tài liệu thực hành môn thực hành hóa sinh bài 1 định tính protein và acid amin

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (283.72 KB, 60 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

- Làm được 6 phản ứng màu định tính protein và acid amin.

- Trình bày được nguyên tắc và làm được ký thuật sắc ký trên giấy để tách acid amin ra khỏi hỗn hợp của chúng.

Các phản ứng màu được sử dụng tại các labo Hóa sinh lâm sàng, trong nghiên cứu hóa sinh và thực hành Dược để xác định các protein và acid amin trong dich sinh vật, trên sắc ký đồ và điện di đồ; định lượng thuốc có bản chất protein và các sản phẩm thủy phân của protein. Chỉ số chất lượng chủ yếu đối với dịch thủy phân protein là hàm lượng của Tryptophan.

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Dung dịch protein trứng khoảng 1%: pha loãng 1 lịng trắng trứng với 15 thể tích nước cất, lọc qua vài lần vải gạc, bảo quản ở 4. Khi dùng pha loãng 0,1%.

- Dung dịch gelatin 0,1% trong nước.- Các dung dịch acid amin:

o Dung dịch glycin 0,1% trong nước.o Dung dịch tyrosin 0,1% trong nước.o Dung dịch tryptophan 0,1% trong nước.o Dung dịch cystein 0,1% trong nước.o Dung dịch isolrucin 0,1% trong nước.o Dung dịch aspartate 0,1% trong nước.o Dung dịch prolin 0,1% trong nước.

Hỗn hợp acid amin để chạy sắc ký: isoleucine, aspartate và prolin có nồng độ 1mg trong hcl n/10 cho mỗi acid amin ( có thể pha dung dịch 1% trong nước)

- Thuốc thử biuret ( pha đơn giản):o Dung dịch cuso4 1% trong nướco Dung dịch naoh 10% trong nước

- Thuốc thử ninhydrin 0,1% (để làm phản ứng màu):o Ninhydrin 0,1 g

o Ethanol 10 ml. hòa tan rồi thêm:o Nước cất vđ 100ml

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

- Thuốc thử Ninhydrin 0,2% trong ethanol 96 ( dể phun sắc ký).- Thuốc thử Miiion: pha trong hốt. hòa tan ở điều kiện lạnh: Thủy ngân 40 g

HNO3 đặc 57 ml

Đun cách thủy nhẹ, pha lỗng dung dịch với 2 thể tích nước. đẻ nắng, gạn lấy dịch trong. Bảo quản trong lọ màu.

- HNO3 đặc- H2SO4 đặc- CH3COOH đặc

- Dung dịch acetat chì (CH3COO)2Pb 5% trong nước

- Hỗn hợp Buoh: acoh: H2O ( 4: 1: 5). Trộn đều trong bình gạn, để lắng thành 2 lớp, gạn lấy phần trên (buoh bão hịa nước).

Dụng cụ và máy móc:

- Ống nghiệm nhỏ, giá- Pipet Pasteur

- Quả bóp cao su 2 ml hoặc 1 ml- Micropipette

- Đèn Cồn, nồi cách thủy

- Bình sắc ký (25 ×× 5 cm) có nút đậy kín.- Bình phun sắc ký

- Giấy sắc ký watman n01- Tủ sấy 1000C

Phản ứng này tạo phức có màu bền vững và ổn định, được dùng để định lượng protein.

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

Dung dịch gelatin 0,1% (giọt) 5

Lắc đều , phản ứng được coi là dương tính khi có màu tím rõ rệt.

1.1.2. phản ứng Ninhydrin xác dịnh nhóm α – amin

Nguyên tắc:

Ninhydrin là chất oxy hóa mạnh, khi đun nóng có khả năng khử amin oxy hóa và khử carboxyl của acid α – tạo Ninhydrin khử, CO2, NH3 và aldehyde bớt di 1 C so với acid amin ban đầu. Sau đó Ninhydrin và ninhydrin khử lại phản ứng tiếpvới nh3 tự do tạo thành phức hợp màu tím có độ hấp thụ cực đại ở = 570 nm. Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin.

Những acid amin khơng có nhóm α – amin cũng tạo phức hợp màu với Ninhydrin nhưng giải phóng CO2, với Prolin và Hydroxyl- Prolin, Ninhydrin cho màu vàng.

Tiến hành:

Cho vào lần lượt 4 ống nghiệm đánh số:

Dung dịch protein trứng 0,1 % (giọt)

Gelatin 0,1% 5

Đun sôi 2 phút sẽ thấy xuất hiện màu.

1.1.3. phản ứng Xanthoprotein xác định acid amin vòng:

Nguyên tắc:

Nhân thơm của acid amin vòng khi tác dụng với acid nitric sẽ tạo dẫn xuất dinitro màu vàng, trong môi trường kiềm được chuyển thành hợp chất muối dưới dạng quinoid có màu da cam.

Phản ứng này đặc trưng cho phenylalanin, Tyrosin và Tryprophan tồn tại dưới dạng tự do hay nằm trong hành phần của protein.

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Nhiều hợp chất khác chứa benzene hoặc phenol cũng cho phản ứng Xanthoprotein dương tính.

Đun cách thủy nhẹ (không qus 500C)

Quan sát sự hiện màu đặc trưng của Tyrosin (mau đỏ tía)

1.1.5. phản ứng Adamkiewich xác định Tryptophan:

Nguyên tắc:

Trong môi trường acid, tryprophan tác dungj với nhóm chức aldehyl của acid glyoxylic có trong acid acetic, hoặc của hydroxymethuyl furfural được hình thành từ fructose tạo thành hợp chất có màu theo các hản ứng ở trang sau:

Tiến hành:

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Tronh 4 ống nghiệm:

Dung dịch protein trứng 0,1% (giọt)

1.1.6. phản ứng Fohl xác định acid amin chứa lưu huỳnh:

Lắc đều. Đun sơi trực tiếp có màu xám đen do PbS tạo thành.

Báo cáo kết quả:

Theo bảng sau đay có ghi chú (+) hay (-):Số

Biuret Ninhydrin

Millon Adamkiewich

Fohl

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

Thí nghiệm 1.2.

SẮC KÝ ACID AMIN TRÊN GIẤY

Giới thiệu phương pháp sắc ký và ứng dụng thực tế trong hóa sinh:

Sắc ký là phương pháp dùng đẻ tách các thành phần của một hỗn hợp bằng cách cho di chuyển các thành phần cần phân tích trong một nội dung thích hợp (gọilà pha di động) trên một chất giá ( gọi là pha cố định). Dựa vào abanr chất khác nhau của pha cố định, người ta phân biệt các loại sắc ký:

- Sắc ký hấp thụ- Sắc ký phân bố

- Sắc ký lọc gel ( còn gọi là “Rây phân tử”)- Sắc ký ái lực

- Sắc ký trao đổi ion

Kỹ thuật sắc ký đơn giản là tiện lợi nhật là sắc ký phân bố trên giấy. Việc táchcó hiệu quả các cấu tử trong một hỗn hợp phụ thuộc vào cách chọn dung môi để tạo nên pha di động và pha cố định. Người ta thường sử dụng một dung mơi hai pha trong đó các pha phân cực và khơng phân cực khơng hịa lẫn nhau; hai dung môi được lắc kỹ trong một bình gạn, như vậy pha di động được bão hịa pha cố định và ngực lại. Ví dụ hệ dung mơi là phenol bão hịa nước trong đó nước và một lượng nhỏ phenol được hấp thụ trên các sợi cellulose tạo nên pha cố định, còn phenol bão hòa nước tạo nên pha di động.

Có nhiều kỹ thuật sắc ký giấy khác nhau: sắc ký từ trên xuống , sắc ký từ dưới lên, sắc ký một chiều, sắc ký hai chiều, sắc ký thẳng, sắc ký tròn.

Việc định tính các thành phần acid amin trong hỗn hợp được tiến hành bằng cách:

+ Chạy sắc ký song song với các acid amin mẫu, so sánh sự di chuyển của các vết nhờ thuốc thử Ninhydrin sau khi đã làm khô sắc ký đồ rồi sấy khô ở 1000C + Xác định tốc độ di chuyển của các acid amin trong hỗn hợp qua hệ số Rf của mỗi acid amin:

Trường hợp cần phân tích định lượng, có thể nói nhiều cách:

Cắt các vết trên sắc ký đồ, làm thôi màu bằng dung mơi thích hợp, sau đó định lượng bằng phương pháp so màu.

Định lượng trực tieps trên các sắc ký đồ bằng phương pháp đo mật đô quang của vết sắc ký, nồng độ của chất tỷ lệ thuận với mật độ quang.

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Phân tích các acid amin tự do trong huyết thanh, nước tiểu và các dịch sinh vật khác bằng phương pháp sắc ký được sử dụng trong lâm sàng để chuẩn đoán các bệnh rối loạn chuyển hóa acid amin di truyền, bệnh gan thận, và để thăm dò sự tiếntriển của bệnh đái đường tụy. Trong ngành Dược, phương pháp sắc ký acid amin được sử dụng để kiểm nghiệm chất lượng của các dịch thủy phân protein và các chế phẩm acid amin hỗn hợp.

Tiến hành:

Sắc ký trên giấy tách một hỗn hợp gồm 3 acid amin (Ile, Pro, Asp):

- Cắt một giải giấy sắc ký tương ứng với kích thước của bình sắc ký. Chú ý khong chạm nhiều ngón tay vào giấy.

- Dùngbút chì vẽ nhẹ một đường ngang cách mép dưới tờ giấy khoảng 2cm. Khoanh một vịng trịn ở chính giưa có đường kính 3mm.

- Dùng micropipet chấm 3 lần vào vịng khoanh đó (tương ứng 0,2 ml dung dịch hỗn hợp gồm 3 acid amin). Làm khơ vết chấm. Móc đầu treenn của giấy vào lắp đậy của bình. Chú ý ước tinh vị trí móc của giấy cho thích hợp sao cho giấy khơng bị chạm vào đáy hoặc thành bình.

- Đổ dung môi (BuOH: AcOH : H2O / 4:1:5) vào bình sắc ký. Để bão hịa hơi dung mơi trong 5-10 phút. Đặt cẩn thận giấy sắc ký đã chấp vào bình. Vết chấm không được chạm vào bề mặt của dung môi. Nút kín. Đặt bình sắc ký cố định, thẳng góc với mặt bàn.

- Khi dung môi đã thấm đến gần mép trên của giấy sắc ký, lấy giấy ra. Đánh dấu tiền tuyến dung môi. Làm khô trong tủ sấy ở 100-1050 trong 5-10 phút.

- Hiện màu sắc kỳ độ: treo giấy lên giá, phun thuốc thử Ninhydrin ( hoặc tráng giấy vào đĩa Petri chứa khoảng 15 ml dung dịch Ninhydrin). Đặt vào tủ sấy cũng ở nhiệt độ trên trong 5 phút.

Báo cáo kết quả:

Đo khoảng cách a và b. Xác định Rf của từng acid amin, suy ra thành phần acid amin trong hỗn hợp. So sánh với kết quả với Rf chuẩn của Ile (0,61), Pro (0,27), Asp (0,16).

Bài 2:

NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT HĨA LÝ CỦA PROTEIN

Mục tiêu:

- Xác định được điểm đẳng điện của protein.

- Làm được 5 thí nghiệm chứng ming những tác nhân gây biến tính protein- Phân lập được protein bằng phương pháp diêm tích.

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Tính chất hóa lý đặc hiệu của protein là cơ sở của một kỹ thuật đã đươc áp dụng trong các phịng thí nghiệm Hóa sinh, thực hành Dược và Hóa sinh thực nghiệm nhằm phân lập, phân chế và phân tích định tính, định lượng protein.

Thí nghiệm 2.1.

XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN

Xác định điểm đẳng điện của protein (ký hiệu là pHi hay pI) của từng protein cho phép lựa chọn điều kiện kết tủa chúng ra ra khỏi các dịch chiết sinh học chứa protein làm thuốc.

Protein la chất lưỡng tính mang cả điện tích dương và điện tích âm phụ thuộc vào số acid amin kiềm và acid trong phân tử protein. Điện tích trên phân tử protein là yếu tố ổn định trong dung dịch vì nó ngăn chặn q trình đơng vón và kết tủa của các tiểu phân protein. Điện tích này do pH của mơi trường quyết định. Mỗi protein được đặc trưng bởi giá trị pH ở đó tổng điện tích dương và âm của protein cân bằng nhau và điện tích tổng cộng bằng 0, pH đó được gọi là điểm đẳng điện (isoelectric point).

Nguyên tắc:

Ở pH = Ip, protein kém bền vững nhất và dễ dàng kết tủa khi cho thêm chất khử như: alcol, aceton, amoni sulfat hoặc tanin. Sử dụng một thang dung dịch đệm có pH khác nhau đã được xác định, với sự hỗ trợ của chất khử nước là tanin, dung dịch đệm nào cho tủa protein mạnh nhất chứng tỏ pH của nó gần với pI của proteinnhất. Một vài protein, ví dụ Casein, tủa ở pI mà không cần thêm chất khử nước.

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Dung dịch đệm acetat có pH=3,6-5,8 được pha heo bảng sau:Ống

CH3COOH 0,2M(ML)

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

dụng cụ và máy móc:

- Pipet 1 ml- ống nghiệm nhỏ

tiến hành:

Dùng 5 ống nghiệm ghi số:

Lắc đều. Để 5 phút. So sánh đục củacác ống trước và sau khi cho tannin: phânbiệt mức độ đục (khơng đục, đục ít, nhiều, rất nhiều).

Thí nghiệm 2.2.

SỰ BIẾN TÍNH CỦA PROTEIN

Sự biến tính của protein được ứng dụng trong các xét nghiệm lâm sàng, trong kiểm nghiệm thuốc và thực nghiệm hóa sinh như:

- Kết tủa protein trong các nguyên liệu sinh vật để tiếp tục nghiên cứu cấu trúc và tính chất sinh học của chúng.

- Định tính và định lượng protein trong các dịch chiết và dịch sinh vật (dặc biệt là phản ứng xác định protein niệu để thăm dò chức năng thận).

- Giải độc muối kim loại nặng (Hg, Cu, Pb) bằng protein (trứng, sữa) trong trường hợp cơ thể chưa kịp hấp thu hoặc có thể sử dụng trong phòng bệnh cho những người phải tiếp xúc với hóa chất này.

Những tác nhân gây phá vỡ cấu trúc (bậc IV, bậc III và thậm chí cả bậc II) của phân tử protein sẽ làm mất tính hóa lý và tính chất sinh học, gây ra sự biến tínhcủa protein:

+Yếu tố hóa học (acid, ion kim loại nặng, alkaloid, tác nhân diện hoạt) và yếu tố vật lý (nhiệt độ, bức xạ ion hóa, tia tử ngoại) là 2 yếu tố gây biến tính lớn nhất. +Yếu tố sinh học có thể do các enzyme thủy phân protein thủy phân protein (tryspin) làm phá hủy phân tử protein ở mức cao hơn trước ki các liên kết peptid bịthủy phân.

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Sự biến tính của protein có ảnh hưởng đến tính chat sinh học và tính chất hóalý của nó đặc biệt là tính chất hịa tan.

Dung dịch keo protein bền vững là nhờ có 2 yếu tố: tiểu phân protein tích điện vào lớp áo nước. vì vậy protein sẽ dễ dàng kết tủa nếu làm mất 2 yếu tố đó: - Làm mất điện tích protein bằng cách:

+ Đưa pH của dung dịch protein tới gần pI của nó, lúc này đa số protein ở dạng lưỡng cực, khơng mang điện tích.

+ Thêm chất điện giải như NaCl, (NH4)2SO4 để trung hịa điện tích của protein.

Thuốc thử và vật liệu thí nghệm:

- Dung dịch protein trứng khơng có NaCl: lọc lòng trắng trứng gà qua vải thưa (để loại các chất nhờn). trộn lẫn một thể tích lịng trắng với 15 thể tích nước cất. trộn kỹ rồi lọc lại sẽ thu được dung dịch protein khoảng 1%. Bảo quản ở 4oC

- Dung dịch Acid acetic 1% và 10%- Dung dịch NaOH 10%

- Dung dịch NaCl bão hòa (độ hòa tan của NaCl ở 100oC là 39,2g; ở 0oC là 35,6g).

- Acid nitric đặc

- Dung dịch Acid trichloracetic 10%- Dung dịch acid sulfosalicylic 20%- Dung dịch CuSO4 1% trong nước

- Dung dịch Pb(CH3COO)2 5% trong nước- Ethanol 96o

- Aceton

Dụng cụ:

- Ống nghiệm nhỏ.- Pipet 5 hoặc 10 ml

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

- Pipet Pasteur- Bơm ca su 1-2 ml- Phễu nhỏ.

- Giấy lọc

2.2.1. biến tính protein băng nhiệt độ

Protein bị kết tủa khi đun sơi trong mơi trường trung tính hay acid yếu vì bị mất lớp áo nước và vì phần lớn protein có pI ≈ 5 ( trừ protamine và Histon có chứa nhiều acid amin kiềm nên có pI ≈ 8), nếu cho thêm chất điện giải cũng làm trung hịa điện tích gây tủa protein dễ dàng hơn.

Đun sôi các ông nghiệm và nhận xét sự kết tủa.

2.2.2. Biến tính protein bằng acid vơ cơ mạnh

Dưới tác dụng của acid vô cơ đậm đặc, protein bị kết tủa. tủa sẽ hòa tan trở lại khi cho thừa acid, trừ acid nitric. Vì vậy HNO3 được sử dụng để định tính và định lượng protein trong nước tiểu.

Tiến hành:

Tủa protein bằng HNO3 và H2SO4. Dùng 2 ống nghiệm:

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

1 2 Dung dịch protein 0,1% (giọt) 5 5 HNO3 đặc (giọt) rỏ từ từ vào thành ống

2.2.3. Biến tính protein bằng acid hữu cơ.

Phản ứng kết tủa protein bằng acid hữu cơ xảy ra khơng thuận nghịch. Trong labo hóa sinh thường dùng:

- Acid trichloracetic (CCl3COOH) để kết tủa protein nhưng không kết tủa peptit và acid amin nên được dùng để khử tạp protein ra khỏi huyết thanh trong các xét nghiệm định lượng các chất phi protid như ure, acid amin, aciduric… Sau đó muốn loại bỏ nó ra khỏi dịch lọc chỉ cần đun sơi vì acid này sẽbị hủy thành CHCl3 và CO2.

- Acid sulfosalicylic [C6H3(OH)(COOH)SO3H] được dùng để phát hiện protein trong nước tiểu và các dịch sinh vật khác.

Tiến hành:

Cho vào 1 ống nghiệm:

Dung dịch protein 0,1 %...5 giọt Dung dịch acid tricloracetic 10%...2 giọt Sẽ thấy tủa trấng của protein.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

2.2.4. Biến tính protein bằng muốn kim loại nặng

Ion kim loại nặng có khả năng gắn vaodf các nhóm chức ở mạch nhánh của acid amin trong phân tử protein làm phá vỡ cấu trúc không gian củ gây tủa. nếu cho thừa muối kim loại nặng (trừ AgNO3 và HgCl2), tủa sẽ tan trở lại do hấp thụ các ion kim loại tạo điện tích dương trên phân tử protein.

2.2.5. biến tính protein bằng dung mơi hữu cơ

Protein kết tủa bông ha bị vẩn đục trong dung môi hữu cơ alcol, aceton, ether… do bị mất lớp áo nước. tủa càng dễ dàng nếu có thêm các chất điện giải và mơi trường trung tính hay hơi acid. Kết tủa protein bằng dung mơi hữu cơ có thể thận nghịch nếu được tiến hành ở nhiệt độ thấp (-15oC đến 0oC), trong thời gian ngắn và được tách nhanh ra khỏi dung môi.

Tiến hành:

Cho vào 1 ống nghiệm:

Dung dịch protein trứng 0,1% ……….5 giọt Ethanol 95o……….15-20 giọt

Dung dịch sẽ vẩn đục. Cho thêm:

NaCl bão hòa……….1 giọt

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Tủa protein xuất hiện rõ rệt.

Thí nghiệm 2.3.

PHÂN LẬP PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DIÊM TÍCH

Diêm tích à phương pháp dùng các muối trung tính có nồng độ cao như NaCl,(NH4)2SO4… để trung hịa điện tích và protein. Các protein khác nhau sẽ tủa ở cácmuối khác nhau, vì vậy có thể tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp. Ví dụglobulin có trọng lượng phân tử lớn hơn và trong dung dịch nó tích điện (-) ít hơnalbumin, do dó kết tủa ở nồng độ sulfat amon do tác dụng khử nước kém hơn, vìvậy muốn tủa được globulin phải dùng nồng độ NaCl bão hòa.

Sự kết tủa này la thuận nghịch, khi giảm nồng độ muối bằng cách pha lỗnghay thâm tích thì albumin và globulin sẽ hịa tan trở lại. kết tủa bằng cách này,protein không bị biến tính, nghĩa là các tính chất hóa lý và sinh học không bị thayđổi. người ta thường dùng phương pháp này để chiết tách các protein có hoạt tínhsinh học làm thuốc hay nghiên cứu.

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Dung dịch protein trứng: khuấy kỹ 3 lòng trắng trứng trong 1000 ml nước.Lọc qua vài lớp vải gạc. (Tương ứng với protein 1%).

- Dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa- Bột (NH4)2SO4 bão hòa

- Bột (NH4)2SO4 mịn- Bột NaCl mịn

- Dung dịch CH3COOH 1% (AcOH 1%)

- Thuốc thử Biuret (dd NaOH 10% và CuSO4 1%)

Dụng cụ và máy móc:

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

- ống nghiệm- pipet 5 ml- Pipet Pasteur- Phễu nhỏ- Giấy lọc

Tiến hành:

 Diêm tích albumin và globulin bằng NaCl:

- Trong ống nghiệm cho 2 ml dung dịch protein trứng 1%. Thêm bột NaCl đến bãohịa hồn tồn (cịn một ít bột khơng tan). Sau vài phút, globulin sẽ tủa.

- Lọc bỏ tua globulin. Dịch còn lại là albumin (khơng tủa trong NaCl bãohịa). Thêm vào dịch lọc 1 giọt AcOH 1% rồi đun sôi, albumin sẽ kết tủa. sau vàiphút, lọc loại tủa albumin. Làm phản ứng Biuret tìm protein trong dịch lọc. phảnứng dương tính hayb âm tính?

 Diêm tích albumin và globulin bằng (NH4)2SO4

- Trong ống nghiệm cho 2 ml dung dịch protein trứng 1%, thêm 2 ml dungdịch sulfat amon bão hòa, globulin sẽ tủa. Sau 5 phút, lọc để loại tủa globulin.Trong dịch lọc cìn lại albumin. Thêm một ít bột sulfat amon cho đến bão hịa (cịndư một ít khơng tan), tủa albumin sẽ nổi lên trên.

- Thêm nước cất vào ống nghiệm dể làm mất nồng độ bão hòa của sulfatamon. Tủa albumin sẽ hòa tan trở lại. dùng dung dịch hòa tan tủa ở trên làm phảnứng Biuret:

Trong 1 ống nghiệm cho: 10 giọt dịch hòa tan 10 giot thuốc thử biuretLắc đều, quan sát màu của ống thử. Giải thích.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Bài 3:

ĐỊNH LƯỢNG N- PROTEIN

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA PROTEIN TẠP

Mục tiêu:

1. Định lượng N- protein huyets thanh bằng phương pháp Kjeldahl.

2. Thủy phân và làm được các phản ứng định tính, xác định thành phần củanucleoprotein.

3. Chiết xuất, thủy phân và làm được các phản ứng định tính xác định thànhphần của Phosphoprotein.

Các phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để định lượng protein trong cácnguyên liệu sinh vật và thuốc là:

- Phương pháp định lượng nitơ (azotometry)

- Phương pháp đo độ đục bằng quang kế (Photonephelometry)- Phương pháp dùng quang phổ kế (Spectrophotometry)

Trong bài này chỉ hướng dẫn kỹ thuật định lượng N- protein bằng phương phápKjeldahl.

Protein tạp có chứa trong phân tử ít nhất 2 thành phần hóa học khác nhau, nốivới nhau bằng các liên kết công hóa trị hoặc liên kết yếu (liên kết ion, hydro,vander Waals…), Glycoprotein hay proteoglycan, Lipoptein hay proteolipid,Metalloprotein, Phosphoprotein và Nucleoprotein. Để định lượng protein tạp trongnguyên liệu sinh vật có thể dựa vào thành phần protein và nhóm ngoại trong phântử ( nhóm prosthetic) vì nhóm này đặc hiệu cho mỗi loại protein tạp.

Thí nghiệm 3.1.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

ĐỊNH LƯỢNG N PROTEIN HUYẾT THANHBẰNG PHƯƠNG PHÁP KJENDAHL

Nói chung N chiếm khoảng 16% tổng số protein, nếu nhân lượng N đã đượcxác định với hệ số 100 : 16 = 6,25 sẽ cho nồng độ protein trong mẫu phân tích. Đốivới các protein khác nhau tỷ lệ % N có thể thay đổi từ 14% đến 19%.

Nồng độ protein huyết thanh bình thường là 65-85g/l, thayb đổi nhiều mỗi khicó các tình trạng rối loạn chuyển hóa trong cơ thể:

- Nồng độ protein huyết thanh tăng do nmaats nước (nôn kéo dài, bệnh tả,bỏng sâu) và trong một số quá trình nhiễm khuẩn mạn (viêm khớp và viêm đakhớp).

- Nồng độ protein huyết thanh giảm trong các trường hợp thiếu dinh dưỡngprotein (đói hay tắc ruột), rối loạn chức năng sản xuất protein ở gan do ảnh hưởngcủa các chất độc hóa học, do bệnh lý khối u ác tính hay nhiễm khuẩn kéo Dài, cơthể bị mất protein do chảy máu, tăng tính thấm thành mạch, uy thận, có thai,….

Trong thực hành dược, các phương pháp định lượng protein cần cho việckiểm nghiệm chất lượng thuốc có chứa protein như vaccin, huyết thaqnh tiêmtruyền, globulin, các chế phẩm protein có nguồn gốc động vật hay hực vật khác.

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Huyết thanh pha lỗng 1/10.- H2SO4 đặc.

- Hỗn hợp xúc tác : CuSO4 + K2SO4 (1:2) hoặc 200 mg CuSO4 + 1- 2 mgHgO

- H2SO4 N/50- NaOH N/50

- Chỉ thị mầu Tashiro: khi dùng trộn 2 dung dịch đỏ Methyl 0,1% trong alcol:2 phần, xanh Methylen 0,1% trong alcol: 1 phần.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

―> Chỉ thị mầu Tashiro chuyển từ tím sang xanh lá cây.- NaOH đặc (40%)

- Dung dịch mẫu Oxalat amon 0,441g % (1ml = 1mg N)- Phenolphthalein 1 % trong alcol.

- Buret định lượng

Nguyên tắc:

Dùng H2SO4 đặc để vơ cơ hóa các ngun liệu động vật hay thực vật (huyếtthanh, dịch nghiền tổ chức…). các chất hữu cơ bị đốt cháy tạo CO2, nước vàammoniac dưới dạng (NH4)2SO4. Cho NaOH phản ứng với sulfat amon để giảiphóng NH3. NH3 được cất kéo chuyển tới bình nón đựng H2SO4 chuẩn độ. Chuẩnđộ H2SO4 thừa bằng NaOH chuẩn độ.

Làm song song với mẫu trắng để kiểm tra lượng NH3 có trong nước, khơngkhí và thuốc thử. Hiệu số giữa kết quả chuẩn độ của mẫu thử và mẫu trắng chính làlượng acid thực tế đã phản ứng với NH3 giải phóng từ mãu ngun liệu đã vơ cơhóa. Từ đó xác định hàm lượng Nitơ và suy ra lượng protein có trong ngun liệu.

Tiến hành:

- Vơ cơ hóa: cho vào bình phản ứng (bình Kjeldahl):

Huyết thanh pha loãng 1/10 1 ml Hỗn hợp xúc tác 0,5 g

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

H2SO4 đặc (rỏ từ từ theo thành bình) 1 ml.

Đun từ từ hỗn hợp trực tiếp trên ngọn lửa, trong hốt. khi hỗn hợp cuyển sangdịch lỏng có thể đun mạnh. Đặt một phễu nhỏ lên miệng bình để cản hơi acid.Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ. Sau khoảng 15 phút, dung dịch sẫm mầulại rồi trong dần. khi dung dịch hồn tồn trong xanh, là q trình vơ cơ hóa đãhồn thành.

- Chuẩn bị máy vi định lượng Kjedahl (hình 3.1).

Máy vi định lượng Kjedahl gồ 2 phần:

+ Bình phản ứng (1) đựng dung dịch cần định lượng đã vơ cơ hóa. Bihfnày được nối với một phễu (2) có khóa Mohr (3).

+ Ống sinh hàn (4) có đầu trên nối với bình (1) và đầu dưới nhúng vàodung dịch H2SO4 chuẩn độ chứa trong bình nón (5).

+ Đỏ vào phễu (2) 5 ml NaOH 40% rồi mở từ từ khóa (3) để NaOH chẩy vàobình phản ứng (1), giữ lại một ít NaOH trên phễu, đóng khóa (3).

+ Đun bình phản ứng có mầu hồng bằng đèn cồn, amoniac giải phóng đượccất kéo theo hơi nước vào bình nón (chú ý ngọn lửa đèn cồn phải đều, nếu giảmnhiệt độ dung dịch trong bình nón có thể bị hút ngược vào bình phản ứng). cấttrong khoảng 15-20 phút, hạ bình nón và cất thêm 3 bình nữa. tráng phần cuối ốngsinh hàn bằng nước cất 2 lần cho chảy vào bình nón.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Tiến hành cất như trên với mẫu trắng (thay huyết thanh bằng nước cất).

- Định lượng amoniac: chuẩn độ H2SO4 N/50 thừa trong bình nón bằngNaOH N/50. Chỉ thị mầu chuyển từ tím sang xanh (1 giọt thừ dung dịch có màuxanh lá). Ghi số ml NaOH N/50 dùng cho mẫu thử (n1 ml) và mẫu trắng (n2=10 mlnếu được cất và thuốc thử khơng có amoniac). Hiệu số n giữa lượng acid ứng vớimẫu trắng và lượng acid ứng với mẫu thử chính là lượng acid thực tế đã tác dụngvới NH3 giải phốn từ mẫu thử.

Báo cáo kết quả :

Ghi kết qua hàm lượng protein huyết thanh qua hàm lượng N toàn phần.Đánh giá kết quả.

Thí nghiệm 3.2.

THỦY PHÂN VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦANUCLEOPROTEIN

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Nucleoprotein có nhiều trong lách, tuyến giáp, gan, các cơ quan và tổ chứckhác giàu tế bào có nhân. Phần protein chủ yếu là histon và protamin có tính kiềmvì trong thành phần có nhiều Arg, Lys, His… Acid nucleic là polynucleotid5’phosphodiester. Acid nuceic ít tan trong nước, dễ tan trong kiềm, acid vô cơ vàmuối của chúng.

Các phản ứng xác định thành phần của nucleoprotein dùng để xét nghiệm cácnguyên liệu sinh học có chứa nó.

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Men bia.- H2SO4 đặc

- Dung dịch H2SO4 5%- Dụng dịch NaOH 10%- Dung dịch CuSO4 1%- Amoniac đặc.

- Dung dịch nitrat bạc trong amoniac: thêm NH3 đặc vào dung dịch AgNO3

1-2% trong nước đến khi có tủa.

- Thuốc thử Molybdat: hòa tan 7,5 g molybdat amon trong 100 ml nước.Thêm 100 ml dung dịch HNO3 32% (tỷ trọng 1,2). Dung dịch tan hoàn toàn.

- Dung dịch Thymol 1% trong alcol 90o.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

- Phát hiện base purin: trong môi trừng kiềm, các base purin : Trong môitrường kieefm, các base purin tác dụng với AgNo3 tạo thành muối của chúng códạng tủa xốp trắng. Để lâu ngồi ánh sáng có màu xám.

- Phát hiện ribosse bằng phản ứng Molic: Khi tác dụng với H2SO4 đậm đặcpentose bị khử nước tạo dẫn furfurol , chất này kết hợp với Thymol hay α- naphtoltrong môi trường acid tạo môi trường ngưng kết có màu đỏ.

- Phát hiện acid phosphoric: bằng phản ứng tạo phosphomolybdat amon cómầu vàng chanh.

H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3 -- > (NH4)PO4.12MoO3↓+ 21NH4NO3 + 12H2O Tinh thể vàng

Tiến hành:

- Thủy phân nucleoprotein (cho 1 nhóm 2 người): trong một ống nghiệm lớn:

500 mg men bia đã nghiền nhỏ. 10 ml H2SO4 5%

Trộn đều, đậy ống nghiệm bằng ống sinh hàn ngược, đun cách thủy sôi trong1 giờ. Để nguội, lọc qua giấy lọc. lấy dịch lọc để thử các phản ứng:

- Xác định thành phần của nucleoprotein:

+ Phản ứng Biuret: cho vào ống nghiệm:

Dịch thủy phân 5 giọt Dung dịch NaOH 10% 10 giọt Dung dịch CuSO4 1% 1 giọt Lắc nhẹ ----> Xuất hiện màu tím hồng.

+ Phản ứng xác định base purin: Cho vào ống nghiệm:

Dịch thủy phân 5 giọt

NH3 đặc 2-3 giọt (kiemf vớigiấy quỳ)

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

AgNO3 2% 1-2 giọt Xuất hiện tủa xốp trắng chuyển thành màu nâu xám khi ra ngoài ánh sáng + Phản ứng Molic xác định pentose: Cho vào ống nghiệm

Dịch thủy phân 7 giọt Dung dịch Thymol 1% trong alcol 1 giọt

Lắc đều, thêm từ từ 1 thể tích H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Xuất hiện sản phẩm ngưng kết mầu đỏ ở lớp ngăn cách.

+ Phản ứng xác định acid Phosphoric : Cho vào ống nghiệm: Dịch thủy phân 5 giọt Thuốc thử Molybdat 10 giọt Đun sôi vài phút ---> xuất hiện màu vàng chanh.

Để nguội ---> Kết tủa tinh thể vàng của Phosphomolybdat amon.

Báo cáo kết quả: (+) hay (-)

CHIẾT XUẤT VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA CASEIN

Casein là protein của sữa có chứa các acid amin cần thiết. Trong sữa nó gắnvới H3PO4 và với Ca++. Thí nghiệm này được ứng dụng để chiết xuất và kiểmnghiệm các sản phẩm sinh học có chứa phosphoprotein.

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Sữa.

- Dung dịch CH3COOH 10%- Bột casein

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

- Dung dịch NaOH hay KOH 10%- HNO3 đặc

- Các thuốc thử tím protein (thuốc thử Biuret, Millon, Adamkiewich).- Thốc thử Molybdat.

Dụng cụ máy móc:

- Ống nghiệm to có nút cắm ống sin hàn ngược- Ống nghiệm nhỏ

- Giấy quỳ- Đèn cồn.

Nguyên tắc:

Casein trong sữa kết hợp với Ca++ ở dạng hịa tan. Khi acid hóa vừa đủ, caseinbi tủa. Thủy phân casein bằng KOH 10%. Kết tủa protein bằng acid, xác định tủaprotein bằng các hản ứng mầu. Tìm H3PO4 trong dịch lọc bằng phản ứng molybdat.

Đun sôi dung dịch từ 30 phút đến 60 phút. Để nguội. trung hòa dịch thủy phânbằng HNO3 đặc (12-15 giọt) cho tới phản ứng acid yếu với giấy quỳ, sẽ tạo tủa

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

albumin, pepton là sản phẩm trung gian của sự thủy phân protein. Lọc bỏ tủa, lấydịch làm phản ứng với thuốc thử Molybdat cho mầu vàng chanh.

- Làm được các thí nghiệm về Oxydase Catalase.

Bài này giúp hiểu rõ những điều kiện hoạt động tối thích của enzym hoặc xácđịnh hoạt độ của enzym phục vụ cho nghiên cứu thực nghiệm và xét nghiệm lâmsàng. Ngồi ra nó cịn giúp tiêu chuẩn hóa các chế phẩm enzym làm thuốc. Khôngxác định đúng những điều kiện chuẩn của enzym sẽ dẫn đến hậu quả chuẩn đoánbệnh nhầm lẫn và kiểm nghiệm sai chất lượng của các chế phẩm enzym.

Thí nghiệm 4.1.

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM

Enzyme có bản chất protein nên cũng dễ bị biến tính. Do đó phải lựa chọn cácđiều kiện thích hợp để phân lập enzym từ những nguồn nguyên liệu khác nhau (tổchức động vật và thực vật, vi khuẩn và các dịch sinh học), nghĩa là phải thực hiện ởnhiệt độ từ 0-4oC và pH 5-9 (trừ những trường hợp đặc biệt). Môi trường sử dụngđể tách chiết enzym phải tuyệt đối khơng có các ion kim loại nặng vì chỉ cần cómặt một lượng rất nhỏ cũng đã làm giảm hoặc mất hoạt tính của enzym.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Các thí nghiệm dưới đây được tiến hành với amylase của nước bọt dựa vàophản ứng thủy phân của amylase trên tinh bột và được theo dõi bằng phản ứng củadịch thủy phân với iod trên khay sứ có lỗ.

4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nguyên tắc: Nhiệt độ của moi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính của enzym.Ở nhiệt độ thích hợp (40 – 450C đối với đa số enzym) hoạt tính của enzym là lớpnhất. Càng xa nhiệt độ thích hợp, hoạt độ của enzym là lớn nhất. Càng xa nhiệt độthích hợp, hoạt độ của enzym càng giảm, ở 00C enzym hầu như không hoạt động.

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Dung dịch tinh bột 1% trong nước.- Dung dịch Iod 5 mmol/L trong KI 3%.- Nước bọt pha loãng 1/20 với nước.

Lắc đều để các ống tiếp tục ở các nhiệt độ trên .

Lấy ngay 1 giọt dịch trong ống 3 để làm phản ứng mầu với Iod trên lỗ đầutiên của khay sứ. Sau đó cứ 1 phút lặp lại phản ứng của ống 3 với Iod cho đến khi

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

nó khơng làm chuyển mầu của Iod nữa thì ngừng lại. Cho ngay vào cả 3 ống, mỗiống 2 giọt Iod.

Quan sát mầu của các ống, giải thích keets quả.

4.1.2. Ảnh hưởng của pH.

Nguyên tắc: pH của môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của enzym.Hoạt tính của enzym đươc thể hiện mạnh nhất ở một vùng pH tương đối hẹp gọi làpH tối thích.

Theo dõi hoạt độ của amylase ở những môi trường pH khác nhau từ đó rút rapH tối thích của enzym này.

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

Acid Citric 0,1M(ml)

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

4.1.3. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế

Chất hoạt hóa là chất làm tăng hoạt động xúc tác của enzym, còn chất ức chếlà chất có khả năng làm giảm hoặc mất hoạt động xúc tác của enzym.

Nguyên tắc:

Theo dõi hoạt động xúc tác của Amylase trong điều kiện bình thường và khicó mặt của NaCl và CuSO4 để xem chất nào là chất hoạt hóa, chất nào là chat ứcchế đối với enzym đó.

Thuốc thử:

- Nước bọt pha lỗng 1/10 trong nước.- Dung dịch tinh bột 1% trong nước- Dung dịch Iod 5 mmol/L trong KI 3%- Dung dịch NaCl 1% trong nước

- Dung dịch CuSO4 1%.

Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm:

- ống nghiệm

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

- Pipet 5 hoặc 10 ml- Pipet Pasteur

Lắc đều, để cả 3 ống ở nhiệt độ phịng trong 20 phút. Sau đó cho vào cả 3ống, mỗi ống 2 giọt Iod. Lắc đều, quan sát và giải thích kêt tủa thí nghiệm.

Thí nghiệm 4.2.

TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYM

Khác với các chất xúc tác thông thường, enzym có tính đặc hiệu cao. Tuynhiên để thích nghi được với những thay đổi của môi trường, mỗi enzym ở nhữngtế bào khác nhau thì có tính đặc hiệu khác nhau. Thí nghiệm sau đây nghiên cứu vềtính đặc hiệu cơ chất của Amylase và Saccarase.

Các enzym này có tính đặc hiệu tương đối và tuyệt đối thường xẩy ra trongq trình thủy phân thức ăn hay chuyển hóa các hợp chất ngoại lai.

Nguyên tắc:

Nói chung mỗi enzym chỉ tác dụng trên một cơ chất nhất định. Amylase vàSaccarase đều là enzym thủy phân liên kết glucosid, nhưng Saccarase chỉ thủyphân Saccarase mà không thủy phân được tinh bột, trong khi Amylase chỉ thủyphân tinh bột mà không tác dụng lên Saccarase. Amylase cũng không thủy phânđược Cellulose.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Tinh bột + nH2O

Saccarase + H2O ---

Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm:

- Dung dịch saccarose 1% trong H2O.- Dung dịch tinh bột 1% trong nước.- Dung dịch Iod

- Thuốc thử Fehling

- Nước bọt pha loãng 1/20 trong nước.

- Dung dịch saccarase: nghiền 10 g men bia thành bột mịn. thêm50 ml nước cất, khuấy kỹ, lọc lấy dịch, bao quản trong tủ lạnh.

- Dung dịch Celluose 1%

Dụng cụ máy móc:

- Ống nghiệm- Máy điều nhiệt

DD Fehling (A+B) 1ml (hoặc 0,5ml A + 0,5ml B)