ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG THỤ THỂ TSH TRÊN NGƯỜI VIỆT NAM BÌNH THƯỜNG BẰNG HAI PHƯƠNG PHÁP RIA VÀ ELISA doc

ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG THỤ THỂ TSH TRÊN
NGƯỜI VIỆT NAM BÌNH THƯỜNG BẰNG HAI PHƯƠNG PHÁP
RIA VÀ ELISA



TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện định lượng TRAb bằng hai phương
pháp RIA và ELISA. Tìm giá trị TRAb trên người Việt nam bình thường.
Phương pháp nghiên cứu: thiết kế nghiên cứu là cắt ngang, tiền cứu.
Đối tượng nghiên cứu: 118 người bình thường khỏe mạnh tình
nguyện (tuổi từ 20 – 52) được loại trừ các bệnh lý tuyến giáp.
Kết luận: Qua nghiên cứu chúng tôi nhận thấy đã có đủ điều kiện và
độ tin cậy để thực hiện việc định lượng TRAb. Giá trị TRAb bình thường
trên người Việt nam khỏe mạnh đối với phương pháp RIA 1,08 0,9 U/L
và ELISA 1,14 0,57 U/L.
ABSTRACT
Objectives: Measuring TRAb by RIA (RadioImmunoAssay) and
ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) methods. Then,
determining normal value of TRAb on healthy Vietnamese.
Method: prospective cross-sectional study.
Results: 118 Vietnamese healthy donator (20-52 age) excluded
thyroid disease.
Conclusion: By the study, we recognize that there are enough
conditional and confidential technique in order to perform the measure
of TRAb. Normal value of TRAb of healthy Vietnamese are: RIA
method: 1.08 ± 0.9 U/L. ELISA method: 1.14 ± 0.57 U/L.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lý tự miễn tuyến giáp ngày nay được xem như là rối loạn miễn
dịch cơ quan đặc hiệu, gồm có hai nhóm bệnh chính: bệnh BASEDOW và
viêm giáp tự miễn.

Định lượng kháng thể tự miễn tuyến giáp rất có ích trong việc xác
định bệnh lý tự miễn của tuyến giáp và thường được ứng dụng trong thực tế
lâm sàng để chẩn đoán và theo dõi bệnh
(19,20)
.
Có ba kháng nguyên liên quan đến bệnh lý miễn dịch tuyến giáp đã
được xác định, Thyroglobulin (Tg), Thyroperoxidase (TPO) và thụ thể TSH
(TSH-R) tương ứng với ba loại kháng thể TgAb, TPOAb và TRAb (TSH
receptor antibodies)
(4,14)
.
Tại Việt Nam kháng thể kháng thyroglobulin (TgAb) và kháng TPO
(TPOAb) là những tự kháng thể được xác định đầu tiên. Xét nghiệm định
lượng các kháng thể tuyến giáp này, ngày nay được sử dụng rộng rãi trong
một số bệnh lý tuyến giáp, riêng kháng thể kháng thụ thể TSH (TRAb) do có
phức tạp về kỹ thuật và chi phí xét nghiệm cao, cho nên hiện tại chỉ có một
số ít trung tâm thực hiện và còn trong vòng nghiên cứu.
Chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này nhằm mục đích:
- Định lượng TRAb bằng hai phương pháp RIA (radioimmunoassay)
và ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
- Định lượng TRAb trên người Việt Nam bình thường để làm giá trị
so sánh đối chiếu trên lâm sàng.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu được thiết kế là nghiên cứu cắt ngang, tiền cứu.
Đối tượng nghiên cứu
Người bình thường khỏe mạnh, không có tiền sử gia đình về các bệnh
lý tuyến giáp. Không dùng corticoid trong khoảng 2 tháng trước đó. Độ tuổi
từ 18 đến 60 tuổi. Tự nguyện tham gia nghiên cứu.
Cỡ mẫu

Cỡ mẫu được tính dựa trên công thức sau
n = C
2
αf(1- f)/ε
2


Trong đó C
2
α = 1,96 với α = 0,05
f: tỉ lệ ước đoán 7%
ε: sai số chọn mẫu 1,6%.
n = 73.
Phương pháp nghiên cứu
+ Phương pháp tiến hành
Hỏi tiền sử và thăm khám lâm sàng để loại trừ các trường hợp bệnh
lý. Tất cả các đối tượng đáp ứng với yêu cầu đề ra được thử FT
4,
FT
3,
TSH
để phát hiện các bất thường bệnh lý tuyến giáp, đồng thời được định lượng
TRAb bằng hai phương pháp RIA và ELISA, theo qui trình như sau:
++ Qui trình định lượng TRAb bằng RIA
Kit TR-AB-CT của hãng Cis bio international.
NGUYÊN LÝ
Trong Kit TR-AB-CT các TRAb trong huyết thanh bệnh nhân được
cho tương tác với thụ thể TSH tráng ở đáy các ống nghiệm. Phần TRAb gắn
kết được phát hiện bởi khả năng ức chế độ gắn của TSH – I
125

với các thu
thể tráng trong ống nghiệm, nồng độ TRAb được xác định trên đường cong
chuẩn. Ngoài ra, có thể diễn giải kết quả bằng sự ức chế tỷ lệ gắn TSH.
QUI TRÌNH KỸ THUẬT:
1. Đưa các gói chứa tubes và các loại thuốc thử ra nhiệt độ phòng (18-
25
0
C) trước khi tiến hành xét nghiệm khoảng 30 phút. Sau khi mở gói chưa
tubes, các ống có tráng kháng thể đáy ống phải được dùng trong ngày, các
ống còn thừa cho vào túi nhựa hút ẩm trữ 2-8
0
C tối đa 1 tuần.
2. Đánh số các ống kép cho total (tổng hoạt tính)(T), chứng 0-1-2-3-4,
chứng dương, mẫu huyết thanh. Riêng total thì dùng ống nghiệm thông
thường. Nếu tính kết quả bằng % độ gắn TSH binding thì có thể không cần
dùng đến các chuẩn 1-4.
3. Cho 50 l start buffer vào tất cả coated tubes (giai đoạn này nên
dùng multipipette eppendorf (ống hút đa thể tích).
4. Cho 100 l chứng, chứng âm, chứng dương và các mẫu huyết
thanh vào mỗi coated tubes tương ứng.
5. Ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng (20-25
0
C), trên máy lắc 200 vòng/phút.
6. Cho 1 ml dung dịch đệm rửa vào mỗi tube, trừ ống T, rồi đổ đi. Lặp
lại lần 2.
7. Cho 100 l
125
I-labelled TSH (TSH gắn I
125
) vào tất cả các ống,

kể cả ống T, bằng multipipette eppendorf. Đậy ống và ủ nhiệt độ phòng trên
1 máy lắc 200 vòng/phút.
8. Cho 1 ml dung dịch đệm rửa vào tất cả các ống, trừ ống T, đổ đi.
Lặp lại lần 2.
9. Đếm mỗi ống 1-2 phút bằng máy đếm gamma.
10. Vẽ đồ thị tỷ lệ B/Bo (Bo la số đếm của chứng âm, tức standard 0)
nghịch với log của hàm lượng standard). Đọc hàm lượng TRAb của mẫu
huyết thanh và chứng dương trên đồ thị chuẩn. (Có thể diễn giải kết quả
bằng tỷ lệ ức chế gắn TSH).
Inhibition TSH binding % = 100-B/Bo x 100
Đặc trưng của phương pháp định lượng
Tính đặc hiệu
TR-AB-CT xét nghiệm đặc hiệu với tự kháng thể kháng TSH. Không
có hiện tượng giao thoa với các tự kháng thể khác và cho kết quả âm tính đối
với kháng thể kháng thyroglobulin, kháng TPO, các yếu tố thấp khớp, thụ
thể acetylcholine. Hơn nữa, không có hiệu quả với người có nồng độ LH cao
khoảng 10 U/ml, TSH khoảng 30 U/L, FSH khoảng 70 U/ml, HCG đến
160U/L).
Test hồi qui:
Thêm 1 lượng biết trước TRAb vào huyết thanh người, tỷ lệ % hồi
qui trong mẫu nằm trong dãy từ 94% đến 111%.
Test pha loãng
Các mẫu có nồng độ đậm đặc cao phải được pha loãng. Tỷ lệ % hồi
qui nằm trong dãy từ 83% đến 120%.
Giới hạn phát hiện
Được định nghĩa như là lượng tối thiểu có thể phát hiện được tương
đương với giá trị huyết thanh âm bằng cpm (số xung đếm trong một phút)
+2SD là 0,3 U/L.
++ Qui trình định lượng TRAb bằng ELISA
Sử dụng kit thử TSH Receptor Autoantibody ELISA của hãng DRG

Instruments GmbH Germany.
Đây là phương pháp miễn dịch men được đo ở bước sóng λ 450 nm.
Thực hiện trên máy tự động.
- Xử lý số liệu
Tất cả số liệu được tính toán bằng mềm SPSS 10.0 (Statistical
Package for Social Sciences) for window. Đối với các test thống kê lấy
ngưỡng ý nghĩa là 5%.
- Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian nghiên cứu từ tháng 11/2002 đến kháng 11/2004. Đề tài này
được thực hiện tại bệnh viện đa khoa tỉnh Đồng Nai, Khoa Y học hạt nhân
Bệnh viện Chợ rẫy và Trung tâm chẩn đoán y khoa MEDIC.
KẾT QUẢ
Tổng số người tình nguyện đáp ứng yêu cầu là 118 người, với đặc
điểm như sau
Bảng 1: Đặc điểm mẫu nghiên cứu
Giới n TB
+ ĐLC
(tuổi)
T
ối
thiểu
(tuổi)
T
ối
đa (tuổi)

Nam 55
32,6
22

49

± 7,3
Nữ 63
33,9
± 9,4
20

52

Chung

118
33,3
± 8,4
20

52

p = 0,45 không có sự khác biệt giữa hai giới.
Trong 118 người tình nguyện tham gia nghiên cứu trong đó nam 55
người nữ 63 người, độ tuổi trung bình nam: 32,6 ± 7,3 tuổi, nữ 33,8 ± 9,4.
Không có sự khác biệt giữa hai giới p = 0,45.
Bảng 2: Kết quả định lượng TRAb bằng phương pháp RIA.
Chung

Nam

Nữ

p
n 118 55 63
TB
1,00 ±
1,02
0,99
0,46
+ ĐLC
(U/ L)
0,62 ± 0,63 ± 0,62
T
ối
thiểu
0,00 0,00

0,00
T
ối
đa
2,11 2,07

2,11
Tất cả 118 người tình nguyện được định lượng TRAb bằng phương
pháp RIA, kết quả giá trị trung bình chung cho cả hai giới là 1,08 ± 0,9 U/L
trong đó thấp nhất là 0,00 và cao nhất là 1,89. Nếu tính riêng cho từng giới
là nam: 1,02 ± 0,63 U/L, nữ: 1,14 ± 1,1. Giữa hai giới không có sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê với p = 0,46.
Bảng 3: Kết quả định lượng TRAb bằng phương pháp ELISA.
Chung

Nam

Nữ

p
n 73 39 34
Chung

Nam

Nữ

p
TB
+ ĐLC
1,14 ±
0,57
1,16
± 0,55
1,11
± 0,6
0,74
T
ối
thiểu
0,00 0,00

0,00
T
ối

đa
2,2 2,2 1,9
Trong 118 người có 73 người được định lượng cả hai phương pháp
RIA và ELISA. Kết quả TRAb bằng phương pháp ELISA của 73 người như
sau: tính chung cả hai giới 1,14 ± 0,57 U/L thấp nhất 0,00 cao nhất 2,2 U/L.
Nam (n = 39) 1,16 ± 0,55 U/L.
Nữ (n = 34) 1,11 ± 0,6 U/L.
Giữa hai giới không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,74
BÀN LUẬN
Định lượng TRAb đã được thực hiện ở những nước tiên tiến vào
những năm đầu của thập niên 1990. Tại nước ta cho đến năm 2002 mới có
một số công trình được báo cáo với cỡ mẫu nhỏ được tiến hành tại Bệnh
viện Bạch Mai và Bộ môn Y học Hạt nhân Trường Đại học Y Hà Nội. Tất cả
các đề tài kể trên thực hiện định lượng TRAb bằng phương pháp RIA với kỹ
thuật kết tủa PEG (Polyethylene glycol) và chưa có báo cáo nào về định
lượng TRAb bằng phương pháp ELISA
(2,25)
.

Đề tài nghiên cứu của chúng tôi tiến hành nhằm mục đích hoàn thiện
kỹ thuật định lượng TRAb bằng phương pháp RIA với kỹ thuật kháng thể
phủ đáy ống và thực hiện định lượng TRAb bằng phương pháp ELISA.
Đồng thời chúng tôi muốn xác định giá trị TRAb trên người Việt Nam bình
thường nhằm mục đích so sánh đối chiếu với các giá trị bệnh lý khác.
Đối với phương pháp RIA nhà sản xuất kit thử đưa ra khuyến cáo, qua
141 trường hợp người bình thường khoẻ mạnh người ta thấy rằng có 140
người chiếm 99% các trường hợp có giá trị TRAb nhỏ hơn 1U/L, giá trị dưới
1U/L được xem là TRAb âm tính. Từ 1,1 đến 1,5 được xem là vùng giới hạn
và lớn hơn 1,5U/L được xem là TRAb dương tính. Tuy nhiên nhà sản xuất
cũng khuyến cáo các phòng xét nghiệm nên đưa ra chỉ số bình thường cho

riêng mình. Như vậy số liệu trung bình của chúng tôi đưa ra là 1,08 ± 0,9
U/L phù hợp với khuyến cáo của nhà sản xuất.
So với số liệu của hai đề tài đã được công bố
Tác giả Bùi T. Huyền
(2)
Đại học Y Hà nội tổng số 20 người chỉ có một
trường hợp có TRAb = 0,38 mU/mL còn 19 trường hợp còn lại âm tính.
Tác giả Trần Xuân Trường
(25)
qua 30 trường hợp đưa ra kết quả giá trị
trung bình TRAb: 1,4 ± 0,6U/L.
Các tác giả này tuy cùng dùng phương pháp RIA nhưng sử dụng kỹ
thuật tủa PEG. Đây là một kỹ thuật phức tạp vì thế chúng tôi chọn kỹ thuật
kháng thể phủ đáy ống để thực hiện đề tài, kỹ thuật này dễ thực hiện, sai sót
do kỹ thuật thấp. Qua 118 trường hợp trong đó có 30 trường hợp chúng tôi
thực hiện mẫu kép, chúng tôi nhận thấy hệ số thay đổi giữa các mẫu kép
CV% (Coefficience of variation) nhỏ hơn 5%, đồ thị thu được có dạng đồ thị
chuẩn TRAb và so với huyết thanh chuẩn nằm trong giới hạn của nhà sản
xuất cho phép. Qua đó chúng tôi nhận định kết quả thu được là đáng tin cậy
có thể ứng dụng để so sánh và đối chiếu trên lâm sàng.
Đối với phương pháp định lượng TRAb bằng ELISA, cho đến nay tại
Việt Nam chưa có báo cáo nào ghi nhận. Theo khuyến cáo của nhà sản xuất
nếu giá trị TRAb nhỏ hơn 1U/L thì được xem là âm tính, lớn hơn 1,5U/l là
dương tính và từ 1 – 1,5U/L là nghi ngờ, kết quả chúng tôi thu được ở 73
người Việt Nam bình thường là 1,14 ± 0,57 là phù hợp.
Kết quả nghiên cứu kể trên của chúng tôi nhằm mục đích hoàn thiện
kỹ thuật định lượng TRAb, tìm giá trị TRAb trên người Việt nam bình
thường nhằm mục đích so sánh đối chiếu với các giá trị bệnh lý khác, đóng
góp một phần công ích trong việc chẩn đoán những bệnh lý tự miễn tuyến
giáp.

KẾT LUẬN
Qua 118 người Việt nam bình thường tự nguyện, chúng tôi nhận
thấy:
- Về mặt kỹ thuật đã đủ điều kiện và độ tinh cậy để triển khai định
lượng TRAb.
- Giá trị TRAb bình thường trên người Việt nam khỏe mạnh, đối với
phương pháp RIA (Kit TR-AB-CT của hãng Cis bio international) 1,08 ± 0,9
U/L. Với phương pháp ELISA (Kit TSH Receptor Autoantibody ELISA của
hãng DRG Instruments GmbH Germany) 1,14 ± 0,57 U/L.