0032 ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong kiểm soát chất lượng dược liệu ngô thù du (fructus evodiae) lưu hành trên thị trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ XUÂN ĐÀO

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO TRONG KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG
DƯỢC LIỆU NGÔ THÙ DU (FRUCTUS EVODIAE)
LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

CẦN THƠ – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ XUÂN ĐÀO

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO TRONG KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG
DƯỢC LIỆU NGÔ THÙ DU (FRUCTUS EVODIAE)
LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN

CẦN THƠ – 2015


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô Ts. Nguyễn Thị Ngọc

Vân, liên bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, trường Đại học
Y Dược Cần Thơ, người đã giúp đỡ, hướng dẫn tận tình và chia sẻ những kinh
nghiệm, kiến thức vô giá cho em.
Em xin cảm ơn các quý thầy cơ tại liên bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm
nghiệm – Độc chất, thầy Ts. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, thầy Ths. Lữ Thiện

Phúc, cô Ds. Nguyễn Thị Tường Vi, cô Trần Thị Thanh Thúy đã tạo điều kiện
cho em hồn thành nghiên cứu này.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn đến quý thầy cô tại bộ môn Dược liệu đặc
biệt là cô Ths. Nguyễn Ngọc Quỳnh đã tạo điều kiện giúp em thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn đến các anh chị khóa 35 đặc biệt là chị Nguyễn
Dư Quỳnh Như đã chia sẻ những kinh nghiệm và các bạn làm cùng bộ mơn

Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất đã quan tâm và giúp đỡ mình.
Cảm ơn ba mẹ và gia đình đã ln ở bên con, động viên tinh thần để con
an tâm làm đề tài.


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả trong quyển luận văn này là trung thực, hồn
tồn của riêng tơi và chưa được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào.
Cần Thơ, ngày 11 tháng 06 năm 2015

Nguyễn Thị Xuân Đào


i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN

Trang

MỤC LỤC…………………………………………………………………….i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................iii
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ SƠ ĐỒ.............................................................. v
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Tổng quan về thực vật học cây Ngơ thù du ............................................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại.................................................................................. 3
1.1.2. Họ Rutaceae ..................................................................................... 3

1.1.3. Chi Evodia........................................................................................ 4
1.1.4. Loài Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth et Hook, họ Cam (Rutaceae)
.................................................................................................................... 4
1.1.5. Đặc điểm vi phẫu quả Ngô thù du (Fructus Evodiae) ..................... 6
1.2. Tồng quan về thành phần hóa học của quả Ngô thù du ............................. 7
1.2.1. Tinh dầu ............................................................................................ 7
1.2.2. Limonoid .......................................................................................... 8
1.2.3. Alkaloid ............................................................................................ 8

1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý và công dụng ......................................... 11
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).................................... 12
1.4.1. Ứng dụng HPLC trong định tính dược liệu ................................... 12

1.4.2. Ứng dụng của HPLC trong định lượng dược liệu.......................... 13
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 14

2.2. Dung mơi – hóa chất ................................................................................ 15
2.3. Trang thiết bị ............................................................................................ 15
2.4. Phương pháp thu mẫu .............................................................................. 17
2.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 17
2.5.1. Đánh giá các chỉ tiêu kiểm nghiệm quả Ngô thù du theo DĐVN IV
.................................................................................................................. 17

2.5.2. Xây dựng chỉ tiêu định tính, định lượng các mẫu dược liệu trên
bằng phương pháp HPLC đã được thẩm định .......................................... 19


ii

Chương 3: KẾT QUẢ ..................................................................................... 25
3.1. Đánh giá các chỉ tiêu kiểm nghiệm quả Ngô thù du theo DĐVN IV ...... 25

3.1.1. Đặc điểm cảm quan ........................................................................ 25
3.1.2. Đặc điểm hiển vi ............................................................................ 27
3.1.3. Độ ẩm ............................................................................................. 29
3.1.4. Tạp chất .......................................................................................... 31
3.1.5. Định tính ......................................................................................... 32

3.2. Xây dựng chỉ tiêu định tính, định lượng các mẫu dược liệu trên bằng
phương pháp HPLC đã được thẩm định ......................................................... 34
3.2.1. Định tính ......................................................................................... 34
3.2.2. Định lượng...................................................................................... 35
3.2.3. Mối liên quan giữa tổng hàm lượng evodiamine và rutaecarpine với
hình dạng quả ........................................................................................... 39
Chương 4: BÀN LUẬN .................................................................................. 46
4.1. Đánh giá các chỉ tiêu kiểm nghiệm quả ngô thù du theo DĐVN IV ...... 46
4.1.1 Đặc điểm cảm quan ......................................................................... 46
4.1.2. Đặc điểm hiển vi ............................................................................ 46
4.1.3. Độ ẩm ............................................................................................. 47
4.1.4. Tạp chất .......................................................................................... 47
4.1.5. Định tính………………………………………………………..47
4.2. Xây dựng chỉ tiêu định tính, định lượng các mẫu dược liệu trên bằng
phương pháp HPLC đã được thẩm định ......................................................... 47
4.2.1. Định tính ......................................................................................... 47
4.2.2. Định lượng...................................................................................... 48
4.2.3. Mối liên quan giữa tổng hàm lượng evodiamine và rutaecarpine
với hình dạng quả ..................................................................................... 49
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 53
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
MỤC LỤC


iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT

Chữ tắt, ký hiệu

Chữ nguyên

Ý nghĩa

1

ACN

Acetonitrile

2

DCM

Dichloromethan

3

DĐVN IV

Dược điển Việt
Nam IV

4

HPLC

5

MeOH

Methanol

Dung mơi methanol

6

PDA

Đầu dị dãy diode
quang

7

SKĐ

Photo Diode
Array
Sắc ký đồ

8

tR

Thời gian lưu

9

tt

Thể tích

10

Tp HCM

Thành phố Hồ
Chí Minh

High Performance Sắc ký lỏng hiệu năng
Liquid of
cao
Chromatography


iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin 40 mẫu dược liệu thu mua ............................................. 14
Bảng 3.1. Kết quả đặc điểm cảm quan của 40 mẫu Ngô thù du ..................... 25
Bảng 3.2. Kết quả tìm các cấu tử đặc trưng cho bột quả Ngô thù du……….27
Bảng 3.3. Kết quả độ ẩm của mẫu quả Ngô thù du ....................................... 30
Bảng 3.4. Kết quả % tạp chất của mẫu quả Ngô thù du ................................. 31
Bảng 3.5. Kết quả định tính evodiamine và rutaecarpine trong một số mẫu
tiêu biểu của quả Ngô thù du.......................................................................... 34
Bảng 3.6. Kết quả hàm lượng Evodiamine và Rutaecarpine có trong mẫu Ngô

thù du thuộc kênh bán lẻ ................................................................................. 36
Bảng 3.7. Kết quả hàm lượng Evodiamine và Rutaecarpine có trong mẫu Ngô

thù du thuộc kênh phân phối sỉ và công ty phân phối dược liệu .................... 37
Bảng 3.8. Kết quả tổng hàm lượng hai alkaloid với kích thước quả .............. 39
Bảng 3.9. Kết quả tổng hàm lượng hai alkaloid với độ bung nang quả ......... 41
Bảng 3.10. Các mẫu có tổng hàm lượng cao nhất………………………… ...45


v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Cây Ngơ thù du ................................................................................. 6
Hình 1.2. Quả Ngơ thù du khơ .......................................................................... 6
Hình 2.1. Các thiết bị được sử dụng ............................................................... 16
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ quy trình chiết mẫu .............................................................. 21
Hình 3.1. Mẫu Ngơ thù du thu mua ở tỉnh Trà Vinh (A01)…………………26
Hình 3.2. Mẫu Ngơ thù du từ cơng ty phân phối dược phẩm (B02) ............... 27
Hình 3.3. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học ...................................... 33

Hình 3.4. Kết quả định tính bằng phản ứng Mayer của các mẫu Ngơ thù du. 33
Hình 3.5. Overlay sắc kí đồ các mẫu A03, A04, A18..................................... 35

Hình 3.6. Kết quả kiểm tra độ tương đồng về phổ UV giữa chuẩn và mẫu B01
của evodiamine và rutaecarpine...................................................................... 35

Hình 3.7. Biểu đồ cột biểu diễn tổng hàm lượng hai alkaloid của 40 mẫu thu
mua trên thị trường .......................................................................................... 38
Hình 3.8. Biểu đồ thề hiện mối liên quan giữa tổng hàm lượng hai alkaloid và

kích thước quả Ngơ thù du…………………………………………………..41
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện mối liên quan giữa tổng hàm lượng hai alkaloid và
độ bung nang quả với quả có kích thước nhỏ……………………………….44
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện mối liên quan giữa tổng hàm lượng hai alkaloid
và độ bung nang quả với quả có kích thước lớn……………………………44


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngơ thù du có tên khoa học là Evodia rutaecarpa họ Cam (Rutaceae),
là dược liệu đã được sử dụng từ lâu ở nhiều nước trên thế giới như Trung
Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Việt Nam…để dùng cho một số trường hợp như
viêm nhiễm, sốt nóng, đau bụng, đau đầu, chân tay tê mỏi [1,6]. … Ở nước
ta, cây mọc nhiều ở tỉnh Hà Giang, người dân thường gọi là cây Xà lạp hay
cây Ngơ thù. Hoạt chất chính trong Ngô thù du được chứng minh là hai

alkaloid evodiamine và rutaecarpine với nhiều tác dụng: tham gia cơ chế
kháng viêm tế bào, ức chế tuyến tụy tiết insulin, ức chế chọn lọc men MAO -

B, kháng viêm, chống huyết khối, tác dụng giãn mạch, hạ huyết áp,… Đặc
biệt là tác dụng diệt tế bào ung thư, có hiệu quả trong các trường hợp ung thư
vú, ung thư cổ tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư bạch cầu,… [13, 14,

22].
Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới về nghiên cứu thuốc từ
dược liệu ngoài các yếu tố như hiệu quả lâm sàng, độ an toàn, nghiên cứu về
cơ chế tác dụng thì cần phải có các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng
như các phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu một cách khoa học và

đầy đủ. Chỉ tiêu đánh giá chất lượng của Ngô thù du được quy định trong
Dược Điển Việt Nam IV. Tuy nhiên, phần định tính bằng phản ứng hóa học
và định lượng bằng tinh dầu không phù hợp cho việc đánh giá chất lượng
dược liệu này. Thực tế, việc sử dụng Ngô thù du dựa vào tác dụng dược lý
của hai alkaloid chính là evodiamine và rutaecarpine [12, 19, 24].
Nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu đầu
vào trong sản xuất của quả Ngô thù du, chúng tôi sơ bộ xây dựng dấu vân tay
cho dược liệu dựa trên việc định tính 2 chất đánh dấu (2 markers) evodiamine

và rutaecarpine trong quả Ngô thù du, đồng thời định lượng hai alkaloid này
trong dược liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Ngoài ra, quả


2

Ngô thù du trên thị trường hiện nay chủ yếu nhập từ Trung Quốc theo đường
tiểu ngạch với chất lượng khơng ổn định nên u cầu cần có nghiên cứu đánh
giá chất lượng dược liệu này trên thị trường.Vì vậy,chúng tôi tiến hành đề

tài:
“ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TRONG KIỂM SỐT CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU NGƠ THÙ DU
(FRUCTUS EVODIAE) LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG”
Với hai mục tiêu cụ thể như sau:

1. Đánh giá sơ bộ chất lượng các mẫu dược liệu thu mua trên thị trường dựa
trên các chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu của DĐVN IV.
2. Xây dựng chỉ tiêu định tính,định lượng các mẫu dược liệu trên bằng
phương pháp HPLC.

Ý nghĩa khoa học:

- Kết quả nghiên cứu góp phần cung cấp quy trình phân tích mới , định tính,
định lượng các hoạt chất chính trong Ngơ thù du nhằm góp phần kiểm sốt
chất lượng của dược liệu này.

- Kết quả đề tài sẽ là kênh tham khảo dữ liệu giúp bổ sung vào chuyên luận
dược liệu của DĐVN V.
Ý nghĩa thực tiễn:

1. Là cơ sở tham khảo về mặt pháp lý giúp kiểm định chất lượng đầu vào của
quả Ngô thù du.

2. Là cơ sở để các công ty dược phẩm lựa chọn nguyên liệu đầu vào với chất
lượng ổn định đảm bảo sản phẩm thuốc đáp ứng yêu cầu phòng chữa bệnh
của nhân dân.


3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về thực vật học cây Ngơ thù du
1.1.1. Vị trí phân loại
- Cây Ngơ thù du có tên khoa học là Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth., họ
Cam (Rutaceae).
- Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, lồi Evodia rutaecarpa
(Juss.) Benth. có vị trí phân loại như sau:
Giới Plantae
↓

Ngành Magnoliophyta
↓

Lớp Magnoliopsida
↓

Phân lớp Rosidae
↓

Bộ Rutales
↓

Họ Rutaceae
↓

Chi Evodia
↓

Loài Rutaecarpa
1.1.2. Họ Rutaceae [5]
Ở Việt Nam họ Rutaceae có gần 30 chi: Acronychia,Aegle,Limonia…,
khoảng 110 lồi.Thân của các cây họ Rutaceae thường là cây gỗ to hay nhỏ,
nhiều loại có gai ít khi là cỏ sống dai.
Lá mọc cách,
đơi khi mọc đối,khơng có
lá kèm,thường kép hình lơng chim.Hoa mọc riêng lẻ hoặc tụ thành xim,


4

chùm,ngù,tán.Hoa thường đều,lưỡng tính,mẫu 5,ít khi đơn tính.Đĩa mật
to nằm giữa bộ nhị và bầu.Bao hoa gồm 5 lá đài rời hay dính,5 cánh hoa rời
ít khi là 4.Bộ nhị: 2 kiểu a) Kiểu đảo lưỡng nhị gặp ở Ruta.Kiểu này hay bị
thu hẹp vì vịng ngồi bị trụy,đơi khi còn lại nhị lép,b) Kiểu nhiều nhị của
Citrus: Bắt nguồn từ kiểu đảo lưỡng nhị nhưng số nhị ở đây tăng lên rất nhiều,
các nhị có thể rời hay dính thành nhiều bó hoặc dính thành ống.Màng hạt
phấn có 3- 6 rãnh lỗ.Bộ nhụy: 2 kiểu a) Kiểu Rutoideae: 4 -5 lá nỗn rời ở
bầu,dính nhau ở đáy và vịi nhụy,mỗi lá noãn chứa 2 hay nhiều noãn.Quả là
sự kết hợp của nhiều quả đại; b) Kiểu Aurantioideae: Số lá nỗn nhiều hơn số
lá đài và dính liền nhau tạo thành bầu trên,
gồm nhiều ơ,mỗi ơ có 2 hay nhiều
nỗn,đính noãn trung trụ.Quả loại cam,đây là quả mọng loại đặc biệt.Hạt
đơi khi có nội nhũ,hạt đa phơi ở Citrus.
Họ Rutaceae có 2 phân họ:

- Phân họ Rutoideae: Lá nỗn rời nhau ít nhiều,bộ nhị theo kiểu đảo lưỡng
nhị đầy đủ hoặc giảm,
quả đại.
bộ nhị đa thể,quả loại cam.
- Phân họ Aurantioideae: Lá nỗn dính,

1.1.3. Chi Evodia
Euodia là chi thực vật thuộc họ Rutaceae.Euodia còn được đọc sai khác
đi là evodia.Các lồi thuộc chi Tetradium cũng có thể thuộc về chi Evodia .

Chi Evodia gồm các loài là cây bụi hay cây gỗ nhỏ có tinh dầu,lá mọc đối,
gồm 3 lá chét,quả đại,hạt đen,bóng,phân bố ở vùng nhiệt đới,cận nhiệt đới.

Chi Evodia có khoảng 100 lồi phân bố từ Đơng Madagascar đến vùng

Nam Á,Đông Nam Á xuống Australia và một số đảo ở Thái Bình Dương.
Ở Việt Nam chi này có khoảng 10 loài phân bố ở vùng núi và trung du.[11],

[26], [27].
1.1.4. Loài Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth et Hook, họ Cam (Rutaceae)
1.1.4.1. Tên gọi


5

Tên khoa học: Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth., họ Cam (Rutaceae)
Tên Việt Nam: Ngô thù du

Tên khác: thù du, ngô vu, ngơ thù [11], xà lạp [6].
Tên nước ngồi: Wuzhuyu (Trung Quốc), medicinal evodia (Anh), cornouiller

(Pháp) [11].
1.1.4.2. Bộ phận dùng
Quả gần chín phơi khơ của cây Ngơ thù du (Fructus Evodiae) [1],[20].

1.1.4.3. Đặc điểm hình thái
Cây cao chừng 2,5 – 8m. Cành màu nâu hay tía nâu, khi cịn non có lơng
mềm dài, khi già nhẵn, có nhiều lỗ bì. Lá mọc đối, kép lông chim lẻ, cả cuống
và lá dài độ 15-35 cm, mang 2-5 đơi lá chét hình trứng hay hình bầu dục có
cuống ngắn; phiến lá chét dài 5-14 cm, rộng 2,5- 6 cm, đầu nhọn mép nguyên,
có lông mịn màu nâu ở cả hai mặt. Hoa đơn tính khác gốc tập hợp thành tán

hay chùm. Hoa nhỏ nhiều, màu trắng hay vàng nhạt, hoa cái lớn hơn hoa đực.
Quả hình cầu dẹt, dày 2mm, đường kính 6mm, thường gồm 5 mảnh vỏ, mặt
ngoài màu lục vàng thẫm đến màu nâu, thơ, xù xì, lúc chín có màu tím đỏ.

Trên quả có nhiều điểm chấm dầu nhơ lên hoặc trũng xuống. Đỉnh quả có kẽ
nứt hình sao 5 cánh, chia quả thành 5 mảnh. Gốc quả cịn sót lại cuống phủ
lơng tơ vàng. Chất cứng giịn. Mặt cắt ngang quả thấy rõ 5 ô, mỗi ô chứa 1 hạt
đến 2 hạt màu vàng nhạt. Mùi thơm ngát, vị cay đắng. Mùa hoa tháng 6-8.
Mùa quả tháng 9-10 [4], [6], [10].


6

Hình 1.1. Cây Ngơ thù du

Hình 1.2. Quả Ngơ thù du khơ

1.1.4.4. Phân bố
Cây Ngơ thù du có nguồn gốc từ vùng ôn đới ấm cận Himalaya thuộc Ấn
Độ, Trung Quốc [11]. Hiện nay, cây phân bố tự nhiên ở Bắc Ấn Độ, Đài
Loan, Trung Quốc. Ở nước ta cây mọc ở tỉnh Hà Giang [1], [6], [10].

1.1.4.5. Sinh thái
Ngô thù du thuộc loại cây gỗ nhỏ, ưa sáng và có thể chịu bóng tốt ở thời
kỳ cây cịn nhỏ. Cây thích nghi với vùng khí hậu tương đối ơn hịa với nhiệt
độ trung bình năm khoảng 21- 220C. Cây rụng lá vào mùa đơng và có thể chịu
đựng tốt khi nhiệt độ xuống dưới 00C. Cây tái sinh tự nhiên và được gieo
trồng chủ yếu bằng hạt. Cây Ngô thù du mọc trong rừng vùng núi cao như Bát
Đại Sơn, Tây Côn Lĩnh ở tỉnh Hà Giang ra hoa vào tháng 6-8, có quả tháng 9

-11 [10], [11].
1.1.4.6. Thu hái và chế biến
Quả (Fructus Evodiae) được thu hái vào tháng 9-10, hái quả lúc còn
xanh hay hơi vàng xanh, chưa tách vỏ, đem về, phơi nắng hay sấy cho khô.

Khi dùng người ta thường rửa qua vài lần bằng nước ấm (60 - 700C), sấy khô,
giã dập, dùng sống. Cũng có thể rửa qua bằng nước Cam thảo để giảm bớt
tính mạnh của thuốc [1].

1.1.5. Đặc điểm vi phẫu quả Ngô thù du (Fructus Evodiae)


7

Bột màu nâu, lông che chở đa bào gồm 2 đến 6 tế bào, đường kính
140µm đến 350µm, vách ngồi có mấu bướu rõ rệt. Một số khoang tế bào
chứa các chất màu vàng nâu đến đỏ nâu. Lông tiết có đầu hình bầu dục gồm 7
đến 14 tế bào, thường chứa chất tiết màu vàng, chân có 2 đến 5 tế bào. Cụm
tinh thể canxi oxalat hình cầu gai hoặc hình lăng trụ, đường kính 10µm đến

25 µm. Tế bào mơ cứng có thành dày và có ống trao đổi rõ thành từng cụm
lớn hoặc rời rạc, đường kính 35µm đến 75µm. Mảnh mơ mềm có chứa tinh
bột, tinh thể canxi oxalat hình cầu gai hoặc hình lăng trụ. Tinh bột, khối màu,
mạch vạch. Đơi khi cịn thấy các mảnh vỡ màu vàng của các khoang dầu [4].

1.2. Tồng quan về thành phần hóa học của quả Ngơ thù du
Quả Ngơ thù du chứa nhiều nhóm hợp chất. Trong đó có các nhóm hợp
chất chính là tinh dầu, limonoid và alkaloid.

1.2.1. Tinh dầu
Trong Ngơ thù du có 0,4% tinh dầu [6]. Theo quy định của Dược điển
Việt Nam IV, hàm lượng tinh dầu khơng ít hơn 0,25%, tính theo dược liệu
khơ kiệt. Trong tinh dầu có oximen C10H10, limonen C10H16. Limonen thuộc
nhóm dẫn chất monoterpen.
Một nghiên cứu gần đây tìm thấy có tổng cộng 38 hợp chất là tinh dầu.

Trong đó thành phần chính là β- myrcen (17,7%), (Z)-β- ocimen (14,8%), α-

phellandren (14,7%), γ- terpinen (6,4%), linalool (5,7%) and β-thujen (5,1%)
thuộc nhóm dẫn chất monoterpen [25].
Cấu trúc một số hợp chất trong tinh dầu trong quả Ngô thù du:

Limonen

β-myrcen

(Z)-β- ocimen


8

1.2.2. Limonoid
Limonoid là thành phần tạo nên vị đắng của các cây thuộc họ Rutaceae ,
trong cấu trúc hợp chất không chứa N [11 ]. Từ quả Ngô thù du, người ta tìm
ra và phân lập được 11 hợp chất limonoid là limonin, rutaevin, evodol,
obacunon, jangomolid, rutaevin acetat, graucin A, 12α -hydroxylimonin, 12αhydroxyevodol, 6 α-acetoxy-5-epilimonin và 6 β-acetoxy-5-epilimonin [21].
Cấu trúc một số hợp hất limonoid có trong quả Ngơ thù du:

limonin

6 α-acetoxy-5- epilimonin
in
1.2.3. Alkaloid

evodol

jangomolid

obacunon

12α-hydroxyevodol


9

Quả còn chứa nhiều alkaloid: evodin, evodiamine, rutaecarpine,
wuchuajin, hydroxyevodiamin, synephrin, … [11] và được chia thành 2 nhóm
hợp chất chính là: indoloquinazoline alkaloid và quinolone alkaloid.

1.2.3.1. Indoloquinazoline alkaloid
Nhóm này có 2 hợp chất chính là evodiamine và rutaecarpine. Đây cũng

là 2 hợp chất được định tính, định lượng trong phạm vi đề tài này.
a. Evodiamine [27],[28]
Ở nhiệt độ thường là chất rắn màu trắng
đến hơi vàng.
Công thức phân tử: C19H17N3O.
Phân tử lượng: 303,3578.
Khối lượng riêng: 1,39 g/cm3.
Nhiệt độ sôi: 575,07oC ở 760mmHg.
Nhiệt độ nóng chảy: 278oC.
Tính tan: DMSO (5 mg/mL, ở 40°C), tan
được trong cloroform, diclorometan,
aceton, ethyl acetat, ít tan trong nước,
methanol và ethanol (<1 mg/mL, ở 25 oC).

b. Rutaecarpine [27], [28]
Chất rắn màu trắng ở nhiệt độ thường.
Công thức phân tử: C18H13N3O
Phân tử lượng: 287,32
Khối lượng riêng: 1,45 g/cm3
Nhiệt độ sơi: 550oC ở 760mmHg
Nhiệt độ nóng chảy: 260oC
Tính tan: DMSO (18 mg/mL, ở 25oC), tan được trong cloroform, benzen,
diethyl ether, ít tan trong nước và ethanol (<1 mg/mL, ở 25 °C).


10

1.2.3.2. Quinolone alkaloid
Quinolone alkaloid được phát hiện với thuốc thử hydrogen
hexachloroplatinate cho màu tím trên bản sắc kí lớp mỏng. Khi phân tích
bằng HPLC thấy có 8 đỉnh tương ứng 8 hợp chất quinolone alkaloid là

evocarpine,

dihydroevocarpine,

1methy-2-pentadecyl-4(1H)-quinolone,

1-methy1-2-undecyl-4(1H)-quinolone,
1-methyl-2-[(Z)-6-undecyl]-4(1H)-

quinolone, 1-methyl-24(6Z,9Z)-6,9-pentadecadieny1]-4(1H)-quinolone, 1methyl-2-[(4Z,7Z)-4,7-tridecadienyl]-4(1H)-quinolone,

1-methyl-2-[(Z)-10-

pentadecenyl]-4(1H)-quinolone [21].
Cấu trúc một số hợp chất quinolone alkaloid có trong quả Ngơ thù du:


11

Q1: 1-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolone;
Q2: evocarpine;
Q3: 1-methy-2-[(6Z,9Z)]-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)-quinolone;
Q4: dihydroevocarpine.
1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý và công dụng
Quả Ngô thù du từ lâu được dùng với tác dụng trị rối loạn tiêu hóa, đau
đầu, đau bụng, cao huyết áp, lỵ, tắc kinh, băng huyết sau sinh [12], [13], [15].

Ngoài ra, các nghiên cứu hiện nay cho thấy rằng trong quả Ngơ thù có 3 hoạt
chất chính (evodiamine, rutaecarpine, goshuyauamide II) tham gia vào cơ chế

kháng viêm tế bào. Rutaecarpine và evodiamine ức chế tổng hợp PGE2 từ
lipopolysaccharide ở nồng độ 1-10µM. Evodiamine ức chế cyclooxygenase-2
nhưng rutaecarpine khơng có tác dụng này. Goshuyuamide II ngăn chặn tổng
hợp 5- lipooxygenase từ RBL- cells dẫn tới không tổng hợp được leukotrien

[24]. Một nghiên cứu khác cho rằng dịch chiết cồn của Evodia rutaecarpa có
tác dụng ức chế men NADPH oxidase trong các tế bào viêm [13].
Dịch chiết từ nhiều dược liệu trong đó có Ngơ thù du có tác dụng trị
bệnh đái tháo đường type 2 do ức chế tuyến tụy tiết insulin và tăng nhạ y cảm
insulin với mơ (gan, cơ) [14].
Một số alkaloid có cấu trúc quinolone trong quả Ngơ thù du có tác dụng
ức chế chọn lọc men MAO- B (là men tham gia thủy phân các chất dẫn truyền

thần kinh trung ương như noreadrenalin, dopamine, serotonin) [22].
Dịch chiết quả Ngô thù du có tác dụng kháng viêm, giảm đau giống
antipyrin, chữa eczema và các bệnh viêm da thần kinh, trị cao huyết áp, rối
loạn vị. [12], [17], [18], [19]

Tác dụng dược lý của quả Ngô thù du không những nhờ vào tác dụng
của các alkaloid mà cịn có sự đóng góp của các limonoid. Limonoid có


12

nhiều tác dụng như kháng virus, kháng khuẩn, kháng viêm, giảm đau, kháng
khối u [16].
Đơn thuốc dùng trong nhân dân có Ngơ thù du: [6]
a) Đơn thuốc chữa nơn mửa, tiêu chảy

Ngơ thù du

5g

Can khương

2g

Nước

300ml

Sắc cịn 100 ml, chia 3 lần uống trong ngày.
b) Đơn thuốc giúp tiêu hóa

Ngơ thù du

2g

Mộc hương

2g

Hoàng liên

1g

Tất cả tán thanh bột, trộn đều. Chia 3 lần uống trong ngày.

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.4.1. Ứng dụng HPLC trong định tính dược liệu
- Xác định độ tinh khiết: khi tiến hành HPLC phân tích trong các điều kiện sắc
ký khác nhau, nếu có một chất chỉ cho một đỉnh đối xứng, tách riêng biệt,
không bị chồng phủ với các đỉnh kế cận thì khả năng đó là một chất tinh khiết
[3].
- Định tính với chất đánh dấu và chất chuẩn: khi thời gian lưu tR của các chất
định quan tâm trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiếu phù hợp với nhau

thì có thể kết luận dương tính. Tuy nhiên để đảm bảo kết quả khi dựa vào thời
gian lưu cần phải tiến hành trên nhiều mẫu thử và trên ít nhất hai điều kiện
thực nghiệm khác nhau. Nếu hệ thống sắc ký có trang bị các detector cung
cấp các dữ liệu về cấu trúc chất cần quan tâm như phổ tử ngoại, hồng ngoại,
phổ khối, ... thì sẽ góp phần khẳng định chắc chắn kết quả phân tích [3].

13

- Định tính bằng phương pháp dấu vân tay: thường áp dụng cho các thành
phần chưa biết rõ. Phương pháp này dựa trên cơ sở khi phân tích một dịch
chiết dược liệu hoặc một phân đoạn chiết xuất từ dược liệu bằng HPLC, trong
điều kiện sắc ký phù hợp đã xác định sao cho thành phần cấu tạo thể hiện tối
đa trên sắc ký đồ. Nếu sắc ký đồ thu được có các chất và dữ liệu sắc ký khớp

với sắc ký đồ của dược liệu hay phân đoạn đối chiếu có thể kết luận được
dược liệu hay phân đoạn này phù hợp với mẫu đối chiếu [3].

1.4.2. Ứng dụng của HPLC trong định lượng dược liệu
- Phương pháp quy về 100% diện tích: trong trường hợp khơng có chất chuẩn
tương ứng, có thể xác định hàm lượng của một hợp chất tự nhiên bằng HPLC

dựa vào nguyên tắc quy về 100% diện tích đỉnh. Phương pháp này yêu cầu
mọi chất tan trong hỗn hợp mẫu thử cần phân tích đều phải được rửa giải và
phát hiện [3], [9].
- Phương pháp dùng chất chuẩn ngoại: nguyên tắc là so sánh trực tiếp chiều
cao hoặc diện tích đỉnh của một dung dịch mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ
đã biết. Đây là phương pháp ứng dụng phổ biến trong HPLC [3], [9].

- Phương pháp dùng chất chuẩn nội: nhằm giảm sai số và đạt độ lặp lại cao,
một chất chuẩn thứ hai được gọi là chất chuẩn nội được thêm vào chất chuẩn
ngoại và mẫu thử. Nhược điểm là sự phân tách sẽ khó tìm được chất chuẩn
nội thích hợp [3].
- Phương pháp thêm chất chuẩn: áp dụng khi có ảnh hưởng của các chất phụ.
ưu điểm là loại trừ được các yếu tố ảnh hưởng (thay đổi về nhiệt độ, áp suất
được bù trừ trong đường chuẩn độ và không ảnh hưởng đến kết quả định

lượng), độ chính xác cao. Tuy nhiên mất khá nhiều thời gian vì phải chuẩn
hóa với từng mẫu mà khơng chuẩn hóa định kỳ như khi áp dụng phương pháp
chuẩn ngoại [3], [9].


14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Quả khô của cây Ngô thù du (Fructus Evodiae) thu mua trên thị trường theo 3

kênh: kênh bán sỉ dược liệu Ngô thù du (chợ sỉ dược liệu ở Hà Nội và thành
phố Hồ Chí Minh); từ các công ty phân phối dược liệu; kênh bán lẻ dược liệu
ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (nhà thuốc đông dược). 40 mẫu dược
liệu được thu mua từ 3 kênh phân phối trên.
Bảng 2.1. Thông tin 40 mẫu dược liệu thu mua

STT

Kênh phân phối

1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

Kênh lẻ

Kí hiệu
mẫu
A03
A14
A10
A04
A05
A06
A07

A13
A23
A24
A02
A17
A18
A19
A20
A21
A22
A09
A15
A08
A11
A12
A25
A01
A16

Nơi thu
mua
Bạc Liêu
Bến Tre
Cà Mau
Cần Thơ
Cần Thơ
Cần Thơ
Cần Thơ
Cần Thơ
Cần Thơ

Cần Thơ
Đồng Tháp
Đồng Tháp
Đồng Tháp
Hà Nội
Hà Nội
Hà Nội
Hà Nội
Hậu Giang
Kiên Giang
Sóc Trăng
Tiền Giang
Tiền Giang
Tp. HCM
Trà Vinh
Vĩnh Long


15

26
27
28
29
30
31
32
33
34
35

36
37
38
39
40

Kênh công ty phân phối
dược liệu

Kênh sỉ

B04
B01
B02
B03
C10
C11
C07
C08
C09
C01
C02
C03
C04
C05
C06

Hà Nội
Tp. HCM
Tp. HCM

Tp. HCM
Cần Thơ
Cần Thơ
Hà Nội
Hà Nội
Hưng Yên
Tp. HCM
Tp. HCM
Tp. HCM
Tp. HCM
Tp. HCM
Tp. HCM

2.2. Dung mơi – hóa chất
Chất đối chiếu: Evodiamine SKS 046K1230V, hàm lượng 99,0%;

Rutaecarpine SKS 032K46091, hàm lượng 99,0% của Sigma-Aldrich (Mỹ).
Dung mơi –

Xuất xứ

Tiêu chuẩn

Hóa chất

Methanol

HPLC

Fisher / Merck

Acetonitril

HPLC

Fisher / Merck

Ethanol

Dược dụng

Trung Quốc

Dichloromethan

Dược dụng

Trung Quốc

Methanol

Dược dụng

Trung Quốc

2.3. Trang thiết bị
- Hệ thống HPLC Hitachi L-2000 (Nhật) với pump Hitachi L-2130, tiêm mẫu
Hitachi L-2200, điều nhiệt L-2300, đầu dò diod quang Hitachi L-2455.
- Bể siêu âm Grant (Anh).
- Cân phân tích 4 số OHAUS Explorer Pro (Mỹ), d=0,1 mg, max 210g.

- Cân phân tích 5 số ABT (Đức) 220-5DM, d=0,01 mg, max 220g, min 1mg.


16

- Cân kĩ thuật OHAUS Vugago Pro (Mỹ), d=0,01g, max 2100g.
- Tủ lạnh SANYO (Nhật).
- Kính hiển vi quang học Olympus CX31 (Nhật).
- Cân phân tích độ ẩm AND MX-50 (Nhật).

(1)

(3)

(2)
Hình 2.1. Các thiết bị được sử dụng

(1) Hệ thống HPLC Hitachi L-2000 với đầu dị DAD-L2500
(2) Kính hiển vi quang học Olympus CX31
(3) Bể siêu âm Grant