thu nhận protease từ đầu tôm

PHẦN I: TỔNG QUAN
I.Giới thiệu về tôm:
 Tôm sú hay còn gọi là tôm cỏ, tôm nương, tôm sú rằn, thuộc lớp giáp xác, bộ
mười chân, họ tôm he, giống tôm he, loài tôm sú, có tên khoa học là Penaeus
monodon, tên thương mại là Black Tiger Shrimp. Tôm sú được đánh bắt và
nuôi trồng hàng đầu thế giới. Theo thống kê của tổ chức Lương Thực Nông
Nghiệp thế giới (Food Agriculture Organization- FAO), sản lượng tôm sú năm
1997 chiếm 52% sản lượng tôm nuôi trồng toàn thế giới, với tốc độ tăng
trưởng trung bình 2% năm. Trong các vùng nuôi tôm chủ yếu trên thế giới,
Đông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới
trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển (thống kê
của FAO năm 1997).

 Hiện nay, ở Việt Nam tôm sú là một trong năm loại tôm được nuôi trồng phổ
biến và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Việt Nam.
Tôm sú (Black Tiger Shrimp) – Penaeus monodon.
Tôm thẻ (Banana Shrimp) – Penaeus merguiensis.
Tôm chân trắng (White Leg Shrimp) – Penaeus vannamei.
Tôm Nhật Bản (Kuruma Shrimp) – Penaeus japonicus.
Tôm càng xanh (Giant Fresh Water Prawn).
 Nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây, trở thành ngành kinh
tế quan trọng. Năm 2004, xuất khẩu thủy sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất
khẩu tôm đông lạnh chiếm 47%. Năm 2004, xuất khẩu thủy sản đạt giá trị 2,4
tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước trong đó tôm đông lạnh
chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản. Hiện nay, tôm sú vẫn là đối tượng
chủ lực, thu hút sự chú ý lớn của người dân, chính quyền và cung cấp trong
chuyển dịch cơ cấu kinh tế ven biển.
II.Khái quát protease:
II.1:Định nghĩa protease:
Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy
phân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và cắt liên kết peptid giữa các L-

acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton. Và chúng thường tác
động lên các ester đơn giản.
II.2:Phân loại protease:
 Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm:
-Protease nội bào.
-Protease ngoại bào.
 Dựa vào tính đặc hiệu cơ chất:
-Endopeptidase: Enzyme thủy phân peptid ở giữa mạch.
-Enxopeptidase: Enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch.
 Dựa vào pH hoạt động:
-Protease acid tính.
-Protease kiềm tính.
-Protease trung tính.
 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:
-Protease động vật.
-Protease thực vật.
-Protease vi sinh vật.
 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme:
-Serine protease (OH): Trypesine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline
protase (MAP), Thrombin…
-Thiol protease (SH): Papain, bromeline…
-Aspartic protease (COOH): Pepsin, rennin…
-Metallo protease: Carboxylpeptidase A, collagenase (cần trung tâm hoạt động là
Zn
2+
hoặc Mg
2+
).
III.Protease của tôm:
III.1: Khái quát:

 Sự tiêu hóa và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài
giáp xác khác nhau rất nhiều. Hầu hết các cơ chế tiêu hóa và hấp thụ khác
với động vật có xương sống. Các enzyme tiêu hóa, đặc biệt các enzyme tiêu
hóa ở protein ở giáp xác nói chung và ở tôm nói riêng khá giống với enzyme
có trong dạ dày của cá. Protease của tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở
dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất
cao. Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin, astacine, collagenase…
 Protease của tôm cũng như các loài động vật thủy sinh khác là các protease
nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa, sau đó đến nội tạng và
cơ thịt. Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hóa nội tạng nằm ở phần đầu nên
hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác.
 Có nhiều cách phân loại protase, tùy vào khả năng thủy phân khác nhau mà
các protease có đặc tính khác nhau. Nhóm enzyme này có tác dụng thủy
phân protein, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thủy phân liên kết
peptid mà còn có thể thủy phân các liên kết ester và cũng có thể xúc tác cho
chuyển về gốc acid amin. Tuy nhiên mức độ tác dụng khác nhau.
III.2: Tính chất:
 Phần lớn các nhóm enzyme thuộc protease của tôm thường có tính chất
chung của một enzyme:
-Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung tính,
đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ khác, nên dựa vào những đặc tính này để
tách chiết chúng.
-Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol,
acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme.
-Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa
hay ức chế.
-Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: Nhiệt độ, pH môi
trường.
 Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu cùng cộng tác viên về
protease đầu tôm biển và Th.s Nguyễn Thị Mỹ Trang về protease đầu tôm bạc

nghệ cho thấy các enzyme tiêu hóa protein là các enzyme hoạt động mạnh
trong môi trường kiềm. Theo Nguyễn Việt Dũng thì protease của tôm sú lại thể
hiện hoạt tính cao ở môi trường gần trung tính.
 Khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hóa protein khác nhau tùy theo loài.
Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô được xác
định như khả năng hoạt động phân giải casein của tôm càng xanh và tôm đất
thấp hơn ở tôm sú, tôm Nhật Bản…
IV.Ứng dụng của enzyme protease:
Các protease nói chung được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
IV.1:Trong công nghiệp:
-Trong sản xuất nước chấm: Nước mắm, tương, chao…
-Trong công nghệ thực phẩm: Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi chế biến…
-Trong công nghệ thuộc da: Làm mềm lông, sạch lông, bóng da…
-Trong công nghệ tơ tằm: Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
-Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng giặt
sạch vết máu, sữa trên vải.
-Trong công nghiệp sữa, các protease như renine, pepsine được dùng trong sản
xuất formate, sữa đông tụ.
IV.2:Trong nông nghiệp:
Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn
của lợn và gia cầm.
IV.3:Trong mỹ phẩm:
-Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi
tóc, kem mặt,…để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.
IV.4:Trong y học:
-Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất
huyết thanh miễn dịch.
-Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu…bị sơ cứng.
-Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch…
-Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng.

-Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị tiêu hóa
kém…

Dùng cho các bệnh về thận Dùng trong các ngành công nghiệp(acid protease)
IV.5:Trong kỹ nghệ phim ảnh:
-Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu như phim điện ảnh,
phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy
ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý.
PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN
PROTEASE:
I. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ:
Đầu Tôm Sú
Ly tâm thu chế phẩm thô
Ly tâm thu dịch chiết
Nghiền mịn
Kết tủa enzyme protease
Chiết dịch enzyme thô
Chế phẩm
enzyme
thô
Cồn 96
0
(1/6)
Aceton 65%
(NH
4
)
2
SO
4

70%
Nước(1/4)
Muối(1/3)
Đệm P(1/7)
Tris-HCl(1/7)
Tinh sạch bằng
sắc ký lọc gel
Xác định trọng lượng phân
tử bằng điện di SDS- PAGE
II.GIẢI THÍCH QUI TRÌNH:
II.1:Nghiền mịn:
 Xay đầu tôm trên cối xay thịt,nghiền nhuyễn bằng cối inox với cát
thạch anh đã xử lý và làm sạch
II.2:Chiết dịch enzyme thô:
 Để chiết rút enzyme ta có thể dung các dung môi:nước cất,dung
dịch muối sinh lý, đệm phosphate, đệm tris-HCl.Thực nghiệm cho
thấy dd Tris-HCl 0,05M pH=7,5 cho kết quả hoạt tính protease tốt
nhất với tỉ lệ mẫu\Tris-HCl=1\7(w\v).Khuấy đảo liên tục ở nhiệt độ 0-
4ºC trong 40 phút để chiết rút enzyme,ly tâm lạnh ở 4ºC,tốc độ
6.000 vòng\phút trong 15 phút để loại bỏ phần cặn,thu dịch chiết.
II.2.1: Xác định dung môi và chế độ tách chiết thích hợp:
 Dung môi chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme,tách protease
đầu tôm bằng các dung môi:nước cất,muối sinh lý, đệm phosphates
0.1M pH=7.0, đệm Tris-HCl 0.05M pH=7.5 cùng với các tỉ lệ mẫu
\dung môi khác nhau,rồi tiến hành các bước như trên để tìm ra tỷ lệ
thích hợp và loại dung môi thích hợp nhất.
 Sau khi khảo sát khả năng tách chiết của các dung môi ( nước cất,
nước muối sinh lý, đệm phosphate, đệm Tris- HCl) ở các tỷ lệ khác
nhau, tiến hành so sánh khả năng tách chiết của từng loại dung môi
ở tỷ lệ thích hợp để chọn ra dung môi chiết enzyme protease thích

hợp.
Bảng 1 : Hàm lượng protein và hoạt tính protease từ Dịch chiết của các
dung môi của đầu Tôm sú
Dung môi chiết Hàm lượng
protein(mg/g)
Hoạt tính
protease(U/g
Nước (1/4) 36,77 56,02
Muối (1/3) 19,61 79,10
Đệm P (1/7) 19,61 79,10
Tris- HCl (1/7) 20,04 121,53
 Từ bảng số liệu trên ta thấy khả năng chiết của dung môi khác nhau
và ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính protease,hàm lượng protein
của dịch chiết. Ở dung môi nước cất cho kết quả hàm lượng protein
tốt nhất,còn dung môi Tris-HCl cho kết quả hoạt tính protease tốt
nhất,ta sẽ chọn đệm Tris-HCl điều ta cần quan tâm là hoạt tính
protease.Thu được kết quả trên có thể là do dung môi đệm Tris-HCl
đảm bảo được điều kiện pH của môi trường phù hợp khả năng
khuếch tán protein của protease vào dịch chiết,hiệu suất thu hồi
proein enzyme mong muốn tốt hơn.
 Như vậy,chọn dung môi chiết đệm Tris-HCl 0.05M pH=7.5 với tỷ lệ
mẫu\dung dịch đệm Tris-HCl =1\7 (w\v) để thu dịch chiết sử dụng
trong các bước tiếp theo.
II.3: Ly tâm thu dịch chiết:
 Ly tâm lạnh ở 4
0
C, tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ
phần cặn, thu dịch chiết.
II.4: Kết tủa dịch chiết thu hồi chế phẩm protease thô:
 Dung môi hữu cơ thường để kết tủa thuận nghịch protease trong

dịch chiết mà không làm giảm hoạt tính của chúng là ethanol và
acetone.Hóa chất thường dùng để kết tủa thuận nghịch protease
trong dịch chiết mà không làm giảm hoạt tính protease của chúng là
muối (NH
4
)
2
SO
4 .
 Tiến hành tủa dịch chiết bằng các tác nhân trên ở điều kiện 0-
4ºC,thời gian tủa 60 phút,ly tâm lạnh ở 4ºC với tốc độ 6.000
vòng\phút trong 15 phút,thu cặn là chế phẩm enzyme thô.sau đây ta
sẽ đi tìm tỷ lệ hay nồng độ của tác nhân tủa và điều kiện tủa thích
hợp nhất.
Bảng 2: Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lượng
protease của Chế phẩm thô.
Tác nhân tủa Hàm lượng
protein
(mg/g)
Hoạt tính
protease
(U/g)
Hoạt tính riêng
(U/mg)
Cồn 1:6 18,40 121,98 6,63
Aceton 65% 17,00 106,00 6,24
(NH
4
)
2

SO
4
70% 23,00 122,73 5,34
 Kết quả khảo sát cho thấy khả năng tủa của các tác nhân ảnh
hưởng lớn đến hoạt tính và hàm lượng protein của Chế phẩm thô.
Tủa bằng Amoni sunfat 70% cho kết quả hoạt tính protease và hàm
lượng protein của Chế phẩm thô tốt hơn tủa bằng Cồn và Aceton
nhưng hoạt tính riêng khi tủa bằng Cồn lại cho kết quả tốt hơn
 Tóm lại, sử dụng cồn làm tác nhân tủa thì giá thành rẻ, quá trình thu
Chế phẩm thô đơn giản, nhanh( chỉ cần đưa bột nhão thu được sau
khi ly tâm vào tủ chân không), sau khi làm khô hoạt tính enzyme
không giảm. Tiến hành thu hồi lượng cồn trong khối dịch sau khi thu
kết tủa để sử dụng lại nhiều lần, sẽ giảm đáng kể chi phí sản xuất,
vệ sinh và an toàn môi trường cũng hoàn toàn đảm bảo. Với tác
nhân sulfat amon, ưu điểm không làm giảm hoạt độ enzyme, không
gây mùi khó chịu như cồn và aceton nhưng có nhược điểm: trong
Chế phẩm thô có muối sunfat amon, phải tinh sạch loại muối tiếp.
Phương pháp tinh sạch loại muối thường dùng là dùng màng thẩm
tích hay sắc ký lọc gel. Hai quá trình này rất tốn thời gian. Mặt khác,
sulfat amon có tính ăn mòn cao, làm rỉ sắt thép, các thiết bị, vì thế,
dụng cụ tiếp xúc với nó phải được làm từ hợp kim đặc biệt.
 Căn cứ vào hoạt tính riêng, sự phân tích về hiệu quả kinh tế của
quá trình tủa, ta nên chọn cồn 96
0
với tỷ lệ 1/6 để làm tác nhân tủa
protease trong dịch chiết đầu Tôm để thu chế phẩm Enzyme thô là
hợp lý nhất.
II.5: Ly tâm thu Chế phẩm thô:
 Ly tâm lạnh ở 4
0

C, tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút thu tủa là
Chế phẩm enzyme thô
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính Protease của Chế phẩm
thô:
i. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease của Chế
phẩm thô
- Xác định hoạt tính protease trong Chế phẩm thô tủa
cồn của dịch chiết mẫu theo phương pháp Amano. Ủ
enzyme của Chế phẩm thô với casein 1%, pH 7,0
trong 60 phút và nhiệt độ ủ thay đổi lần lượt: 30
0
C,
37
0
C, 47
0
C, 57
0
C,67
0
C, 77
0
C.
Bảng 3:
Nhiệt
độ
30 37 47 57 67 77
Hoạt
tính(U/g)
357,28 497,15 577,01 362,46 126,29 29,13

-Từ bảng kết quả cho thấy: Khi nhiệt độ tăng cao hơn nhiệt độ tối ưu la
47
0
C, hoạt tính protease giảm rất nhanh và hầu như mất hoạt tính hoàn
toàn ở nhiệt độ lớn hơn 77
0
C.
-Trái với suy nghĩ của nhiều người cho rằng protease động vật hoạt
động tối ưu ở 37
0
C và khoảng nhiệt độ tối ưu từ 35- 45
0
C, thực nghiệm
cho thấy enzyme của Tôm có nhiệt độ thích hợp ở 47
0
C.Tuy nhiên, kết
quả này lại có sự khác biệt với kết quả của một số tác giả trước đó, so
sánh giữa các kết quả ta thấy nhiệt độ của môi trường sống có ảnh hưởng
đến nhiệt độ hoạt động của enzyme. Mặt khác, trong Chế phẩm thô này,
ngoài protease còn protein và các tạp chất khác, chính các tạp chất này
có thể làm ảnh hưởng đến nhiệt độ hoạt động của protease trong Chế
phẩm thô. Để làm rõ thì ta cần phải nghiên cứu sâu thêm.
ii. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của Chế phẩm thô:
-Xác định hoạt tính protease trong Chế phẩm thô tủa cồn của dịch chiết
mẫu theo phương pháp Amano. Ủ enzyme của Chế phẩm thô với Casein
1% thay đổi theo pH lần lượt: 5, 6, 7, 8, 9 trong 60 phút ở 47
0
C.
Bảng 4:
pH 5 6 7 8 9

Hoạt
tính(U/g)
378,68 430,40 552,49 414,09 349,27
-Qua các thí nghiệm trên cho thấy protease Chế phẩm thô mẫu hoạt
động mạnh nhất tương ứng tại pH 7. Kết quả này tương tự như kết quả
của các nghiên cứu khác, vì vậy có thể kết luận sơ bộ rằng hệ protease
trong đầu Tôm hoạt động tối ưu ở khoảng pH trung tính.
iii. Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của
Chế phẩm thô từ mẫu:
Bảng 5:
Nồng độ muối
ăn(%)
Hoạt tính
protease(U/g)
0 449,16
1 457,80
3 552,49
5 442,23
7 423,62
9 394,34
11 373,11
13 324,54
15 298,13
17 235,67
19 213,57
-Kết quả cho thấy nồng độ muối ăn ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính
protease của Chế phẩm thô. Nồng độ muối ăn 3% cho hoạt tính protease đạt
cực đại. Điều này có thể lý giải là do muối ăn phân li thành Na
+
và Cl

-
, nồng
độ muối thấp, lớp vỏ hydrate của phân tử protein cũng chưa bị biến đổi, chưa
gây biến tính protein. Mặt khác, các ion này cũng liên kết với các phần mang
điện trong phân tử enzyme, làm tăng điện tích của trung tâm hoạt động này.
Kết quả những biến đổi trên làm tăng cường sự tương tác giữa phân tử
enzyme và phân tử protein, làm thay đổi chiều hướng và sự phân bố electron
trong phân tử protein, điểm tương tác giữa các phân tử protein dễ bị cắt đứt
hơn. Ở nồng độ muối ăn tăng lên trên 3% thì hoạt tính protease của Chế
phẩm thô giảm rất nhanh, khi nồng độ muối tăng lên trên 5% thì hoạt tính
protease giảm chậm lại. Do muối ăn có tính phân li mạnh nên khi nồng độ
cao, các ion đã liên kết mạnh với các phân tử nước, tạo áp suất thẩm thấu
lớn, kéo các phân tử nước khỏi liên kết với phân tử protein, làm cấu trúc
không gian bậc cao của phân tử mất đi, phân tử protein duỗi ra, bị biến tính,
kết tủa, làm hoạt tính enzyme giảm và protein của cơ chất cũng bị biến tính,
khó bị thuỷ phân.
II.6: Tinh sạch protease Chế phẩm thô bằng sắc ký lọc gel:
 Chế phẩm thô với các tác nhân tủa: cồn 96
0
(1/6), aceton (65%), và
muối sulfate amon(70%) tủa dịch chiết từb mẫu đầu Tôm được tinh
sâch bằng sắc ký lọc Gel
Bảng 6 : Hoạt tính riêng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của protease
sau sắc ký lọc gel
Enzyme tinh
sạch từ Chế phẩm
thô
Hoạt tính
riêng
(U/mg)

Độ tinh sạch Hiệu suất(%)
CPT tủa cồn 32,43 4,89 56,90
CPT tủa acetone 38,94 6,24 72,75
CPT tủa sunfate
amon
46,35 8,68 76,67
 Kết quả cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn, acetone hay
muối sunfate amon, hoạt tính riêng của protease từ mẫu đầu Tôm
sú qua bước tinh sạch đều tăng lên đáng kể. Sau quá trình tủa, hoạt
tính riêng protease của Chế phẩm thô tăng lên rất nhiều so với Dịch
chiết ví quá trình tủa đã loại bớt được một số tạp chất và enzyme
không thể hiên hoạt tính protease.Các protein lạ này sẽ bị loại bỏ
tiếp tục qua quá trình sắc ký.
 Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel cho thấy enzyme thu được
nhờ tác nhân tủa sunfate amon của mẫu đầu Tôm cho hoạt tính
riêng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch đều cao nhất so với cồn và
acetone. Điều này chứng tỏ, dùng muối sunfate amon thích hợp cho
việc tủa thu Chế phẩm thô protease từ dịch chiết mẫu đầu Tôm. Tuy
nhiên, xét về mặt kinh tế và qui mô sản xuất công nghiệp thì tác
nhân tủa cồn vẫn mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn.
II.7:Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS- PAGE:
 Trọng lượng phân tử của protease chiết tách và tinh sạch dao
động trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da.
III.ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM ENZYME:
Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano:
 Nguyên tắc:
-Phương pháp Amano hay còn gọi là phương pháp Anson cải tiến dựa trên
cơ sở thuỷ phân casein( hoặc Hemoglobin) bởi enzyme có trong dịch chế
phẩm nghiên cứu. Định lượng acid amin được tạo thành trong phản ứng thuỷ
phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của

Tyrozin để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzyme xúc tác tạo nên.
-Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme chuyển hoá được một lượng
caseinat natri thành dạng không bị kết tủa bởi acid tricloacetic tương đương
với 1 micromol tyrozin ở 30
0
C trong 1 phút. 1 mol tyrozin=0,181mg.
 Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) protease được xác định là lượng
enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg
tyrosine trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Ký hiệu:U
- Hoạt tính protease (ĐVHT/ml)= (A
m
–A
0
)F1/100n
- Hoạt tính protease( ĐVHT/g)= (A
m
–A
0
)F1/100nV
m
-Am: độ hấp thu của mẫu
-A
0
: độ hấp thu của ống đối chứng
-F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thu ở bước sóng
660nm trên đường chuẩn
-n: Hệ số pha loãng của enzyme
-1/100:Hệ số chuyển đổi
-V: thể tích của dung dịch enzyme
-m: khối lượng chế phẩm enzyme thô

Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của protease: từ kết quả hàm lượng
protein (mg/ml) và hoạt tính protease (U/ml), tính hoạt tính riêng của enzyme.
HTR(U/mg) =Số đơn vị hoạt tính
mg protein enzyme