ung thư di căn hạch thường biểu hiện quá mức p53 với mức
độ biểu hiện thường cao. Nhận đònh này đã được ghi nhận trong
một số nghiên cứu (Tatemoto 1998, Yao 1999, Pande 2002) và
trong nghiên cứu này.

* MDM2, Ki67: Như nhiều nghiên cứu trước đây, chúng tôi không
thấy sự khác biệt về tình trạng di căn hạch theo biểu hiện MDM2,
Ki67. Ngược lại, một số nghiên cứu cho rằng di căn hạch thường
gặp ở những bướu đồng biểu hiện p53/MDM2, tăng biểu hiện Ki67.

* MMP9: Nhìn chung, hầu hết các nghiên cứu (Kurahara 1999,
Hong 2000, Katayama 2004) đều cho rằng có sự liên quan giữa biểu
hiện MMP9 với di căn hạch. Nghiên cứu này cũng cho kết quả
tương tự. Điều này có thể do MMP9 phá hủy chủ yếu collagen

nhóm IV – thành phần chính của màng đáy. MMP9 tăng giúp các tế
bào ung thư dễ xuyên qua thành mạch và cho di căn. Một lý do
khác nữa là MMP9 còn có thể thúc đẩy sự sinh mạch thông qua
việc giải phóng yếu tố tăng trưởng nội mô mạch (VEGF). MMP9 có
thể có vai trò quan trọng trong sự di căn hạch của UTNMM.

4.2.3. Về dự đoán sự đáp ứng với xạ trò

* p53, MDM2, Ki67: Một số nghiên cứu (Couture 2002) nhận thấy
bướu có biểu hiện p53 dương tính, biểu hiện Ki67 thấp thì ít đáp
ứng với xạ trò. Tuy nhiên, trong ung thư đầu cổ, giá trò dự đoán sự
không đáp ứng xạ trò của p53 dương tính hay tỉ lệ Ki67 thấp vẫn
còn đang bàn cãi. Nghiên cứu này cho thấy hiệu quả của xạ trò

5
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu dọc.

2.2. Cỡ mẫu
Theo y văn và để đề tài khả thi, cỡ mẫu phù hợp để khảo sát
hóa mô miễn dòch là 110 trường hợp.

Trong y văn, một số nghiên cứu đột biến gen p53 có cỡ mẫu
nhỏ như nghiên cứu của Gopalakrishnan (1997) báo cáo 4 trường
hợp đột biến gen p53 trong số 10 trường hợp UTNMM, Ibrahim và
c.s. (1999) tìm thấy 8 trong số 13 trường hợp UTNMM. Do là nghiên
cứu đầu tiên khảo sát đột biến gen p53 ở người Việt Nam và để đề
tài khả thi (xét nghiệm rất tốn kém và phải làm ở Nhật Bản) nên cỡ
mẫu phát hiện đột biến gen p53 là 18 trường hợp.

2.3. Mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu về lâm sàng, giải phẫu bệnh, hóa mô miễn dòch
được tiến hành trên 110 bệnh nhân UTNMM điều trò tại Bệnh viện
Ung Bướu TPHCM từ 15/7/2000 đến 15/7/2002. Trong số này, có 18
bệnh nhân từ 15/7/2000 đến 15/8/2000 được khảo sát sinh học phân
tử về đột biến gen p53.

Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân:
- Có tổn thương ung thư nguyên phát ở hốc miệng.
- Có chẩn đoán giải phẫu bệnh là carcinôm tế bào gai.
- Phỏng vấn trực tiếp thói quen nhai trầu, hút thuốc, uống rượu.
- Chưa được điều trò ung thư đặc hiệu.
- Mẩu mô ung thư có đủ thành phần biểu mô và mô liên kết
thuận lợi khảo sát hóa mô miễn dòch và sinh học phân tử.
- Theo dõi được tình trạng sống còn sau điều trò cho đến ngày kết
thúc ghi nhận (15/10/2004).

6
Đặc điểm mẫu nghiên cứu:
- Gồm 56 nam và 54 nữ. Trong số này, 35 nữ có thói quen nhai
trầu và 49 nam có thói quen hút thuốc.
- Thường gặp nhất ở lưỡi (2/3 trước) (47,3%), độ mô học 1 (50%),
giai đoạn trễ (65,5%). Tỉ lệ di căn hạch cổ là 50%.
- 99 bệnh nhân (90%) được điều trò bằng xạ trò trong (cắm kim
radium) và/hoặc xạ trò ngoài (máy cobalt-60).

Ngoài ra, để có cơ sở nhận biết sự khác biệt về biểu hiện hóa
mô miễn dòch trong UTNMM so với trong niêm mạc miệng bình

thường, chúng tôi nhuộm hóa mô miễn dòch 26 mẩu mô niêm mạc
miệng bình thường, được sinh thiết từ nướu răng hàm dưới tại Đại
học Y Dược TPHCM trong tháng 3 và 4 năm 2002.

2.4. Qui trình thực hiện


¾ Sử dụng mẫu phiếu ghi nhận thống nhất các dữ liệu gồm:
- Thói quen nhai trầu, hút thuốc, uống rượu: qua phỏng vấn.
- Khám và đánh giá lâm sàng, cận lâm sàng, chẩn đoán và điều
trò ung thư (ghi lại theo hồ sơ bệnh án).

¾ Khảo sát giải phẫu bệnh
- Mẩu mô lấy từ bệnh phẩm sinh thiết hay phẫu thuật bướu, được
cố đònh, vùi nến, cắt lát mỏng và nhuộm Hematoxylin-Eosin
thường quy tại Bệnh viện Ung Bướu TPHCM.
- Chẩn đoán độ mô học theo cách đánh giá độ mô học của
Jakobsson cải biên theo Anneroth (1987).

¾ Khảo sát sinh học phân tử chẩn đoán đột biến gen p53
- Ly trích DNA: từ mẩu mô sinh thiết ở bướu nguyên phát, bằng
bộ ly trích QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), tại phòng thí
nghiệm sinh học phân tử Đại học Y Dược TPHCM.

19
p53 dương tính. Điều này có thể do protein p53 biến đổi tuy bền
vững nhưng bò mất chức năng ngừng chu trình tế bào. Nhờ vậy, các
tế bào bướu không còn bò p53 kiểm soát nữa nên sinh sản liên tục,
thể hiện qua sự tăng biểu hiện Ki67.

4.2. Về dự đoán diễn tiến UTNMM của p53, MDM2, Ki67, MMP9

4.2.1. Về độ (ác tính) mô học của UTNMM

* p53: Một số nghiên cứu (De Aráujo 1997, Thongsukai 2001) nêu
lêân khi bướu biểu hiện p53 dương tính càng tăng thì độ mô học
càng cao. Trong nghiên cứu này, biểu hiện p53 dương tính mạnh
thường gặp ở những bướu có độ mô học 2 hay độ 3. Huỳnh Anh Lan
(1996) tìm thấy p53 biểu hiện dương tính mạnh trong những bướu
biệt hóa kém (55,6%) hơn trong những bướu biệt hóa cao (34,8%).

* MDM2: Theo Ralhan (2000), Shwe (2001), những bướu biệt hóa
kém thường biểu hiện quá mức MDM2 hay p53/MDM2. Tuy nhiên,
đồng quan điểm với Schoelch (1999), với Millon (2001), chúng tôi
nhận thấy bướu có độ biệt hóa kém hay độ mô học cao – một trong
những yếu tố tiên lượng xấu – thường không biểu hiện MDM2.

* Ki67: Theo de Vicente (2002), biểu hiện Ki67 cao thường gặp ở
những bướu có độ biệt hóa kém hay vừa. Kết quả nghiên cứu này
cho thấy biểu hiện Ki67 có sự tương quan thuận với độ mô học.

Protein p53, MDM2, Ki67 ảnh hưởng chu trình tế bào. Có thể
chính sự bất thường của những protein này đã giúp tế bào ung thư
liên tục bước vào chu trình tế bào, thể hiện chỉ số phân bào cao và
độ mô học cao.

* MMP9: Biểu hiện MMP9 dương tính phản ánh sự tăng hoạt động
phá hủy chất nền ngoại bào, giúp các tế bào ung thư xâm lấn sâu

18

khác bò biến đổi trong tế bào (như protein MDM2). Nghiên cứu này
phát hiện biểu hiện quá mức MDM2 trong 62,5% các trường hợp
biểu hiện quá mức p53 nhưng không có đột biến gen p53.

So sánh tình hình p53, MDM2 trong UTNMM ở một số nước châu
Á cho thấy tỉ lệ biểu hiện quá mức p53 cao. Tuy nhiên, ở Ấn Độ,
Đài Loan, Myanmar, thường do tỉ lệ biểu hiện quá mức MDM2 cao;
trong khi ở Nhật Bản và nước ta, biểu hiện quá mức p53 thường liên
quan với đột biến gen p53 hơn là với biểu hiện quá mức MDM2.

Bảng 4.9: Đột biến gen p53, biểu hiện p53 và MDM2 trong UTNMM


Biểu hiện
p53(+)
Biểu hiện
MDM2(+)
Đột biến
gen p53(+)
Ấn Độ 66–75% 69–78% 17–21%
Đài Loan 61% 69% 5,4%
Myanmar 75% 72,5% 17,5%
Nhật Bản 60–63,8% 36,2% 63%
Nghiên cứu này 75,5% 36,4% 44,4%

Thói quen nhai trầu ở Việt Nam hiện nay đã giảm rất nhiều và
không còn phổ biến như ở Ấn Độ, Đài Loan; nhưng vẫn còn một số
người nhai trầu (chiếm 4,17% dân số nữ miền nam Việt Nam) tạo
nên sự khác biệt so với Nhật Bản và các nước phương Tây. Phải
chăng vì vậy mà tỉ lệ đột biến gen p53 và tỉ lệ biểu hiện quá mức

MDM2 trong UTNMM ở nước ta nằm trong khoảng trung gian giữa
hai cực tỉ lệ cao và thấp của một bên là Nhật Bản, phương Tây, và
một bên là một số nước châu Á có thói quen nhai trầu phổ biến.

4.1.7. Liên quan giữa biểu hiện p53 với biểu hiện Ki67

Tương tự kết quả của Iamaroon (2004), nghiên cứu này cho thấy
biểu hiện Ki67 dương tính thường gặp trong những bướu biểu hiện

7
- Các thí nghiệm tiếp theo được tiến hành tại Bộ môn Ung thư
tế bào và phân tử của Đại học Y Nha Tokyo, Nhật Bản.
- Phản ứng chuỗi polymerase (PCR): Nghiên cứu này chỉ khảo
sát đột biến ở các exon 5, 6, 7 và 8 của gen p53 do đa số
(87%) đột biến xảy ra tại các exon này. Các exon 5-8 của
gen p53 được khuếch đại qua PCR đánh dấu bằng [α
32
P]-
dCTP (3000 Ci/mmol) (ICN Biomedicals Inc., CA, Mỹ), thực
hiện trong máy luân nhiệt qua 35 chu kỳ nhiệt gồm 94
o
C (1
phút), 60
o
C (30 giây), 72
o
C (30 giây).
- Đa hình chuỗi đơn DNA (SSCP): Biến tính DNA ở 80
o
C trong

5 phút. Điện di trên gel polyacrylamide 6% ở điện thế 40 W,
25
o
C trong 4 giờ. Chụp bản ghi hình và phân tích hình ảnh
qua máy BAS 2000 (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Nhật Bản).
- Giải trình tự chuỗi DNA: Chỉ những mẫu DNA đã tìm thấy có
đột biến gen p53 mới cần thiết xác đònh trình tự các
nucleotide, theo phương pháp Sanger cải tiến, sử dụng bộ
PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ).
Điện di trên gel và phân tích kết quả qua máy giải trình tự
DNA tự động (Applied Biosystems Model 373A).

¾ Khảo sát hóa mô miễn dòch
- Qui trình nhuộm theo phương pháp phức hợp avidin-biotin-
peroxidase (ABC) sử dụng bộ xét nghiệm Histofine (Nichirei,
Nhật Bản) và các kháng thể đơn dòng kháng p53 (DO7),
kháng MDM2 (IF2), kháng Ki67 (MIB1) (Dako, Đan Mạch)
và kháng MMP9 (56-2A4) (Nhật Bản), được thực hiện tại Bộ
môn Bệnh học miệng Đại học Y Nha Tokyo (Nhật Bản).
- p53, MDM2, Ki67 dương tính khi nhân tế bào bướu nhuộm
màu nâu, MMP9 dương tính khi bào tương của tế bào bướu
bắt màu nâu đậm hơn so với tế bào biểu mô bình thường.

8
Bảng 2.4: Thang điểm đánh giá mức độ nhuộm hóa mô miễn dòch

Nhuộm Âm tính Dương tính
p53 -: 0-10% 1+: 11-30% 2+: 31-50% 3+: 51-100%
MDM2 -: 0-10% 1+: 11-30% 2+: 31-50% 3+: 51-100%

Ki67 -: 0-20% +: 21-100%
MMP9 -: 0-50% +: 51-100%

¾ Theo dõi đến 15/10/2004 bằng cách ghi nhận kết quả các lần
tái khám theo hồ sơ bệnh án, qua trao đổi thư và điện thoại.
- Tiêu chuẩn chẩn đoán di căn hạch: dựa trên chẩn đoán lâm
sàng và/hoặc trên vi thể xác đònh có di căn hạch.
- Tiêu chuẩn chẩn đoán đáp ứng hoàn toàn với xạ trò: Sau khi
xạ trò, bệnh nhân còn sống và không bò tái phát, hoặc nếu tái
phát thì ung thư tái phát vẫn đáp ứng với xạ trò.
- Tiêu chuẩn chẩn đoán ung thư tái phát: Có chẩn đoán lâm
sàng tái phát tại bướu nguyên phát và/hoặc hạch cổ, và giải
phẫu bệnh của tổn thương tái phát là carcinôm tế bào gai.
- Tiêu chuẩn chẩn đoán tử vong: Khi ở lần tái khám cuối cùng,
bác só đánh giá ung thư diễn tiến nặng không điều trò được
nữa, hoặc người nhà báo tin bệnh nhân tử vong.
- Thời gian sống còn ở bệnh nhân tử vong: Từ lúc chẩn đoán
ung thư đến ngày bệnh nhân tử vong, hay thông tin lần tái
khám cuối cùng ghi nhận diễn tiến nặng không điều trò được.
- Thời gian sống còn toàn bộ ở bệnh nhân còn sống: Từ lúc
chẩn đoán ung thư đến ngày kết thúc ghi nhận nghiên cứu.

¾ Xử lý dữ liệu

Nhập và xử lý dữ liệu bằng phần mềm Excel và Stata 8.0, với
kiểm đònh χ2, hệ số tương quan Spearman, phương pháp Kaplan-
Meier và kiểm đònh log-rank. Liên quan được xem là có ý nghóa
khi P < 0,05.

17

4.1.3. Biểu hiện của protein MDM2 trong UTNMM

Tỉ lệ biểu hiện quá mức MDM2 là 36,4%, gần tương tự tỉ lệ
36,2% trong một nghiên cứu ở Nhật Bản (Yanamoto 2002), tỉ lệ
25,9% ở Trung Quốc (Ng 1999) ; nhưng thấp hơn tỉ lệ 78% ở Ấn Độ
(Agarwal 1999), 69% ở Đài Loan (Huang 2000).

Kết quả cho thấy biểu hiện MDM2 không liên quan với lâm
sàng. Mặc dù Agarwal (1999), Huang (2001) tìm thấy tỉ lệ cao biểu
hiện MDM2 nhưng vẫn không thấy sự liên quan này.

4.1.4. Biểu hiện của protein Ki67 trong UTNMM

Tỉ lệ cao về tăng biểu hiện Ki67 như 80% (Schoelch 1999), 71%
(Ng 1999), 62,9% (de Vicente 2002), 67,3% (nghiên cứu này) phản
ánh UTNMM thường có hoạt động sinh sản tế bào ung thư mạnh.

Mặc dù cách chọn điểm ngưỡng quy đònh kết quả dương tính
khác nhau, nhưng đa số các nghiên cứu trước đây và nghiên cứu
này ghi nhận biểu hiện Ki67 không liên quan với giới tính, thói
quen, vò trí, giai đoạn, di căn hạch.

4.1.5. Biểu hiện của protein MMP9 trong UTNMM

Tỉ lệ MMP9 dương tính khá cao, trong nhiều nghiên cứu như
53,1% (Kurahara 1999), 60,9% (Guttman 2004) và trong nghiên cứu
này (56,4%), cho thấy MMP9 thường tham gia trong UTNMM.

Cũng như nhiều nghiên cứu trước đây (Gu 2004), nghiên cứu
này cho kết quả biểu hiện MMP9 không liên quan với tuổi, giới

tính, thói quen, vò trí, kích thước bướu.

4.1.6. Liên quan đột biến gen p53, biểu hiện p53 và biểu hiện MDM2

Theo y văn, ngoài nguyên nhân đột biến gen p53, sự trở nên
bền vững của protein p53 còn do protein của virut hoặc do protein

16
223, 234–258, 270–286. Nghiên cứu này phát hiện đột biến tại các
điểm nóng codon 156, 175, 237, 270.

Nucleotide đột biến: Khoảng 2/3 các đột biến gen p53 trong ung
thư đầu cổ xảy ra tại các vò trí guanin. Nghiên cứu này cũng cho kết
quả đột biến thường xảy ra tại các guanin của gen p53.

Kiểu đột biến: Đa số là đột biến điểm, và là đột biến sai nghóa.

Protein p53 đột biến: Đa số đột biến gen p53 là đột biến sai
nghóa sản xuất protein p53 đột biến có cấu hình bất thường, bền
vững hơn, dẫn đến tích tụ nhiều trong nhân nên biểu hiện quá mức
khi nhuộm hóa mô miễn dòch (Greenblatt 1994). Vì vậy, các nghiên
cứu đều tìm thấy tỉ lệ cao về biểu hiện quá mức protein p53 đột
biến như tỉ lệ 85% (Ahomadegbe 1995), 92% (Saranath 1999),
87,5% trong nghiên cứu này.

4.1.2. Biểu hiện của protein p53 trong UTNMM

Tỉ lệ 75,5% biểu hiện quá mức p53 gần tương tự với tỉ lệ 78,9%
trong một nghiên cứu trong nước trước đây (Huỳnh Anh Lan 1996),
và với kết quả của nhiều nghiên cứu khác như 75% ở Anh (Kaur

1994), 70% ở Thái Lan (Kerdpon 2001), 63,8% ở Nhật Bản
(Yanamoto 2002). Kết quả này một lần nữa khẳng đònh người Việt
Nam thường có protein p53 biểu hiện quá mức khi bò UTNMM.

Nghiên cứu này cũng như nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy
biểu hiện p53 không liên quan với thói quen hút huốc, nhai trầu,
thậm chí khi phân tích trên cỡ mẫu lớn như nghiên cứu của
Thongsukai (2001) trên 156 trường hợp UTNMM ở Thái Lan; cũng
như không liên quan với giới tính, vò trí, kích thước bướu, giai đoạn
lâm sàng. Tỉ lệ biểu hiện quá mức p53 tăng cao có ý nghóa ở những
bệnh nhân trên 60 tuổi, tương tự kết quả nghiên cứu của Xu (1998).

9
CHNG 3: KẾT QUẢ

3.1. Đột biến gen p53 trong UTNMM
Bảng 3.7: Đột biến gen p53 trong 18 trường hợp UTNMM
STT Tuổi/ giới/
thói quen
Vò trí/ TNM/
Độ mô học
Đột biến
gen p53
Biểu hiện
protein p53
1 71/nữ/không thói quen Lưỡi /T2N0/I - 1+
2 53/nam/hút thuốc Lưỡi/T1N1/II Exon 5 3+
3 75/nữ/nhai trầu Nướu/T4N2/I - 1+
4 52/nữ/nhai trầu Môi/T4N3/I Exon 5 2+
5 40/nữ/không thói quen Má/T3N2/II Exon 7 1+

6 69/nữ/nhai trầu Má/T1N1/II Exon 8 1+
7 53/nữ/không thói quen Lưỡi /T2N0/I - 1+
8 71/nam/hút thuốc S.miệng/T3N2/I - 3+
9 70/nam/hút thuốc Sàn miệng
/T3N0/II
Exon 7
Exon 8
3+
10 80/nữ/nhai trầu Má/T2N2/II - 1+
11 35/nữ/không thói quen Lưỡi /T3N0/I - -
12 51/nữ/nhai trầu Má/T4N2/I Exon 8 3+
13 44/nam/hút thuốc Lưỡi /T3N1/I - 1+
14 66/nam/hút thuốc Lưỡi /T3N1/II - 1+
15 73/nữ/nhai trầu Má/T2N0/I Exon 8 2+
16 74/nam/hút thuốc Môi/T4N2/I - 3+
17 75/nữ/nhai trầu Má/T2N1/I - -
18 82/nam/hút thuốc Lưỡi/T3N0/I Exon 7 -
- 8 trường hợp có đột biến gen p53, chiếm tỉ lệ 44,4%, gồm đột
biến tại exon 5 (2 trường hợp), exon 7 (2 trường hợp), exon 8 (3
trường hợp), exon 7 cùng exon 8 (1 trường hợp). Không gặp đột
biến tại exon 6.
- 100% đột biến điểm, tại codon 156, 175, 237 và 270, trong đó
66,7% đột biến tại các guanin.
- Đột biến sai nghóa gặp trong 7 trường hợp biểu hiện p53(+), đột
biến ghép nối sai gặp trong 1 trường hợp biểu hiện p53(-) và
trong 1 trường hợp kèm đột biến sai nghóa biểu hiện p53(+).

10

15

53 và tron
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1.Đột biến gen p53 và biểu hiện p53, MDM2, Ki67, MMP9

4.1.1. Đột biến gen p53 trong UTNMM

Tỉ lệ đột biến: Đột biến gen p53 khá phổ biến trong UTNMM ở
Nhật Bản (63%, Sakai 1992), châu Âu (67%, Ahomadegbe 1995),
Mỹ (50%, Xu 1998) – nơi mà hút thuốc lá và uống rượu được xem
là những yếu tố nguy cơ chính trong UTNMM. Ngược lại, tỉ lệ này
tương đối thấp ở những nước có thói quen nhai trầu phổ biến. Mặc
dù mẫu nghiên cứu này cũng có những bệnh nhân nhai trầu, nhưng
kết quả tỉ lệ đột biến gen p53 (44,4%) tương đối cao hơn ở những
nước phổ biến thói quen nhai trầu như Ấn Độ: 17–21% (Munirajan
1996, Saranath 1999), Đài Loan: 5,4% (Kuo 1999), Myanmar:
17,5% (Shwe 2001). Kết quả này cho thấy gen p53 của người Việt
Nam dễ bò đột biến trong quá trình sinh ung thư ở niêm mạc miệng.

Dù tỉ lệ đột biến gen p53 có thể khác nhau tùy theo mỗi nước,
nhưng kết quả nghiên cứu này cũng như của các nghiên cứu trước
đây trên thế giới về đột biến gen p53 trong UTNMM đều thống
nhất những điểm sau:

Số exon đột biến: Đa số đột biến xảy ra trên một exon, mặc dù
vò trí exon dễ bò đột biến nhất thì có thể khác nhau. Nhật Bản
(Sakai 1992), Đài Loan (Hsieh 2001), Myanmar (Swe 2001) thường
gặp đột biến tại exon 5, trong khi đó exon 8 dường như là vùng đích
dễ bò đột biến nhất trong UTNMM ở người Việt Nam, cũng như ở
Ấn Độ (Kannan 1999).

Codon đột biến: Đột biến thường tập trung tại các điểm đột biến
nóng như các codon 130–142, 151–164, 171–181, 193–200, 213–

















Hình 3.10: Đột biến điểm gen p53 và biểu hiện quá mức p53
A. Đột biến gen p53 tại exon 8 được phát hiện qua PCR-SSCP.
B. Đột biến điểm thay thế adenin bằng thymin được phát hiện
qua kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA.
C. Biểu hiện quá mức p53 với mức độ mạnh (3+) (x200).
AAA
M 2 M 4 M 5 M 9 M18
M 6 M 9 M12 M15
∗
∗

B

A
A B C
Hình 3.9: Kết quả PCR-SSCP (+) cho thấy đột biến gen p53 (*)

A. Đột biến tại exon 5 (mẫu số thứ tự 2, 4).
B. Đột biến tại exon 7 (mẫu số thứ tự 5, 9, 18).
C. Đo
ä
t biến ta
ï
i exon 8
(
mẫu số thứ tư
ï
6
,
9
,
12
,
15
)
.
C

14

11

3.3.7. Liên quan biểu hiện protein-độ mô học với tiên lượng
3.2. Biểu hiện protein p53, MDM2, Ki67 và MMP9 trong UTNMM


Bướu có độ mô học hay độ 3 kết hợp với biểu hiện quá mức
p53 hay Ki67 hay MMP9 thường có tiên lượng xấu (P < 0,05).
- Có sự khác biệt về biểu hiện của p53, Ki67 (P < 0,001), MDM2
(P < 0,05) giữa UTNMM với niêm mạc miệng bình thường.


- Biểu hiện quá mức p53 chiếm 75,5%, gồm 31,8% biểu hiện
(1+), 15,5% biểu hiện (2+) và 28,2% biểu hiện (3+).
3.3.8. Tương quan giữa p53, MDM2, Ki67, MMP9 với thói
quen, các yếu tố tiên lượng và tiên lượng của UTNMM

Bảng 3.20: Tương quan giữa biểu hiện p53, MDM2, Ki67, MMP9
với thói quen, các yếu tố tiên lượng và tiên lượng của UTNMM


p53 MDM2 Ki67 MMP9
Tương quan
hai chiều

- Biểu hiện quá mức MDM2 chiếm 36,4%, gồm 26,4% biểu hiện
(1+), 6,4% biểu hiện (2+) và 3,6% biểu hiện (3+). Biểu hiện quá
mức MDM2 xảy ra trong 62,5% các trường hợp biểu hiện quá
mức p53 nhưng không có đột biến gen p53.

Tương
quan

Giá trò
P
Tươn
g

quan
Giá trò
P
Tương
quan
Giá trò
Spearman
P
Tương
quan
Giá trò
P
Thói quen
-0,0372 0,6995 0,1266
- Biểu hiện quá mức Ki67 gặp trong 67,3% và MMP9 trong 56,4%
các trường hợp UTNMM.
0,1875 0,0521 0,5887 -0,0037 0,9692
Độ mô học 0,3015*
0,0014
-0,298*

0,0016
0,2819*
0,0028
0,2837*

0,0027
Di căn hạch 0,2376*
0,0124 0,0831 0,3879 0,0387 0,6877
0,2200*
0,0209
Không đ.ứng xạ
0,0411 0,6861 0,0177 0,8622 0,1944 0,1400
0,4340*
0,0000
Tái phát
-0,1058 0,4249 -0,0365 0,7838 -0,1058 0,4249
0,3280*
0,0112
Tử vong
0,0928 0,3347 0,0332 0,7306 0,1290 0,1793
0 ,4237*
0,0000
p53
1,0000 . -0,1177 0,2205 0,3340* 0,0004 0,1739 0,0693
MDM2
-0,1177 0,2205 1,0000 . -0,0491 0,6103 -0,1469 0,1256
Ki67
0,3340* 0,0004 -0,0491 0,6103 1,0000 . 0,0504 0,6008
MMP9
0,1739 0,0639 -0,1469 0,1256 0,0504 0,6008 1,0000 .

Dấu * biểu thò sự tương quan có ý nghóa (P < 0,05).

- Biểu hiện p53 tương quan thuận với di căn hạch, độ mô học, Ki67.

- Biểu hiện MDM2 có sự tương quan nghòch với độ mô học.

- Biểu hiện Ki67 có sự tương quan thuận với độ mô học, với p53.

- Biểu hiện MMP9 có sự tương quan thuận tăng dần với các yếu tố
lần lượt là: bướu di căn hạch, độ mô học cao, sự tái phát, nguy cơ
tử vong cao, bướu không đáp ứng xạ trò.




H
ình 3.17:
M
DM2(+)
H
ình 3.18: Ki67(+)

H
ình 3.21A: p53(+)
H
ình 3.21B: MMP9(+)

12

13

T
3.3.5. Đồng biểu hiện p53, MDM2, Ki67, MMP9:
3.3. Liên quan p53, MDM2, Ki67, MMP9 với diễn tiến UTNMM

3.3.1. p53:
¾ Đồng biểu hiện quá mức p53/MDM2: 26,4%, p53/Ki67: 54,5%,
p53/MMP9: 46,4%, MDM2/Ki67: 23,6%, MDM2/MMP9: 17,3%,
Ki67/MMP9: 39,1%, p53/MDM2/Ki67/MMP9: 10%. Ngược lại,
2,7% trường hợp vắng biểu hiện cả bốn protein này.
- Đột biến gen p53 không liên quan với các yếu tố lâm sàng.
Không có sự khác biệt có ý nghóa về thời gian sống còn giữa
những bệnh nhân có đột biến tại các exon khác nhau (P> 0,05).


- Biểu hiện p53 liên quan với tuổi, di căn hạch (P < 0,05).

¾ Liên quan có ý nghóa (P < 0,05) giữa:
Bảng 3.12: Liên quan giữa biểu hiện p53 với lâm sàng
- Độ mô học với p53/Ki67, p53/MMP9, Ki67/MMP9.
Biểu hiện p53 UTNMM
Số
ca
- 1+ 2+ 3+
P
Tuổi


Di căn hạch
N0
N1, 2, 3

43
67

55
55

15(34,9%)
12(17,9%)

18 (32,7%)
9 (16,4%)

7(16,3%)
28(41,8%)

17 (30,9%)
18 (32,7%)

8(18,6%)
9(13,4%)

11 (20,0%)
6 (10,9%)

13(30,2%)
18(26,9%)

9 (16,4%)
- Di căn hạch, tình trạng tái phát với p53/MMP9.
- Sự đáp ứng xạ trò, tiên lượng sống còn với p53/MMP9,
0,029
22 (40,0%)

0,019
Ki67/MMP9, MDM2/MMP9.
≤ 60
> 60

3.3.6. Liên quan giữa biểu hiện MMP9 với thời gian sống còn
y
û lệ sốn
g

3.3.2. Biểu hiện MDM2, Ki67: không liên quan với các yếu tố
lâm sàng (P > 0,05).

3.3.4. Biểu hiện MMP9: liên quan với di căn hạch, giai đoạn trễ,
sự tái phát, sự không đáp ứng xạ trò, tiên lượng xấu (P < 0,05).
Bảng 3.15: Liên quan giữa biểu hiện MMP9 với lâm sàng
UTNMM Số ca MMP9(-) MMP9(+)
P
Di căn hạch
N0
N1, 2, 3
Sự đáp ứng xạ trò
Không đáp ứng
Đáp ứng
Tình trạng tái phát
Không tái phát
Tái phát
Tình trạng sống còn

Sống
Tử vong

55
55

64
35

45
14

45
65

30 (54,5%)
18 (32,7%)

17 (26,6%)
25 (71,4%)

30 (66,7%)
4 (28,6%)

31 (68,9%)
17 (26,1%)

25 (45,5%)
37 (67,3%)

47 (73,4%)
10 (28,6%)

15 (33,3%)
10 (71,4%)

14 (31,1%)
48 (73,9%)
0,021


0,000


0,012


0,000









%
Thời

Biểu đồ 3.6: Đường tiên lượng sống còn Kaplan-Meier của những
bệnh nhân bướu MMP9(+) và những bệnh nhân bướu MMP9(-)

Thờøi gian sống còn của những bệnh nhân có bướu MMP9(+)
(TB = 19,3 ± 2,3 tháng) ngắn hơn so với của những bệnh nhân có
bướu MMP9(-) (TB = 35,7 ± 2,8 tháng) (P < 0,001).

Thời gian sống còn của bệnh nhân UTNMM giảm 3,71 lần nếu
MMP9(+), giảm 3,17 lần nếu Ki67(+)/MMP9(+), giảm 2,6 lần nếu
p53(+)/MMP9(+), giảm 2,45 lần nếu MDM2(+)/MMP9(+).
g
ian sốn
g
(thán
g
)
0
50 100
0
25
50
75
100
MMP9(-)
MMP9(+)