Luận văn : XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE part 6 docx

100

Bảng 3.4: Qui trình phản ứng PCR
Chu kỳ Nhiệt độ (
o
C) Thời gian
0 94 2 phút
1 đến 35
94 30 giây
51 hoặc 46 30 giây
72 2 phút 15 giây
36 72 5 phút
37 10 1 phút
38 4 15 phút

3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer
Multiplex PCR rất cần thiết trong nghiên cứu về microsatellite vì nó có
thể nghiên cứu nhiều al, nhiều locus có kích thước khác nhau cùng một lúc. Ngày
nay với sự phát triển của các chất nhuộm màu huỳnh quang cho phép nghiên cứu
cùng lúc những al có kích thước bằng nhau và được gắn các màu huỳnh quang khác
nhau.
Để phản ứng multiplex PCR cho kết quả tốt, tất cả các locus phản ánh
đúng, chính xác thì các primer phải có nhiệt độ bắt cặp gần nhau.
Dựa trên thành phần phản ứng PCR với 1 cặp primer, chúng tôi thay
thành phần nước bằng thể tích của 2 cặp primer. Do đó tổng thể tích cho 1 phản ứng
multiplex PCR là 22.2µl với thành phần phản ứng như sau:

Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCR
Thành phần

Dung dịch gốc

Thể tích sử dụng

PCR buffer
MgCl
2

dNTP
Primer mix 1
Primer mix 2
Primer mix 4
DNA mẫu
10X
25mM
1.5mM
1pmol/µl
1pmol/µl
1pmol/µl
50ng/µl
2.0µl
1.8µl
4.0µl
4.0µl
4.0µl
4.0µl
2.0µl

101

Taq polymerase 5U/µl 0.4µl

Chúng tôi áp dụng qui trình PCR trên cho phản ứng multiplex PCR với 3
primer mTcCIR8, mTcCIR11 và mTcCIR15có cùng nhiệt độ T
a
= 46
o
C. Ba primer
này được đánh dấu bằng 3 màu huỳnh quang khác nhau: primer mTcCIR8 có màu
xanh lá cây, mTcCIR11 có màu vàng và mTcCIR15 có màu đỏ.

Bảng 3.6: Qui trình phản ứng Multiplex PCR

Chu kỳ Nhiệt độ (
o
C) Thời gian
0 94 2 phút
1 đến 35
94 30 giây
46 30 giây
72 2 phút 15 giây
36 72 5 phút
37 10 1 phút
38 4 15 phút
3.2.6. Điện di sản phẩm PCR
Đổ gel agarose với nồng độ 1.4%, nấu agarose trong lò viba trong 2.5 phút,
500W . Trộn 2 µl sản phẩm PCR với 2µl loading dye (BioRad). Vận hành máy điện
di ở 100V, 250A trong 15 phút. Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút

Các mẫu khác nhau nhưng được khuếch đại bởi cùng loại primer có băng
điện di rất giống nhau nên không thể phân biệt được trên gel điện di agarose, cần
phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự DNA.

3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được đưa vào phân tích trình tự qua 3 bước chính:
 Bước 1: Tiến hành trộn mẫu PCR với size standard và hidi formamide.
Tổng thể tích cho 1 phản ứng trên máy giải trình tự DNA là 10µl với thành
phần phản ứng như sau:
Thành phần Thể tích dùng cho 1 phản ứng

Sản phẩm PCR 0.5µl


102

Size standard
Hidi formamide

0.5µl
9µl
Bước 2: Biến tính mẫu ở 95
o
C trong 5 phút bằng máy PCR để DNA
mạch đôi tách thành 2 mạch đơn. Sau đó phải giữ lạnh mẫu trong đá ngay để 2
mạch đơn không bắt cặp lại với nhau.
 Bước 3: Bơm 10µl mẫu vào từng ô trên đĩa, sau đó đưa vào máy giải trình
tự DNA đã được lắp đặt sẵn mao quản thích hợp và cài đặt chương trình phù hợp
trong phần mềm Gene Mapper, là phần mềm sẽ phân tích kích thước al chứa trình
tự microsatellite. Máy sẽ tiến hành điện di và phân tách các sản phẩm PCR bên

trong mao quản.
Kết quả được phân tích tự động dựa trên số liệu trong bin set do công ty
Master Food cung cấp. Bin set là một tập tin dạng text, chứa đầy đủ thông tin về
kích thước và độ tin cậy của các al tương ứng với mỗi loại primer, 5 bin set của 5
loại primer sau khi được thiết lập trong phần mềm Gene Mapper sẽ phân tích kết
quả tự động để cho ra dữ liệu của 2 al có độ tin cậy cao nhất của từng mẫu với mỗi
loại primer. Do đó, có những trường hợp kết quả phân tích có nhiều hơn 2 al
microsatellite nhưng bin set chỉ cho ra dữ liệu của 2 al đặc trưng nhất (có độ tin cậy
cao nhất).


Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu Hình 3.6: Lắp cappilary vào máy
 Một số sản phẩm PCR được tinh sạch để so sánh hiệu quả phân tích giữa
2 nghiệm thức: tinh sạch và không tinh sạch. Qui trình tinh sạch gồm các bước sau:
- Bước 1: Hút 2.5µl EDTA 125mM và 60µl Ethanol 100%. Đảo nhẹ ống
và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
- Bước 2: Li tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4
o
C.


103

- Bước 3: Hút bỏ dịch trong.
- Bước 4: Hút 60µl Ethanol 70% cho vào mỗi ống. Li tâm 12000 vòng
trong 20 phút ở 4
o
C.
- Bước 5: Hút bỏ dịch trong. Làm khô trong 30 phút.
- Bước 6: Hoà tan DNA đã tinh sạch trong 10µl nước cất tinh khiết.

Sau đó làm tiếp tục với ba bước phân tích trình tự như trên.

3.2.9.Phương pháp phân tính mức độ đồng nhất di truyền bằng phần mềm
Cevus
Cervus là một phần mềm phân tích tần số al để kiểm tra sự đồng nhất di truyền
của các cá thể và tìm ra đời bố mẹ của cá thể dựa trên các chỉ tiêu được lựa chọn.
Cervus phân tích tần số al dựa trên dữ liệu về kiểu gen của các codominant- loci.
Dữ liệu đưa vào phân tích ở dạng bảng trong Excel và kết quả phân tích sẽ được
xuất ra dưới dạng file text.
Chúng tôi đưa vào dữ liệu di truyền microsatellite 13 dòng cacao thương mại và
13 mẫu mã hoá (từ A2 đến A14) với 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8
để tiến hành phân tích sự đồng nhất của các cá thể dựa trên sự trùng khớp giữa các
loci của chúng (matching loci), từ đó chúng tôi sẽ định danh được các mẫu mã hoá.
Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả dựa trên dữ liệu microsatellite của 3 loci
đã loại trừ những allele dropping (xem trang 57). Mỗi loci gồm 2 al đồng hợp
(VD: al 292- al 292) hoặc 2 al dị hợp (VD: al 235- al 244), đây cũng chính là đặc
tính của codominant-loci.
Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus
CODE 15A 15B 18A 18B 8A 8B
BAL209 252

254

344

346

288

290

BAL244 244

246

337

344

292

292

BR25 235

244

331

344

302

305

KKM225 235

244

331

346

286

286

PBC123 235

244

331

342

288

290

PBC154 232

252

342

344

288

305

PBC157 235

250

331

346

288

302

]PBC159

235

244

331

346

290

302

PBC230 235

250

331

342

286

288

PBC236 235

250

342

344

290

305

QH1213 252

254

344

346

288

290

QH22 232

252

342

344

288

302

QH441 232

254

342

344

288

288



104

A2 244

244

337

344

292

292

A3 235

250

331

342

288

290

A4 232

252

342

344

288

302

A5 235

244

331

346

286

286

A6 235

250

342

344

290

305

A7 252

254

344

346

288

290

A8 235

244

331

346

290

302

A9 235

244

331

344

302

305

A10 252

254

344

346

288

290

A11 235

250

331

346

288

302

A12 232

252

342

344

288

305

A13 235

250

331

342

286

288

A14 232

254

342

344

288

288

Chọn các chỉ tiêu phân tích để tìm ra các cá thể có sự đồng nhất di truyền bằng
công cụ “Identity Check” trong phần mềm Cervus. Dựa trên các chỉ tiêu phân tích
này, Cervus sẽ tiến hành kiểm tra tất cả các cá thể và đưa ra dữ liệu của những cặp
cá thể có sự đồng nhất về mặt di truyền thỏa mãn các chỉ tiêu đề ra. Có 3 chỉ tiêu
chính sau:
 Số lượng loci phân tích.
 Số lượng loci đồng nhất tối thiểu
 Số loci sai khác cho phép.
Chúng tôi dựa trên kết quả kiểm tra và nhận diện các cặp cá thể có sự đồng
nhất di truyền do Cevus phân tích để định danh các mẫu mã hóa. Do đó việc định
danh sẽ chính xác và khách quan.
3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm
Genetix
Genetix là một phần mềm tiếng Pháp dùng cho nghiên cứu di truyền quần
thể dựa trên định luật Hardy-Weinberg và xử lý bằng phép toán thống kê Fichier
(Weir & Cockerham,1984) thông qua giá trị thống kê F. Giá trị này xác định mối
quan hệ giữa các al của các cá thể và nó liên quan đến hệ số cận huyết. Hệ số này
có thể đánh giá mối quan hệ không ngẫu nhiên giữa các al trong quần thể, nó cũng
đánh giá sự giao phối thân cận giữa các đơn vị dưới quần thể và quần thể.
Từ 21 dòng cacao khảo sát, căn cứ vào tên giống, chúng tôi có 6 quần thể với
dữ liệu microsatellite tương ứng với 5 primer của mỗi cá thể được đưa vào phần
mềm Genetix để tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các
quần thể và giữa các cá thể trong quần thể dựa trên biểu đồ 3D (3 chiều).

105

Khoảng cách về chiều dài của các al microsatellite chứa thông tin về khoảng
cách di truyền giữa các quần thể. Hai quần thể càng tách biệt nhau về mặt di truyền
thì tần số các al khác nhau càng rõ rệt. Những tính toán về khoảng cách di truyền
giữa các quần thể có sự giao phối ngẫu nhiên và có sự phân ly ít trong quá trình di
truyền sẽ giúp chỉ ra cấu trúc của quần thể và dưới quần thể.
Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix




106

Bi
ểu đồ 3.1
:
6 quần thể với số lượng cá
thể tương ứng
Bi
ểu đồ 3.2
:
5 primer

với số lượng al
tương ứng

Bảng 3.9: Kích thước các al phân tích với mỗi loại primer

Bảng 3.10: Số lượng các al phân tích của mỗi quần thể với từng loại primer



107

Phần 4
Kết quả và thảo luận

4.1.Sản phẩm DNA li trích
Li trích DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành
công cho phản ứng PCR sau này. Đối với lá cacao, việc li trích gặp một số khó khăn
do lá cacao có lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh, bên trong mô lá chứa hàm lượng
lớn polysaccharide, polyphenol và các sắc tố khác. (Hoàng Thị Liễu, 2004).
Qui trình li trích DNA của chúng tôi đạt hiệu quả vì DNA li trích có độ tinh
khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ. Vì ở qui trình li trích này, trong dịch trích DNA
có chất mercapto có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Bước ủ Rnase sẽ phân
hủy RNA có trong mẫu li trích, góp phần hạn chế lượng DNA tạp tổng hợp từ RNA
trong phản ứng PCR sau này. Đặc biệt sự có mặt của muối sodium acetate có khả
năng làm biến tính enzyme phân hủy DNA. Mặt khác, bước sử dụng Chloroform

được lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và
polysaccharide có trong mẫu. Do đó, DNA thu được rất tốt, đảm bảo cho phản ứng
PCR xảy ra
Kết quả định lượng DNA bằng quang phổ kế cho thấy DNA của các mẫu
đem li trích có độ tinh sạch tương đối cao với tỉ lệ OD
260nm
/OD
280nm
nằm trong
khoảng 1.5 đến 2.2 và lượng DNA có trong mỗi mẫu trung bình khoảng 50ng/µl.


Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm li trích DNA




108

 Những mẫu có tỉ lệ OD thấp, độ tinh sạch không cao, chúng tôi vẫn có thể
chạy PCR đạt kết quả tốt bằng cách xử lý như sau: pha loãng mẫu 2-3 lần, rồi li tâm
ở 12000 vòng, trong 5 phút ở 4
o
C để lắng cặn xuống đáy ống, rồi nhẹ nhàng hút
DNA ở khoảng giữa ống để thực hiện phản ứng PCR, trong trường hợp này thể tích
DNA trong phản ứng PCR được tăng lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl) và giảm thể tích
nước đi 2µl.
Bước pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li
trích sau cùng, bước li tâm tiếp theo sẽ giúp thu được DNA tinh sạch với nồng độ
thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống.

4.2.Sản phẩm PCR
Qui trình PCR cho kết quả ổn định với cả 5 cặp primer. Tuy nhiên primer
mTcCIR11 thường cho những band rất mờ do mức độ khuếch đại thấp hơn các
primer khác. Vì vậy khi pha trộn mẫu với primer mTcCIR11 cần tăng nồng độ
DNA lên gấp đôi.

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7

Qui trình PCR cho kết quả tương đối ổn định. Những mẫu có nồng độ DNA
li trích cao sẽ cho kết quả tốt khi chạy multiplex PCR, cho các band điện di sáng,
rõ. Do đó khi thực hiện phản ứng multiplex PCR cần tăng nồng độ DNA lên gấp
đôi.

Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR


109

4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao
Sản phẩm PCR có thể đưa vào phân tích ngay trên máy giải trình tự DNA mà
không cần phải qua bước tinh sạch. Vì kết quả so sánh giữa 2 nghiệm thức tinh sạch
và không tinh sạch cho kết quả phân tích như nhau. Do đó sản phẩm PCR không
cần phải tinh sạch trước khi phân tích để giảm tốn kém.
Ngoài ra để giảm thời gian (1 giờ cho mỗi 16 giếng trên đĩa) và hóa chất
phân tích (size standard và hidi formamide), chúng tôi tiến hành trộn 3 sản phẩm
PCR riêng biệt (0.5µl/1sản phẩm) với cùng một lượng size standard và hidi
formamide như với 1 sản phẩm. Điều này giúp giảm chi phí xuống 3 lần mà vẫn cho
kết quả phân tích tốt.
Những mẫu có sản phẩm PCR không xuất hiện band nào trên gel điện di

hoặc band điện di quá mờ vẫn có thể cho kết quả khi phân tích trên máy giải trình tự
DNA bằng cách tăng lượng mẫu PCR lên gấp đôi (1µl thay vì 0.5µl) trong hỗn hợp
mang điện di.
Trong trường hợp không nhận được kết quả khi phân tích microsatellite (No
data), chúng tôi tiến hành hoàn thiện phản ứng bằng cách nâng lượng mẫu trong
phản ứng PCR lên gấp đôi (4µl thay vì 2µl). Do đó chúng tôi thu được kết quả phân
tích của tất cả các mẫu với 5 primer.
Kết quả phân tích 21 dòng cacao khảo sát với 5 cặp pimer được tóm tắt ở
2 bảng 4.1 và 4.2 với các cặp al đặc trưng sau khi đã loại trừ những allele dropping
(xem trang 54). Từ kết quả này, chúng tôi nhận thấy 5 primer sử dụng có thể phân
biệt được 21 kiểu gen khác nhau.
Với đặc tính đồng trội (codominant), những cặp al khác nhau được gọi là dị
hợp (VD: al 235- al 250), còn những cặp al giống nhau được gọi là đồng hợp
(VD: al 288- al 288).
Dựa vào 2 bảng dữ liệu dưới đây chúng tôi có thể định danh được 21 dòng
cacao khảo sát dựa vào đặc điểm microsatellite của chúng cũng như xây dựng được
bảng dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao phục vụ cho công tác định danh và
phân tích đa dạng di truyền.