Nghiên cứu virus cúm a h5n1 ở việt nam và thái lan dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC THÁI LAN





BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam
và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán
và vaccine phòng chống


Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Lê Thanh Hòa
ThS. NCS. Đoàn Thị Thanh Hương






9191

Hà Nội, 2011

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VỚI VƯƠNG QUỐC THÁI LAN





BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI


Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam
và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán
và vaccine phòng chống


Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Lê Thanh Hòa
ThS. NCS. Đoàn Thị Thanh Hương

Hà Nội, 2011

 i
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn:
 Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cấp kinh phí thực hiện.
 Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Kế hoạch tài chính - Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt để đề tài
thực hiện đúng tiến độ̣.
 Phòng Miễn d
ịch học - Viện Công nghệ sinh học
 Phòng virus học - Viện Công nghệ Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc
gia Thái Lan (BIOTEC).
 Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học.
 Phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện Công nghệ sinh học.
 Trại sinh học thực nghiệm Cổ Nhuế - Viện Công nghệ sinh học.
 Các đơn vị trong Viện Công nghệ sinh học đã hợp tác, giúp đỡ
để hoàn
thành đề tài.


Chủ nhiệm đề tài



PGS. TS. Lê Thanh Hòa

TS. Đoàn Thị Thanh Hương

 ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký
hiệu
Tiếng Anh Tiếng Việt
bp base pair Cặp bazơ
Ck Chicken Gà
cDNA Complementary DNA DNA bổ sung
Da Dalton Đơn vị khối lượng dalton
Dk Duck Vịt
ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic
dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate Deoxy Nucleotide Triphosphate
ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate dideoxy Nucleotide Triphosphate
Gs Goose Ngỗng
HA Hemagglutinin Kháng nguyên HA
HI Hemagglutination Inhibition Phản ứng ngưng kết hồng cầu
HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao
kb Kilo base Kilo base
LB Luria-Bertani medium Môi trường LB
LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis Phân tích di truyền tiến hoá phân tử
NA Neuraminidase Kháng nguyên NA
NEP Nuclear Export Protein Nuclear Export Protein
NP Nucleoprotein Nucleoprotei
NS Non-structural protein Protein không cấu trúc
PA Polymerase acidic protein Protein PA
PB1 Polymerase basic protein 1 Protein PB1

PB2 Polymerase basic protein 2 Protein PB2
RT-
PCR
Revertranscription Polymerase Chain
Reaction
Phản ứng trùng hợp chuỗi PCR
ngược
ARN Ribonucleic Acid Axit ribonucleic
RNP Ribonucleoprotein Ribonucleoprotein
SPF Specific Pathogen Free Sạch mầm bệnh
(-)
ssRNA
Negative single-strand Ribonucleic Acid ARN sợi đơn âm


 iv
DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
STT Họ và tên
Trách nhiệm
trong đề tài
Học hàm,
học vị
Số
tháng
làm việc
1 Lê Thanh Hòa
Chủ nhiệm giai
đoạn một
PGS.TS.
NCVCC

36 tháng
2 Đoàn Thị Thanh Hương
Chủ nhiệm giai
đoạn hai
TS 36 tháng
3 Hoàng Thị Minh Châu Thư ký ThS 36 tháng
4 Nguyễn Thị Bích Nga Tham gia ThS. NCS 24 tháng
5 Trương Nam Hải Tham gia
PGS.TS.
NCVCC
9 tháng
6 Đỗ Thị Huyền Tham gia TS 9 tháng
7 Nguyễn Bá Thành Tham gia TS 12 tháng
8 Lê Thị Kim Xuyến Tham gia TS 12 tháng
9 Trần Ngọc Linh Tham gia BSTY 12 tháng
10 Vũ Thị Tiến Tham gia ThS 24 tháng

Và một số người khác


 v
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn……………………………………………………………………… i
Danh mục các từ viết tắt……………………………………………………… ii
Danh sách cán bộ tham gia thực hiện đề tài………………………………… iv
Mục lục……………………………………………………………………… v
Danh mục bảng………………………………………………………………… viii
Danh mục hình……………………………………………………………… ix
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………… 4
1.1. Bệnh cúm và virus cúm A/H5N1………………………………………… 4
1.2. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam………………………… 7
1.2.1.Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam…………………………… 7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu virus H5N1 và biện pháp phòng chống………… 8
1.3. Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao 9
1.4. Sự hình thành genotype c
ủa virus cúm A/H5N1 12
1.5. Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) 13
1.6. Sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 14
1.7. Vaccine và biện pháp phòng chống dịch cúm A/H5N1 16
1.8. Tổng quan về virus Newcastle…………………………………………… 17
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……
19
2.1. Nguyên liệu……………………………………………………………… 19
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất 20
2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 20
2.2.2. Hóa chất………………………………………………………………… 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… 21
2 3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1…………. 21
2.3.1.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng s
ố 21
2.3.1.2. Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR………………………… 23

 vi
2.3.1.3. Phương pháp chuyển đổi cDNA………………………………………… 23
2.3.1.4. Phương pháp thôi gen và tinh sạh sản phẩm thôi gen…………………
24
2.3.1.5. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen…………………………
25

2.3.1.6. Phương pháp giải trình trình tự ……………………………………………
26
2.3.1.7. Phương pháp xử lý số liệu……………………………………………
27
2.3.2. Phương pháp tạo kháng nguyên HA
1
tái tổ hợp sử dụng cho chẩn đoán . 27
2.3.2.1. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện …………………………………
28
2.3.2.2. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp………………………………. 28
2.3.2.3. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 29
2.3.2.4. Phương pháp tinh chế HA
1……………………………………………………………………………

29
2.3.2.5. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên …………………….
30
2.3.2.6. Phương pháp kiểm tra độ sạch của protein HA
1
…………………………
31
2.3.3. Phương pháp tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 ……… 31
2.3.3.1. Phương pháp thu nhận hệ gen virus Newcastle chủng LaSoTa………
32
2.3.3.2. Phương pháp thiết kế plasmid vector …………………………………….
32
2.3.3.3. Phương pháp gắn gen H5 (cúm A/H5N1) vào plasmid vector
33
2.3.3.4. Phương pháp nuôi cấy giống vaccine LaSoTa tái tổ hợp 33
2.3.3.5. Phương pháp kiểm tra đáp ứng miễn dịch với

34
2.3.3.6. Phương pháp thực hiện phản ứng HA và HI
34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………
37
3.1. Nghiên cứu dịch tễ
phân tử virus cúm A/H5N1…………………………… 37
3.1.1. Kết quả thu nhận gen H5 và N1 37
3.1.2. Kết quả lưu giữ gen H5 vào plasmid…………………………………… 39
3.1.3. Kết quả lưu giữ gen N1 vào plasmid…………………………………… 41
3.1.4. Kết quả giải mã hệ gen đại diện virus cúm A/H5N1 ……………………. 42
3.1.5. Kết quả phân tích gen H5 và so sánh với các chủng của thế giới……… 42
3.1.6. Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ nguồn gốc …………………… 51
3.1.7. Kết quả xác định các phân nhóm kháng nguyên xuất hiện mới tại VN…. 55
3.2. Thiết kế vector biểu hiệ
n và thu nhận protein kháng nguyên 56

 vii
3.2.1. Kết quả thu nhận gen HA1 và dòng hóa vào vector pET22trx…………. 56
3.2.2. Kết quả biểu hiện gen HA
1
trong tế bào E. Coli………………………… 59
3.2.3. Kết quả tinh chế TrxHa1 và nghiên cứu khả năng nhận biết TrxHA1 …. 61
3.2.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên……………………… 62
3.2.5. Kết quả tạo kit ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) …… 62
3.2.4.1. Kết quả tạo kit ELISA………………………………………………… 62
3.2.5.2. Thử nghiệm kit ELISA 65
3.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất vaccine LaSoTa TTH gắn gen H5… 68
3.3.1. Kết quả thiết kế plasmid vector chứa hệ gen virus LaSoTa (pLST)……. 68
3.3.1. 1. Nguyên liệu và phương pháp tạo plasmid vector LaSoTa……………

68
3.3.1.2. Kế
t quả thu nhận phân đoạn gen F1 và chuyển nạp vào vector……….
69
3.3.1.3. Kết quả thu nhận đoạn gen F2 và chuyển nạp vào vector tách dòng….
71
3.3.1.4. Kết quả thu nhận plasmid tái tổ hợp chứa toàn bộ hệ gen chủng virus
vaccine LaSoTa………………………………………………………………………
71
3.3.2. Kết quả lắp ghép virus LaSoTa TTH mang gen H5 virus cúm A/H5N1 73
3.3.3. Kết quả kiểm tra giống virus tái tổ hợp…………………………………. 73
3.3.3.1. Bố trí thí nghiệm 73
3.3.3.2. Kết quả chuẩn độ virus tái tổ hợp của giống virus vaccine ……………
74
3.3.3.3. Kết quả kiểm tra an toàn, vô trùng của giống virus vaccine ……………
76
3.3.3.4. Kiểm tra tính ổn định của giống vaccine tái tổ hợp ………………………
77
3.3.3.5. Kết quả kiểm tra virus vaccine LaSoTa tái tổ hợp chứa gen H5 ………
77
3.3.4. Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch của giống virus vaccine tái tổ hợp 78
3.3.4.1. Bố trí thí nghiệm ……………………………………………………………
78
3.3.4.2. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 …
79
3.3.4.3. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng Newcastle………………
80
K
ẾT QUẢ HỢP TÁC QUỐC TẾ VIỆT NAM-THÁI LAN…………………
81

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………
82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………
85
PHỤ LỤC………………………………………………………………………
90


 viii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Danh sách 14 chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu đã
được phân lập và giải trình tự……………………………………………
20
Bảng 2.2: Danh sách các mồi sử dụng trong thu nhận, lưu giữ và giải mã gen
H5 và N1……………………………………………………………………
23
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA trong nghiên
cứu………
24
Bảng 3.1: Danh sách các biến chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và
thế giới sử dụng gen H5 trong phân tích so sánh…………………………….
43
Bảng 3.2: Các vị trí nucleotide sai khác trong gen H5 giữa 14 chủng c
ủa
Việt Nam và 18 chủng của thế giới…………………………………………
45
Bảng 3.3: Xác định liều gây nhiễm 50% trên phôi trứng gà (EID

50
) của
giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 của virus cúm A/H5N1……….
75
Bảng 3.4: Quy trình thực hiện phản ứng HA……………………………… 77

















 ix
M
DANH MỤC CÁC HÌNH


Trang
Hình 1.1a. Virus cúm với các yếu tố kháng nguyên H và N, lớp màng bao
(envelop), protein liên kết (matrix protein M1), ribonucleoprotein (RNP)….

4
Hình 1.1b. Influenza A virus, loại virus gây bệnh cúm gia cầm……………. 4
Hình 1.2. Ảnh chụp và mô hình tiểu phần virus cúm A…………………… 5
Hình 1.3. Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm A………………… 6
Hình 1.4. Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á. 11
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus cúm A 22
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát qui trình chế tạo kháng nguyên tái tổ
hợp HA1 28
Hình 3.1: Điện di sản phẩm RT-PCR gen H5 38
Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen N1 ……………………… 39
Hình 3.3. Kết quả tách dòng gen H5 các chủng ……………………………. 40
Hình 3.4. Kết quả tách dòng gen N1 của các chủng ……………………… 41
Hình 3.6. Trình tự amino acid của chuỗi polypeptide H5………………… 48
Hình 3.7. Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ……………………… 52
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR thu nhận gen HA1………… 57
Hình 39. Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp………………………… 58
Hình 3.10. Phân tích sản phẩ
m cắt các plasmid tái tổ hợp pCRha1 58
Hình 3.11. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid táo tổ hợp (pET22Trxha1)  59
Hình 3.12. Protein tổng số từ các chủng tái tổ hợp E. coli BL21 60
Hình 3.13. Xác định hàm lượng protein tái tổ hợp 60
Hình 3.14. Xác định độ sạch của protein HA1 61
Hình 3.15. Phân tích khả năng liên kết giữa kháng nguyên tái tổ hợp với
kháng thể kháng viurs H5N1.
62
Hình 3.16. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thiết kế vector ch
ứa toàn bộ hệ gen 69
Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasimd tái tổ hợp 70
Hình 318. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen N2.1và N2.2 71
Hình 3.19. Phương pháp gắn gen HA của virus H5N1 vào plasmid 72

Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra gen H5 của virus tái tổ hợp 73
Hình 3.21. Hình ảnh ấp trứng và tiếp truyền virus tái tổ hợp 74
Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR m
ẫu virus LaSoTa TTH 77
Hình 3.23. Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng virus
cúm A/H5N1

80
Hình 3.24. Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng virus
Newcastle

80

1
MỞ ĐẦU
Từ cuối năm 2003 cho đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực (HPAI) cao gây
dịch cúm gia cầm (còn gọi là dịch cúm A/H5N1) bùng phát ở nhiều nước châu Á,
trong đó có Việt Nam. Dịch bệnh liên tục tái phát hàng năm, lây lan nhanh chóng và
diễn biến phức tạp tại nhiều quốc gia ở các châu lục trên thế giới. Việt Nam là một
trong các nước có số người nhiễm và tử vong do cúm A/H5N1 cao nhất trong khu
vực và trên thế giới, được WHO xác định là một trong các qu
ốc gia “tiêu điểm”, có
thể xảy ra dịch cúm mới ở người cần đặc biệt quan tâm khống chế.
Virus cúm A/H5N1 là một phân type (chủng) trong nhóm virus cúm A thuộc họ
Orthomyxoviridae, loại hình phân type kháng nguyên Hemagglutinin (HA) là H5 và
Neuraminidase (NA) là N1 trên bề mặt capsid của hạt virus hoàn chỉnh, có độc lực
cao gây bệnh dịch nặng nề ở gia cầm và gây được bệnh cúm nặng trên người. HA
và NA là hai protein vỏ có vai trò quan trọng liên quan đến khả năng xâm nhiễm,
độc lực gây bệnh của virus trên vậ
t chủ. Trong đó, protein HA được mã hoá bởi gen

HA (phân đoạn 4) trong hệ gen virus cúm A, có vai trò khởi động quá trình xâm
nhiễm của virus ở tế bào cảm thụ của động vật cảm nhiễm, thông qua sự kết hợp
HA với thụ thể đặc hiệu của nó có trên bề mặt màng của các tế bào này, và do đó
quyết định khả năng thích ứng xâm nhiễm của virus cúm A ở các loài vật chủ. Đoạn
nố
i giữa HA
1
và HA
2
(điểm cắt của protease) có vai trò quyết định độc lực gây
bệnh của virus cúm A/H5N1. Bên cạnh đó, HA còn là một protein kháng nguyên
của virus, có ý nghĩa quan trọng kích thích cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch
chống lại virus, tham gia vào phản ứng trung hòa virus, và do đó được coi là đích
chủ yếu của bảo hộ miễn dịch bảo vệ cơ thể nhiễm. Sử dụng các vaccine phòng cúm
là nhằm vô hiệu hóa vai trò c
ủa HA(H5) trong quá trình lây nhiễm của A/H5N1,
qua đó phòng chống dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm, và ngăn chặn đại dịch cúm trên
người.
Virus cúm A/H5N1 luôn có sự biến đổi hệ gen. Sự tích lũy các đột biến điểm
nội gen (antigenic drift) , hoặc trao đổi các gen (antigenic shift) của virus A/H5N1
với các chủng virus cúm A đã thích nghi lây nhiễm trên người trong quá trình lây

2
truyền tự nhiên, hình thành virus cúm gây đại dịch ở người, như các chủng:
A/H1N1; A/H2N2 và A/H3N1 gây ra trong lịch sử.
Đặc điểm biến đổi thành phần nucleotide và acid amin của gen H5 cho phép
phân tích mối quan hệ tiến hoá và phân type, xác định tương đồng kháng nguyên-
miễn dịch và phân định nhóm kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1. Do đó,
phân tích, giám sát chặt chẽ gen H5 và hệ gen virus cúm A/H5N1 là thực sự cần
thiết, nhằm tìm hiểu những đặc điểm biến đổi về các đặc tính phân tử gen H5, và

ảnh h
ưởng của những biến đổi đó đến tương quan kháng nguyên-miễn dịch, qua đó
dự báo sớm và chính xác về dịch tễ học phân tử, giúp định hướng sử dụng và sản
xuất vaccine phòng cúm cho gia cầm, cũng như cho người.
Có nhiều loại vaccine đang được sử dụng và nghiên cứu bao gồm cả vaccine
truyền thống và vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và
di truyền ngược. Tuy nhiên các loại vaccine này vẫn có những nhược điểm khó
khắc phục như giá thành cao, khó bảo quản và khó sử dụng (đưa vaccine vào cơ thể
bằng đường tiêm). Do vậy các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát
triển những loại vaccine mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản hơn và dễ sử
dụng để có thể sử dụng
đại trà. Virus Newcastle (NDV) là virus có vai trò dịch tễ
học quan trọng ở gia cầm, là loại có hệ gen đơn sợi RNA, không phân đoạn, không
khép kín, nên trở thành đối tượng lý tưởng tạo vector cho vaccine đa dụng. Trong số
các chủng tự nhiên của NDV, LaSoTa là chủng hoàn toàn vô độc, có khả năng kích
thích miễn dịch niêm mạc, rất thuận lợi cho việc thiết kế vector sử dụng cho
ăn/uống/khí dung.
Từ sự cấp thiết của tình hình hiện nay và trên cơ s
ở một số thành công trong
việc tạo vaccine thế hệ mới, được sự phê duyệt của Bộ Khoa học và Công nghệ,
chúng tôi hợp tác với Viện Công nghệ Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia
Thái Lan (BIOTEC) thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở Việt
Nam và Thái Lan: Dịch tễ phân tử, chẩn đoán và vaccine phòng chống”.
Đề tài được thực hiện với những mục tiêu và nội dung sau:


3
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1 qua giải mã gen kháng
nguyên H5 và N1 của các chủng virus phân lập tại Việt Nam.

2. Nghiên cứu tạo chế phẩm protein HA
1
tái tổ hợp cho mục đích chẩn đoán.
3. Nghiên cứu tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 của cúm
A/H5N1.
Nội dung nghiên cứu:
1. Nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1
- Thu thập mẫu bệnh phẩm cúm A/H5N1 tại các vùng khác nhau của Việt Nam
từ năm 2004 - 2011.
- Giải mã gen HA (H5) và gen NA (N1) của các chủng virus cúm A/H5N1 phân
lập tại Việt Nam.
- Giải mã hệ gen của 01 chủng virus cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam thuộc
dòng Quảng Đông và 01 chủng thu
ộc dòng Phúc Kiến.
- Lưu giữ gen HA (H5) và gen NA (N1) trong plasmid.
- Nghiên cứu dịch tễ học phân tử qua phân tích, so sánh với các chủng của thế
giới.
2. Tạo chế phẩm kháng nguyên HA
1
tái tổ hợp
- Thu nhận phân đoạn gen HA
1
(là thành phần chính trong gen HA - quyết định
tính kháng nguyên của virus).
- Tạo protein HA
1
tái tổ hợp cho mục đích chẩn đoán.
3. Tạo giống virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 của cúm A/H5N1
- Thu nhận toàn bộ hệ gen chủng virus LaSoTa.
- Thiết kế plasmid vector tái tổ hợp mang toàn bộ hệ gen virus LaSoTa.

- Gắn gen HA (H5) của chủng virus cúm A/H5N1 DkNA-114 phân lập tại Việt
Nam thuộc dòng Phúc Kiến vào plasmid vector LaSoTa. Chuyển nạp vào vector
biểu hiện.
- Đồng nhiễm vào tế bào biểu hiện BHK-21.
- Tiếp truyền giống virus tái tổ hợp nhiều đời trên phôi trứng gà 10 ngày tu
ổi để
nhân giống virus tái tổ hợp.
- Thử nghiệm đáp ứng miễn dịch của virus tái tổ hợp ở quy mô phòng thí
nghiệm.

4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH CÚM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao trên khắp thế giới. Hiện
nay, cúm H5N1- phân type virus cúm nguy hiểm nhất hiện nay đã lan truyền trên 40
quốc gia ở Châu Á, Trung Đông, Châu Âu và Châu Phi. Chủng này mới xuất hiện
gần đây, nhưng là một loại subtype có độc lực cao, được chứng minh là có khả năng
lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà
nhữ
ng năm 1996-2005. Theo tổng kết của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Việt Nam
là nước có số người mắc bệnh và tử vong cao nhất trong số 8 nước có dịch xảy ra ở
châu Á.


Hình 1.1a. Virus cúm với các yếu tố
kháng nguyên HA và NA, lớp màng
bao (envelop), protein liên kết M
(matrix, protein M1),
ribonucleoprotein (RNP).

Hình 1.1b. Influenza A virus, loại virus gây
bệnh cúm gia cầm. (Ảnh chụp những tiểu
phần virus được nhuộm âm tính trên kính hiển
vi điện từ truyền qua).

Virus cúm A/H5N1 chính thức được công bố xuất hiện ở Việt Nam vào cuối
tháng 12/2003, đã nhanh chóng gây nên đại dịch cúm gia cầm lớn trong cả nước.
Đây là lần đầu tiên dịch cúm A xảy ra, chưa có một cơ sở nghiên cứu nào ở nước ta
tiến hành nghiên cứu một cách sâu sắc nên đã có sự lúng túng trong việc phòng
chống cũng như dập tắt các ổ dịch. Chỉ trong một thời gian ngắn, dịch cúm gia cầm
đã bùng phát t
ại nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước, hàng chục triệu con gia cầm bị
tiêu huỷ, gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế quốc dân.

5
Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà) có tên khoa học là
Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại (Basic
Taxomomy) (Murphy and Webster, 1996).
Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính
80-120 nanomet (nm), đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng
250 triệu Dalton (Da). Phân tích thành phần hoá học một virion có chứa khoảng 0,8-
1,1% RNA; 70-75% là protein; 20-24% lipid và 5-8% là carbonhydrate (Murphy,
1996).
Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm: vỏ (capsid), màng bao ngoài (envelope) và
lõi là RNA sợi đơn đối mã (sợi đơn âm – negative single strand) (Murphy and
Webster, 1996) (Hình 1.3).
(A) (B)

Hình 1.2. Ảnh chụp và mô hình tiểu phần virus cúm A (Lê Thanh Hòa, 2006).
(A: Ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử truyền qua. B: Mô hình

cấu tạo hạt virus cúm A. Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân
tử kháng nguyên NA, Capsid: vỏ virus, Lipid envelope: lớp màng bao lipid, RNA: Hệ gen
virus)

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus,
bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc
hiệu hoá gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô
ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10-14 nm có đường kính 4-6 nm, đó
là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein (GP) gồm:
HA, NA, M (matrix antigen) và các dấu ấn khác c
ủa virus (Murphy and Webster,
1996; Bender, 1999). Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử HA và NA (tỉ
lệ khoảng 4HA/1NA), đây là hai protein kháng nguyên vỏ có vai trò quan trọng

6
trong quá trình xâm nhiễm vật chủ của virus (Murphy and Webster, 1996; Wagner,
2002).
Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-)
ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS) nối với
nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus (Murphy and Webster, 1996; Ito,
1998).
Tên
Serotype
Vùng địa
lí phân lập
Số hiệu
chủng
Năm
phân lập
Phân type

HA và NA
A/Ck/VN/HG4/05(H5N1)
Loài
nhiễm
A
Tên
serotype
Vùng địa lí
phân lập
Số hiệu
chủng
Năm
phân lập
Phân type
HA và NA
A/VN/1194/2004(H5N1)
B

Hình 1.3. Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cúm A (WHO, 2004)
(A: Phân lập ở các loài động vật; B: Phân lập trên người)

Nhóm virus cúm A được phân chia thành nhiều phân type (subtype), các phân
type này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính protein kháng nguyên bề
mặt (HA và NA) của chúng, cho đáp ứng kháng thể khác nhau giữa các chủng virus
và cơ thể nhiễm (Murphy and Webster, 1996; Wagner, 2002). Có 16 phân type HA
và 9 phân type NA đã được phát hiện, sự tổ hợp giữa các phân type này, về lý
thuyết, có thể tạo ra hơn 144 chủng virus khác nhau (Webster, 1998, WHO, 2004).
Tổ chức Y tế thế giới đã qui định thống nhất danh pháp lưu trữ h
ệ gen của các
chủng virus cúm trong Ngân hàng gen (GenBank), cũng như trong Trung tâm dữ

liệu các gen virus cúm ISD (Influenza Sequence Database), theo thứ tự kí hiệu: Tên
serotype/Loài động vật bị nhiễm/Vùng địa lí phân lập/Số hiệu đăng kí chủng
virus/Thời gian phân lập/Loại hình phân type (HA(H) và NA(N)) (Hình 1.4A). Ví
dụ: A/Chicken/VietNam/TY31/05(H5N1). Đối với các virus được phân lập trên
người bệnh, thì bỏ qua phần động vật bị nhiễm trong danh pháp (WHO, 2004). Ví
dụ: A/VietNam/1194/04(H5N1) (Hình 1.4B).

7
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÚM H5N1 Ở VIỆT NAM
1.2.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam
Virus cúm A/H5N1 chính thức được công bố xuất hiện ở Việt Nam vào cuối
tháng 12/2003, đã nhanh chóng gây nên đại dịch cúm gia cầm lớn trong cả nước.
Đây là lần đầu tiên dịch cúm A xảy ra, chưa có một cơ sở nghiên cứu nào ở nước ta
tiến hành nghiên cứu một cách sâu sắc nên đã có sự lúng túng trong việc phòng
chống cũng như dập tắt các ổ dịch. Chỉ
trong một thời gian ngắn, dịch cúm gia cầm
đã bùng phát tại nhiều tỉnh, thành phố trong cả nước, hàng chục triệu con gia cầm bị
tiêu huỷ, gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế quốc dân.
Dịch cúm gia cầm xảy ra từ tháng 12/2003 đến cuối năm 2005, được chia
thành các đợt như sau:
Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 đến tháng 30/3/2004: xảy ra ở các tỉnh Hà
Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng 2 tháng dịch
đã
xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu
huỷ hơn 57,5 triệu con.
Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4-11/2004: dịch bệnh cúm gà tái phát tại 17 tỉnh, thời
gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004. Tổng số
gia cầm tiêu hủy ở giai đoạn này là 84 ngàn con. Trong đợt này có 27 người mắc
bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong.
Đợt dịch thứ 3 t

ừ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch xảy ra trên
36 tỉnh thành trong cả nước (15 tỉnh phía Bắc và 21 tỉnh phía Nam), những tỉnh bị
dịch bệnh nặng là Long An, Tiền Giang, Bạc Liêu, Đồng Tháp. Số gia cầm bị tiêu
huỷ là 1.846 triệu con (gồm: 470 ngàn gà, 825 ngàn thuỷ cầm và 551 ngàn chim
cút). Đánh giá thiệt hại trong các đợt dịch cúm gia cầm ở Việt Nam đã làm thiệt hại
khoảng 3.000 tỷ đồng, trong đó thiệt hại trực tiếp do gia cầm bị ch
ết và tiêu huỷ là
1.800 tỷ đồng.
Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10/2005 lan
nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005, tuy thiệt hại không
lớn nhưng gây sự hoang mang trong cộng đồng dân cư là dịch cúm vẫn còn dai
dẳng xảy ra.

8
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số người bị nhiễm cúm gia
cầm từ năm 2003 đến 09/08/2011 thì toàn thế giới đã có 519 trường hợp người mắc
cúm A subtype H5N1, trong đó có 306 trường hợp đã tử vong, riêng Việt Nam có
119 người mắc, trong đó có 59 người tử vong.
Cho đến nay chỉ có hai biến chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5 và H7
được xem là loại có độc lực cao gây bệnh ở gia cầm, đã tạo nên tái tổ
hợp phân type
H7N7 gây đại dịch cúm gà ở châu Âu và H5N1 ở châu Á. Tuy nhiên, không phải tất
cả các chủng chứa H5 và H7 đều gây bệnh và chính bản thân H7N7 hoặc H5N1
cũng tồn tại nhiều biến chủng vô độc hoặc độc lực thấp. H5N1 mới xuất hiện gần
đây ở các nước châu Á là một phân type có độc lực cao, được chứng minh là có khả
năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dị
ch
cúm gà trong những năm 1996 - 2010 (Ligon et al., 2005).
Tháng 6/2009, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công bố đại dịch cúm do
virus type A/H1N1 trên toàn thế giới.

1.2.2. Tình hình nghiên cứu virus H5N1 và biện pháp phòng chống bệnh tại
Việt Nam
Ngay từ khi dịch cúm gia cầm xảy ra tại Việt Nam, các tổ chức quản lý, y tế và
khoa học công nghệ đã đặc biệt quan tâm đến bệnh mới phát sinh này. Bộ Chính trị
đã ban hành Chỉ thị số 35-CT/TW, ngày 06-02-2004 về triể
n khai các biện pháp cấp
bách ngăn chặn dịch cúm gia cầm và cúm A (H5N1) trên người. Ý thức được tầm
quan trọng và mức độ nguy hiểm của bệnh, ngay từ những ngày đầu tiên xuất hiện
bệnh , các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học, Viện Paster thành phố Hồ Chí
Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Thú y đã giải mã các gen quan trọng,
quyết định tính gây bệnh cho người và gia cầm là HA (H5), NA (N1), NP và một số
gen quan trọng khác củ
a một số chủng virus H5N1 lây nhiễm ở gia cầm. Các trình
tự gen này đã được công bố trên Ngân hàng gen thế giới (GenBank). Trên cơ sở
phân tích gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả đã khẳng định nguồn gốc của
virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với của Thái
Lan, Hồng Kông, Trung Quốc, đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông ( Le et
al., 2004; Muramoto et al., 2006a; Nguyễn Tiến Dũng et al., 2004; Lê Thanh Hòa et

9
al., 2005; Lê Trần Bình et al., 2006). Các chủng phân lập những năm 2004-2006 đã
được nghiên cứu khá chi tiết về gen học và quan hệ phân tử với các nhóm trong
vùng và thế giới, kết quả đã khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á
thuộc nhóm di truyền VTM (Viết tắt: Vietnam-Thailan-Malaysia) có những đặc tính
sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hồng Kông (Li et al.,
2004; Chen et al., 2006; Hulse-Post et al., 2007).
Để có thể đáp ứng nhanh nhu cầu về vaccine cúm gia cầm, ngoài việc ti
ếp
tục những nghiên cứu về vaccine tái tổ hợp trên cơ sở các tiểu đơn vị và vaccine
DNA, ngày 3 tháng 11 năm 2005 Viện Công nghệ Sinh học đã hoàn tất các thủ tục

và tiến hành tiếp nhận chủng virus sản xuất vaccine NIBRG-14 từ Viện Quốc gia về
Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học, Vương Quốc Anh. Đây là chủng virus được tạo
bằng công nghệ di truyền ngược, tái tổ hợp trên cơ sở các gen c
ủa chủng gốc
PR8/34 với các gen HA (đã bị đột biến mất 4 amino acid RRRL và đột biến thay thế
3 axit amin tại vùng gây độc) và NA có nguồn gốc từ chủng virus cúm H5N1 phân
lập từ bệnh nhân Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004). Chủng NIBRG-14 này đã được
Tổ chức Y tế thế giới công nhận về độ an toàn và khuyến cáo là một trong các
chủng dùng cho sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay. Các chủng này cũng được
nhiều nước như
Trung Quốc, Hungary, Brazil sử dụng để sản xuất vaccine cho gia
cầm. Một số nước đã sử dụng chủng này để sản xuất vaccine cho người.
Theo sự khuyến cáo của WHO, Viện Công nghệ sinh học đã sử dụng chủng
NIBRG-14 để nhân virus trên phôi gà và kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản của một giống
virus. Viện cũng đã phối hợp với Bộ NN&PTNT và một số cơ quan xây dựng và
triể
n khai đề án sản xuất vaccine cúm gia cầm A/H5N1 bằng chủng virus
vaccine NIBRG-14.
1.3. Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus cúm
A/H5N1
Lần đầu tiên năm 1959 phát hiện chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh ở gia
cầm được coi là chủng cổ điển. Sau thời gian gần 40 năm không xuất hiện, vào năm
1996 virus H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc)
đây là chủng
đã tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong những năm vừa

10
qua (Xu et al, 1999). Chủng virus nguyên thuỷ này cung cấp nguồn gen HA(H5) cho
quá trình tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở
Hồng Kông năm 1997, và nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hồng Kông

được kiến tạo từ virus cúm A có ở chim cút (Guan et al., 1999). Riêng nguồn gen
NA(N1) trong cấu trúc của gen đã có hiện tượng xóa đi 57 nucleotide mã hóa cho 19
amino acid, tại vùng đầu N của protein neuraminidase, và đột biến “xóa gen” của N1
có liên quan đến tính thích ứng của virus cúm từ thuỷ cầ
m lên gia cầm trên cạn và
người (Matrosovich et al., 1999).
Năm 1997, virus H5N1 gây bệnh tại Hồng Kông làm chết 6 người trong tổng
số 18 người bị nhiễm, do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1
nguyên thủy gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, tưởng như virus
đã biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng
ở vùng Nam Trung Quốc, trở thành ngu
ồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới
(Cauthen et al., 2000; Webster et al., 2002). Trong các năm 1997 - 2002, các biến
chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều đặc tính kháng nguyên khác nhau của phân
type H5 được hình thành tạo nên nhóm kháng nguyên (clade ) có độc lực cao với gà
nhưng thấp đối với vịt, để rồi sau đó bị đào thải trong những năm 2001 - 2002. Tiếp
tục, trong năm 2002 - 2003, gen HA(H5) có những đột biến mới do hậu quả của
hiện tượng ”lệch” kháng nguyên (antigenic drift)
để tạo nên biến chủng có tính gây
bệnh cao, đặc biệt đối với vịt, và có khả năng lây nhiễm sang người (Guan et al.,
2004). Đặc tính thích ứng và gây bệnh trên người càng ngày càng cao dần, cùng với
độc lực tăng cường đối với đa vật chủ để rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập
xuống các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan (Li et al., 2010;
Chen, 2009; Duan et al., 2008).
Tại Việt Nam, virus cúm gia cầm H5N1 xu
ất hiện ở Việt Nam từ năm 2001,
nhưng đến cuối năm 2004 mới chính thức được công bố (Trương Văn Dung,
Nguyễn Viết Không, 2004; Nguyễn Tiến Dũng et al., 2004). Virus H5N1 thể độc
lực cao và H5N2, H9N3 thể độc lực thấp đã được phân lập ở ngỗng và vịt từ năm
2001 và 2003 (WHO, 2005). Phân tích phả hệ cho thấy nhóm virus này không phải

clade 1 thuộc phân dòng Quảng Đông đã gây b
ệnh ở người vào cuối năm 2003

11
(Jadhao et al., 2009). Tiến hóa chủng/type và dòng tái tổ hợp mới thường xuất phát
từ các tỉnh ở Nam Trung Quốc (Smith, 2006 ; Wang et al., 2008).
Sau giai đoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ hoàn thiện
về đặc tính gây bệnh trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và
người trong các năm 2004 - 2005 (Smith et al., 2006). Tuy nhiên, xét về di truyền
học phân tử và tính kháng nguyên, các chủng virus H5N1 giai đoạn 1997 - 2002 vẫn
mang tính đồng nhất kháng nguyên cùng với chủ
ng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của
Quảng Đông (Chen, 2009) và bắt đầu phân hóa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra
năm 2003 - 2005 (Hình 1.4).















Hình 1.4. Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á. Các mũi tên

chỉ sự lan truyền của virus theo các năm (Nguồn : Duan et al., 2008).

Cuối năm 2005, ngoài phân dòng Quảng Đông còn có nhiều subtype (phân
dòng) của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất hiện của phân
dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến
(Fujian and Fujian-like sublineage), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc, Hồng

12
Kông, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan (Li và cs, 2011; Smith và cs, 2006), tràn sang
Trung Á, châu Âu và châu Phi có tính gây bệnh cao đối với người (Ducatez và cs,
2007; Skeik và Jabr, 2008).
Các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến và Thanh Hải có cấu trúc gen N1 không
thay đổi nhiều, nhưng trong gen H5 có motif amino acid ở vùng chuỗi nối của điểm
cắt protease là (-RRRK-) đã giảm mất một Lysine (K) so với các chủng thuộc phân
dòng Quảng Đông (Smith et al, 2006), vì thế kể từ năm 2006 đến nay, nhiều nhóm
kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 cùng tồn tại gây bệnh, trong
đó có
Việt Nam (Nguyen et al., 2008). Trong các năm 2006 - 2008, dịch cúm gia cầm xảy
ra không ác liệt như những năm 2003 - 2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng cúm
A/H5N1 có biến động kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học có thể đã trở
nên phức tạp hơn (Zhao et al., 2008; Gambotto et al., 2008).
1.4. Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 trên thế giới và Việt Nam
Kể từ khi cúm gia cầm type A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông
(A/Gs/CN/Gd1/1996(H5N1) (Xu et al., 1999), có tất cả 12 genotype, bao gồm GD,
A, B, C, D, E, X(X
0
-X
3
), V, Y, W, Z(Z
+

) và G.
Từ năm 2002 trở lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã
không còn tồn tại (đó là các genotype A, C, D, E), nhưng lại tiến hóa xuất hiện 8
genotype của H5N1 (V, W, X
1
, X
2
, X
3
, Y, Z và Z+) (Macken et al., 2006). Sự xuất
hiện của genotype Z với tính gây bệnh cao ở các nước Đông Nam Á là bằng chứng
của sự đột biến “lệch kháng nguyên” của cúm A/H5N1 (Wu et al., 2008). Các
chủng virus H5N1 phân lập tại Việt Nam năm 2004-2006, thuộc dòng Quảng Đông,
tập trung chủ yếu là genotype Z, gần đây xuất hiện thêm genotype G, nhưng được
phân biệt thành 2 nhóm: nhóm N (North) phổ biến ở phía Bắc Việt Nam và nhóm S
(South) phân bố ở
phía Nam (Smith et al., 2006; Nguyen et al., 2008). Type Z là
type virus phổ biến nhất lưu hành trong khu vực châu Á từ năm 2003. Đặc điểm của
type Z là các gen NA và NS đều bị mất đoạn và vùng chuỗi nối HA
1
-HA
2
(điểm cắt
protease) mang nhiều aminno acid qui định độc lực của virus. Đến 2007, Việt Nam
đã tồn tại 9 nhóm di truyền. kí hiệu VN1 – VN9 được xác định dựa trên phân tích trao
đổi chéo các phân đoạn để tái tổ hợp hình thành genotype (Wan et al., 2008).

13
Các nhóm kháng nguyên và nhóm di truyền đó là : clade 3 (VN1, năm 2001);
clade 5 (VN2, năm 2003 ; clade 1 (VN3 năm 2003 - 2007); clade 2.3.2 (VN4 năm

2005; clade 0 (VN5 năm 2005); clade 2.3.4 (VN6 năm 2007); clade 2.3.4 (VN7, năm
2007); clade 2.3.4 (VN8, năm 2007) ; clade 2.3.4 (VN9, năm 2007), clade 7 thuộc
dòng Á-Âu đã xuất hiện ở Lạng Sơn và clade 2.3.2 xuất hiện từ 2009 đến nay (Wan
et al., 2008; Nguyen et al., 2009; Davis et al., 2010).
Ngoài ra còn một số chủng chỉ xuất hiện rồi biến mất trong vòng một năm và chỉ
trao đổi nguồn gen trong quá trình tiến hoá; một số khác chỉ tồn tạ
i vài năm rồi sau
đó không phát hiện được; số khác mới xâm nhập gần đây, chẳng hạn như phân dòng
2.3.4 có nguồn gốc từ Phúc Kiến và phân dòng 2.3.2 có nguồn gốc từ Thanh Hải -
Trung Quốc hiện nay có xu hướng tiến hoá nội bộ tạo nên nhiều chủng biến đổi
khác nhau.
1.5. Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm kháng
nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1
Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm A/H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng
nguyên dẫn đến ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng
vacxin. Virus cúm gia cầm lưu hành tại Việt Nam đa dạng về kiểu hình HA liên quan
nhiều đến đặc tính kháng nguyên, trong đó clade 1 và clade 2 được xác định gây bệnh
cho người và clade 2 cũng đã phát triển thành các nhóm khác nhau trên cơ sở thay đổi
về một số amino acid (Lê Quỳnh Mai, 2011).
Theo thông báo của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và WHO cho biết
hiện nay đã phát hiện các phân nhánh virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao thuộc
clade 1.1 và 2.3.2.1 (FAO, 2011). Các phân nhánh này không phải là mới xuất hiện
mà do trong quá trình tiến hoá tự nhiên được hình thành. Phân nhánh 1.1 có nguồn
gốc tứ clade 1 trước đây. Phân nhánh 2.3.2.1 được tiến hoá từ clade 2.3.2 đã được
phát hiện từ chim hoang dã sau đó là gia cầm Trung quốc (Hunan, Qinghai), Mông
Cổ, Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào và Hồng Kong và mới đây là Việt Nam (WHO,
2011).
Hiện nay, clade 1.1 thay thế cho clade 1 giai đoạn 2004-2005 ở hầu hết các
tỉnh thành xuất hiện cúm gia cầm A/H5N1. Trong năm 2011, clade 2.3.2.1 đã được


14
phát hiện ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và vùng duyên hải miền Trung thay thế
cho clade 2.3.4 trước đây (FAOAIDEnews, 2011), còn ở các tỉnh phía Nam thuộc
vùng đồng bằng sông Cửu Long vẫn lưu hành chủ yếu clade 1.
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1
tại Việt Nam và Campuchia cũng cho thấy có sự hình thành clade 1.1. Clade 1.1 đã
được phát hiện ở gia cầm của Việt Nam tại phía Nam; ở gia cầm và người t
ại
Campuchia gây chết 9/9 người từ cuối 2010 đến nay (WHO-FAO-OIE, 2011). Phân
tích đặc điểm di truyền của gen HA đã chỉ ra là, đến thời điểm hiện nay, tại Việt
Nam, clade 1.1 đã thay thế cho clade 1 ở phía Nam và clade 2.3.2 và phân nhánh
2.3.2.1 đã thay thế clade 2.3.4 ở phía Bắc, lưu hành trước đây (WHO, 2011; WHO-
FAO-OIE, 2011). Cho đến nay, sau gần 10 năm xuất hiện tại Việt Nam, virus cúm
gia cầm A/H5N1 đã trở thành một tác nhân nguy hiểm cho gia cầm và cộng
đồng và
là mối nguy cơ lại càng gia tăng khi vacxin hiện nay không có đáp ứng miễn dịch đối
với các chủng virus thuộc các clade mới xuất hiện năm 2011. Kết quả thí nghiệm của
Cục Thú y liên quan đến clade 2.3.2.1 xuất hiện năm 2011 cho thấy, sau khi công
cường độc 100% gà bị chết trong vòng 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7 ngày.
Như vậy nhóm virus này có độc lực cao với gà hơn đối với vịt (nhánh cũ có thể gây
chết 60 – 70% vịt) ( />).
Hiện tại chưa phát hiện thấy virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người. Tuy
nhiên vấn đề chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 này, như
vậy, gia cầm hoàn toàn bỏ ngỏ không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus
cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ đáng lo ngại
gây bệnh trên người. Do đó, việc quan trọng cần làm là phải tăng cường công tác
giám sát virus cúm ở gia cầm, ch
ủ động áp dụng các biện pháp phòng chống dịch
thích hợp. Mục đích nhằm ngăn chặn sự lây truyền dịch ở gia cầm và ngăn chặn lây
truyền từ gia cầm sang người.

1.6.

SINH HỌC PHÂN TỬ VIRUS CÚM A/H5N1

Hệ gen virus cúm A là ARN sợi đơn âm ((-)ssARN), gồm 8 phân đoạn gen
riêng biệt, mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp