Luận văn : PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC part 3 ppt

10
2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật
Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với
nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế
bào hay ngoài môi trường.
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã
hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong
bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào
được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân.
2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường:
Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng
lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối
thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh
bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi
trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác.
Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô.
Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi
sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon,
nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng
trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin.
Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi
lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi
sinh vật.
Mg
2+
ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác.
Ca

2+
cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase
khỏi tác động của protease.

11
Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase.
Coban kích thích tổng hợp amylase.
Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.
 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp amylase:
Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng
không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào
đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α–
amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là 7,0 – 7,8.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với
sinh trưởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase.
Độ thông khí: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sự
sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp các enzyme của vi sinh vật.
2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật
Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm đại mạch), công nghiệp
nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hoá tinh bột, công
nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, bổ sung
vào khẩu phần chăn nuôi.
2.3.2. Enzyme protease
2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có
thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease
ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với
protease nội bào. Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công
nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông

nghiệp, y học.
Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số
loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

12
2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi
sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt
động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn
nhóm như sau:
Protease – xerin
Protease – tiol
Protease – kim loại
Protease – acid
Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của
chúng bao gồm:
Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo.
Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH
hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus
thermoproteolyticus.
Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm
hoạt động của chúng có serin.
Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả năng
phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid.
Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase
và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid.
Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000
dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin

vào khoảng 33800 – 48400 dalton. Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có
trọng lượng phân tử vào khoảng 30000 – 40000 dalton.
Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc
trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác. Ví dụ histidin thường tham
gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease – tiol còn tyrosin là

13
trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các
protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng
thuỷ phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:
E + S E – S E – S
*
+ P
1
E + P
2

Trong đó:
E – là enzyme, S – là cơ chất.
E – S : là phức chất enzyme – cơ chất
E – S
*
: là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hoá (axilenzyme)
P
1
: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do mới
được tạo thành)
P
2
: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới

được tạo thành).
2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có
thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có
trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên
cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các
protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể
hoàn thành một số chức năng sau:
Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid
amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này
có thể có ‎ nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi
polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội
bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến,

14
hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh
Cẩm Ngọc, 2005).
2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi
sinh vật
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh
vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông
thoáng, thành phần môi trường
Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng
sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng
hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các
vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh

chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
Ảnh hưởng của pH môi trường : khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt,
pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa
pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật.
Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảng hưởng rất lớn đến sự tích
luỹ protease trong môi trường.
Độ thông khí : độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá
trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống
vi sinh vật.
Ảnh hưởng thành phần môi trường : thành phần môi trường có ảnh hưởng
rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi
trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp.
2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật
 Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp
thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như : ngành chế biến cá,
thịt, sữa, làm bánh mì, nước giải khát, thuộc gia, dệt, phim ảnh Ngoài ra protease
còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt,

15
có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng
chữa viêm lợi.
 Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản
xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá
kém do dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh
nghẽn tĩnh mạch. Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ
viêm, làm thông đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy
vi sinh vật.
 Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức
ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu
đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

2.3. Giới thiệu về probiotic
2.4.1. Định nghĩa
Theo Fuller (1989; trích dẫn Lã Văn Kính, 1998), định nghĩa probiotic như
một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua
việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột.
2.4.2. Chức năng sinh học
Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống
enzyme.
Tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng.
Trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính.
Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột.
2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng
Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng
khác nhau như:
ENZYMBIOSUB của công ty vacxin và sinh phẩm số 2.
Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2.
BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie .

16
VIME - BACTEVIT của công ty Gấu Vàng.
Ngoài ra còn có rất nhiều loại chế phẩm nước ngoài như: PROTEXIN,
UNLEASH, hay FLORAZYMEEFA.
2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus
subtilis
 Trong nông nghiệp:
Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus subtilis
trong nông nghiệp được tiến hành như sau:
Chăn nuôi:
Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm
Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con.

Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc
Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng.
Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc,
nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic.
Trồng trọt:
Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm
Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae ngoài ra còn ứng dụng nhiều
trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch.
Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm
sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại TPHCM trừ các loại
nấm bệnh trên rau cải.
Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà
Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia
furnacalis trên bắp.
Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm
kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm
mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus.

17
Kháng sinh:
Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin có tác
dụng ức chế vi khuẩn Gr
+
và Gr
-
(Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
18
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
3.1.1. Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007.
3.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường Đại Học Nông
Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu thí nghiệm
3.2.1. Đối tƣợng khảo sát
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
3.2.2.1. Thiết bị
Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex),
lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, …
3.2.2.2. Dụng cụ
Lam, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa petri,
micropipete, giá ống nghiệm, …
Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch,
bao gói và hấp tiệt trùng ở 121
0
C /15 phút.
19

3.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất
Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn
và các yếu tố ảnh hưởng.
Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản.
3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn
Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở
dưới. Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô
trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10
-1
.
3.4.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis
Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự
từ 1 đến 4. Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có
nồng độ pha loãng 10
-1
cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được
nồng độ pha loãng 10
-2
, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn
các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10
-3
,10
-4
, 10
-5
dùng micropipete hút 0,1 ml từ
mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và
trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở
37
0
C/24h. Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc
nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống
lại trên môi trường TSA nghiêng.