XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1
TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG

GVHD: Th.S Lâm Thanh
Hiền
Thực hiện: Huỳnh Minh Duy, Nguyễn Văn Phú
Khoa Công Nghệ Sau Thu Hoạch
Sumary :
The research of Post-harvest Technology Faculty’s students and teachers have
successfully applied the method of Thin Layer Chromotography with two columns:
immuno-affinity column and silicagel column to determine Aflatoxin B
1
(produced by
Aspergillus flavus and Aspergillus paraciticus) on 30 samples (of peanut and corn) at
its minimum concentration of 2ppb. This rapid, simple and economic method has
served extension work for developing food safety control.
I. Đặt vấn đề:
Thức ăn gia súc, thực phẩm và các loại hạt có dầu, thảo dược,…đều có khả
năng nhiễm độc tố nguy hiểm aflatoxin B
1
do 2 loài vi nấm điển hình là Aspergillus
flavus (hình 1) và Aspergillus paraciticus gây nên. Các aflatoxin là những tinh thể
màu vàng tan trong một số dung môi hữu cơ (clorofoc, methanol, acetone,…) và độc
tính cao, rất bền vững với tác nhân hóa lí..., chỉ bị huỷ ở nhiệt độ trên 120
0
C trong
môi trường kiềm.
Do cấu trúng hóa học có vòng dihydrofuran (hình 2) nên aflatoxin B
1
liên kết
với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong. Ngoài ra, aflatoxin B1

còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA) gây tổn thương gan và
gây ung thư gan. Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến di tật
thai nhi hoặc quái thai, nặng có thể chết non.
Hình 1: Aspergillus flavus Hình 2: Cấu trúc aflatoxin B1
(C
17
H
12
O
6
)
Do đó, việc kiểm tra thực phẩm có nguy cơ nhiễm aflatoxin B
1
là rất cần thiết.
Theo tiêu chuẩn Việt Nam, thực phẩm dùng cho người lượng aflatoxin không
vượt quá 10ppb. Để phát hiện và định lượng aflatoxin, hiện nay 2 nhóm phương pháp
chính sau:
 Nhóm phương pháp hóa lí: sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng cao áp (HPLC)
 Nhóm phương pháp miễn dịch học: miễn dịch phóng xạ (RIA), miễn dịch
enzym (ELISA) và cột sắc kí ái lực miễn dịch.
Đối với phương pháp sắc kí lỏng cao áp, trước khi phát hiện phải trải qua rất
nhiều thao tác phức tạp như chiết lấy aflatoxin từ vật liệu, sau đó phải cô đặc trước
khi định lượng nên tốn nhiều thời gian thao tác kĩ thuật, hơn nữa thiết bị đầu tư rất
đắt tiền.
Với phương pháp ELISA, lại có nhiều hạn chế vì aflatoxin thường không bám
đặc hiệu vào các giếng polystirene, khoảng phát hiện hẹp, và cần phải có aflatoxin
đánh dấu hoặc kháng thể đánh dấu, sai số lớn mặc dù có độ nhạy cao.
Vì những lí do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định hàm lượng độc tố
aflatoxin B1 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng sử dụng cột ái lực miễn dịch và cột
silicagel” trong mẫu hay nhiễm nhất là đậu phộng và bắp với những ưu điểm sau:

 Cô đặc trên cột với nồng độ thấp và loại bỏ được tạp chất ảnh hưởng đến qui
trình định lượng.
 Thời gian tiến hành nhanh, độ nhạy cao, thiết bị đơn giản và hóa chất ít.
II. Vật liệu và phương pháp
2.1. Nguyên liệu
-Bắp hạt và đậu phộng lấy từ chợ Bà Chiểu, Chợ Tân Sơn Nhất.
-Bắp hạt và đậu phộng lấy của một số công ty.
2.2. Thiết bị và hóa chất
-Thiết bị:
+ Bột thiết bị chạy sắc kí TLC
+ Dụng cụ làm khô gia nhiệt, bình thổi khí, đèn soi
+ Các tấm silicagel 10 x 10 cm mua từ Merk
+ Microsylinge Halmilton 10µ
+ Các dụng cụ thủy tinh cần thiết
-Hóa chất : acetonlintril, methanol, benzen (tinh khiết) và nước cất
+ Dung dịch triển khai:
2
18
=
Acetone
Chloroform
; dung dịch hòa cặn:
2
98
ln
=
itrilAceto
Benzen
+ Aflatoxin B1 chuẩn 0,5ppm trong dung dịch hòa cặn.
2.3. Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1. Nơi tiến hành nghiên cứu: Phòng thí nghiệm phân tích hóa sinh, công
ty cổ phần giám định và khử trùng FCC.
2.3.2. Tiến trình nghiên cứu:

 →
cột IAC
 →
kết quả IAC
Bắp hạt + đậu phộng
 →

 →
sắc ký bản mỏng TLC →

 →
cột silicagel
 →
kếtquả silicagel
2.3.3. Qui trình thực hiện:
2.3.3.1. Sơ đồ phân tích hàm lượng Aflatoxin B
1
bằng cột IAC
Mẫu phân tích (25gam)
 →
chiết xuất (5g NaCl, 37,5ml nước cất, methanol
87,5ml, thời gian 30 phút)
 →
lọc thường (thu 15 ml và cho thêm 15ml nước cất)
 →
lọc giấy thủy tinh (thu 45ml dịch lọc)

 →
qua cột IAC (2 giọt/phút)
 →
làm khô
dịch chiết (trong N
2
/40 – 50
0
C)
 →
định lượng bằng TLC
2.3.3.2. Sơ đồ phân tích hàm lượng Aflatoxin B
1
bằng cột Silicagel
-Chuẩn bị cột Silicagel:
Sắc ký cột
 →
cho 5gam Na
2
SO
4
khan
 →
cho CHCl
3
tới ½ ống
 →
cho 10g
silicagel
 →

rửa thành ống 20ml CHCl
3

 →
cho từ từ 15gam Na
2
SO
4
khan
 →
cho
CHCl
3
chảy tới đỉnh Na
2
SO
4

-Tiến hành:
Mẫu phân tích (50gam)
 →
chiết xuất (25ml nước cất, 250ml CHCl
3
, đậy kín
và lắc mạnh trong 30 phút)
 →
lọc thường (thu 50 ml)
 →
cột silicagel (đã chuẩn
bị)

 →
rửa giải tạp (lần 1: 150ml C
6
H
6
, lần 2: 150ml (C
2
H
5
)
2
O)
 →
rửa giải
Aflatoxin B
1
(150ml CH
3
OH : CHCl
3
= 3:97)
 →
thu dịch Aflatoxin B
1
vào bình cầu
 →
làm khô với máy cô quay chân không
 →
hòa cặn (2ml CHCl
3

)
 →
làm khô
(trong N
2
/40 – 50
0
C hoặc chân không/40
0
C)
 →
định lượng Aflatoxin B
1
.
III. Kết quả và bàn luận
3.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B
1
trên các mẫu phân tích
Bảng 3.1. Hàm lượng Aflatoxin B
1
trong các mẫu của khách hành
STT Tên mẫu
Khách
hàng
Cột IAC Cột Silicagel
Hàm lượng Aflatoxin B
1
(ppb)
1 Bắp Cty. Thái
Dương

2 không phát
hiện
2 Bắp Phòng
Hàng Hải
không phát
hiện
không phát
hiện
3 Bắp Phòng
Hàng Hải
không phát
hiện
không phát
hiện
4 Bắp Cty. Gò
Sao
10 7
5 Bắp FCC Hà
Nội
20 14
6 Bắp Cty. Gò
Sao
7 Bắp FCC Hà
Nội
8 Bắp FCC Hà
Nội
9 Đậu
phộng
Phòng
hiện trường

10 Đậu
phộng
11 Đậu
phộng
12 Đậu
phộng
13 Đậu
phộng
14 Đậu
phộng
15 Đậu
phộng
16 Đậu
phộng
Nhận xét: theo bảng 3.1, mức độ nhiễm các mẫu đều ≤ 20ppb và cột IAC phát
hiện được 3 mẫu và cột silicagel phát hiện được 2 mẫu. Tỉ lệ nhiễm 3/16 mẫu (với
cột IAC) và 2/16 mẫu (với cột silicagel)
Bảng 3.2. Hàm lượng Aflatoxin B
1
trong các mẫu ở chợ Bà Chiểu và Tân Sơn
Nhất
STT Tên mẫu
Cột IAC Cột Silicagel
Hàm lượng Aflatoxin B
1
(ppb)
1 Bắp không phát hiện không phát
hiện
2 Bắp 7 5
3 Bắp 2 không phát

hiện
4 Bắp 1 không phát
hiện
5 Bắp không phát hiện không phát
hiện
6 Đậu phộng 4 2,5
7 Đậu phộng 1 không phát
hiện
8 Đậu phộng không phát hiện không phát
hiện
9 Đậu phộng 30 25
10 Đậu phộng 2 không phát
hiện
Nhận xét: theo bảng 3.2, mức độ nhiễm các mẫu đều ≤ 20ppb và cột IAC
phát hiện được 7 mẫu/10 mẫu và cột silicagel phát hiện được 3 mẫu/10 mẫu.
Nhìn chung, mức độ nhiễm trên bắp và đậu phộng ≤ 10ppb. Như vậy, độ nhạy
của cột IAC cao hơn so với cột silicagel.
So với các mẫu khác hàng, các mẫu thu ở các chợ có nguy cơ nhiễm cao
hơn.
3.2. So sánh tỉ lệ phát hiện của cột IAC và cột Silicagel
Bảng 3.3. So sánh tỉ lệ phát hiện Aflatoxin B
1
của cột IAC và Silicagel
Mẫu
Tổng số
mẫu
Cột IAC Cột Silicagel
Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm
(%)
Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm

(%)
Khách hàng 16 3 18,75 2 12,50
Mua chợ 10 7 70,0 3 30,0
Ủ ẩm 4 4 100 4 100
Tổng 30 14 46,67 9 30,0
Nhận xét: theo bảng 3.3, cột có IAC độ nhạy phát hiện tốt hơn cột
Silicagel.
IV. Kết luận và đề nghị
4.1. Kết luận
Trong tổng số 34 mẫu thu nhận và phân tích tại phòng Sinh hóa, Công ty
FCC có 30,77% mẫu nhiễm Aflatoxin B
1
với mức độ nhiễm ≤ 20ppb và có 10
mẫu nhiễm với mức độ < 50ppb.
Độ nhạy phát hiện Aflatoxin B
1
của cột IAC cao hơn so với cột Silicagel.
Trong 30 mẫu, cột IAC phát hiện 14 mẫu (chiếm 46,67%) và cột silicagel phát
hiện được 9 mẫu (chiếm 30%).
Cột silicagel không phát hiện được mẫu nhiễm Aflatoxin B
1
dưới hàm
lượng 2ppb.
4.2. Đề nghị
Với phương pháp đơn giản, ít tốn kém và phổ phát hiện nhạy và rộng nên
phương pháp dùng cột IAC để phát hiện Aflatoxin B
1
trong các sản phẩm và
nguyên liệu có dầu là phương pháp tối ưu hiện nay. Hi vọng phương pháp này
sớm được áp dụng rộng đặc biệt tại các chợ, các nguồn thu mua nguyên liệu.

Phương pháp này chỉ thử nghiệm một số mẫu giới hạn, đề tài này cần
được nghiêu cứu thêm các nội dung sau:
 Khảo sát thêm một số mẫu thuộc các nguồn nguyên liệu khác
nhau
 Khảo sát thêm một số khu vực khác nhau
Khảo sát thêm một số mẫu trong các thời điểm khác nhau