Đậu thị thu hà nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất apigenin từ cúc hoa vàng sử dụng dung môi eutectic khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
------ oOo ------

ĐẬU THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH
CHIẾT XUẤT APIGENIN
TỪ CÚC HOA VÀNG
SỬ DỤNG DUNG MƠI EUTECTIC
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
------ oOo ------

ĐẬU THỊ THU HÀ
Mã sinh viên: 1801157

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH
CHIẾT XUẤT APIGENIN
TỪ CÚC HOA VÀNG
SỬ DỤNG DUNG MƠI EUTECTIC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng

2. ThS. Nguyễn Văn Phương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược liệu
Khoa Dược liệu - DHCT

HÀ NỘI - 2023


LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày phần nội dung đề tài khóa luận của mình, tơi xin gửi lời cảm ơn
chân thành đến những người trong suốt thời gian qua đã ln hỗ trợ, động viên và giúp đỡ
tơi hồn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình.
Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với những người thầy, người cơ đáng
kính của tơi. Với tất cả tấm lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành nhất tới PGS.TS. Nguyễn Thu Hằng - Trưởng bộ môn Dược liệu, Trường Đại
học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tơi trong suốt q trình nghiên cứu và
làm khóa luận tại bộ mơn Dược liệu.
Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ThS. Nguyễn Văn Phương - Giảng viên bộ
môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi nhất giúp tơi hồn thành khóa luận và có những chỉ dẫn hữu ích, kịp thời giúp tơi
vượt qua những lúc khó khăn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian
tôi học tập tại trường.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ nhiệt tình từ thầy cơ ở bộ mơn Dược liệu, các anh chị, các
bạn, các em sinh viên đang nghiên cứu khoa học trên bộ môn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất tới bố mẹ, gia đình, bạn bè những người ln động viên, khích lệ và là chỗ dựa tinh thần vững chắc nhất cho tơi trong
cuộc sống và trong suốt q trình thực hiện khóa luận.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận
tốt nghiệp có thể cịn nhiều điều thiếu sót. Tơi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cơ,

bạn bè để khóa luận được hồn thiện hơn.
Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023
Sinh viên

Đậu Thị Thu Hà


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

3

1.1. Tổng quan về Cúc hoa vàng

3

1.1.1. Thơng tin chung .................................................................................................. 3
1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................................ 3
1.2. Tổng quan các quy trình chiết xuất flavonoid từ Cúc hoa vàng

8

1.2.1. Quy trình của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự .......................................... 8

1.2.2. Quy trình của tác giả Na Guo và cộng sự ......................................................... 10
1.2.3. Quy trình của tác giả Leqin Ke và cộng sự ...................................................... 10
1.3. Phương pháp thủy phân flavonoid glycosid

10

1.3.1. Các phương pháp thủy phân flavonoid glycosid .............................................. 10
1.3.2. Phương pháp sử dụng enzym trong dung môi eutectic .................................... 11
1.4. Tổng quan về enzym 𝛃-glucosidase
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị

12
16
16

2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ............................................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu

18

2.3. Phương pháp nghiên cứu

18

2.3.1. Quy trình dự kiến .............................................................................................. 18
2.3.2. Phương pháp định lượng apigenin trong dịch chiết Cúc hoa vàng .................. 19
2.3.3. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân apigenin
glycosid từ Cúc hoa vàng............................................................................................ 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

23


3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn hệ dung môi eutectic tham gia quá trình chiết xuất
23
3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

23

3.2.1. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất .............................................................................. 23
3.2.2. Khảo sát thời gian chiết xuất............................................................................. 24
3.2.3. Khảo sát pH của dịch chiết đậu nành ................................................................ 25
3.2.4. Khảo sát thể tích dịch chiết đậu nành tham gia quá trình thủy phân ................ 26
3.3. Kết quả khảo sát và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất

28

3.3.1. Thiết kế thí nghiệm ........................................................................................... 28
3.3.2. Xây dựng mơ hình ............................................................................................ 30
3.3.3. Đánh giá mơ hình .............................................................................................. 32
3.3.4. Lựa chọn điều kiện tối ưu của các biến đầu vào ............................................... 34
3.3.5. Thẩm định mơ hình ........................................................................................... 34
3.4. Bàn luận

35

3.4.1. Về ý nghĩa của việc sử dụng dung môi eutectic (DES) trong chiết xuất apigenin
từ Cúc hoa vàng. ......................................................................................................... 35

3.4.2. Về ý nghĩa của việc kết hợp dung môi eutectic và enzym β-glucosidase đậu
nành trong chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng. ....................................................... 36
3.4.3. Về kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quy
trình chiết xuất apigenin từ Cúc hoa vàng .................................................................. 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

41


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

DES

Deep eutectic solvent

Dung môi eutectic

HBD

Hydrogen bond donor

Chất cho liên kết hydro

HBA

Hydrogen bond acceptor

Chất nhận liên kết hydro

ANOVA

Analysis of variance

Phân tích phương sai

XO

Xanthine oxidase

Xanthin oxidase

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MAE

Microwave-assisted extraction

Chiết xuất có sự hỗ trợ của vi
sóng

RDE

Rutin degrading enzyme

Enzym thủy phân rutin

OFAT

One factor at a time

Phương pháp thay đổi một yếu
tố

RSM

Response surface methodology

Phương pháp bề mặt đáp ứng

Glc

Glucose

Glucose

Rha

Rhamnose

Rhamnose

Glu

Gluconic acid

Acid gluconic

Gal

Galactose

Galactose

Ac

Acetyl

Acetyl

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

STT

Số thứ tự

TB

Trung bình


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong Cúc hoa vàng

4

Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

16

Bảng 2.2. Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

17

Bảng 3.1. Kết quả mã hóa biến đầu vào

28

Bảng 3.2. Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm

29

Bảng 3.3. Kết quả phân tích ANOVA hàm lượng apigenin trong dịch chiết Cúc hoa vàng
(mg/g)

32

Bảng 3.4. Một số thông số thống kê đánh giá chất lượng mơ hình

33

Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra khả năng dự đốn của mơ hình ở điều kiện tối ưu

35


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Khung cấu trúc flavonoid có trong dược liệu Cúc hoa vàng

4

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các dẫn chất apigenin có trong Cúc hoa vàng.

7

Hình 1.3. Một số cơ chất của enzym β-Glucosidase

13

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

19

Hình 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết xuất

24

Hình 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết xuất

25

Hình 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH của dịch chiết đậu nành

26

Hình 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dịch chiết đậu nành

27

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng apigenin trong dịch chiết Cúc
hoa vàng vào các điều kiện chiết xuất

31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cụm hoa của cây Cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.) là một trong những

dược liệu phổ biến, được sử dụng để chữa các bệnh về mắt, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt,
đinh nhọt và hỗ trợ điều trị các bệnh lý như tăng huyết áp, bệnh gút, béo phì [2], [4], [10].
Nhiều tác dụng của dược liệu này cũng đã được chứng minh trên các mơ hình dược lý như
chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn hay bảo vệ gan [14]. Một trong những tác dụng
nổi bật của Cúc hoa vàng được nghiên cứu nhiều là khả năng ức chế enzym xanthin oxidase
(XO) [8], [35], [39], [50]. Xanthin oxidase là enzym xúc tác q trình oxy hóa xanthin tạo
thành acid uric trong cơ thể. Ức chế hoạt động của enzym này sẽ làm giảm nồng độ acid
uric máu, từ đó giúp phịng ngừa hoặc điều trị bệnh gút [35]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng,
thành phần hóa học chính liên quan đến tác dụng ức chế XO của Cúc hoa vàng là các hợp
chất flavonoid, trong đó, nổi bật là apigenin [50]. Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất
flavonoid nói chung và apigenin nói riêng từ dược liệu Cúc hoa vàng để nghiên cứu và phát
triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gút theo cơ chế ức chế enzym xanthin oxidase là cần
thiết.
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về chiết xuất apigenin từ dược liệu đã
tăng lên đáng kể. Trong phần lớn các nghiên cứu này, các dung môi hữu cơ thông thường
như methanol, ethanol, hexan vẫn là dung mơi chính được sử dụng. Mặc dù có hiệu quả
chiết xuất cao do khả năng hịa tan chọn lọc nhưng những dung mơi này vẫn còn tồn tại
một số nhược điểm như dễ cháy nổ, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng tới sức khỏe
con người [41]. Do đó, việc nghiên cứu sử dụng dung mơi xanh để chiết xuất các hợp chất
có hoạt tính sinh học từ dược liệu nói chung và apigenin từ Cúc hoa vàng nói riêng nhằm
giảm thiểu những ảnh hưởng đối với môi trường và sức khỏe con người đang ngày càng
được quan tâm [51].
Trong một nghiên cứu tiến hành năm 2022, tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự đã
tiến hành ứng dụng dung môi eutectic (DES) để chiết xuất apigenin và luteolin từ Cúc hoa
vàng [13]. Đây được coi là hệ dung môi xanh thế hệ mới, không độc hại, thân thiện với môi
trường, với hiệu quả chiết xuất cao hơn dung môi hữu cơ thông thường. Để tiếp tục hồn
thiện quy trình chiết xuất trên, đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất
apigenin từ Cúc hoa vàng sử dụng dung môi eutectic” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân tạo thành apigenin từ
dịch chiết Cúc hoa vàng.

1


2. Tối ưu hóa q trình q trình thủy phân tạo thành apigenin từ dịch chiết Cúc
hoa vàng.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Cúc hoa vàng
1.1.1. Thơng tin chung
Cúc hoa vàng có tên khoa học: Chrysanthemum indicum L. thuộc họ Cúc
(Asteraceae) [1], [3]. Tên đồng nghĩa là Dendranthema indicum (L.) Des Moul. [5].
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009, cây Cúc hoa vàng thuộc chi Cúc
(Chrysanthemum), họ Cúc (Asteraceae), bộ Cúc (Asterales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida),
ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), giới Thực vật (Plantae) [7].
Về đặc điểm thực vật, Cúc hoa vàng là cây thân thảo, sống lâu năm, cao khoảng 0,25
- 1m. Thân rễ ngắn, bò trên mặt đất. Thân mọc thẳng, phân nhánh, có lơng thưa. Những lá
phía dưới khơ héo vào thời kỳ cây ra hoa. Lá giữa thân có cuống dài 0,5 - 2cm; phiến lá
hình trứng, trứng dài hoặc elip - trứng: có lơng thưa; mặt dưới có nhiều lơng hơn mặt trên,
lá chẻ lơng chim, mỗi bên có 3 - 4 thùy, thùy tận cùng lớn nhất, mép có răng cưa, chóp lá
tù, góc lá hình nêm. Cụm hoa đầu, đường kính khoảng 1 - 1,5cm, tỏa trịn, màu vàng, cuống
dài khoảng 1 - 5cm, có lơng dày đặc. Trong cụm hoa, hoa ở viền có dạng lưỡi, nhiều hàng,
lưỡi có hình elip thn dài, chóp ngun hoặc có 2 - 3 thùy, hoa ở trong dạng ống, dài 3 5mm, nửa dưới của ống hẹp, nửa trên hình chng, chóp có 5 thùy bằng nhau. Lá hoa xếp
thành 4 - 5 vịng, có lơng, mép khơ, màu nâu, chóp tù hoặc trịn; những lá hoa bên ngồi
nhỏ hơn, hình trứng, dài 2 - 3mm; những lá hoa ở giữa và ở trong cùng hình trứng dài 3 5mm [1], [2], [4], [5].
Cúc hoa vàng có nguồn gốc từ các quốc gia Đông Á như Trung Quốc, Nhật Bản,
Việt Nam [1]. Tại Việt Nam, cây được trồng rộng rãi ở các tỉnh miền núi, trung du, đồng
bằng Bắc Bộ, miền Trung, Tây Nguyên và đồng bằng Nam Bộ [5]. Ở miền Bắc, Cúc hoa

vàng được trồng nhiều nhất ở làng Nghĩa Trai (Hưng Yên), Nhật Tân (Hà Nội) và Tế Tiêu
(Hà Tây) [6].
Dược liệu Cúc hoa vàng là cụm hoa đã chế biến và phơi hay sấy khô của cây Cúc
hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.), họ Cúc (Asteraceae).
1.1.2. Thành phần hóa học
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành và xác định được thành phần của dược liệu Cúc
hoa vàng bao gồm flavonoid, terpenoid, acid phenolic, phenylpropanoid, polyacetylen và
một số hợp chất khác. Flavonoid là một trong những thành phần quan trọng chiếm tỷ lệ khá
3


cao so với các thành phần còn lại. Hiện tại có 38 hợp chất flavonoid và 4 hợp chất
dihydroflavonoid đã được tìm thấy trong dược liệu Cúc hoa vàng [14], [96]. Trong số đó,
apigenin là một trong số các flavonoid chính và quan trọng nhất có trong Cúc hoa vàng với
các tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, ức chế xanthin oxidase, hạ acid
uric máu [9], [12], [25]. Khung cấu trúc của các flavonoid trong dược liệu Cúc hoa vàng
được trình bày ở hình 1.1.

Hình 1.1. Khung cấu trúc flavonoid có trong dược liệu Cúc hoa vàng
Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong Cúc hoa vàng được trình bày
trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong Cúc hoa vàng [14]
STT

Tên chất

R3

R6

R7

R8

R’

1

Acacetin

H

H

OH

H

4’-OCH3

2

Acacetin-7-O-β-Dglucopyranosid

H

H

Glc-O

H

4’-OCH3

3

Acacetin-7-Orutionsid

H

H

Rha-Glc-O

H

4’-OCH3

4

Acacetin-7-O-(6”-Oacetyl)- β-Dglucopyranosid

H

H

AcO-6-Glc-O

H

4’-OCH3

5

Acacetin-7-O-β-Dgalactopyranosid

H

H

Gal-O

H

4’-OCH3

6

Acacinin-7-O-αrhamnoglycosyl

H

H

Rha-Glc-O

H

4’-OCH3

4


STT

Tên chất

R3

R6

R7

R8

R’

H

4’-OCH3

(16)-β -D-glucoside

7

Acacetin-7-O-(6”-αL-rhamnosyl)sophorosid

H

H

8

Acacinin-7-O-αrhamnosel (16)-[2O-acetyl-β-Dglucosyl (12)-β -Dglucosid

H

H

AcO-6-Glc(Rha)-Glc-O

H

4’-OCH3

9

Apigenin

H

H

OH

H

4’-OH

10

Apigenin-7-Oglucosid

H

H

Glc-O

H

4’-OH

11

Apigenin-7-Orutinosid

H

H

Rha-Glc-O

H

4’-OH

12

Diosmetin

H

H

OH

H

13

Diosmetin-7-Oglucosid

H

H

Glc-O

H

14

Diosmetin-7-Oglucuronid

H

H

GluC-O

H

15

Eupatilin

H

OCH3

OH

H

16

(2S)-Hesperetin

H

H

OH

H

17

(2S)-Hesperetin-7-Oβ-D-glucuronid

H

GluC-O

H

18

Linarin

H

OH

Rha-Glc-O

H

4’-OCH3

19

Luteolin

H

H

OH

H

3’,4’-OH

Glc-(Rha)Glc-O

5

3’-OH,
4’-OCH3
3’-OH,
4’-OCH3
3’-OH,
4’-OCH3
3’,4’-OCH3
3’-OH,
4’-OCH3
3’-OH,
4’-OCH3


STT

Tên chất

R3

R6

R7

R8

R’

20

Luteolin-7-Oglucosid

H

H

Glc-O

H

3’,4’-OH

21

Luteolin-7-Oglucuronid

H

H

Glc-O

H

3’,4’-OH

22

Luteolin-7-O-(6’’-Oacetyl)glucopyranosid

H

H

OAc-6-Glc-O

H

3’,4’-OH

23

Tricin

H

H

OH

H

24

5,3’,4’-trihydroxy6,7-dimethoxy Flavon

H

OCH3

OCH3

H

3’,4’-OH

25

5,4’-dihydroxy-7methoxy Flavonoids

H

H

OCH3

H

4’-OH

26

5-Hydroxy-4’, 7methoxy Flavonoids

H

H

OCH3

H

4’-OCH3

27

5,6,7-trihydroxy-3’,
4’,5’-trimethoxy
Flavon

H

OH

OH

H

3’,4’,5’OCH3

28

5,7,3’,4’
tetrahydroxy-6,5’dimethoxy Flavon

H

OCH3

OH

H

29

5-hydroxy-7,8,3’,4’etramethoxy Flavon

H

H

OCH3

OCH3

3’,4’-OH

30

Kaempferol

OH

H

H

H

4’-OH

31

Kaempferol-7-O-β-Dglucosyl (16)-Lrhamnosid

OH

H

Glc-Rha-O

H

4’-OH

32

Quercetin

OH

H

H

H

3’,4’-OH

33

Quercetin 7-O-β-Dglucosid

OH

H

H

H

3’,4’-OH

6

4’-OH,
3’,5’-OCH3

3’,4’-OH,
5’-OCH3

STT

Tên chất

R3

R6

R7

R8

R’

34

Quercetin 3,7-di-O-βD-glucopyranosid

GlcO

H

H

H

3’,4’-OH

35

Sudachitin

H

OCH3

OCH3

OCH3

36

Isoquercitrin

GlcO

H

H

H

37

Isorhamnetin

OH

H

H

H

38

Isorhamnetin-3-O-bβ-glucosid

GlcO

H

H

H

4’-OH,
3’-OCH3
3’,4’-OH
4’-OH,
3’-OCH3
4’-OH,
3’-OCH3

Theo nghiên cứu của tác giả Yanhao Shao và cộng sự, Hisashi Matsuda và cộng sự,
trong Cúc hoa vàng, apigenin tồn tại dưới dạng là apigenin, apigenin-7-O-glucosid và
apigenin-7-O-rutinosid [17], [18]. Cấu trúc hóa học của các dẫn chất apigenin có trong Cúc
hoa vàng được trình bày ở hình 1.2.

Apigenin

Apigenin-7-O-glucosid

Apigenin-7-O-rutinosid
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các dẫn chất apigenin có trong Cúc hoa vàng.
7


1.2. Tổng quan các quy trình chiết xuất flavonoid từ Cúc hoa vàng
Khơng có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid do các flavonoid
có cấu trúc phức tạp dẫn đến chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung
môi hữu cơ. Các flavonoid dạng glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực, các
flavonoid dạng aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực [23].
Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các chất thân dầu
bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp
cloroform và ethanol. Ethanol ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần
lớn các flavonoid. Hỗn hợp cloroform và ethanol hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy
flavonoid. Các chất anthocyanin thường kém bền vững, nhất là các acyl anthocyanin được
acyl hoá với các acid aliphatic, do đó người ta thường chiết bằng methanol với sự có mặt
của các acid yếu như acid acetic, tartric hoặc citric thay vì acid chlohydric. Có nghiên cứu
đã sử dụng một lượng nhỏ acid mạnh dễ bay hơi là trifluoroacetic acid (0,5-3%) để chiết
các polyacylanthocyanin phức tạp vì acid này dễ bay hơi trong quá trình làm đậm đặc. Cũng
có thể tách flavonoid bằng cách tạo kết tủa với muối chì. Sau khi thu tủa người ta tách chì
bằng cách sục dihydrosulfid thì flavonoid được giải phóng [31], [37], [91].
Nước và một số dung môi hữu cơ như methanol, ethanol và ethyl acetat thường hay
được sử dụng để chiết xuất flavonoid. Tuy nhiên, việc sử dụng các dung môi này đòi hỏi
nhiều bước xử lý và yêu cầu điều kiện nhiệt độ cao. Hơn nữa, các phương pháp chiết xuất
hiện tại địi hỏi một lượng lớn dung mơi hữu cơ và tốn rất nhiều thời gian để thực hiện q
trình chiết xuất. Các dung mơi hữu cơ cũng có thể gây ion hóa, thủy phân, oxy hóa và bất
hoạt flavonoid [19]. Bên cạnh đó, nước có nhược điểm là khả năng chiết xuất các hợp chất

ít phân cực kém, trong khi đó, các dung mơi hữu cơ lại gây ô nhiễm môi trường, dễ cháy
nổ và ảnh hưởng đến sức khỏe của con người [24].
Vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm các dung mơi mới nhằm khắc phục những nhược
điểm của nước và dung môi hữu cơ để chiết xuất flavonoid từ dược liệu nói chung hay
apigenin từ Cúc hoa vàng nói riêng là cần thiết.
1.2.1. Quy trình của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự
Với những đặc tính như: an tồn, thân thiện với mơi trường, dễ phân hủy, dễ điều
chế, chi phí thấp, hiệu suất cao, dung môi eutectic (DES) đang ngày càng được ứng dụng
rộng rãi như một giải pháp thay thế xanh hiệu quả cho các dung môi hữu cơ thông thường
để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học [13], [23]. Hệ dung môi eutectic được điều
8


chế bằng cách trộn hai hoặc nhiều chất (trong đó ít nhất 1 chất ở trạng thái rắn) để tạo thành
một hỗn hợp có điểm nóng chảy thấp hơn so với nhiệt độ nóng chảy của các chất thành
phần [93], [94]. Hệ dung môi eutectic tồn tại ở dạng lỏng ở nhiệt độ thấp hơn 150°C, tuy
nhiên trong khoảng nhiệt độ phòng đến 70°C, hầu hết DES đã đạt trạng thái dung dịch lỏng
đồng nhất [94]. Ví dụ: Cholin chlorid và ure có nhiệt độ nóng chảy lần lượt là 302°C và
133°C. Hệ DES được tạo nên tử cholin chlorid và ure với tỉ lệ 1:2 có nhiệt độ nóng chảy là
12°C [95].
Một hệ DES bao gồm 2 thành phần: chất cho liên kết hydro (HBD - Hydrogen bond
donor) và chất nhận liên kết hydro (HBA - Hydrogen bond acceptor). Các thành phần này
không tác dụng với nhau, không tác dụng với nước mà tương tác với nhau thông qua các
liên kết hydro [93], [95]. Hệ dung mơi euctectic có thể được điều chế theo một trong 4
phương pháp: gia nhiệt, đông khô, chưng cất dưới áp suất thấp và nghiền. Trong đó, gia
nhiệt là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện và có thể ứng dụng ở quy mơ phịng thí
nghiệm cũng như quy mơ cơng nghiệp.
Như đã đề cập ở trên, mặc dù nước và dung môi hữu cơ hiện nay được sử dụng rộng
rãi để chiết xuất dược liệu nhưng chúng đều có những nhược điểm nhất định. Nước chỉ có
khả năng chiết xuất hiệu quả những hợp chất phân cực. Ngược lại, dung môi hữu cơ tuy có

khả năng chiết xuất tốt hơn nước nhưng lại dễ bay hơi, khả năng phân hủy sinh học kém và
tác động xấu tới môi trường cũng như sức khỏe con người [24]. Dung môi eutectic - DES
được coi là một loại “dung mơi xanh” mới có thể thay thế nước và dung mơi hữu cơ trong
q trình chiết xuất với nhiều ưu điểm nổi bật. DES có khả năng chiết được nhiều loại hợp
chất trong dược liệu như các hợp chất phenolic, polysaccharid, protein, terpenoid... Áp suất
hơi bão hịa thấp sẽ giúp giảm hao hụt lượng dung mơi eutectic trong q trình chiết xuất.
Ngồi ra DES cịn có khả năng phân hủy sinh học nên an tồn, ít gây cháy nổ và thân thiện
với môi trường [93], [95].
Trong một nghiên cứu năm 2022, tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự đã tiến hành
sàng lọc trên 119 dung mơi eutectic, từ đó lựa chọn được hệ dung mơi phù hợp nhất để chiết
xuất apigenin và luteolin từ Cúc hoa vàng [13]. Nghiên cứu cũng đã xác định được các điều
kiện chiết xuất tối ưu bao gồm thời gian chiết xuất là 65 phút, nhiệt độ chiết xuất là 90°C
và hàm lượng nước là 20%. Lượng apigenin chiết được ở điều kiện tối ưu là 0,5 mg/g. Bằng
sự kết hợp giữa phương pháp chưng cất và sử dụng phản dung mơi, apigenin có thể được
thu hồi một cách hiệu quả từ dịch chiết eutectic với tỷ lệ thu hồi trên 80%.

9


1.2.2. Quy trình của tác giả Na Guo và cộng sự
Chiết xuất các hợp chất tự nhiên với sự hỗ trợ của sóng siêu âm đang ngày càng trở
nên phổ biến và được được áp dụng rộng rãi trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên với
nhiều ưu điểm khác nhau. Năm 2020, Na Guo và cộng sự đã sử dụng phương pháp chiết
xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm kết hợp với dung môi eutectic (cholin chlorid - ethylen
glycol, tỷ lệ 1:2) để chiết xuất linarin từ Cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.) [92].
Kết quả cho thấy rằng, lượng linarin thu được từ phương pháp này cao hơn 1,21 lần so với
phương pháp chiết xuất thông thường sử dụng dung mơi ethanol 80%.
1.2.3. Quy trình của tác giả Leqin Ke và cộng sự
Năng lượng vi sóng dưới dạng bức xạ khơng ion hóa có tần số từ 300 đến 300.000
MHz và có thể tạo ra nguồn nhiệt phân bố theo thể tích, do đó có thể ứng dụng trong chiết

xuất các hợp chất tự nhiên. Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted
extraction - MAE) từ lâu đã được áp dụng rộng rãi do có thể tiết kiệm thời gian một cách
đáng kể, lượng dung mơi cũng như chi phí năng lượng u cầu thấp [20], [21], [34]. Phương
pháp này cũng đã được tác giả Leqin Ke và cộng sự nghiên cứu để chiết xuất flavonoid từ
Cúc hoa vàng vào năm 2016 [21]. Kết quả cho thấy các điều kiện chiết xuất tối ưu được
xác định bao gồm: tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 25:1 (mL:g); thời gian chiết xuất 19 phút;
cơng suất vi sóng 582 W. Tại điều kiện này, tổng lượng flavonoid chiết được là
11,21 ± 1,12 %, cao hơn 53,21 % so với phương pháp ngâm nóng.
1.3. Phương pháp thủy phân flavonoid glycosid
1.3.1. Các phương pháp thủy phân flavonoid glycosid
Phần lớn flavonoid trong Cúc hoa vàng nói chung và apigenin nói riêng đều tồn tại
chủ yếu dưới dạng glycosid. Tuy nhiên, các glycosid lại có nhược điểm là sinh khả dụng
thấp do tính phân cực cao và khả năng hấp thu kém trong cơ thể người. Do đó, để tăng sinh
khả dụng, những glycosid này nên được thủy phân thành các aglycon tương ứng. Bên cạnh
đó, để đơn giản hóa quy trình định lượng và tránh sai số, flavonoid glycosid thường được
thủy phân thành các aglycon nhằm làm giảm nhiễu cực đại trong q trình phân tích. Ngồi
ra, nghiên cứu của tác giả de Araújo ME và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng việc loại bỏ gốc
đường còn giúp làm tăng khả năng chống oxy hóa của dịch chiết flavonoid [30].
Về mặt lý thuyết, quá trình thủy phân có thể được thực hiện với xúc tác là các acid
vô cơ mạnh với nồng độ 1 - 2 M [28], [33], [36]. Tuy nhiên, các loại flavonoid khác nhau

10


đòi hỏi các điều kiện thủy phân khác nhau [28], [32]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng đã
chỉ ra quy trình thủy phân cần được tối ưu hóa riêng cho từng loại dược liệu [33]. Nói cách
khác, khơng có quy trình chung cho quá trình thủy phân flavonoid glycosid bằng acid.
Bên cạnh sử dụng acid, enzym cũng là một tác nhân phổ biến để chuyển hóa
flavonoid dạng glycosid thành aglycon. Quá trình thủy phân bằng enzym thường diễn ra
trong môi trường nước. Các điều kiện phản ứng (nhiệt độ, thời gian phản ứng, pH, v.v.)

tương ứng với trạng thái hoạt động tối ưu là đặc trưng cho từng enzym. Phản ứng giữa
enzym và cơ chất của nó rất đặc hiệu. Mỗi enzym có một tính đặc hiệu nhất định đối với
từng cơ chất của nó, giống như ổ khóa và chìa khóa. Do đó, việc lựa chọn loại enzym nào
để thủy phân sẽ phụ thuộc rất nhiều vào bản chất của nguyên liệu cần thủy phân và tính
chất của enzym. Bên cạnh đó, cũng có thể sử dụng kết hợp nhiều enzym để tăng hiệu quả
mong muốn. Tuy nhiên, khi sử dụng enzym, phản ứng phải được dừng lại đúng lúc để tránh
các phản ứng theo tầng quá mức làm biến tính sản phẩm mong muốn [67].
Để thủy phân gốc đường trong phân tử glycosid có thể sử dụng các enzym thuộc
nhóm hydrolase. Một số enzym phù hợp cho q trình thủy phân flavonoid có thể thu được
từ các nguồn tự nhiên. Ví dụ như β-glucosidase được dùng để deglycosyl hóa flavonoid từ
chiết xuất vỏ kén Sasamayu [42] và vỏ cây liễu [43]. Ngoài ra, naringinase, một hỗn hợp
của α-L-rhamnosidase và β-D-glucosidase cũng đã được sử dụng để thủy phân các dẫn xuất
glycosid của flavanol trong dịch chiết hoa Dạ yên thảo [44]; tuy nhiên, hỗn hợp enzym này
không được ứng dụng thương mại hóa. Các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng việc xử lý
dịch chiết bằng enzym thích hợp có thể làm tăng hàm lượng của các thành phần có hoạt
tính sinh học, từ đó cải thiện tỷ lệ hấp thu và hiệu quả khi đưa vào cơ thể.
1.3.2. Phương pháp sử dụng enzym trong dung môi eutectic
Hiện nay, xu hướng chiết xuất đang tập trung vào những quy trình xanh, thân thiện
với mơi trường, có thể điều chỉnh dung môi dễ dàng, cũng như yêu cầu lượng năng lượng
thấp [57], [60]. Dung môi Eutectic (DES) là loại dung môi xanh và bền vững đầy tiềm năng
có thể đáp ứng các yêu cầu trên [58]. DES có các tính chất vật lý và khả năng hịa tan tốt
tương tự chất lỏng ion và các dung môi hữu cơ truyền thống song an toàn, áp suất hơi bão
hịa thấp cũng như thân thiện với mơi trường [59, 61, 62]. Cho đến nay, DES đã được sử
dụng thành cơng để chiết xuất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật, trong đó có
flavonoid [13], [64].

11


Tuy nhiên, DES có một nhược điểm lớn nhất là độ nhớt cao. Trong các nghiên cứu

trước đây, DES thường được trộn với nước để giảm độ nhớt, song điều này lại làm giàm
khả năng thẩm thấu vào tế bào thực vật của DES, ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất. Nhiều
nghiên cứu đã được thực hiện để nâng cao hiệu suất chiết xuất bằng cách sử dụng dung môi
DES kết hợp với các kỹ thuật chiết xuất khác nhau. Trong đó, việc kết hợp sử dung mơi
DES và enzym đang ngày được quan tâm nghiên cứu vì hiệu quả của cũng tính chất “xanh”
của nó.
Một nghiên cứu năm 2020 của tác giả Yuan-Yuan Zang và cộng sự đã sử dụng dung
mơi eutectic để chiết xuất rutin từ nụ hịe (Sophora japonica L.), sau đó thủy phân thành
quercetin bằng enzym thủy phân rutin (RDE) thu được từ hạt mạch đắng (Fagopyrum
tataricum) nảy mầm [63]. Nghiên cứu đã cho thấy, DES có khả năng khắc phục được những
hạn chế của các dung mơi hữu cơ với các đặc tính an tồn, không độc hại và không ảnh
hưởng tới môi trường. Bên cạnh đó, sử dụng enzym - chất xúc tác sinh học thay vì acid
chlohydric hoặc acid sunfuric cũng giúp thu được thành phần hoạt tính mục tiêu với năng
suất cao và sản phẩm phụ thấp do tính đặc hiệu của nó. Ngồi ra, quy trình cũng đơn giản
hơn và thời gian cần thiết được rút ngắn đáng kể. Sau khi tối ưu hóa cả hai bước, tỷ lệ thủy
phân rutin lên tới 8,36 mg.min−1·L−1.
1.4. Tổng quan về enzym 𝛃-glucosidase
β-glucosidase (glucohydrolase, E.C. 3.2.1.21) là các enzym thủy phân các liên kết
glycosid để giải phóng gốc glucosyl cuối cùng của phân tử glycosid và oligosaccharid. Dựa
trên trình tự acid amin, β-glucosidase được phân nhóm thành các họ glycosid hydrolase
(GH) bao gồm GH1, GH3, GH5, GH9 và GH30.
Về cơ chế tác dụng, β-glucosidase có khả năng phân tách liên kết β-glycosid giữa
hai hoặc nhiều phân tử glucose hoặc giữa phần đường và phần không phải đường (aglycon).
Trong hầu hết các trường hợp, quá trình thủy phân liên kết glycosid là quá trình thuận
nghịch. Nói cách khác, β-glucosidase có thể xúc tác cả 2 q trình: glycosyl hóa và
deglycosyl hóa [65], [72]. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các β-glucosidase tự nhiên trong
các mơ thực vật chính là tác nhân chính trong việc thủy phân các glycosid thành aglycon
tương ứng [65].

12

Hình 1.3. Một số cơ chất của enzym β-Glucosidase [65]
13


β-glucosidase có mặt trong tất cả các loại sinh vật bao gồm vi khuẩn, vi khuẩn cổ,
sinh vật nhân chuẩn, và đóng một số vai trị quan trọng trong nhiều quá trình như chuyển
đổi sinh khối ở vi sinh vật, phân hủy glycolipid, tham gia bảo vệ chống lại sâu bệnh, kích
hoạt phytohormon, dị hóa thành tế bào trong thực vật và tham gia vào cả tương tác thực vật
- vi khuẩn và thực vật - côn trùng [65]. Trong ngành công nghiệp hương liệu, β-glucosidase
là enzym chủ chốt trong q trình giải phóng các hợp chất thơm có trong trái cây và các
sản phẩm lên men từ tiền chất glucosid [66]. β-glucosidase cũng có thể thủy phân các
anthocyanin và các flavonoid glycosid khác thành các aglycon tương ứng [68]. Một số
nghiên cứu đã ứng dụng thành công β-glucosidase deglycosyl hóa flavonoid từ cao chiết
vỏ kén Sasamayu [69] và vỏ cây liễu [71]. Ngoài ra, naringinase, một hỗn hợp của α-Lrhamnosidase và β-D-glucosidase cũng đã được sử dụng để thủy phân flavanol và flavonol
glycosid từ cao chiết hoa Dạ yên thảo [44].
β-glucosidase hiện nay có thể được sản xuất từ một số loài vi sinh vật bằng
phương pháp lên men [81], [82]. Tuy nhiên, phương pháp này gặp nhiều khó khăn, chủ yếu
do hoạt tính enzym trong vi sinh vật còn thấp nên thời gian thủy phân lâu, dễ nhiễm tạp và
dễ bị ức chế bởi nồng độ glucose cao [83], [84]. Trong một nghiên cứu khác, tác giả Janbon
G và cộng sự đã tiến hành sản xuất β-glucosidase từ chủng nấm Candida molischiana đột
biến. Nghiên cứu cho thấy lượng enzym thu được từ chủng nấm đột biến này cao gấp 35 so
với chủng nấm bình thường [85]. Tuy nhiên, phương pháp này còn một số hạn chế, do khả
năng tạo β-glucosidase của chủng nấm Candida molischiana còn phụ thuộc vào rất nhiều
yếu tố khác nhau như: loại cơ chất, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ … để thu được lượng
sinh khối tối ưu [86]. Một trong những nguồn β-glucosidase thay thế đang được quan tâm
hiện nay là từ các thực vật như đậu nành, hạt hạnh nhân, hạt mơ, lá chè… [87], [88].
Trong một nghiên cứu năm 2013, tác giả Luciana C. Grade và cộng sự đã sử dụng
β-glucosidase để đánh giá sự thủy phân các isoflavon β-glycosid thành aglycon tương ứng

[74]. Trong đó, β-glucosidase thu được từ giống đậu nành BRS 213 và được cố định trong
hạt chitosan hoạt hóa với 2,5% glutaraldehyd, sau đó được ủ với 1mL chế phẩm nước đậu
nành từ 0 đến 60 phút, pH 5,5 và ở 50 °C. Hàm lượng isoflavon được xác định bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả cho thấy hàm lượng ban đầu của aglycon
trong chế phẩm là 32,20 µg.mL-1. Sau 60 phút xử lý, hàm lượng aglycon tăng lên 24%. Như
vậy có thể thấy, β-glucosidase được điều chế từ giống đậu nành BRS 213 có khả năng thủy
phân các flavonoid glycosid thành các aglycon mong muốn, từ đó làm tăng hàm lượng
aglycon lên gấp nhiều lần so với chế phẩm ban đầu. Nghiên cứu của tác giả R.F. Santos và
14


cộng sự cũng đã chỉ ra β-glucosidase có trong đậu nành có hoạt tính cao nhất ở pH 5,0 và
nhiệt độ 45oC, và ổn định trong tối đa 4 ngày ở 25oC [73].

15


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là dược liệu Cúc hoa vàng được thu hái vào tháng 3 năm
2022 tại làng Nghĩa Trai, xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên. Dược liệu sau
khi thu hái được phơi khơ, để nơi khơ ráo thống mát. s
Nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ hạt Đậu nành được thu hái vào tháng 6 năm 2022
tại bãi Quỹ, xã Thành Lợi, huyện Vụ Bản, tỉnh Nam Định. Dược liệu sau thu hái được tách
hạt, phơi khô và bảo quản nơi khô ráo thống mát.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị

2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên hóa chất

Nguồn gốc

STT

Tên hóa chất

Nguồn gốc

1

Methanol (HPLC)

Mỹ

6

Cholin chlorid

Trung Quốc

2

Acetonitril (HPLC)

Mỹ

7

Propylen glycol

Trung Quốc

3

Ethyl acetat

Trung Quốc

8

Acid citric

Trung Quốc

4

Acid Phosphoric

Trung Quốc

9

Natri chlorid

Trung Quốc

5

Methanol (dung
môi)

Việt Nam

10

Nước cất

Việt Nam

2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.2.

16


Bảng 2.2. Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
STT

Dụng cụ, thiết bị

Nguồn gốc

1

Cân phân tích Precisa (độ chính xác 0,1mg)

Thụy Sĩ

2

Cân kỹ thuật Sartorius TE 3102S (độ chính xác
0,01g)

3

Máy xác định hàm ẩm Ohaus

4

Tủ sấy Menmert

Đức

5

Máy siêu âm Sonic vibra cell

Mỹ

6

Máy đo pH

7

Bể cách thủy điều nhiệt Memmert

8

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu:
gồm: bơm LC-20AD, detector DAD SPD-M20A,
hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20C, bộ phận điều
nhiệt CTO-20A; cột sắc ký Phenomenex C18 (kích
thước 250mm x 4,6mm; kích thước hạt 5µm).

9

Màng lọc 0,45µm

Trung Quốc

10

Pipet pauster, pipet chính xác 1ml, 2ml, 5ml, 10ml.

Trung Quốc

11

Bình gạn 150ml

Việt Nam

12

Phễu

Việt Nam

13

Ống đong

Việt Nam

14

Ống nghiệm

Việt Nam

15

Cốc có mỏ

Việt Nam

16

Quả bóp cao su

Việt Nam

Đức
Trung Quốc

Nhật Bản
Đức

17

Nhật Bản