Luận văn : XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE part 7 ppsx

110


Bảng 4.1: Dữ liệu microsatellite thu được với 3 primer
Thứ tự

Tên dòng

mTcCIR 8

mTcCIR 11

mTcCIR 15

A1 A2 A1 A2 A1 A2
1

BAL 209

288

290

298

305

252

254

2 BAL 244 292

292 295 314 244 246
3

BR 25

302

305

298

308

235

244

4 KKM 225

286

286 295 298 235 244
5 PBC 123 288

290 295 305 235 250
6 PBC 154 288

305 298 305 232 252
7 PBC 157 288

302 295 305 235 250
8

PBC 159

288

302

298

305

235

244

9 PBC 230 286

288 305 314 235 250
10

PBC 236

290

290

298

305

235

250

11 QH 1213 288

290 295 298 252 254
12 QH 22 288

302 295 298 232 252
13

QH 441

288

288

295

295

232

252

14 CT1 288

288 141 314 248 250
15

CT3

288

29
0

141

305

244

248

16 CT4 269

269 150 150 242 252
17

CT5

288

294

305

314

244

248

18 CT6 288

288 288 314 252 252
19 CT7 286

294 141 314 248 250
20

CT8

288

288

288

288

248

250

21 CT9 286

286 150 314 248 250
Bảng 4.2: Dữ liệu microsatellite thu được với 2 primer
Thứ tự Tên dòng
mTcCIR 7 mTcCIR 18
A1

A2

A1

A2

1 BAL 209 155 157 344 346
2 BAL 244 157 157 337 344
3 BR 25 153 155 331 344
4 KKM 225 153 155 331 346
5 PBC 123 155 157 331 342
6 PBC 154 153 157 342 344
7

PBC 157

155

157

331

346

8 PBC 159 155 157 331 346
9 PBC 230 155 157 331 342
10 PBC 236 153 157 342 344
11 QH 1213 153 157 344 346
12 QH 22 153 157 342 344
13 QH 441 157 157 342 344
14

CT1

153

153

335

344

15

CT3

153

157

333

344

16 CT4 153 157 333 335
17 CT5 153 157 333 335
18 CT6 155 157 344 344
19 CT7 153 153 342 342


111

20 CT8 153 153 342 342
21 CT9 153 153 335 342
 Allele dropping
Allele dropping là những al chỉ xuất hiện 1 lần trong 3 lần lặp lại thí nghiệm.
Đó là những al xuất hiện không ổn định, có thể do nồng độ mẫu quá thấp, hoặc bị
tạp nhiễm với 1 kiểu gen khác trong quá trình thí nghiệm, hoặc do việc thêm vào
một nucleotid adenosine (A) vào đầu 3’ của đoạn DNA khuếch đại (Smith et al.,
1996), hoặc do lỗi phân tích của máy ABI 3100. Những al đó cần được ghi nhận để
loại bỏ trong những lần phân tích sau.
Trong quá trình thí nghiệm, một số mẫu được lặp lại 2-3 lần với cùng một
primer để tìm nồng độ pha loãng thích hợp và để định danh lại mẫu mã hóa. Từ đó,
chúng tôi ghi nhận được sự xuất hiện allel dropping của một số dòng như sau:
 Dòng PBC 159 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 246.
 Dòng PBC 154 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15:al 244.
 Dòng PBC 154 có 1 allele dropping với primer mTcCIR18:al 331.
 Dòng BAL 209 có 1 allele dropping với primer mTcCIR18:al 331.
Có 6 mẫu dưới đây chỉ mới lặp lại thí nghiệm 2 lần, do đó cần lặp lại thí

nghiệm một lần nữa để khẳng định allele dropping, bao gồm:
 Dòng BAL 209 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 295.
 Dòng PBC 123 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 244.
 Dòng QH 441 có 1 allele dropping với primer mTcCIR15: al 244.
 Dòng QH 441 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 298
 Dòng BAL 244 có 1 allele dropping với primer mTcCIR11: al 150.
 Dòng QH 1213 có 2 allele dropping với primer mTcCIR15: al 235, al 244.









Al dropping 246


112


Hình 4.4: Giống PBC 159 có 1 allele dropping 246 với primer mTcCIR15.
4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóa
Với dữ liệu microsatellite của 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8
(bảng 3.7), chúng tôi tiến hành định danh bằng cách phân tích mức độ đồng nhất di
truyền giữa 13 mẫu mã hóa với 13 dòng cacao tương ứng với chúng bằng phần
mềm Cervus dựa trên các chỉ tiêu sau:
 3 loci được đưa vào phân tích.
 Có ít nhất 2 loci có al hoàn toàn giống nhau.

 Số loci sai khác cho phép là 1.
Sự chênh lệch giữa số lượng loci đưa vào phân tích và số loci giống nhau càng
cao thì kết quả phân tích mức độ đồng nhất di truyền có độ tin cậy càng cao, hay kết
quả định danh sẽ càng chính xác và ngược lại. Còn nếu số loci sai khác càng cao thì
độ tin cậy của kết quả càng thấp, việc định danh do vậy cũng không chính xác.


Hình 4.5: Các chỉ tiêu để kiểm tra mức độ đồng nhất di truyền

Kết quả phân tích cho ra 10 cặp cá thể đồng nhất di truyền thỏa mãn các chỉ
tiêu trên, đồng thời cũng là kết quả nhận diện hay định danh tương ứng với 10 mẫu


113

mã hoá. Kết quả định danh có độ chính xác cao do hoàn toàn không có loci sai khác
(mismatching loci bằng 0).

Bảng 4.3: Kết quả nhận diện trong phần mềm Cervus
**** Parameters ****
Number of loci: 3
Minimum number of loci needed for match: 2
Number of mismatching loci allowed: 1
**** Genotype matches ****
The following individuals had matching genotypes in the genotype file:
ID1 Loci typed ID2 Loci typed Matching loci Mismatching loci
BAL209 3 A10 3 3 0
BR25 3 A9 3 3 0
KKM225 3 A5 3 3 0
PBC154 3 A12 3 3 0

PBC157 3 A11 3 3 0
]PBC159 3 A8 3 3 0
PBC230 3 A13 3 3 0
PBC236 3 A6 3 3 0
QH1213 3 A7 3 3 0
QH22 3 A4 3 3 0
TOTAL: 10
Còn lại ba mẫu mã hóa A2, A3, A14 và 3 dòng cacao là BAL 244, PBC 123
và QH441 chưa được nhận diện. Kết quả phân tích microsatellite cho thấy:
- Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của
mẫu A2 và BAL244 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 và
mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 loci của primer mTcCIR15: mẫu A2 bị thiếu
mất một al 246 (xem phụ lục trang 65 ).
- Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của
mẫu A3 và PBC123 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 và
mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 al của loci xác định bởi loci của primer


114

mTcCIR15:al 250 là al đặc trưng của mẫu A3, nhưng ở mẫu PBC123 thì al 250
không phải là al đặc trưng mà thay vào đó là al 244 (xem phụ lục trang 66).

- Dữ liệu microsatellite với 3 primer mTcCIR18, mTcCIR15, mTcCIR8 của
mẫu A14 và QH441 hoàn toàn giống nhau với 2 loci của primer mTcCIR18 và
mTcCIR8, chúng chỉ khác nhau ở 1 al của loci xác định bởi primer mTcCIR15: al
252 là al đặc trưng của mẫu A14, nhưng ở mẫu QH441 thì al 252 không phải là al
đặc trưng mà thay vào đó là al 244 (xem phụ lục trang 77).
Sự sai khác ở 1 al như trên là do hiện tượng allele dropping xảy ra trong quá
trình phân tích trình tự microsatellite. Tuy có sự sai khác ở 1 al nhưng kết quả phân

tích trên đủ để kết luận mẫu A2 mã hóa cho dòng cacao BAL244, mẫu A3 mã hóa
cho dòng cacao PBC123, và mẫu A14 mã hóa cho dòng cacao QH441.
Bảng 4.4: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóa
Giống lấy mẫu

Mẫu mã hóa

Giống nhận diện

Đánh giá kết quả

BAL 244
PBC 123
QH 22
KKM22
PBC 236
QH 1213
PBC 159
BR 25
BAL 209
PBC 157
PBC 154
PBC 230
QH 441
A2
A3
A4
A5
A6
A7

A8
A9
A10
A11
A12
A13
A14
BAL 244
PBC 123
QH 22
KKM225
PBC 236
QH 1213
PBC 159
BR 25
BAL 209
PBC 157
PBC 154
PBC 230
QH 441
Sai khác 1 al
Sai khác 1 al
Chính xác
Chính xác
Chính xác
Chính xác
Chính xác
Chính xác
Chính xác
Chính xác

Chính xác
Chính xác
Sai khác 1 al
Việc định danh này không sử dụng sự hỗ trợ của việc nhận diện kiểu hình
nhưng trên thực tế việc định danh luôn có sự hỗ trợ bằng cách nhận diện kiểu hình
dựa vào kinh nghiệm (như nhận diện qua hình dạng, màu sắc của hoa, quả) nên sẽ
đơn giản và thuận tiện hơn.


115

Nhưng lợi thế của phương pháp định danh bằng microsatellite là có thể áp
dụng từ giai đoạn cây con còn đang được ươm trong nhà lưới, chưa có hoa hay quả
để giúp cho việc nhận diện bằng kiểu hình. Uu điểm của việc định danh từ giai đoạn
cây con là giúp loại bỏ kịp thời những cây bị nhầm lẫn giống trước khi đem ra vườn
trồng.
4.5. So sánh dữ liệu microsatellite
Khi so sánh dữ liệu microsatellite của 3 giống cacao NA33, AMAZ15/15,
PA107 tại vườn sưu tập giống cacao, Đại Học Nông Lâm, với dữ liệu tương ứng
của chúng trên ngân hàng cacao thế giới ICGD chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt
ở ít nhất 2 primer (được trình bày ở 3 bảng 4.4, 4.5 và 4.6).
Như vậy 3 giống cacao NA33, AMAZ15/15, PA107 trong bộ sưu tập giống
cacao của Đại Học Nông Lâm và Ngân hàng cacao thế giới ICGD không giống
nhau, có thể do nguồn gốc lai tạo khác nhau.
Tuy nhiên, kết quả này cũng cho thấy phương pháp và kỹ thuật phân tích của
chúng tôi đúng với phương pháp phân tích microsatellite của ngân hàng cacao thế
giới. Điều này sẽ hỗ trợ cho việc so sánh sự đa dạng di truyền giữa các giống cacao
tại Đại Học Nông Lâm với các giống cacao trên thế giới dựa trên dữ liệu về
Microsatellite.
Bảng 4.5: Dữ liệu microsatellite của giống NA33

NA33- ICGD
NA 33

Kết quả
thí nghiệm
Kết quả trong cơ sở
dữ liệu ICGD
Primer 8 290 290 289 293
Al đồng hợp Al dị hợp
Primer11

295 305 305 305
Al dị hợp Al đồng hợp
Primer 18
333 342 333 343
Al dị hợp Al dị hợp

Bảng 4.6: Dữ liệu microsatellite của giống AMAZ15/15
AMAZ15/15

Kết quả
thí nghiệm
Kết quả trong cơ
sở dữ liệu ICGD


116

AMAZ15/15- ICGD

Primer 8
288 292 289 293
Al dị hợp Al dị hợp
Primer15

244 254 245 257
Al dị hợp Al dị hợp
Primer 18
333 346 340 340
Al dị hợp Al đồng hợp
Bảng 4.7: Dữ liệu microsatellite của giống PA107

PA107-ICGD
PA107
Kết quả
thí nghiệm
Kết quả trong cơ sở
dữ liệu ICGD
Primer 8

244 244 242 242
Al đồng hợp Al đồng hợp
Primer18

337 346 337 347
Al dị hợp Al dị hợp

4.6.Kết quả phân tích multiplex PCR
Một trong các lợi thế của kỹ thuật microsatellite thực hiện trên máy giải trình

tự là có thể thực hiện cùng lúc nhiều phản ứng PCR, hoặc cùng lúc điện di nhiều
sản phẩm PCR nhưng thiết bị vẫn có thể nhận diện từng sản phẩm. Lợi thế này cho
phép sự kết hợp thực hiện cùng lúc nhiều phản ứng PCR hay multiplex PCR để
giảm chi phí hóa chất và thời gian thí nghiệm.
Phản ứng multiplex PCR được thực hiện với 3 primer có cùng nhiệt độ bắt
cặp 46
o
C và có màu huỳnh quang khác nhau: mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15.
Kết quả phân tích microsatellite của sản phẩm multiplex PCR giúp phân biệt
nhanh chóng những mẫu có kết quả giống nhau ở 1 đến 2 cặp primer. Ví dụ 2 mẫu
QH441 và BAL244 có kết quả giống nhau với primer mTcCIR8 nhưng có thể phân
biệt chúng dễ dàng vì kết quả của 2 primer còn lại khác nhau. Do đó chỉ cần 1 lần
phân tích thay vì 3 lần với 3 primer riêng biệt.
Quan trọng nhất là kết quả này có hiệu quả kinh tế cao, vì giúp giảm chi phí
cho cả giai đoạn PCR lẫn giai đoạn phân tích microsatellite.


117

Ngoài ra, nếu trộn 3 sản phẩm PCR riêng biệt với 3 primer (có màu huỳnh
quang khác nhau) của cùng một mẫu rồi đem phân tích trình tự thì kết quả cũng
tương tự như khi thực hiện phản ứng multiplex PCR. Ưu điểm của cách làm này so
với multiplex PCR là có thể kết hợp phân tích cùng lúc những primer có nhiệt độ lai
khác nhau (trong khi phương pháp multiplex PCR đòi hỏi các primer phải có cùng
nhiệt độ lai), nhưng khuyết điểm là chi phí cao hơn phương pháp multiplex PCR vì
số phản ứng PCR thực hiện nhiều gấp 3 lần.

BAL
2
44

QH
4
41

mTcCIR8
mTcCIR8
mTcCIR15
mTcCIR11
mTcCIR15
mTcCIR11


118

Hình 4.6:So sánh kết quả của 2 mẫu multiplex PCR giống nhau ở primer
mTcCIR8

Hình 4.7:Kết quả phân tích mẫu CT3 bằng phương pháp kết hợp 3 sản phẩm PCR
riêng biệt với 3 primer mTcCIR7, mTcCIR15 và mTcCIR11.
4.7. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền
Với dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao khảo sát nằm trong 6 quần thể:
CT, PBC, BAL, QH, BR và KKM, chúng tôi dùng phần mềm Genetix để xử lý dữ
liệu microsatellite của từng cá thể trong quần thể, từ đó mô tả được quan hệ di
truyền gần hoặc xa giữa các quần thể, cũng như giữa các cá thể trong quần thể dựa
trên khoảng cách giữa chúng trên biểu đồ. Kết quả phân tích như sau:
 Các quần thể có quan hệ di truyền gần nhau:
 Quần thể QH và quần thể BAL.
 Quẩn thể BR, KKM và PBC.
 Các quần thể có quan hệ di truyền xa nhau:

 Quần thể BR và quần thể QH.
 Quần thể BR và quần thể BAL.
 Quần thể BR và quần thể CT.
 Quần thể KKM và quần thể QH.
 Quần thể KKM và quần thể BAL.
 Quần thể KKM và quần thể CT.
mTcCIR7

mTcCIR11

mTcCIR15


119

 Các cá thể phân tích trong quần thể BAL và QH có quan hệ di truyền gần với
nhau. Riêng 2 quần thể BR và KKM chỉ có một cá thể đại diện nên không thể nhận
xét về mặt cá thể.
 Quần thể PBC có 6 cá thể, trong đó:
 3 cá thể PBC 123, PBC 157 và PBC 236 có quan hệ di truyền rất gần
nhau
 2 cá thể PBC 159 và PBC 230 có quan hệ di truyền khá gần nhau nhưng
khá xa 3 cá thể trên.
 Cá thể còn lại PBC 154 có quan hệ di truyền xa nhất với các cá thể khác
trong quần thể PBC.
 Quần thể CT có 8 cá thể, trong đó:
 5 cá thể CT1, CT5, CT7, CT8, CT9 có quan hệ di truyền rất gần nhau.
 3 cá thể CT3, CT4 và CT6 có quan hệ di truyền khá xa với nhau và khá
xa với cả 5 cá thể còn lại trong quần thể CT. Riêng cá thể CT6 có quan hệ di truyền
khá gần với 2 cá thể PBC 154 và QH 441.