khảo sát đột biến gen stxbp2 trong hội chứng thực bào máu bằng kỹ thuật giải trình tự dna

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.18 MB, 92 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

---oOo---

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN STXBP2

TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ DNA

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC – Y DƯỢC

GVHD : PGS. TS. Hoàng Anh Vũ SVTH : Nguyễn Thị Lan Vi MSSV : 1553010245

Khóa : 2015-2019

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

---oOo---

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN STXBP2

TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ DNA

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – Y DƯỢC

Chữ ký GVHD GVHD : PGS. TS. Hoàng Anh Vũ SVTH : Nguyễn Thị Lan Vi MSSV : 1553010245

Hồng Anh Vũ Khóa : 2015-2019

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2019

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CÁM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Hoàng Anh Vũ, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thiện khóa luận này.

Em cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các anh/chị kỹ thuật viên, nghiên cứu viên, nhân viên Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM, đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có cơ hội học hỏi, trao dồi thêm kiến thức chun mơn cũng như nhiệt tình giúp đỡ em để có thể hồn thành khóa luận này một cách tốt nhất.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy, cô Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt 4 năm đại học vừa qua để cho chúng em có những hành trang vững chắc và đủ tự tin khi rời khỏi ghế nhà trường.

Cuối cùng con/em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, đặc biệt là cha mẹ, anh chị, cùng những người thân yêu khác đã luôn ủng hộ, khích lệ và tạo cho em động lực vượt qua những khó khăn, trở ngại.

Do điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế, khơng thể tránh khỏi những thiếu sót về nội dung và trình bày. Kính mong nhận được sự thơng cảm và góp ý chân thành từ q Thầy Cơ để em có thể rút ra được nhiều bài học quý báu cho mình.

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2019

Nguyễn Thị Lan Vi

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basis Local Aligement Search Tool

FHL Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis

ITK Interleukin-2 inducible T-cell kinase.

MAHS Malignancy-associated hemophagocytic syndrome

MAS Malignancy associated hemophagocytic syndrome

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD Optical Density

Polyphen2 Polymorphism Phenotyping 2

SNARE Soluble NSF Attachment Protein Receptor

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Nguyên nhân dẫn đến HLH [28]. ... 5

Bảng 1.2. Các subtype liên quan đến FHL [20]. ... 9

Bảng 1.3. Biểu hiện lâm sàng phổ biến của HLH [6, 44]. ... 11

Bảng 1.4. Tiêu chuẩn chẩn đoán HLH – 2004 của Henter và cộng sự (2004) [23]. ... 13

Bảng 2.1. Trình tự các mồi sử dụng để PCR khuếch đại các exon gen STXBP2. ... 26

Bảng 3.2. Độ tinh sạch của DNA tổng số thu nhận được từ mẫu máu. ... 45

Bảng 3.3. Kết quả phân tích trình tự 19 exon của gen STXBP2 ... 52

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

DANH MỤC CÁC HÌNH/ SƠ ĐỒ

Hình

Hình 1.1. Đáp ứng miễn dịch ở người bình thường và ở bệnh nhân HLH [27]. ... 8

Hình 1.2. Cơ chế bệnh sinh của HLH [2]. ... 10

Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt hướng điều trị (theo phác đồ HLH – 2004) [8]. ... 15

Hình 1.4. Vị trí gen STXBP2 trên nhiễm sắc thể số 19 [43]. ... 15

Hình 1.5. Vai trị của gen STXBP2 trong con đường giết tế bào nhiễm bằng các hạt ly giải tế bào [8]. ... 16

Hình 1.6. Một đột biến điểm xảy ra dẫn đến thay thế một cặp nucleotide G-C bằng A-T hoặc ngược lại tạo ra một SNP [48]. ... 18

Hình 1.7. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase. ... 20

Hình 1.8. Các chu kỳ của kỹ thuật PCR. ... 20

Hình 1.9. Sơ đồ quy trình giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động [49]. ... 22

Hình 1.10. Máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer ... 23

Hình 2.1. Cột lọc dùng trong tách chiết DNA mẫu máu. ... 29

Hình 2.2. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR. ... 31

Hình 2.3. Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Cycle Sequencing. ... 36

Hình 2.4. Đĩa 96 giếng sử dụng trong việc giải trình tự gen. ... 36

Hình 3.1. Cấu trúc trình tự gen STXBP2. ... 39

Hình 3.2. Vị trí bắt cặp của 5 cặp mồi trên gen STXBP2. ... 44

Hình 3.3. Kết quả Primer-BLAST cặp mồi STXBP2_g1F-g4R cho vùng exon 1 – 4 của gen STXBP2. ... 44

Hình 3.4. Kết quả PCR khuếch đại các vùng exon của gen STXBP2.. ... 46

Hình 3.5. Kết quả giải trình tự của exon 2, 3. ... 49

Hình 3.6. So sánh trình tự gDNA chuẩn với kết quả giải trình tự exon 2, 3 của mẫu bệnh phẩm. ... 50

Hình 3.7.Trường hợp đồng hợp tử (1 sóng) và dị hợp tử (2 sóng) từ trái sang phải. .... 51

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Hình 3.8. Kết quả biến đổi nucleotide tại vị trí c.1057T>C ở exon 13. ... 53

Hình 3.9. Kết quả tra cứu biến thể c.1057T>C (p.C353R) bằng phần mềm Polyphen2. ... 54

Hình 3.10. Kết quả biến đổi nucleotide tại vị trí c.1430C>T ở exon 16. ... 55

Hình 3.11. Kết quả tra cứu các biến đổi nucleotide trên NCBI. ... 56

Hình 3.12. Kết quả biến đổi nucleotide tại vị trí c.1576A>G ở exon 18. ... 57

Hình 3.13. Kết quả biến đổi nucleotide tại vị trí c.1696+20A>G ở intron 18. ... 57

Hình 3.14. Kết quả biến đổi nucleotide tại vị trí c.1697-26T>G ở intron 18. ... 58

Sơ đồ

Sơ đồ 2.1. Quy trình tách chiết gDNA mẫu máu ngoại vi bằng QIAamp Mini Kit. ... 29

Sơ đồ 2.2. Quy trình tủa sản phẩm Cycle Sequencing. ... 37

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

1.1.8.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định ... 12

1.1.8.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán phân biệt ... 12

1.1.9. Điều trị ... 14

1.2. Tổng quan về gen STXBP2 ... 15

1.2.1. Vị trí, tên gọi và cấu trúc gen STXBP2 ... 15

1.2.2. Chức năng của gen STXBP2 ... 15

1.2.3. Đột biến gen STXBP2 ... 17

1.2.4. Tính đa hình đơn nucleotide (SNP) ... 18

1.3. Kỹ thuật di truyền phân tử xác định đột biến gen STXBP2 trong hội chứng thực bào máu. ... 19

1.3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 19

1.3.2. Điện di ... 21

1.3.3. Giải trình tự gen... 21

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

1.3.3.1. Phương pháp Maxam – Gilbert ... 21

1.3.3.2. Phương pháp Sanger ... 21

1.3.3.3. Máy giải trình tự tự động dựa trên phương pháp Sanger cải tiến ... 22

1.3.4. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự Nucleotide ... 23

2.2.2.1. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc ... 25

2.2.2.2. Thiết kế - đánh giá mồi cho phản ứng PCR kết hợp giải trình tự ... 25

2.2.3. Khảo sát thực nghiệm ... 27

2.2.3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình xác định đột biến trên gen STXBP2 ở bệnh nhân mắc HLH………... 27

2.2.3.2. Tách chiết DNA bộ gen (gDNA) từ mẫu máu ... 28

2.2.3.3. Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận ... 29

2.2.3.4. Phản ứng PCR... 30

2.2.3.5. Điện di ... 32

2.2.3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR ... 33

2.2.3.7. Phản ứng giải trình tự (Cycle Sequencing) ... 34

2.2.3.8. Tủa sản phẩm Cycle Sequencing………..36

2.2.3.9. Phân tích dữ liệu giải trình tự đồng thời so sánh với các cơng trình nghiên cứu trước……… ... 37

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

2.3. Thời gian thực hiện và địa điểm... 38

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 39

3.1. Khai thác dữ liệu ... 39

3.2. Khảo sát in silico ... 39

3.2.1. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc ... 39

3.2.2. Thiết kế - đánh giá mồi cho phản ứng PCR kếp hợp giải trình tự ... 40

3.2.3. Khảo sát thực nghiệm ... 45

3.2.3.1. Tách chiết gDNA từ mẫu máu ... 45

3.2.3.2. Phản ứng PCR ... 46

3.2.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR ... 48

3.2.3.4. Phản ứng Cycle Sequencing và đọc kết quả giải trình tự ... 48

3.2.3.5. Phân tích kết quả giải trình tự đồng thời so sánh với các cơng trình nghiên cứu trước……. .. ... 50

Trang Web trực tuyến ... 64

PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PRIMER – BLAST ... 66

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ SO SÁNH GIỮA TRÌNH TỰ DNA CHUẨN VỚI KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CỦA MẪU BỆNH ... 68

PHỤ LỤC 3: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG ... 75

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Được biết đến đầu tiên vào năm 1939, hội chứng thực bào máu (Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - HLH) biết đến như một rối loạn hiếm gặp, có thể đe dọa tính mạng, đặc trưng bởi phản ứng viêm rất nghiêm trọng, gây ra bởi sự tăng sinh các tế bào lympho và đại thực bào hoạt hóa quá mức, tăng cytokine, làm tổn thương tế bào, suy đa cơ quan. Những người mắc phải HLH thường biểu hiện các triệu chứng bệnh trong những tháng đầu hoặc năm đầu của bệnh. Các triệu chứng có thể bao gồm sốt, gan to, lách to, giảm tế bào máu ngoại vi và có thể có biểu hiện triệu chứng thần kinh trung ương đi kèm [29].

HLH được chia làm hai thể gồm: hội chứng thực bào máu nguyên phát (Primary HLH) và hội chứng thực bào máu thứ phát (Secondary HLH). HLH nguyên phát hay còn được biết đến là HLH có tính chất gia đình (Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis - FHL), là một bệnh di truyền lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường

do đột biến trên các gen PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2 tương ứng với các subtype

FHL2, FHL3, FHL4 và FHL5, được tìm thấy nhiều ở những thành viên cùng huyết thống cha mẹ và thường có biểu hiện lâm sàng lúc tuổi nhỏ.Tỷ lệ trẻ em mắc phải FHL dưới 1 tuổi ước tính khoảng 1,1/100.000 [7, 8, 20, 22].

Trong đó, gen STXBP2 nằm trên nhiễm sắc thể số 19, có vai trị mã hóa cho protein

Munc18-2 tham gia vào quá trình vận chuyển trong tế bào, điều khiển SNARE (các thụ thể protein gắn các yếu tố nhạy cảm N - ethylmaleimide hòa tan) đảm nhiệm việc lắp ráp phức hợp và giải phóng các hạt ly giải các tế bào nhiễm, do đó đột biến trên gen này là một trong những nguyên nhân gây ra FHL (còn biết đến với tên gọi FHL5) [43].

Những năm gần đây, FHL này ngày càng được chú ý nhiều hơn vì tầm quan trọng trong việc quyết định điều trị sớm với thuốc ức chế miễn dịch [5] mà việc sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chỉ có thể tạm thời kiểm sốt bệnh. Hiện nay, phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu được coi là cách duy nhất có khả năng chữa khỏi bệnh.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Xuất phát từ thực tiễn trên, nhóm tiến hành thực hiện đề tài “KHẢO SÁT ĐỘT

BIẾN GEN STXBP2 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU BẰNG KỸ

THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ DNA” với mục tiêu cụ thể sau:

− Khuếch đại thành công 19 exon gen STXBP2.

− Thực hiện giải trình tự bằng phương pháp Sanger.

− Phân tích và khảo sát đột biến tại các vùng exon của gen mục tiêu.

− Tiền đề cho nghiên cứu phát hiện đột biến gen STXBP2 trong hội chứng thực

bào máu tiếp theo với số lượng mẫu lớn, để có thể ứng dụng kỹ thuật vào chẩn đoán trên lâm sàng, giúp các bác sĩ lâm sàng đưa ra chuẩn đoán sớm, liệu pháp điều trị thích hợp cũng như tư vấn di truyền cho bố, mẹ, anh/chị, em ruột.

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

PHẦN I: TỔNG QUAN

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Những người mắc phải HLH thường biểu hiện các triệu chứng bệnh trong những tháng đầu hoặc năm đầu của bệnh. Các triệu chứng có thể bao gồm sốt, gan lách to, giảm tế bào máu ngoại vi, tăng triglyceride máu, giảm fibrinogen máu, thường có co giật và có thể có biểu hiện triệu chứng thần kinh trung ương đi kèm [29].

FHL là bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường (gồm nhiễm sắc thể số 6, 9, 10, 17 và 19) hoặc nhiễm sắc thể giới tính X [7]. Có thể tự xuất hiện hoặc khởi phát sau khi nhiễm trùng, thường có biểu hiện lâm sàng từ lúc tuổi nhỏ, tỷ lệ trẻ em mắc bệnh dưới 1 tuổi là 1,1/100.000 ca. Tuy nhiên cũng không loại trừ trường hợp FHL ở trẻ lớn hơn [20] và tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả nam và nữ.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

1.1.2.2. HLH thứ phát

HLH thứ phát (Secondary HLH) hay HLH mắc phải chiếm tỷ lệ cao hơn HLH nguyên phát, thường xảy ra sau một yếu tố khởi phát thường là sau nhiễm siêu vi. Thể thứ phát có thể tìm thấy trong các bệnh tự miễn, bệnh ác tính (bạch cầu huyết, lymphoma) và bệnh do rối loạn chuyển hóa [1, 23] có thể gặp ở tất cả các lứa tuổi nhưng thường xuất hiện ở trẻ lớn và người lớn [6].

Cả hai nhóm HLH thứ phát và FHL đều có thể khởi phát sau q trình nhiễm khuẩn, nên rất khó có thể phân biệt hai nhóm này bằng các triệu chứng lâm sàng nếu không sử dụng các phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử.

Nguyên nhân gây HLH ở cả 2 thể nguyên phát và thứ phát được trình bày chi tiết trong Bảng 1.1.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Bảng 1.1. Nguyên nhân dẫn đến HLH [28].

Vị trí nhiễm sắc

thể HLH nguyên phát

19p13.2-3

Hội chứng thiếu hụt miễn dịch liên quan đến HLH nguyên phát

Hội chứng Griscelli type 2 RAB27A Rab27a 1q42.1-q42.2

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Chú thích:

− XLP-1: rối loạn thâm nhiễm Lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type 1. − XLP-2: rối loạn thâm nhiễm Lympho liên quan đến nhiễm sắc thể X type 2. − HPS-2: Hội chứng Hermansky-Pudlak type 2 (Hermansky-Pudlak syndrome

Theo đó, một ước tính gần đây về tỷ lệ mắc HLH ở những người dưới 18 tuổi là 1,07/100.000. Tỷ lệ mắc FHL ước tính ở Thụy Điển là 0,12/100.000 trẻ em dưới 15 tuổi mỗi năm hoặc với tần suất 1/50.000 trẻ đẻ sống [31], hầu như các trường hợp mắc bệnh đều được chẩn đốn trong vịng một năm đầu sau sanh [20] và tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả nam và nữ. Tuy nhiên, cũng không loại trừ chuẩn đoán FHL ở trẻ trên 1 tuổi [40]. Tỷ lệ mắc HLH ở người lớn mặc dù không được biết chính xác, nhưng người ta ước tính rằng có khoảng 1/2.000 người lớn nhập viện tại các trung tâm y tế địa phương [34, 35].

Năm khiếm khuyết di truyền FHL đã được xác định, tương ứng với 5 subtype của FHL (Bảng 1.1) [37]. Tần số xuất hiện của các subtype HLH là khác nhau giữa các chủng tộc [41]. Ở Châu Á có khoảng 70 - 80% ở bệnh nhân FHL biểu hiện bệnh dưới 1 tuổi, và chỉ có 10% bệnh nhân có triệu chứng biểu hiện trong giai đoạn sơ sinh [29]. Các trường hợp FHL hầu như đều tử vong nếu không được điều trị, thời gian sống trung bình được báo cáo trong các nghiên cứu là khác nhau từ 2 - 6 tháng sau khi được chẩn đoán [8].

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

Các trường hợp được chẩn đoán HLH thứ phát thường đi kèm với nhiễm trùng, đặc biệt là nhiễm EBV. Tại Nhật Bản, khoảng 40% bệnh nhân HLH có liên quan đến nhiễm EBV [26]. HLH phát triển trong bệnh lý ác tính, được biết với tên gọi là bệnh ác tính liên quan đến HLH (MAHS). Trong một nghiên cứu với tất cả 52 trẻ mắc phải MAHS thì có 60% trường hợp liên kết với u lympho không Hodgkin (Non- hodgkin’s lymphoma), tiếp theo là bệnh bạch cầu cấp (Leukemias), hội chứng rối loạn sinh tủy (Myelodysplastic syndromes), bệnh mụ bào (Langerhans cell histiocytosis). Ngoài ra, HLH thứ phát cịn được tìm thấy trong các trường hợp ức chế miễn dịch, sau khi cấy ghép [30].

Trái ngược với FHL, HLH thứ phát thường xuất hiện ở độ tuổi lớn hơn. HLH thứ phát trên một số bệnh nhân có thể tự giới hạn vì bệnh nhân có thể phục hồi hồn tồn sau khi được điều trị chăm sóc hỗ trợ (tiêm immunoglobulin tĩnh mạch). Tuy nhiên, sự thuyên giảm lâu dài không cần sử dụng liệu pháp ức chế miễn dịch và gây độc tế bào là không thể trong phần lớn các bệnh nhân HLH ở người lớn có triệu chứng trên hệ thần kinh trung ương (CNS).

1.1.5. Cơ chế bệnh sinh

Hơn hai thập kỷ qua, sinh lý bệnh học của HLH đã được xác định, mặc dù người ta chưa hiểu hoàn toàn về những giai đoạn gây bệnh của nó [24]. Giải thiết hiện tại được chấp nhận được cho là liên quan đến các khiếm khuyết về chức năng của tế bào lympho T gây độc (CTL) và tế bào giết tự nhiên (NK). Tuy vậy, cơ chế sinh bệnh chính xác của HLH thứ phát vẫn chưa được làm sáng tỏ hồn tồn và có khả năng là do đa yếu tố [27]. Ở người bình thường, một trong những cơ chế miễn dịch bảo vệ cơ thể khỏi tác nhân nhiễm trùng bằng các tác nhân nội bào là giải phóng các hạt ly giải tế bào vào các tế bào nhiễm của CTL và NK. CTL và NK trở nên hoạt hóa sau khi nhận diện được tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen Presenting Cell - APC), hình thành khe miễn dịch (Immunological synapse - IS) giữa hai tế bào, sau đó chúng giải phóng các hạt ly giải tế bào chứa perforin và granzyme vận chuyển vào bên trong tế bào nhiễm, thực hiện chu trình chết theo chương trình (apoptosis) (Hình 1.1). Quan trọng hơn, các hạt ly giải tế

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

bào của tế bào lympho không chỉ tác động trực tiếp vào tế bào bị nhiễm mà còn chống lại APC. Việc loại bỏ các APC góp phần quan trọng trong việc hạn chế các đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T. Đây là bằng chứng cho thấy CTL quan trọng hơn trong sinh bệnh học của HLH so với tế bào NK, nhưng cơ chế miễn dịch thông qua việc giết các APC cũng đã được mô tả cho các tế bào NK [14, 38].

Hình 1.1. Đáp ứng miễn dịch ở người bình thường và ở bệnh nhân HLH [27].

Ở FHL, khiếm khuyết nhiều tổ hợp gen liên quan đến hoạt động của perforin và granzyme được chia thành 5 subtype, chức năng bị ảnh hưởng của các subtype tương ứng đã được liệt kê trong Bảng 1.2.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Bảng 1.2. Các subtype liên quan đến FHL [20].

FHL1

Chưa xác định, nằm trên cánh tay ngắn nhiễm sắc thể số 9, vị trí

21.3 - 22

Chưa xác định Chưa xác định

Giải phóng các hạt ly giải tế bào của CTL đến tế bào đích, khởi phát quá trình

chết theo chương trình

FHL3 UNC13D Munc 13 – 4 Các hạt gây ly giải tế bào

của CTL được mồi

FHL4 STX11 Syntaxin 11 Hòa màng, vận chuyển các

hạt ly giải bên trong tế bào

Hòa màng, vận chuyển và giải phóng các hạt ly giải tế

bào

Do sự bất thường của các gen liên quan đến FHL như được trình bày ở bảng trên, dẫn đến việc các tế bào CTL hoặc NK bị giảm hoặc mất chức năng gây độc lên các tế bào nhiễm [27]. Trong trường hợp này, APC tiếp tục kích thích CTL [17], một lượng lớn cytokine được tạo ra bao gồm interferon gamma (IFN-γ) có vai trị quan trọng trong việc hoạt hóa đại thực bào, yếu tố hoại tử mơ α (TNF- α). Điều này giúp duy trì sự hoạt hóa các đại thực bào và thâm nhiễm vào các mô như gan, tủy xương và hệ thần kinh trung ương, tiết cytokine và gây hoạt hóa thực bào. IFN-γ và TNF- α cịn có tác dụng gây độc với các tế bào tạo máu, góp phần làm giảm các tế bào máu. TNF-α cũng ức chế lipase

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

lipoprotein, gây tăng triglyceride máu đồng thời các interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6) và TNF-α cũng được tiết ra, gây ra tình trạng sốt [29]. Các đại thực bào hoạt hóa tiết ferritin đồng thời cũng là yếu tố hoạt hóa plasminogen (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cơ chế bệnh sinh của HLH [2].

1.1.6. Biểu hiện lâm sàng

FHL và HLH thứ phát khó có thể phân biệt chính xác dựa vào các biểu hiện lâm sàng. Scott và Robb – Smith đã mô tả bốn biểu hiện đầu tiên ở bệnh nhân đều có các triệu chứng lâm sàng như sốt kéo dài, gan to, lách to, hạch bạch huyết to, sau đó chuyển biến thành vàng da, xuất huyết, thiếu máu và giảm bạch cầu [36]. Ngồi ra cịn có các triệu chứng lâm sàng khác như viêm gan, các triệu chứng thần kinh (chẳng hạn như co giật, bệnh màng não, giảm mức độ ý thức), phát ban [20]. Một số biểu hiện lâm sàng phổ biến của HLH được nêu rõ trong Bảng 1.3.

KKÍCH HOẠT

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Sốt là biểu hiện xuất hiện sớm nhất, có đặc điểm kéo dài kèm theo các dấu hiệu viêm đường hơ hấp hoặc nhiễm trùng tiêu hóa. Gan to, lách to chiếm khoảng hơn 90% trường hợp HLH, gan lách to thay đổi theo từng giai đoạn hoạt động của bệnh [44]. Ban đỏ ở dạng dát sần vị trí mọc và hướng lan khơng điển hình, khơng theo thứ tự chiếm tỷ lệ thấp hơn khoảng 43% bệnh nhân HLH.

Bảng 1.3. Biểu hiện lâm sàng phổ biến của HLH [6, 44]. Triệu chứng lâm sàng Tỉ lệ

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

1.1.7. Cận lâm sàng

Một số đặc điểm cận lâm sàng của HLH như giảm các dịng tế bào máu (ảnh hưởng ít nhất 2 dòng tế bào trong máu ngoại vi), tăng ferritin, tăng triglyceride máu (đặc biệt là trong HLH thứ phát), giảm fibrinogen máu, tăng men gan trong máu, tăng bilirubin huyết, đông máu bất thường, giảm natri máu và protein máu. Trong đó, nồng độ ferritin >500 ng/ml làm tăng nghi ngờ đối với HLH và mức ferritin >10.000 ng /ml được chứng minh nhạy cảm (90%) và đặc hiệu với HLH (96%) [34, 35].

1.1.8. Chuẩn đoán

1.1.8.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định

Các tiêu chuẩn chẩn đoán HLH dựa theo tiêu chuẩn HLH – 2004 của Henter và cộng sự (2004) được trình bày trong Bảng 1.4 [23].

1.1.8.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán phân biệt

Biểu hiện lâm sàng của HLH rất đa dạng và có thể giống với đặc điểm lâm sàng của nhiều bệnh khác như nhiễm trùng huyết, bệnh ác tính và rối loạn viêm nhiễm [23]. Các bất thường về huyết học có thể gợi ý bệnh cảnh của bạch cầu cấp, u lympho, thiếu máu, hội chứng loạn sinh tủy.

Ngoài ra, bệnh cảnh của HLH liên quan tới một số hội chứng suy giảm miễn dịch và rối loạn di truyền như hội chứng Chediak-Higashi, Griscelli, bệnh lý tăng sinh lympho bào liên kết giới tính X (X-linked lymphoproliferative disease), bệnh mụ bào Langerhans. Tóm lại, chẩn đốn HLH là chẩn đốn loại trừ [30, 39].

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Bảng 1.4. Tiêu chuẩn chẩn đoán HLH – 2004 của Henter và cộng sự (2004) [23].

HLH được chẩn đốn khi có ít nhất 1 trong 2 tiêu chuẩn sau:

o Nhóm tiêu chuẩn 1: chẩn đốn phân tử xác định FHL dựa vào việc phát

hiện các đột biến gen PFR1, UNC13D, STX11, STXBP2.

o Nhóm tiêu chuẩn 2: chẩn đoán dựa vào biểu hiện lâm sàng và xét nghiệm.

Nếu khơng có tiêu chuẩn về sinh học phân tử, bệnh nhân được chẩn đoán HLH khi có ít nhất 5 trong 8 tiêu chí:

1. Sốt ≥ 38,50C kéo dài trên 7 ngày. 2. Lách to > 3cm dưới bờ sườn (T).

3. Giảm tế bào máu: ít nhất từ 2 đến 3 dịng tế bào máu ngoại vi . i. Hemoglobin < 9 g/dl (ở trẻ sơ sinh < 4 tuần tuổi Hb <10 g/dl).

ii. Tiểu cầu < 100 x 103/ml. iii. Neutrophils < 1 x 103/ml.

4. Tăng Triglyceride máu và/ hoặc giảm Fibrinogen máu <150 mg/dl. i. Lúc đói > 3,0 mmol/l hoặc 265 mg/dl.

ii. Và / hoặc giảm Fibrinogen máu < 150 mg/dl. 5. Hình ảnh thực bào ở tủy xương hoặc ở gan/ lách/ hạch. 6. Giảm hoạt tính tế bào NK.

7. Ferritin máu > 500ng/ml.

8. Tăng nồng độ CD 25 hòa tan (chuỗi alpha của IL-2 receptor) > 2 lần giá trị trung bình được hiệu chỉnh theo lứa tuổi và tùy vào điều kiện cụ thể của từng labo, thường có giá trị chẩn đốn khi nồng độ > 2.400 U/ml).

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

1.1.9. Điều trị

Điều trị HLH phụ thuộc vào nguyên nhân gây bệnh cũng như mức độ nghiêm trọng của bệnh. Hai lựa chọn có thể cân nhắc trong điều trị HLH là ức chế phản ứng viêm và các triệu chứng cơ bản của bệnh (nếu có thể) [27]. Năm 1994, Hiệp hội mô bào thế giới công bố phác đồ điều trị quốc tế về HLH, tăng tỷ lệ sống trên 5 năm lên 54% ± 6%. Điều này cải thiện đáng kể tỷ lệ sống của bệnh nhân HLH so với trước khi chưa điều trị bằng phác đồ điều trị, thời gian sống của bệnh nhân giảm cịn ít hơn 2 tháng [25]. Phác đồ này kết hợp giữa hóa trị liệu và thuốc ức chế miễn dịch (bao gồm etoposide, corticosteroids, cyclosporine A, ở một số bệnh nhân chắc chắn mang bệnh, methotrexate tiêm kênh tủy) và biện pháp cuối cùng là tiến hành cấy ghép tủy xương cho bệnh nhân FHL hoặc HLH thứ phát dai dẳng.

Etoposide rất hữu ích trong điều trị đối với các bệnh thuộc mô bào và bạch cầu đơn nhân [20]. Trong khi đó, cyclosporin A được biết đến là thuốc ức chế đặc hiệu của tế bào lympho T [21]. Phác đồ điều trị HLH-94 gồm giai đoạn tấn công trong 8 tuần đầu nhằm ngăn chặn và kiểm sốt q trình tăng viêm liên kết với HLH. Sau khi áp dụng phác đồ điều trị này, các bệnh nhân hồi phục sẽ chấm dứt liệu pháp điều trị vào 8 tuần cuối, trong khi đó những ca khơng cải thiện thì vẫn tiếp tục liệu pháp như một cầu nối để chờ truyền tế bào sinh máu khác alen cùng loài (allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation – HCT). HCT sẽ cần đòi hỏi áp dụng đối với các trường hợp HLH đột biến gen, bệnh lý diễn biến trên hệ thần kinh trung ương hay ca bệnh tái phát. Năm 2004, Hiệp hội mô bào thế giới đã thiết kế một phác đồ điều trị mới, HLH-2004 gồm việc bổ sung cyclosporine vào ngay giai đoạn đầu tấn công và bổ sung corticosteroids cùng với methotrexate với trường hợp bệnh lý thần kinh trung ương [23]. Sơ đồ tóm tắt điều trị bệnh HLH được trình bày cụ thể trong Hình 1.3.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt hướng điều trị (theo phác đồ HLH – 2004) [8].

1.2. Tổng quan về gen STXBP2

1.2.1. Vị trí, tên gọi và cấu trúc gen STXBP2

Dựa vào thông tin trên cơ sở dữ liệu NIH (National Institutes of Health), gen STXBP2

(Syntaxin Binding Protein 2) nằm trên vùng cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể số 19, định

vị tại vị trí 19p13.2 từ vị trí nuleotide 7.637.101 đến 7.647.875 (Hình 1.4). Gen STXBP2

có độ dài 10.774 bp gồm 19 exon.

Hình 1.4. Vị trí gen STXBP2 trên nhiễm sắc thể số 19 [43].

1.2.2. Chức năng của gen STXBP2

Gen STXBP2 mã hóa cho protein 2 gắn kết với Syntaxin hay còn được biết đến với

tên gọi là Munc18-2, một thành viên thuộc họ protein SEC/ MUNC gồm 593 amino acid, có kích thước phân tử 66.453 Da. Protein được mã hóa này tham gia vào việc vận chuyển

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

bên trong tế bào, điều khiển việc lắp ráp phức hợp SNARE (các thụ thể protein gắn các yếu tố nhạy cảm N - ethylmaleimide hòa tan - Soluble N-ethylmaleimide sensitive factor Attachment protein Receptor). Phức hợp này thực hiện vai trò hòa màng giữa tế bào đích và túi tiết chứa các hạt ly giải gồm perforin và granzyme B, sau đó giải phóng các hạt perforin và granzyme B đến khe miễn dịch (Immunological Synapse - IS) [18, 21].

Perforin là một protein nội bào, khi có mặt của ion Ca2+, perforin được polyme hóa

tạo cấu trúc dạng ống, đâm xuyên vào lớp lipit kép của màng tế bào đích (hay tế bào nhiễm) làm thủng màng đồng thời vận chuyển các granzyme B theo lỗ thủng vào

các tế bào đích. Tiếp đó, granzyme B xâm nhập vào trong nhân của tế bào đích để tham gia khởi phát quá trình chết theo chương trình (apoptosis). Thiếu perforin, các tế bào CTL và NK cho thấy giảm hoặc mất khả năng ly giải tế bào đích [47, 48].

Hình 1.5. Vai trị của gen STXBP2 trong con đường giết tế bào nhiễm bằng các

hạt ly giải tế bào [8].

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

1.2.3. Đột biến gen STXBP2

Protein STXBP2 hay Munc 18-2 tương tác với Syntaxin 11 - một protein liên quan đến FHL4. STXBP2 rất quan trọng, cần thiết trong con đường giải phóng các hạt ly giải tế bào xâm nhập vào tế bào đích khởi phát q trình chết theo chương trình, giết tế bào bị nhiễm bằng cách gắn kết với Syntaxin 11 tạo thành phức hợp SNARE. Vì vậy, đột

biến ở gen STXBP2 ảnh hưởng đến chức năng của STXBP2, sự thiếu hụt protein

STXBP2 dẫn đến hoạt tính gây độc của tế bào NK và CTL giảm hoặc mất khả năng ly giải lên tế bào nhiễm, là nguyên nhân gây ra FHL5 [42].

FHL5 được báo cáo chiếm khoảng 10% cá thể FHL ở Thổ Nhĩ Kỳ và Arab Saudi,

20% ở Đức [7, 33]. Hơn 100 kiểu biến đổi của gen STXBP2 đã được báo cáo trên Clinvar

của ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI ( bao gồm 39 đột biến sai nghĩa (missense mutation), 2 đột biến lệch khung (frameshift mutation), 2 đột biến vùng nối (splice site mutation). Hầu hết bệnh nhân FHL5 mang hai loại đột biến khác nhau trên cả hai alen nằm trên hai nhiễm sắc thể. Trong đó, đột biến sai nghĩa là loại đột biến phổ biến nhất.

Theo báo cáo của Pagel J. và cộng sự (2012) các đột biến gen của STXBP2 ở bệnh

nhân FHL5 nằm rải rác trên tồn bộ vùng mã hóa, trong đó có một số đột biến thường gặp như:

• c.1430C>T (p.Pro477Leu): đột biến sai nghĩa được phát hiện ở 5 bệnh nhân từ Ả Rập.

• c.1621G>A (p.Gly541Ser): được tìm thấy ở 7 bệnh nhân chủ yếu là người da trắng.

Ngồi ra, cịn có đột biến tại vùng nối c.1247-1G>C ảnh hưởng đến vị trí cắt nối của exon 15 được xác định trên 12 bệnh nhân, 5 trường hợp đồng hợp tử và 7 trường hợp kết hợp với một đột biến khác. Những đột biến loại này thường được tìm thấy ở các bệnh nhân từ Đức và Thổ Nhĩ Kỳ [33].

Hội chứng HLH qua xem xét hồ sơ dữ liệu về mặt dịch tễ học cho thấy khơng có ưu thế về chủng tộc nào. Nghiên cứu tại các quốc gia châu Âu như Thụy Điển, Anh và Ý

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

báo cáo với các số liệu thống kê tương tự nhau. Đồng thời bệnh cũng khơng có ưu thế cho giới tính nào [8].

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về HLH phần lớn mô tả về các đặc điểm lâm sàng, chuẩn đoán và điều trị HLH thứ phát. Trong đó, có 2 cơng trình nghiên cứu về đột biến gen liên

quan đến FHL gồm: “Phát hiện đột biến gen Perforin gây hội chứng thực bào máu ở

trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA” của Hoàng Anh Vũ và cộng sự (2012)

và “Phát hiện đột biến gen UNC13D gây hội chứng thực bào máu ở trẻ em bằng kỹ

thuật giải trình tự chuỗi DNA” của Hồng Anh Vũ và cộng sự (2013).

Đột biến STXBP2 vẫn còn khá mới ở Việt Nam, nhất là các nghiên cứu về tính chất

đột biến ở các gen liên quan đến FHL, vì vậy việc “KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN

STXBP2 TRONG HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI

TRÌNH TỰ DNA” là vơ cùng cần thiết.

1.2.4. Tính đa hình đơn nucleotide (SNP)

Tính đa hình là sự xuất hiện hai hay nhiều biến thể hoặc các hình thức khác nhau được gọi là kiểu hình thay thế trong một quần thể lồi. Có 3 dạng: đa hình cân bằng, đa hình di truyền, đa hình đơn nucleotide (SNP).

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) là sự thay đổi của nucleotide đơn trên một chuỗi trình tự DNA mà sự thay đổi đó chiếm một tỉ trọng đủ lớn (>1%) trong cộng đồng. Marker này thường được dùng để phân tích genome người, hiện nay được áp dụng cho genome nhiều sinh vật khác với số lượng lớn nhờ một đột biến điểm tại một nucleotide trên genome.

Hình 1.6. Một đột biến điểm xảy ra dẫn đến thay thế một cặp nucleotide G-C bằng A-T hoặc ngược lại tạo ra một SNP [48].

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

SNP xảy ra ở vùng không mã hóa thường xuyên hơn so với vùng mã hóa do ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên, tỷ lệ tái tổ hợp và đột biến di truyền. Khi SNP nằm trong vùng mã hóa có thể khơng nhất thiết làm thay đổi trình tự các amino acid do tính thối hóa của mã di truyền [32].

Các SNP trong vùng mã hóa có hai loại: đa hình đồng nghĩa (khơng ảnh hưởng đến chuỗi protein) và đa hình thay thế (thay đổi trình tự amino acid của protein). SNP khơng nằm trong vùng mã hóa protein vẫn ảnh hưởng đến sự liên kết gene, sự gắn kết yếu tố sao chép và sự thối hóa RNA.

SNP xảy ra thường xuyên trong bộ gene người. Trung bình xảy ra một lần trong mỗi 300nu , có nghĩa là có khoảng 10 triệu SNPs trong hệ gen của con người. Thông thường nhất những biến thể này được tìm thấy trong DNA giữa các gen. Nó được xem như là dấu chứng sinh học giúp xác định các vị trí gen liên quan đến bệnh. Khi SNP xảy ra trong gen hoặc trong khu vực gần một gene quy định nó có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự xuất hiện của bệnh bằng cách ảnh hưởng đến chức năng của gen.

1.3. Kỹ thuật di truyền phân tử xác định đột biến gen STXBP2 trong hội

chứng thực bào máu.

1.3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction) [10]

Kỹ thuật PCR được phát hiện bởi Kary Mullis vào năm 1980. PCR là một phản ứng

khuếch đại trình tự DNA được thực hiện trong điều kiện in vitro với sự tham gia của các

thành phần như: DNA mạch khuôn, dNTP (gồm 4 thành phần: dATP, dTTP, dGTP, dCTP, mồi, enzyme polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm).

Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì đều gồm 3 bước:

• Giai đoạn biến tính (denaturation) ở 90 - 98oC: Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands).Thời

gian biến tính trong một phản ứng PCR thường kéo dài trong khoảng 15 giây – 1 phút. • Giai đoạn gắn mồi (annealing): nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nóng

chảy của mồi – Tm) cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn DNA, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70°C (nhiệt độ cần cho sự bắt cặp đặc hiệu giữa mồi với mạch khuôn

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

là Ta, Ta < Tm khoảng 5°C). Thời gian bắt cặp trong một phản ứng PCR thường kéo dài trong khoảng 15 giây – 1 phút.

• Giai đoạn kéo dài hay tổng hợp (extension): nhiệt độ được tăng lên 72°C, là nhiệt độ tối ưu của DNA polymerase chịu nhiệt, thực hiện quá trình tổng hợp mạch DNA mới theo ngun tắc bổ sung với trình tự đích. Thời gian tổng hợp phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại. Thường thì thời gian tổng hợp trong phản ứng PCR kéo dài trong khoảng 30 giây đến nhiều phút.

Hình 1.7. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase.

Hình 1.8. Các chu kỳ của kỹ thuật PCR.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

1.3.2. Điện di

Là phương pháp định tính nucleic acid dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt phân tử nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường. Sự di chuyển này phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức là số nucleotide của phân tử), kiểu cấu trúc (mạch thẳng hay đơn, vòng hay xoắn) và nồng độ của chất cấu thành gel. Sau đó, các acid nucleic trong gel agarose sẽ phát quang dưới tia tử ngoại khi liên kết với chất nhuộm màu thường là ethidium bromide (EtBr) hoặc gel red.

1.3.3. Giải trình tự gen

Trình tự acid nucleic là một trình tự nối kết liên tiếp nhau theo một thứ tự xác định của các nucleotide. Việc xác định trình tự acid nucleic nhằm tìm hiểu bản chất của acid nucleic tương ứng với gen gì, có chức năng điều hịa hay phiên mã cho protein nào. Ngồi ra, nó cịn cho phát hiện chính xác các đột biến điểm, thay đổi nhỏ thêm hoặc bớt trên trình tự acid nucleic…

Các phương pháp xác định trình tự có thể kể đến như phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert, phương pháp enzyme của Sanger và cộng sự, phương pháp giải trình tự trực tiếp bằng máy tự động.

1.3.3.1. Phương pháp Maxam – Gilbert

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert khó thực hiện vì phải xác định nhiều thơng số cho thí nghiệm. Vì vậy, hiện nay người ta sử dụng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội.

1.3.3.2. Phương pháp Sanger [3]

Phương pháp Sanger được đưa ra bởi Frederick Sanger và cộng sự năm 1977. Nguyên tắc chung của phương pháp này là tổng hợp các đoạn DNA từ mạch DNA khn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide, có các đầu tận cùng là dideoxynucleotide (ddNTP) - một phân tử triphosphate nhân tạo có cấu trúc tương tự như phân tử deoxynucleotide (dNTP) nhưng ở carbon số 3 của đường deoxyribose không phải là

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

nhóm hydroxyl (-OH) mà là –H. Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, nếu một ddNTP có gắn đồng vị phóng xạ được gắn vào đầu 3’ của chuỗi tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừng lại do khơng hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotide tiếp theo. Do đó, phương pháp này còn được gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi.

Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacryamide biến tính. Sau khi điện di, cũng giống như phương pháp Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA.

1.3.3.3. Máy giải trình tự tự động dựa trên phương pháp Sanger cải tiến [9]

Máy giải trình tự tự động ngày nay sử dụng phương pháp Sanger với những cải tiến, trong đó, phản ứng giải trình tự với bốn ddNTP đánh dấu huỳnh quang được thực hiện trong cùng một microtube và được nạp vào máy giải trình tự sau khi đã tinh sạch DNA. Máy giải trình tự sẽ tự động nạp đầy gel vào vi ống rồi nạp mẫu DNA vào 1 đầu của vi ống, áp dung một hiệu điện thế lên vi ống để các đoạn DNA được phân tách trong gel và di chuyển về đầu còn lại của vi ống. Ở cuối vi ống có một cửa sổ quang học cho phép đầu đọc bằng tia laser ghi nhận từng vạch DNA di chuyển qua với mẫu huỳnh quang tương ứng. Tín hiệu này sẽ được máy tính chuyển thành sắc ký đồ (chromatograph) và trình tự tương ứng.

Hình 1.9. Sơ đồ quy trình giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động [49].

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Hình 1.10. Máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Mỹ).

1.3.4. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự Nucleotide 1.3.4.1. Cơ sở dữ liệu

Cơ sở dữ liệu là nơi tập hợp và lưu trữ một cách có tổ chức những thơng tin nghiên cứu về tính chất, cấu trúc của các phân tử sinh học, các dữ liệu về bộ gen và vô số những dữ liệu hữu ích khác. Sau q trình giải trình tự mẫu bệnh phẩm, tiến hành phân tích kết quả bằng cách so sánh trình tự thu nhận với cơ sở dữ liệu. Có nhiều nguồn dữ liệu cho việc phân tích: trình tự của những gen đã được công bố, cơ sở dữ liệu gen của tổ chức National Center for Biotechnology Information (NCBI). Trong đó, NCBI là cơ sở dữ liệu thường được lựa chọn vì quy mơ lớn và phổ biến rộng rãi. NCBI có giao diện liên kết đơn giản, dễ sử dụng với khả năng lưu trữ, tìm kiếm, so sánh và tính tốn nhanh chóng.

1.3.4.2. Phần mềm phân tích trình tự Nucleotide

Cơng cụ CLC Sequence Viewer được thiết kế vào năm 2005 với tên gọi ban đầu là CLC Free WorkBench bởi các nhà khoa học của CLC Bio. Năm 2008, phần mềm này được đổi tên lại thành CLC Sequence Viewer. Đây là phần mềm hỗ trợ cho phép người sử dụng dễ dàng thực hiện những phân tích dữ liệu trình tự DNA, RNA, và protein như: sắp gióng cột các trình tự, nhận biết vị trí cắt giới hạn của các enzyme, phân tích biểu hiện gen, thiết kế mồi, sao chép phân tử, phân tích phát sinh lồi, kết hợp với quản lý dữ liệu theo thứ tự.

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Mẫu nghiên cứu

Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân được chẩn đoán HLH theo tiêu chuẩn HLH - 2004 của Henter và cộng sự (2004) (Bảng 1.4) [23].

Mẫu máu sau khi thu nhận được bảo quản chống đông bằng EDTA hoặc citrate, giữ ở nhiệt độ phịng và nhanh chóng chuyển đến phịng xét nghiệm, tiến hành tách chiết.

2.1.2. Công cụ trực tuyến

NCBI ( ngân hàng cơ sở dữ liệu dùng cho việc khai thác

thông tin, thu thập các công trình nghiên cứu.

IDT ( cơng cụ trực tuyến

giúp đánh giá các thông số vật lý của mồi.

Primer-BLAST ( được sử dụng để

kiểm tra các thông số và độ đặc hiệu của mồi.

Polyphen2 ( công cụ tin sinh học giúp đánh giá các biến thể nucleotide có thể là đột biến hay SNP.

2.1.3. Phần mềm

Phần mềm CLC Main Workbench version 5.5 được sử dụng để thiết kế các cặp mồi

đặc hiệu cho 19 exon của gen STXBP2 và phân tích các kết quả giải trình các exon của

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Dựa vào các bài báo nghiên cứu chúng tôi tiến hành phân tích dữ liệu nhằm xác định

tính chất đột biến trên gen STXBP2, đồng thời đưa ra được phương pháp sinh học phân

tử phát hiện đột biến tốt nhất, phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.

2.2.2. Khảo sát in silico

2.2.2.1. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc

Thu nhận trình tự nucleotide gen STXBP2 trên cơ sở dữ liệu NCBI

( với mã số truy cập (accession number) là NG_016709 đồng thời xác định cấu trúc của gen.

2.2.2.2. Thiết kế - đánh giá mồi cho phản ứng PCR kết hợp giải trình tự

• Thiết kế mồi:

Để có thể khảo sát hết được các đột biến đặc biệt là các đột biến mới (có thể) lựa chọn an tồn nhất vẫn là sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự.

Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu nhằm khuếch đại các vùng exon của gen STXBP2 gồm

exon 1 – 4, exon 5 – 6, exon 7 – 13, exon 14 – 16, exon 17 – 19 bằng phần mềm CLC Main Workbench version 5.5 (phần mềm chuyên dụng cho phép thiết kế mồi của phản ứng PCR từ trình tự gen có sẵn) (Bảng 2.1).

Các công cụ trực tuyến Oligo Analyzer 3.1

( và Primer-BLAST ( được sử dụng để kiểm tra các thông số vật lý và độ đặc hiệu của mồi.

Cặp mồi được thiết kế có nhiệt độ gắn mồi xấp xỉ nhau đồng thời đạt các thông số lý thuyết theo yêu cầu. Sau khi kiểm tra các thông số vật lý và độ đặc hiệu của mồi, mồi sẽ được tổng hợp tại công ty IDT (Intergrated DNA Technologies, Mỹ).

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Bảng 2.1. Trình tự các mồi sử dụng để PCR khuếch đại các exon gen STXBP2.

Kích thước

mồi (bp)

Kích thước khuếch

đại (bp)

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Thực hiện phản ứng Cycle Sequecing

Tủa sản phẩm Cycle Sequencing

Đọc và phân tích kết quả Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

</div>