báo cáo tham quan thực tập xí nghiệp chế biến phế thải cầu diễn

Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
MỞ ĐẦU
Xã hội ngày càng phát triển nên vấn đề sức khỏe của con người ngày
càng được quan tâm. Do đó các sản phẩm thực phẩm không ngừng được cải
tiến nâng cao chất lượng, mẫu mã sản phẩm cũng ngày càng đa dạng. Khi
những thành tựu về y học, hóa sinh học, sinh lý học và dinh dưỡng học được
soi sáng thì những thực phẩm ăn kiêng, thực phẩm điều trị bệnh, thực phẩm
chức năng ra đời.
Ngày nay thực phẩm chức năng đang được con người đặc biệt quan tâm
vì đây là những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng và mức năng lượng thấp,
nhưng trong đó lại chứa các hoạt chất có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe
con người. Trong nhóm thực phẩm chức năng, đường chức năng là một bộ
phận quan trọng. Có nhiều loại đường chức năng như: đường
Paratinose, maltitol, sorbitol, Fructooligosaccharide (FOS), Trehalose. Trong
số đó đường Trehalose là một loại có nhiều công dụng đối với cuộc sống con
người, đặc biệt đối với những người mắc bệnh tiểu đường, béo phì, sâu răng
và một số bệnh lý khác.
Bên cạnh đó, công nghệ sinh học phân tử cũng đã phát triển nhanh
chóng, đạt được những thành tựu to lớn về lý thuyết và thực tiễn. Sự phát
triển không ngừng của sinh học phân tử giúp cho con người hiểu biết cơ sở
khoa học một số bệnh nan y, tìm ra các loại thuốc giúp cho con người chống
lại các bênh tật và nâng cao sức khỏe đời sống. Thành tựu công nghệ sinh học
phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp
đặc biệt là các sản phẩm chức năng.
Cùng với sự phát triển của đường chức năng, các loại enzym ứng dụng
trong lĩnh vực này cũng ngày được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng
Trehalase là enzym được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhân tố điều chỉnh
quá trình đông lạnh, ngăn ngừa quá trình kết tinh, cung cấp giá trị dinh
SV: Vũ Thị Hằng
1

Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
dưỡng. Do vậy nghiên cứu sản xuất Trehalase là enzym được sử dụng để sản
xuất Trehalose là nhu cầu cần thiết. Đặc biệt trên thị trường Việt Nam hiện
nay chủ yếu nhập chế phẩm này từ nước ngoài nên giá thành tương đối cao.
Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzym Trehalase không chỉ có ý nghĩa khoa
học mà còn có giá trị kinh tế xã hội.
Mặt khác, một số chủng vi sinh vật tích lũy các chất hoạt tính sinh học
hoặc enzym, kháng sinh cao cũng được ứng dụng ở quy mô lớn mang lại
thành tựu và lợi ích kinh tế rất lớn cho con người như chủng Bacillus s.p,
Bacillus Licheniformic, Bacillus sterothermophilus, đều có khả năng sinh
tổng hợp Trehalase.
Nhưng bằng cách nào đó ta có thể thu được Trehalase? Làm cách nào
để chủng vi sinh vật Bacillus sterothermophilus có thể sinh tổng hợp
Trehalase? Cấu trúc, đặc tính, các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của
Trehalase hay các điều kiện tối ưu cho hoạt động của Trehalase như thế nào?
SV: Vũ Thị Hằng
2
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới và Việt Nam
I.1 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới
Enzym có vai trò vô cùng quan trọng, không chỉ xúc tác cho các phản
ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống
chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (intro). Bởi vậy, công
nghệ enzym ngày càng phát triển. Những thành tựu cơ bản về enzym là cơ sở
để phát triển các nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tiễn.
Hàng năm, hàng trăm tấn chế phẩm enzym được sản xuất phục vụ cho
ngành công nghiệp và y học. Năm 1980, trên thế giới sản xuất 530 tấn

protease từ vi khuẩn, 350 tấn glucoamylase, 320 tấn α – Amylase, 70 tấn
glucoisomerase, tất cả trị giá 150 triệu USD.
- Amylosidase: sản xuất với sản lượng 5 tấn /năm sử dụng để tách L-
acid amin khỏi hỗn hợp DL axit amin (250 tấn L axit amin trên năm)
- Amyloglucosidase: sản lượng 1 tấn /năm, sản xuất 3000 tấn glucose từ
tinh bột/năm.
- Glucoisomerase: sử dụng để sản xuất xiroglucose – fructose 42%
(2.150.000 tấn /năm) và xiroglucose- fructose 55% (1.450.000 tấn/
năm).
Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng với 4
mục đích chính:
-Điều chỉnh những khiếm khuyết của nguyên liệu. Trong công nghiệp
chế biến đường, tinh bột, bánh mỳ, bia… người ta bổ xung Amylase để bù
hoạt lực enzym yếu của nguyên liệu ngũ cốc. Trong sản xuất fomat, enzym
lipase và protease được sử dụng thay thế các enzym từ nguyên liệu sữa bị vô
hoạt để thanh trùng.
SV: Vũ Thị Hằng
3
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
- Tham gia chuyển hóa, ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất bánh
bisque, fomat, nước uống … protease cho phép cải thiện tính lọc của bia và
tính năng ổn định của nó ở nhiệt độ thấp. Amylase, pectinase, hemicellulase
tạo điều kiện cho việc tách chiết và lọc nước quả. Protease trung tính làm
mềm dẻo khung gluten cải thiện độ nở của bột nhào và độ giòn của bisque.
-Tăng giá trị nguyên liệu tự nhiên. Sự phát triển của công nghệ enzym
đã cho ra đời một loạt các chế phẩm enzym cho phép tạo ra nhiều sản phẩm:
chất làm đặc, chất thơm, chất tạo ngọt, chất tạo chua… việc cải thiện đặc tính
của enzym về tính đặc hiệu và tính chịu nhiệt là cơ sở để sản xuất chế phẩm
enzym mới thích hợp môi trường và đặc hiệu hơn.

- Cải thiện chất lượng sản phẩm: các enzym sử dụng để loại bỏ các chất
tự nhiên có ảnh hưởng xấu tới tính chất cảm quan của thực phẩm. Chế phẩm
enzym còn cho phép tạo hương vị, màu sắc sản phẩm như lipase trong sản
xuất fomat, lactase trong sản xuất sữa.
Trong công nghiệp thực phẩm, protease được dùng để làm mềm thịt,
công nghiệp bánh mỳ, enzym dịch vị 9 chủ yếu là chimosin thu được từ dạ
dày bò được sử dụng để sản xuất fomat, papain từ nhựa đu đủ để làm mềm
thịt.
Enzym trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu sử dụng để sản xuất
đường tinh bột. Đầu tiên người ta sử dụng hai enzym α- Amylase và β-
Amylase để sản xuất mật từ tinh bột, sản phẩm này chứa dextrin, glucose và
maltose được dùng nhiều trong công nghiệp bánh kẹo. Glucose được sản xuất
nhờ α- Amylase và β- Amylase, tuy nhiên glucose dùng trong thực phẩm có
nhược điểm độ ngọt thấp chỉ vào khoảng 0.8 lần đường kính vì vậy nó được
dùng chủ yếu cho y dược.
Năm 1998, tổng lượng đường tiêu thụ trên thế giới là 10 triệu tấn thì
riêng Mỹ tiêu thụ 4.2 tấn Fructose (bao gồm cả xirogluco – fructose), nhật là
SV: Vũ Thị Hằng
4
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
800.000 tấn, EU là 2 triệu tấn, Canada 300000 tấn, Đông Âu 200000 tấn, các
nước đang phát triển là 500000 tấn.
Sau công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng trong
công nghiệp, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, chế biến thức ăn gia súc. Đặc
hiệu việc sử dụng enzym của các hệ vi sinh vật trong nước thải trong công
nghiệp xử lý môi trường ngày càng được nghiên cứu khai thác sử dụng.
Trong công nghiệp dệt, Enzym từ nước chiết Malt và Pancrease được
sử dụng để rũ hồ. Năm 1971, sử dụng enzym Amylase của Bacillus subtilis rũ
hồ ở nhiệt độ cao, rút ngắn thời gian.

Trong công nghiệp bột giặt và tẩy rửa, các chế phẩm enzym được sử
dụng là protease, lipase, cellulose, amylase, oxydoreductase tăng vận tốc và
hiệu quả quá trình tẩy rửa. Một số enzym được bổ xung vào các loại xà phòng
và kem dưỡng da, thuốc đánh răng như bromelin, collagenase, lipase…các
enzym này có tác dụng tẩy hôi, tẩy các vết bẩn bám trên da khá tốt, đồng thời
làm mịn và tăng độ đàn hồi cho da.
Trong nông nghiệp, enzym dùng để sản xuất thức ăn cho động vật
nhằm tăng giá trị thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng cho thức ăn. Các enzym sử
dụng với mục đích này là các enzym thủy phân như amylase, protease, đặc
hiệu là celluloase và hemicelluloase. Chúng thủy phân các chất có phân tử lớn
thành dạng dễ hấp thụ hơn thường làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn.
Sự phát triển của y học phản ánh sự lớn mạnh của tiềm năng enzym.
Ngay từ thế kỷ 19 enzym tụy tạng được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu
hóa. Enzym tripsin, chymotripsin sử dụng để làm tiêu viêm, lành vết thương,
vết bỏng, viêm phổi, viêm khí quản. Tipsin chữa bệnh viêm tĩnh mạch huyết
khối, viêm tụy. Chymotripsin chữa bệnh loét dạ dày tá tràng. Một số enzym
tiêu hóa được sử dụng để chữa bệnh suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già và
người bệnh như pepsin (từ dạ dày lợn). Ngày nay, một số thuốc tổng hợp hóa
học đã lần lượt được thay thế bằng các quá trình enzym nhờ những ưu điểm
SV: Vũ Thị Hằng
5
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
của nó. Ví dụ việc sản xuất Pinicillin bán tổng hợp nhờ enzyme penicillin
acylase để sản xuất hai dẫn xuất ban đầu 6- APA và 7 – ADCA, từ đó tổng
hợp lên kháng sinh thế hệ II, III, IV, V. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật
gen và lai tạo tế bào, người ta đã sản xuất được những chất mà cơ thể sống chỉ
có thể tổng hợp được với lượng cực nhỏ như interferon, hormone sinh trưởng
người, isulin, vaccine… Ngoài việc nghiên cứu enzym trong y học lâm sàng
và trong điều trị học, người ta còn nghiên cứu sự phát triển của enzym trong

cơ thể từ giai đoạn bào thai cho đến lúc già. Bởi vậy ngày nay enzym học còn
đóng vai trò quan trọng trong di truyền học phân tử, trong nghiên cứu quá
trình tiến hóa của các giống nòi và trong nhiều lĩnh vực khác.
I.2 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym ở Việt Nam.
Việc nghiên cứu và ứng dụng enzym ở Việt Nam chỉ mới được tập
trung chú ý trong vài thập kỷ trở lại đây. Cho đến nay Việt Nam chưa có một
enzym nào được sản xuất ở quy mô công nghiệp mà mới chỉ dừng lại ở quy
mô nhỏ, phạm vi phòng thí nghiệm của các trường đại học, các viện nghiên
cứu.
Những chế phẩm enzyme được sử dụng rộng rãi nhất ở nước ta hiện
nay là amylase chủ yếu dùng trong công nghiệp sản xuất rượu bia, đường
glucose, đường nha, công nghiệp dệt…Enzyme phân giải protein (protease)
tăng độ bền ngọt của bia, công nghiệp chất tẩy rửa, nước chấm, y học…
Một số enzyme (chủ yếu nhập từ nước ngoài) được sử dụng rộng rãi
trong việc nâng cao chất lượng sản phẩm và đa dạng hóa sản phẩm sữa.
Các chế phẩm protease (dùng trong công nghiệp sản xuất nước chấm,
chế biến thịt cá) và prozimabo (y học) là các chế phẩm có nguồn gốc từ thực
vật.
Sản lượng chế phẩm enzyme tiêu thụ hàng năm khoảng 100-300
tấn/năm. Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme trong các ngành công nghiệp ở
SV: Vũ Thị Hằng
6
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
nước ta còn ở dạng tiềm năng, do vậy trong những năm tới khả năng ứng
dụng của enzyme còn được khai thác và mở rộng ra nhiều lĩnh vực khác: xử
lý rác thải sinh hoạt và rác công nghiệp, sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em, sản
xuất chế phẩm probiotic, prebiotic…
I.3 Enzyme Trehalases
I.3.1 Giới thiệu về enzyme Trehalase

Trehalase là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Nó được dùng
khá phổ biến trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác.
Trehalase là một loại enzyme glycoside hydrolase có tác dụng xúc tác
cho quá trình chuyển đổi trehalose thành glucose. Nó được tìm thấy trong hầu
hết các động vật. Trehalose là đường đôi không khử (α-D-glucopyranosyl-
1,1-α-D-glucopyranoside) là một trong những nguồn carbohydrate quan
trọng nhất xuất hiện trong hầu hết các loại sinh vật, trừ lớp động vật có vú.
Disaccharide được thủy phân vào 2 phân tử glucose bằng enzyme Trehalase.
Có 2 loại Trehalase được tìm thấy trong Saccharomyces cerevisiae (nấm
men), là Trehalase trung tính (NT)và Trehalase axit (AT) được phân loại dựa
vào độ pH của chúng [4]. NT có độ pH là 7.0 trong khi AT là 4.5.
Theo báo cáo mới đây, hơn 90% AT hoạt động trong S. cerevisiae là
ngoại bào và tách ngoại bào Trehalose thành glucose trong môi trường chất
bao.
I.3.2 Trehalase trong vi khuẩn
Trehalose được tìm thấy như tích lũy carbonhydrate trong
Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium và trong rất nhiều khuẩn tia và là nguyên
nhân của khả năng kháng khuẩn. Hầu hết các enzyme Trehalase tách biệt với
các vi khuẩn có độ pH từ 6.5 đến 7.5.
SV: Vũ Thị Hằng
7
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
Enzyme Trehalase của Mycobacterium là một màng protein bị ràng
buộc. Tế bào chất Trehalase của Escherichiacoli K12 được kích thích bở sự
tăng cao trong nồng độ thẩm thấu. Sự thủy phân của Trehalose thành glucose
diễn ra trong bào chất, và sau đó glucose được chuyển vào các tế bào vi
khuẩn. Một tế bào chất Trehalase khác cũng được tìm thấy từ E.coli. Gen mã
hóa tế bào chất Trehalase có tính đồng đẳng cao với Trehalase tế bào chất.
I.3.3Trehalase trong thực vật

Trong thế giới thực vật, mặc dù Trehalose được tìm thấy từ rất nhiều
loài cây không hoa bao gồm Selaginella lepidophylla và Botrychium lunaria;
đường rất hiếm trong cây có mạch và chỉ được tìm thấy trong quả chín của
các loại thuộc Apiaceae và trong lá cây của thực vật hạt kín có khả năng chịu
khô hạn như Myrothamnus flabellifolius.
Tuy nhiên enzyme Trehalase lại phổ biến trong các loại cây. Điều này
rất khó hiểu vì tuy thiếu cơ chất nhưng Trehalase lại có mặt ở các loại thực
vật bậc cao. Không có sự chứng minh rõ ràng nào về vai trò hoạt động của
Trehalase trong thực vật. Tuy nhiên có nhiều ý kiến cho rằng Trehalases có
thể đóng vai trò trong cơ cấu kháng khuẩn hoặc enzyme có thể đóng vai trò
trong việc giảm lượng Trehalose có nguồn gốc từ vi sinh thực vật
I.3.4 Trehalase trong nấm men
Trong S.cerevisiae có ít nhất 2 enzyme Trehalase khác biệt được tìm
thấy. Một loại được điều hòa bởi cAMP-phụ thuộc phosphorylation. Hoạt
động của loại enzyme này được tìm thấy trong dịch bào tương. Loại enzyme
hoạt động thứ hai được tìm thấy trong các không bào của 12 vi sinh vật tương
ứng. Nồng độ pH của Trehalase dịch bào tương vào khoảng 7.0 do đó nó
được cho vào cùng loại với Trehalase trung tính. Trong khi đó, enzyme
Trehalase không bào được cho rằng có khả năng hoạt động tốt nhất tại độ pH
SV: Vũ Thị Hằng
8
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
khoảng 4.5 và được coi là Trehalase axit. Hai loại enzyme này mã hóa bởi hai
loại gen khác nhau là NTH1 và ATH1
I.3.5 Thủy phân Trehalose
Một phân tử Trehalose được thủy phân thành 2 phân tử glucose bằng
enzyme Trehalase. Thủy phân enzyme của Trehalose lần đầu tiên được tiến
hành vào năm 1893 tại Aspergillus niger bởi Bourquelot. Fischer đã thấy
được phản ứng này trong S. cerevisiae vào năm 1895. Kể từ lần thủy phân

enzyme Trehalose đó, Trehalase (α, α-trehalose-1-C-glucohydrolase, EC
3.2.1.28) đã được tìm thấy trong rất nhiều sinh vật bao gồm động vật và thực
vật. Thủy phân Trehalose bằng enzyme Trehalase là một quá trình sinh lý
học quan trọng của nhiều loại sinh vật như nảy mầm bào tử nấm, côn trùng
bay và tăng trưởng lại trong tế bào không hoạt động tích cực.
I.4 Tổng quan về đường chức năng Trehalose
I.4.1 Trehalose
Trehalose là một đường tự nhiên với chức năng tương tự như đường
sucrose nhưng ổn định hơn và có vị ngọt nhẹ hơn. Trehalose là đường đa chức
năng, vị ngọt nhẹ của nó (45% sucrose).
SV: Vũ Thị Hằng
9
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
Hình 1: Biểu đồ hàm lượng đường trehalose, maltose, glucose, sucrose

Thành phần các chất dinh dưỡng trong đường Trehalose:
Thành phần Giá trị thành phần trong 100g
Năng lượng 628kj/150kcal
Protein 0g
Carbonhydrate trong đường 100g
Hàm lượng chất béo 0g
Hàm lượng xenluloza 0g
Hàm lượng natri 0g
Bảng 1: Thành phần các chất trong đường Trehalose
Cấu tạo Trehalose:
SV: Vũ Thị Hằng
10
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học

Hình 2: Công thức cấu tạo của trehalose
SV: Vũ Thị Hằng
11
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
Hình 3:Sơ đồ phản ứng enzyme
I.4.2 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể sống
I.4.2.1 Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon
Trehalose không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột nên
khi ăn lượng đường hòa tan trong máu không bị biến động. Trong gan, hoạt
lực của enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn sacaroza nhưng sẽ được bình thường
hóa bởi sự cung ứng Trehalose. Như vậy, Trehalose có vai trò khá tích cực
trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét về góc độ bệnh lý liên quan
đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu. Vì thế Trehalose hiện nay được
SV: Vũ Thị Hằng
12
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
dùng nhiều như một chất thấp năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng bị
bệnh tiểu đường.
Từ kết quả của một nghiên cứu khác cho thấy, đối với những người
mắc bệnh tiểu đường, nếu mỗi ngày mỗi người ăn 8g trehalose, lượng đường
trong máu sẽ giảm nhanh trong 14 ngày.
I.4.2.2 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose
Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng Trehalose có thể tăng cường sự
hấp thụ canxi của tế bào. Nhờ đặc tính này, Trehalose có thể giúp cho con
người phòng chống các bệnh về chuyển hóa và bệnh loãng xương.
Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già.
Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều có
một kết luận chung là do ba yếu tố sau:

+ Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lên
men, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi
+ Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi
trường có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tán
vào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi.
+ Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển
của hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tế
bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu. Ngoài canxi,
Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie. Điều này thúc đẩy quá
trình phát triển xương, tăng cường hàm lượng canxi trong xương.
I.4.2.3 Ảnh hưởng của trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng
Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liên
cầu khuẩn gây nên. Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng của
người và động vật. Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinh
dưỡng thích hợp dễ lên men, phát triển và gây bệnh. Vì thế nếu trong thành
SV: Vũ Thị Hằng
13
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
phần thức ăn của ta không chứa hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinh
dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh. Để xét ảnh
hưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người ta đã tiến hành thí nghiệm trên
cơ thể chuột. Kết quả cho thấy nhóm chuột thí nghiệm (ăn đường Trehalose)
bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn Saccaroza)
Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi
trường Trehalose đã chứng tỏ cơ chế và khả năng phòng bệnh sâu răng của
nó. Đó là do Trehalose không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật
trên phát triển.
Ngoài ra Trehalose còn có khả năng chữa bệnh sâu răng. Vì thế ngày
nay trên thế giới người ta còn dùng Trehalose thay thế cho đường kính trong

thành phần ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em
để phòng bệnh sâu răng.
I.4.2.4 Tính kháng khuẩn của trehalose
SV: Vũ Thị Hằng
14
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
Như chúng ta đã biết probiotic là những chế phẩm chứa nhiều vi sinh vật có
lợi như lactobacillus và bifidobacteria. Các vi sinh vật này có khả năng kháng
khuẩn gây bệnh đi ngoài. Hiện nay các chế phẩm probiotic bán trên thị trường
thường chứa nhiều đường Trehalose, bởi đường Trehalose có tác dụng là cơ
chất tốt cho sự phát triển của các vi sinh vật có lợi. Chính sự có mặt và đóng
góp vai trò tích cực trên người ta đã nói rằng đường Trehalose có khả năng
kháng khuẩn (antibiotic)
SV: Vũ Thị Hằng
15
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
Hình 4: Một số loại thực phẩm chứa Trehalose
Phụ thuộc vào độ tinh khiết Trehalose thương phẩm chủ yếu có hai loại
là Trehalose có độ tinh khiết 45% và Trehalose có độ tinh khiết cao hơn 70%.
Với độ tinh khiết 45% thường được dùng trực tiếp như một loại thực phẩm
hoặc như một loại chất ngọt bổ xung trong chế biến các loại thực phẩm khác.
Còn đường có độ tinh khiết cao hơn 70% thường dùng cho các đối tượng mắc
bệnh, các đối tượng ăn kiêng. Ngoài ra đường tinh khiết 100% dùng trong
việc phân tích hóa học.
Đường Trehalose có nhiều đặc tính sinh học đáng quý, có hương vị và
tính chất hóa lý tương tự đường kính nên được sử dụng thay thế đường kính
trong sản xuất các loại thực phẩm chứa đường như kẹo, bánh và bột dinh
dưỡng trẻ em.v.v… Sản phẩm sau khi cải tiến này sẽ có giá trị cao về mặt

dinh dưỡng cũng như chức năng phòng ngừa bệnh tật đồng thời hương vị
cũng được cải tiến rất nhiều.
Trên thế giới việc sử dụng đường Trehalose trong sản xuất các mặt
hàng chức năng như sữa, bánh kẹo, thức ăn cho người bệnh.v.v… Các sản
phẩm được bổ sung đầu tiên là bánh quy, sữa chua. Ngày nay đã được dùng
cho các sản phẩm đồ uống.
Ngoài ra, Trehalose còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau.
Đường có độ tinh khiết thấp có thể làm chất bổ sung trong môi trường nuôi
cấy một số vi khuẩn, loại có hàm lượng trung bình dùng cho người ăn trực
tiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn loại tinh khiết dùng trong kỹ thuật phân
tích.
Trehalose cũng được sử dụng như một loại dược phẩm dùng nhiều cho
các đối tượng người già, trẻ em và người bệnh trong thời kỳ phục hồi sức
khỏe để tăng cường hoạt động tiêu hóa, giúp cho các đối tượng trên nhuận
tràng ăn tốt. Trehalose có tính hòa tan cao
SV: Vũ Thị Hằng
16
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
Hình 5: Tính hòa tan của Trehalose và Sucrose
SV: Vũ Thị Hằng
17
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1 Nguyên vật liệu và hóa chất
II.1.1 Giống vi sinh vật
Chủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 alpha.
E.coli được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria – Bertani) [1%
tryptone, 0.5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 100µg/ml ampicillin để

làm nhân tố chọn lọc.
II.1.2 Plasmid:
DNA mang gen Trehalase được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Sinh
Học Hàn Quốc, Seoul
II.1.4 Hóa chất
Tinh bột tan (Trung Quốc), bactotryton (Hàn Huốc), bacto yeast extract
(Hàn Quốc), NaCl (Trung Quốc), canxiclorua (Trung Quốc), agar (Việt Nam),
glycerol (Việt Nam), acrylamide (Trung Quốc), N,N-methylene-bis
Acrylamide (Trung Quốc), glycine (Trung Quốc), sodiummetabisulfate
(Trung Quốc), methanol (Trung Quốc), acetic acid (Trung Quốc),
Amononium persulfate (ASP, USA), Ampicillin (USA), comassie-blue R-250
(USA), axit photphoric (Trung Quốc), ethanol (Trung Quốc), Tris-base
(Sigma, USA), phenol (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc), potassium
Sodium Tartrate (Trung Quốc), EDTA (USA), SDS (USA), DNS 3,5 Dinitro
salicylic (Trung Quốc), Imidazole (Hàn Quốc), Glucose (Trung Quốc),
Maltose (Trung Quốc), NaH
2
PO
4
(Trung Quốc), Na
2
HPO
4
(Trung Quốc), 2-
mercaptoethanol (Đức), Bromophenol blue (Đức), NaHCO
3
(Trung Quốc),
Na
2
CO

3
(Trung Quốc), potassium acetate (Hàn Quốc), Boric axit (Trung
Quốc), HCl (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), TEMED (Trung Quốc),
APS (Trung Quốc), Dithiotheritol (Hàn Quốc), Ethidumbromide (Hàn Quốc)
SV: Vũ Thị Hằng
18
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
II.1.5 Máy móc và thiết bị
Máy li tâm (Trung Quốc), máy so màu quang điện, máy đo pH, máy lắc
(Trung Quốc), bình ổn nhiệt (Trung Quốc), nồi hấp (Trung Quốc), máy khuấy
từ (Trung Quốc), máy siêu âm (Trung Quốc), cân điện tử (Đức), máy điện di
(Trung Quốc), tủ sấy, box cấy (Trung Quốc), cân kỹ thuật (Mỹ), buồng điện
di DNA (Nhật), máy li tâm lạnh siêu tốc liên tục (Đức).
Và các dụng cụ cần thiết khác như bình tam giác, ống nghiệm, ống
eppendof, đầu côn xanh, đầu côn vàng, đĩa peptri, pipet thủy tinh và pipet
nhựa, blank,…
II.2 Phương pháp nghiên cứu
II.2.1 Biến nạp E.coli DH5 alpha bằng phương pháp sốc nhiệt
Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp tách ra từ tế bào
thể cho sang thể nhận.
Có nhiều phương pháp biến nạp được sử dụng như biến nạp bằng xung
điện, sốc nhiệt…Trong đó biến nạp bằng sốc nhiệt là phương pháp được sử
dụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao. Cơ chế biến nạp chủ yếu
bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thể
tiếp nhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếp
nhận DNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường.
Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khả
biến
Nguyên tắc: Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế

bào được xử lý CaCl
2
để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA. Tạo hỗn hợp vi khuẩn
với DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao
(4
o
C). Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vi
khuẩn. Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và
SV: Vũ Thị Hằng
19
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
cố định trong tế bào vi khuẩn. Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứa
môi trường có bổ sung kháng sinh.
Quy trình biến nạp gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
Phương pháp tiến hành như sau:
+ Tạo tế bào khả biến DH5 alpha
Hoạt hóa tế bào E.coli trên môi trường thạch LB (1% w/v Bacto
trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl; 2% Agar) ở 37
o
C, 24 giờ.
Lấy một khuẩn lạc cấy vào môi trường 5ml LB lỏng
Hình 6: Vi khuẩn E.coli trong LB rắn (khuẩn lạc)
Môi trường LB lỏng: 1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast
extract; 0.5 % NaCl
Nuôi trên máy lắc (37
o
C, 12 – 14 giờ). Sau đó lấy 1% dịch nuôi cấy
trên (50µl cho 50ml môi trường nuôi cấy LB) tiến hành lắc trên máy lắc 200 –
250 rpm ở 37

o
C để đạt được Abs 600 (khoảng 2 – 3 giờ). Tiếp đó chuyển dịch
SV: Vũ Thị Hằng
20
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
nuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50ml và ly tâm ở 4
o
C tốc độ 5000 – 7000
rpm trong 5 phút.
Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12.5 ml) dung
dịch 50mM CaCl
2
. Lắc nhẹ để làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phút
trên đá. Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên và
cho vào 1/10 thể tích (2.5 ml) dung dịch 100mM CaCl
2
và làm tan hoàn toàn
cặn. Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerol
bảo quản trong nitơ lỏng.
+ Biến nạp
Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µl
DNA. Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt 2 phút ở 42
o
C. Sau sốc nhiệt bổ
sung thêm 1ml LB và ủ ở 37
o
C trong 1h. Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biến
nạp trên cấy trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (100ml LB, 100µl
Amp) và để phát triển qua đêm ở 37

o
C.
Tất cả các thao tác đều làm trong box cấy vô trùng, các dụng cụ đều
được hấp khử trùng ở 121
o
C trong 20 phút.
II.2.2 Tách DNA plasmide
DNA tái tổ hợp sau khi được biến nạp vào chủng DH5 alpha sẽ nhân
lên thành nhiều bản sao cùng với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Sau đó
vector tái tổ hợp được tách chiết ra khỏi DNA genom vi khuẩn bằng cách xử
lý với NaOH, SDS. Trong điều kiện này, DNA genom của vi khuẩn ở dạng
mạch thẳng có phân tử lượng lớn sẽ bị đứt gãy còn plasmid ở dạng mạch vòng
có kích thước phân tử nhỏ và bền vững nên sẽ không bị đứt gãy. Protein và
tạp chất được loại bỏ bằng hỗn hợp Chloroform: iso – amyl alcohol. DNA
plasmid thu được nhờ quá trình kết tủa với cồn và muối CH
3
COONa. Có rất
nhiều phương pháp tách plasmid như: tách plasmid bằng phương pháp kiềm,
tách plasmid bằng phương pháp boiling.
SV: Vũ Thị Hằng
21
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng, nhặt
một khuẩn lạc E.coli chứa plasmid từ đĩa petri nuôi cấy tế bào qua đêm vào
ống nghiệm hoặc bình tam giác có chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung
chất kháng sinh Ampicillin (nồng độ 100µg/ml) nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ
37
o
C, tốc độ 200 vòng/phút. Thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong các

eppendoff 1.5ml. Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối loại
dịch nổi. Đồng nhất tế bào, cho 100µl Sol I vào trong ống eppendoff chứa tế
bào, hòa tan tế bào bằng máy vortex.
Dung dịch Sol I: 25mM Tris – HCl pH 8.0; 10mM EDTA pH 8.0;
50mM glucose. Dung dịch được khử trùng ở 126
o
C và được cất giữ ở 4
o
C.
Phá màng tế bào, cho 200µl Sol II vào tiếp, dùng tay đảo ngược ống
eppendoff nhanh, nhẹ nhàng từ 3 – 5 lần.
Dung dịch Sol II: 0.2N NaOH; 1% SDS
Cho 150µl Sol III vào tủa protein, dùng tay đảo nhẹ ống từ 3 – 5 lần.
Dung dịch Sol III: 3M Potasium Acetate pH 5.5; acetic acid 11.5M
dung dịch được khử trùng và cất giữ ở 4
o
C
Sau đó ly tâm ở 4
o
C với tốc độ 10000 rpm/phút trong 20 phút. Dùng
pipet lấy dịch trong ở trên cho vào eppendoff mới (eppendoff được khử trùng)
bỏ cặn. Lấy 600 - 800µl Isopropanol cho vào và lắc lên lắc xuống nhiều
lần. Đem ly tâm ở 4
o
C với tốc độ 12000rpm/phút trong 10phút. Ta bỏ dịch
phía trên đi, lấy cặn (DNA). Ta cho 500µl cồn 70% (cồn để lạnh) để rửa
DNA, dùng pipet bơm lên, bơm xuống cho DNA tung ra. Ly tâm lạnh ở
12000 rpm/phút trong 15 phút sau đó lấy hết cồn ra rồi thực hiện rửa cồn 1
lần nữa. Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng.
Hòa tan DNA plasmid tách được trong 40µl dung dịch TE hoặc nước

cất vô trùng. Điện di mẫu kiểm tra mấu DNA plasmid trên gel agarose 0.8%.
Bảo quản mẫu ở -20
o
C.
SV: Vũ Thị Hằng
22
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
II.2.3 Xác định DNA biểu hiện ở E.coli trên gel Agarose
Nguyên tắc: Phương pháp điện di DNA trên gel agarose dựa vào đặc
tính tích điện âm của phân tử axit Nucleic ở pH trung tính nhờ các nhóm
photphat nằm trên các cầu nối phosphodiester của axit Nucleic. Khi được đặt
trong điện trường, các phân tử axit Nucleic sẽ dịch chuyển về cực dương với
tốc độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Các phân tử có kích thước
lớn sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử có kích thước bé. Khả năng di động
của các phân tử axit Nucleic này còn phụ thuộc vào nồng độ gel. Ở đây chúng
tôi sử dụng gel agarose 0.8%. Các axit Nucleic trong gel sẽ hiện hình dưới tia
tử ngoại (UV) nhờ hóa chất ethidium bromide.
Phương pháp tiến hành: 0.8% agarose gel trong dung dịch đệm TBE
được đổ trên một giá thể nằm ngang (chuẩn bị gel agarose vào dung dịch đệm
đun cho agarose tan hoàn toàn). Để nguội khoảng 50
o
C,cho 1µl ethidium
bromide vào rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược.
Sau khoảng 30 phút, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ dung dịch
chạy điện di là đệm TBE (40mM Tris HCl và 2 mM EDTA, pH 8.) vào bể để
dung dịch ngập cách mặt gel khoảng 2mm và tiến hành tra mẫu. Trộn mẫu với
1.5µl đệm màu xanh 1X – xanh Bromophenol. Quá trình chạy điện di được
tiến hành dưới hiệu điện thế 100V, thời gian là 25 – 30 phút. Sau khi chạy
xong lấy bản gel ra và đem soi bằng tia tử ngoại UV 280 nm, plasmid DNA là

những vạch màu da cam được so sánh với marker DNA ta xác định được kích
thước và độ tinh sạch của DNA.
II.2.4 Phương pháp phá vỡ tế bào
Protein chiết xuất từ các tế bào vi khuẩn là một bước quan trọng đặc
biệt đối với nghiên cứu trong các lĩnh vực hóa sinh học, vi sinh học và sinh
học phân tử cũng như cho sự phát triển của quá trình sản xuất protein trong
công nghệ sinh học và kỹ thuật sinh hóa. Hiện nay, protein chiết xuất từ các tế
SV: Vũ Thị Hằng
23
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
bào vi khuẩn thường được sử dụng phương pháp cơ học, đòi hỏi dụng cụ
tương đối đắt tiền và đòi hỏi kỹ năng kỹ thuật.
i4 lysis đệm đã được phát triển bằng công nghệ Enzyme Phòng thí
nghiệm của các quốc gia Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học
(BIOTEC) để cung cấp một giải pháp rẻ tiền để chiết xuất protein. Có rất
nhiều phương pháp để phá vỡ tế bào: phương pháp phá vỡ tế bào bằng
phương pháp cơ học và không bằng cơ học. Trong đó, phương pháp cơ học
gồm có rất nhiều phương pháp như phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng
siêu âm, phá vỡ tế bào bằng máy đồng hóa cao áp, phá vỡ tế bào bằng phương
pháp lạnh đông,… Phương pháp không bằng cơ học như phương pháp sốc
thẩm thấu, phương pháp xử lý kiềm,…
Do enzyme của chúng tôi là enzyme nội bào nên ở đây chúng tôi sử
dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế bào. Các bộ đệm lysis đã được xây dựng
để khai thác protein vi khuẩn bằng cách sử dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế
bào. Điều quan trọng ở đây là chúng tôi sử dụng dung dịch phá vỡ tế bào rất
có hiệu quả với nhiều loại tế bào vi khuẩn, nấm trong khi vẫn bảo toàn hàm
lượng và hoạt tính của protein. Dung dịch đệm cũng được sử dụng cho tách
chiết DNA từ vi sinh vật.
Các đặc điểm của i4 lysis đệm:

Phương pháp tiến hành:
Lấy 2 ống eppendoff sạch đem cân ống eppendoff trên cân phân tích và
ghi lại trọng lượng.
Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng. Nhặt một khuẩn lạc từ đĩa petri
(đã biến nạp, đĩa petri LB thạch có kháng sinh). Nuôi cấy tế bào qua đêm vào
ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc
qua đêm ở 37
o
C tốc độ 200v/p
SV: Vũ Thị Hằng
24
Báo cáo khoa học Viện ĐH Mở - Khoa Công nghệ Sinh
học
Sau đó thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong 2 eppendoff mà ta vừa
cân được đem ly tâm ở 6000rpm/phút trong 20 phút ở 4
o
C để thu sinh khối.
Bỏ dịch trong và cân trọng lượng tế bào thu được.
Bổ sung 200-300 µl/100mg tế bào. Sau đó, hòa tan cặn bằng vortex và
đem ngâm đá 15 – 20 phút. Ly tâm 10 000 v/phút trong 30 phút rồi bỏ cặn thu
dịch nổi.
II.2.5 Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford
Cơ sở của phương pháp: hàm lượng protein – enzyme đã được xác định
vào năm 1976 bằng phương pháp của bradford. Cơ sở của phương pháp là
dựa vào độ hấp thụ màu của phản ứng giữa enzyme và dung dịch Bradford,
dựa vào đồ thị chuẩn BSA-Bradford để tính hàm lượng protein – enzyme.
Phương pháp tiến hành: cho 100µl dung dịch protein pha loãng vào
900µl dung dịch Bradford (100mg Coomassie Brillitant Blue G250 hòa tan
500 ethanol, bổ sung 100ml phosphorich acid 85%, sau đó định mức đến 1lít
bằng nước cất). Chuẩn bị blank (mẫu đối chứng) bằng cách bổ xung nước cất

thay cho protein. Hỗn hợp phản ứng giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, cứ 1
phút vortex một lần. Sau đó, hỗn hợp được đo quang phổ ở bước sóng 620nm
bằng máy spectrophotometer (máy so màu). Độ hấp thụ quang của dung dịch
phản ứng dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford tính được nồng độ
enzyme – protein có trong mẫu.
Dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford có:
Y = 1.0361x + 0.0524
R
2
= 0.9944
Phương pháp tính toán hàm lượng protein – enzyme được viết như sau:
X (mg/ml) = (∆
abs
- 0.0524): 1.0361 *D*RF
Trong đó:
SV: Vũ Thị Hằng
25