Nghiên cứu sự lưu hành của gene netb ở các chủng clostridium perfringens type a gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố nha trang

i

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội

LỜI CẢM ƠN
Được sự phân công của ban giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi
trường, Trường Đại học Nha Trang và được sự đồng ý của Ban lãnh đạo Phân viện
Thú y miền Trung cho phép tôi thực tập tại Bộ môn nghiên cứu Vi trùng từ 2/2012
đến 5/2012.
Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám
Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám Đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi
trường, toàn thể quý thầy cô giáo đã tạo điều kiện và truyền đạt rất nhiều kiến thức
cho tôi cũng như các thành viên trong lớp 50CNSH trong suốt 4 năm học.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Lập, TS. Vũ Ngọc Bội cùng BS. Lê
Đình Hải đã tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Phân viện Thú y miền Trung, các anh
chị trong Bộ môn Vi trùng học đã rất nhiệt tình, tạo một môi trường thuận lợi, học
hỏi cao trong suốt thời gian tôi thực tập tại Viện.
Xin gửi lời cảm ơn đến nhóm bạn “Tùng – Tiến - Linh - Chi” đã luôn đồng
hành chia sẽ khó khăn, niềm vui và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.
Để hoàn thành đề tài này, ngoài một phần nỗ lực của bản thân thì sự động
viên của gia đình và bạn bè là nguồn lực to lớn không thể thiếu với tôi. Tôi xin chân
thành cảm ơn!
Do trình độ kiến thức còn hạn chế, lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên
cứu khoa học. Kính mong nhận được sự thông cảm, góp ý nhiệt tình của Quý thầy
cô giáo, các cô chú, anh chị và toàn thể các bạn để khóa luận của tôi được hoàn
thiện hơn. Xin được chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 11 tháng 5 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Lại Nhật Linh
ii

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
MỤC LỤC

MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii
LỜI NÓI ĐẦU 1
1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 4
1.1.1 Trên thế giới 4
1.1.2 Ở Việt Nam 7
1.2. Vi khuẩn C. perfringens [29] 7
1.2.1. Đặc điểm hình thái 8
1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học 8
1.2.3. Đặc tính di truyền 9
1.3. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens 10
1.4. Các loại độc tố của C. perfringens [15] 11
1.4.1 Alpha toxin 11
1.4.2. Beta toxin 12
1.4.3. Epsilon toxin 12
1.4.4. Iota toxin 13
1.4.5. Enterotoxin (CPE) 13
1.4.6. Delta toxin 14
1.4.7. Theta toxin 14
1.5. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens và khả năng gây bệnh 14

1.6. Phản ứng PCR [3] [5] 18
1.6.1. Nguyên tắc phản ứng 18
1.6.2. Các điều kiện của phản ứng PCR 21
1.6.3. Các hạn chế của phản ứng PCR 22
iii

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
1.6.4. Phản ứng Multiplex PCR 24
1.7. Điện di [3] [5] 24
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Đối tượng nghiên cứu 26
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26
2.3. Vật liệu nghiên cứu 26
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 26
2.3.2. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 26
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu 26
2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học 27
2.4.3. Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi [4] [7] 28
2.4.4. Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn [4] [7] 28
2.4.5. Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học 28
2.4.6. Phương pháp giữ giống vi khuẩn C. perfringens 29
2.4.7. Phương pháp định type vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR [11] [25] 30
2.4.8. Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR [8] 32
2.4.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu
33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang 34
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C. perfringens trên gà ở địa bàn thành phố Nha Trang 34
3.1.2. Kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens phân lập

được 35
3.1.2.1. Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn C. perfringens 35
3.1.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di đông của vi khuẩn C. perfringens bằng phương pháp soi
tươi 36
3.1.2.3. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn C. perfringens phân lập được trên một
số môi trường 36
3.1.2.4. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens 37
iv

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
3.2. Kết quả xác định type độc tố vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR 40
3.3. Kết quả xác định gene độc tố netB bằng kỹ thuật PCR 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

v

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
DANH MỤC CÁC BẢNG

BẢNG 1.1. Vị trí gene mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens
BẢNG 1.2. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens
BẢNG 1.3. Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens
BẢNG 2.1. Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR định type vi
khuẩn C. perfringens
BẢNG 2.2. Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn
C. perfringens
BẢNG 2.3. Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex PCR định type vi khuẩn C.
perfringens
BẢNG 2.4. Trình tự cặp mồi của gene netB
BẢNG 2.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định gene netB
BẢNG 2.6. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR xác định gene netB
BẢNG 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens từ mẫu phân thu được
BẢNG 3.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens
BẢNG 3.3. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens

vi

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
DANH MỤC CÁC HÌNH

HÌNH 1.1. Vi khuẩn C. perfringens gây bệnh NE trên gà
HÌNH 1.2. Các điểm tổn thương ruột gà do vi khuẩn C. perfringens
HÌNH 1.3. Sơ đồ phản ứng chuỗi PCR
HÌNH 1.4. Các chu kỳ của phản ứng PCR
HÌNH 3.1. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn C. perfringens
HÌNH 3.2. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường TSC agar
HÌNH 3.3. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường thạch máu
HÌNH 3.4. Kết quả kiểm tra lên men đường
HÌNH 3.5 Kết quả nuôi cấy trên môi trường Litmus milk
HÌNH 3.6. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường Egg yolk
HÌNH 3.7. Kết quả CAMP - test
HÌNH 3.8. Kết quả điện di định type vi khuẩn C. perfringens
HÌNH 3.9. Kết quả điện di xác định gene netB của vi khuẩn C. perfrienges type A

vii

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

C. perfringens Clostridium perfringens
E. coli Escherichia coli
Taq Thermus aquaticus
SPS agar Perfringens Selective Agar
TSC agar Tryptose – Sulfit – Cycloserin Agar
PCR Polymerase Chain Reaction
dNTP Deoxynucleotide Triphosphate
TBE Tris Boric EDTA
DNA Deoxyribonucleic Acid
RNA Ribonucleic Acid
M Maker – Thang chuẩn DNA
Cpa Gene mã hóa C. perfringens alpha toxin
Cpb Gene mã hóa C. perfringens beta toxin

Ext Gene mã hóa C. perfringens Epsilon toxin
Itx Gene mã hóa C. perfringens iota toxin
Cpe Gene mã hóa C. perfringens enterotoxi
1

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
LỜI NÓI ĐẦU
Ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm có vai trò quan trọng trong hệ thống nông
nghiệp, góp phần mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người chăn nuôi. Sản phẩm của
ngành chăn nuôi không những là nguồn cung cấp thực phẩm, nguyên liệu cho công
nghiệp chế biến mà phế phẩm của nó còn được tận dụng cho các ngành khác… Tại
Hội nghị triển khai chiến lược phát triển chăn nuôi tại các tỉnh phía Nam đã đề ra
chỉ tiêu tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến năm 2020 đạt trên 42%. Trong
đó, năm 2010 đạt khoảng 32% và năm 2015 đạt 38%. Muốn đạt được kế hoạch đó
thì phải đầu tư hơn nữa cho ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt chăn nuôi gà mang
một ý nghĩa to lớn.
Những người chăn nuôi, đặc biệt là ở nông hộ, khi mà có quá nhiều khó khăn
đến từ vốn, con giống, thức ăn thì họ còn phải đối mặt thêm một vấn đề nữa liên
quan đến công tác thú y, đó là dịch bệnh. Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis
- NE) do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra là một trong những bệnh nguy
hiểm xảy ra ở gia cầm nói chung và loài gà nói riêng, đặc biệt là ở các nước có
ngành chăn nuôi gia cầm phát triển như Việt Nam. Bệnh rất khó phát hiện các biểu
hiện lâm sàng và khi đã phát hiện được thì không có khả năng cứu chữa.
Vi khuẩn C. perfringens là loại trực khuẩn yếm khí Gram dương, chúng có
thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi đứng song song. Vi khuẩn có khả năng hình
thành nha bào, không di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Căn cứ
vào sự sản sinh các loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota người ta chia vi
khuẩn này thành 5 type là A, B, C, D, E. Mỗi type sản sinh ra một độc tố khác nhau
và gây ra các bệnh khác nhau trên các đối tượng động vật khác nhau. Type A sản

sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta và epsilon; type C sản sinh độc
tố alpha và beta; type D sản sinh độc tố alpha và epsilon; type E sản sinh độc tố
alpha và iota. Ngoài ra C. perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama,
delta, eta, theta, kappa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,…
Khi cơ thể gà gặp các điều kiện bất lợi như thức ăn kém phẩm chất, thay đổi
khẩu phần ăn đột ngột, vi khuẩn C. perfringens có mặt ở đường tiêu hóa của gia
cầm sẽ tăng sinh về số lượng và sản sinh độc tố gây bệnh. Gà mắc bệnh viêm ruột
2

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
hoại tử thường xuất hiện các triệu chứng như ủ rũ, biếng ăn, xù lông và xả cánh.
Bệnh thường xảy ra ở hai thể cấp tính và mãn tính. Thể cấp tính chủ yếu xuất hiện
trên gà từ 2- 4 tuần tuổi; con vật mắc bệnh bị mất nuớc, tiêu chảy, phân có màu sẫm
và có mùi thối khắm. Bệnh tích bao gồm các điểm hoại tử xuất huyết ở ruột non,
đặc biệt là ở ruột chay (jejunum) và ruột hồi (ileum). Thể mãn tính với các bệnh tích
hoại tử điểm hoặc hoại tử dạng sợi ở ruột non, nếu con vật còn sống thì tạo thành
các đám loét. Thiệt hại do bệnh này gây ra cho các hộ chăn nuôi và các trang trại
chăn nuôi có thể lên đến 50%.
Những nghiên cứu trước đây cho rằng độc tố alpha do vi khuẩn C.
perfringens type A sản sinh là nguyên nhân chính gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà.
Những năm gần đây, bằng thực nghiệm gây đột biến gene mã hóa độc tố anpha, một
số nghiên cứu đã chứng minh rằng alpha toxin không phải là độc tố quyết định khả
năng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử, các tác giả đã phát hiện một loại độc tố mới,
độc tố netB, là tác nhân chính gây ra các bệnh tích điển hình của bệnh viêm ruột
hoại tử ở gà.
Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam, đặc
biệt là vai trò gây bệnh viêm ruột hoại tử của các loại độc tố do vi khuẩn C.
perfringens sản sinh ở mức phân tử. Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của
Ban Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và Ban Giám Đốc Viện Công nghệ Sinh

học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, đã cho tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sự lƣu hành của gene netB ở các chủng Clostridium perfringens
type A gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang”.
Nội dung của đề tài:
- Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens từ mẫu phân của gà khỏe và gà
mắc bệnh viêm ruột hoại tử.
- Xác định các type độc tố của Clostridium perfringens bằng kỹ thuật
Multiplex PCR.
- Xác định gene mã hóa độc tố netB bằng kỹ thuật PCR.
Mục tiêu của đề tài
3

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
Để tìm hiểu về bệnh viêm ruột hoại tử ở gà nuôi tại thành phố Nha Trang và
sự lưu hành của gene netB trong các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà
mắc bệnh.
Phát hiện sự lưu hành của gene mã hóa độc tố netB trong các chủng
Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà từ đó có thể đề xuất các
biện pháp điều trị bệnh có hiệu quả và giúp giảm thiểu tối đa những thiệt hại do C.
perfringens gây ra.

4

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột
hoại tử ở gà
1.1.1 Trên thế giới
Kể từ khi lệnh cấm sử dụng chất kháng sinh để thúc đẩy tăng trưởng trong
thức ăn chăn nuôi của Liên minh Châu Âu EU được ban hành, bệnh viêm ruột hoại
tử đã trở thành nguyên nhân chính gây tử vong ở gà. Viêm ruột hoại tử là một trong
những bệnh phổ biến nhất và gây thiệt hại tài chính đáng kể, trung bình thiệt hại
0,05USD cho mỗi con gia cầm, và có thể lên đến 2 tỷ USD hàng năm. Bệnh có thể
gây ra tỷ lệ chết lên đến 50% hoặc làm giảm đáng kể hiệu suất tăng trưởng. [8]
Bệnh NE là một bệnh đa yếu tố phức tạp với nhiều yếu tố không rõ ràng ảnh
hưởng đến sự xuất hiện của nó và mức độ nghiêm trọng của dịch bệnh. Đặc biệt các
dịch lẻ tẻ của NE có thể xảy ra thường xuyên trong các trang trại trong đó thuốc

kháng sinh không được sử dụng như kích thích tăng trưởng, thực hành chăn nuôi
không nghiêm ngặt và chế độ ăn uống dựa trên các loại ngũ cốc nhớt với các nguồn
protein động vật là phổ biến.[9]

Hình 1.1 Vi khuẩn C. perfringens gây bệnh NE trên gà
Theo báo cáo của Long J.R. (1973) bệnh NE được biết đến lần đầu tiên vào
năm 1961, bệnh xảy ra trên gà trống non từ 6 – 7 tuần tuổi tại Anh, sau đó xuất hiện
tại Australia, Canada, Mỹ và Thụy Điển. [25]
Viêm ruột hoại tử đã được đề cập trong các báo cáo ở châu Âu, Bắc Mỹ,
Nam Mỹ, Trung Đông, châu Á và New Zealand. Bệnh xảy ra trên gà thịt và gà tây
từ 3 – 7 tuần tuổi. Bệnh do vi khuẩn C. perfringens gây ra, một loại vi khuẩn khá
phổ biến được tìm thấy trong đất, bụi, rác và một lượng nhỏ trong đường tiêu hóa
của gà khỏe mạnh. Vi khuẩn C. perfringens chỉ gây bệnh khi số lượng của nó tăng
5

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
lên đột ngột và điều kiện sức khỏe vật nuôi không tốt, khi đó lượng độc tố ngoại
bào được sinh ra vượt quá mức cho phép sẽ tấn công và gây ra các tổn thương bệnh
lý ở đường tiêu hóa. Phần lớn các nghiên cứu về NE đã tập trung vai trò của độc tố
mang tính quyết định đối với khả năng gây bệnh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng
bệnh NE chủ yếu được gây ra bởi C. perfringens type A và một số lượng nhỏ gia
cầm bị bệnh là do type C [17]. Độc tố alpha được coi là nguyên nhân gây bệnh
chính.
Tại các trang trại gà ở Cario – Ai Cập bị bệnh NE, Effat và cộng sự (2007)
đã phân lập C. perfringens từ các mẫu gà bị bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất
cả những vi khuẩn phân lập được đều là C. perfringens, có khuẩn lạc đặc trưng trên
môi trường thạch máu cừu với hai vòng dung huyết. Ông đã định type vi khuẩn
phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4
gene sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota. Kết quả là type A với độc tố alpha là

nguyên nhân gây bùng phát bệnh NE ở các trang trại này. [14]
Theo nghiên cứu của George Tice về “Sự tồn tại của Clotridia và sự bất ổn
định của đường ruột” đã cung cấp thêm nhiều thông tin có giá trị liên quan đến
nguyên nhân gây bệnh. Trong đó ngoài việc chỉ ra rằng sự tồn tại của chủng C.
perfringens type A sản sinh độc tố alpha có liên quan đến bệnh NE và chế độ ăn
uống cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của bệnh. Gà được sinh ra với
một đường ruột vô trùng và hai tuần đầu tiên sau khi sinh hệ đường ruột có một
lượng lớn oxy đã ức chế sự sinh sản của các vi khuẩn yếm khí Clotridia. Sau hai
tuần, lượng oxy trong ruột bắt đầu giảm, đồng thời Clotridia sinh sôi nảy nở và dẫn
đến tình trạng bệnh lâm sàng. Trong nghiên cứu cũng đề cập đến bệnh lâm sàng
không dẫn đến tử vong và được đặc trưng bởi viêm loét đầu mối ở tá tràng và ruột
chay.[24]
6

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội

Hình 1.2 Các điểm tổn thƣơng ruột gà do vi khuẩn C. perfringens
Một nghiên cứu của các nhà khoa học Australia đã thử nghiệm vai trò gây
bệnh của độc tố alpha sau khi gene này bị gây đột biến. Nghiên cứu được tiến hành
ở 3 nhóm gà: nhóm 1 gây bệnh bằng vi khuẩn C. perfringens mang gene cpa hoang
dại, nhóm 2 gây bệnh bằng C. perfringens mang gene cpa đã gây đột biến không có
khả năng biểu hiện gene này nên không thể sản sinh độc tố alpha và nhóm 3 dùng
làm đối chứng. Kết quả đã chỉ ra rằng biểu hiện bệnh NE ở gà không phụ thuộc vào
vi khuẩn C. perfringens sản sinh độc tố alpha. Như vậy chắc chắn rằng độc tố alpha
không phải là một tác nhân gây bệnh chủ yếu của bệnh NE. [18]
Năm 2008, Anthony Keyburn và cộng sự đã có một phát hiện đột phá rằng
độc tố alpha không phải là yếu tố chính gây bệnh NE trên gà mà do một loại độc tố
mới, được đặt tên là netB gây ra. [13]
Kể từ lần đầu tiên phát hiện ra gene netB năm 2008, sự hiện diện của gene

netB đã được sàng lọc trong số nhiều chủng C. perfringens phân lập từ Australia,
Canada, Mỹ và một số nước châu Âu. Nghiên cứu của A.Tolooe và cộng sự (2011)
đã lần đầu tiên báo cáo sự hiện diện của gene netB giữa chủng C. perfringens phân
lập từ châu Á. Theo A.Tolooe và cộng sự thì tỷ lệ các chủng mang gene mã hóa
độc tố netB là 52,80%, trong số đó chủ yếu là các chủng phân lập từ gà có triệu
chứng của bệnh NE. Trong một cuộc khảo sát ở Bắc Mỹ đã chỉ ra rằng phần lớn các
chủng C. perfringens phân lập từ gà có biểu hiệu lâm sàng của bệnh NE mang gene
netB (58,30%) trong khi chỉ có một tỷ lệ nhỏ (8,60%) chủng C. perfringens phân
lập từ gà khỏe mạnh mang gene này. Tỷ lệ cao nhất (>90%) cho kết quả dương tính
7

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
với gene netB được tìm thấy từ chủng C. perfringens phân lập từ một đàn gà thịt bị
bệnh ở Thụy Điển. Tuy nhiên trong cùng một đàn gà, khoảng 25% cũng cho kết quả
dương tính với gene netB ở gà khỏe mạnh.[8]
1.1.2 Ở Việt Nam
Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do vi khuẩn C. perferingens vẫn chưa được
nghiên cứu rộng rãi và quy mô ở nước ta. Hiện nay mới chỉ có một vài nghiên cứu
về C. perfringens gây bệnh trên bò, dê, cừu và lợn. Các nghiên cứu chủ yếu xác
định sự có mặt và định type độc tố trên các chủng C. perfringens được phân lập.
Theo TS. Lê Lập và cộng sự (2007) khi phân lập và định type độc tố của vi
khuẩn C. perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Tác giả cho
biết những chủng vi khuẩn phân lập từ phân đều thuộc type A mang gene cpa mã
hóa độc tố alpha, những chủng phân lập từ nội tạng của dê, cừu bị bệnh lại thuộc
type D mang gene cpa và etx. [2]
Theo tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009) hội chứng tiêu chảy ở lợn
đã được nhiều tác giả trong nước nghiên cứu. Tuy nhiên các nghiên cứu đầy đủ về
vai trò gây tiêu chẩy ở lợn của vi khuẩn C. perfringens so với E.coli và Salmonella
chưa có nhiều, tác giả đã kết luận C. perfringens đóng vai trò quan trọng trong hội

chứng tiêu chảy ở lợn. Tần suất phân lập được C. perfringens ở lợn bị bệnh là
55,60%. Khi lợn chết vì tiêu chảy với triệu chứng và bệnh tích đặc trưng thì tỷ lệ
phân lập được vi khuẩn C. perfringens ở ruột là 88,91%.[1]
Đặc biệt là các nghiên cứu về gene netB chưa được nghiên cứu ở Việt Nam,
có thể do C. perfringens là vi sinh vật kỵ khí nên quá trình nghiên cứu, phân lập gặp
nhiều khó khăn hơn so với các vi sinh vật hiếu khí khác. Đồng thời sự hạn chế về
các phương tiện nghiên cứu hiện đại cũng khiến cho việc nghiên cứu về nó trở nên
khó khăn hơn.
1.2. Vi khuẩn C. perfringens [29]
C. perfringens lần đầu tiên được phát hiện bởi Feser vào năm 1865, sau đó
nhiều nghiên cứu của các tác giả khác về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra.
C. perfringens phân bố rộng khắp trong môi trường đất, nước, không khí và thường
được tìm thấy trong ruột động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì vi khuẩn phát
triển và sản sinh độc tố gây bệnh trong cơ thể vật chủ. C. perfringens đã được phân
8

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
lập bởi Welch và Nuttall (năm 1892) từ vết thương bị hoại tử và được đặt tên là
Baccillus aerogenes capsulatus. Sau đó đổi thành Bacillus perfringens, tiếp theo là
Clostridium welchii và hiện nay là Clostridium perfringens.
Hệ thống phân loại khoa học của C. perfringens:
Giới (Regnum): Bacteria
Ngành (Phylum): Firmicutes
Lớp (Class): Clostridia
Bộ (Order): Clostridiales
Họ (Familia): Clostridiaceae
Chi (Genus): Clostridium
Loài (Species): C. perfringens
1.2.1. Đặc điểm hình thái

C. perfringens là trực khuẩn Gram dương, hình que, yếm khí và có khả năng
tạo nha bào. C. perfringens có kích thước lớn (0,6 – 0,24 x 1,3 – 19 µm), không di
động. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường thạch máu có dạng tròn, nhẵn,
bóng, được bao bởi một vòng bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và
một vòng bên ngoài không dung huyết hoàn toàn (do độc tố alpha). Người ta gọi
hiện tượng này là hiện tượng dung huyết beta trên môi trường có bổ sung máu động
vật.
Vi khuẩn C. perfringens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 12 - 50
o
C,
phát triển chậm ở 20
o
C và ở 43 - 47
o
C vi khuẩn phát triển nhanh cực độ, có thể tạo
ra một thế hệ trong 8 - 10 phút. Vi khuẩn phát triển ở pH 5 - 8 và hoạt tính nền của
nước là 0,93 – 0,97.
C. perfringens có thể sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt nhờ sự
biến đổi thích nghi của hệ thống biến dưỡng tế bào với khả năng chịu đựng cao và
sản sinh nha bào. Nha bào có thể sống sót trong những môi trường khắc nghiệt như
nóng, khô, acid, chất tẩy rửa.
1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học
C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nhưng điều kiện nuôi cấy yếm khí không
đòi hỏi khắt khe như các vi khuẩn khác.
9

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
- Điều kiện nuôi cấy: C. perfringens phát triển tốt ở môi trường yếm khí,
thông thường từ 2 - 10% CO

2
.
- Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp là 37 - 42
o
C.
- Vi khuẩn này có thể phát triển trên các môi trường:
Môi trường Fluid Thioglycollate: Sau 6 - 8 giờ nuôi cấy ở 37
o
C, vi
khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường.
Môi trường SPS agar hoặc TSC agar: Vi khuẩn phát triển cho khuẩn
lạc tròn, màu đen do vi khuẩn sinh H
2
S kết hợp với Fe có sẵn trong môi trường tạo
thành kết tủa FeS có màu đen.
Môi trường Blood agar: Sau 24 – 48 giờ nuôi cấy ở 37
o
C, thu được
khuẩn lạc C. perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng dung huyết
kép (vòng bên trong dung huyết hoàn toàn - do độc tố theta và một vòng bên ngoài
dung huyết không hoàn toàn – do độc tố alpha). Đây là hiện tượng dung huyết beta
trên môi trường thạch máu.
Môi trường Litmus milk: Vi khuẩn phát triển tạo thành dạng vẩn mây
điển hình do đường lactose trong môi trường kiềm bị lên men, tạo ra acid, làm đông
vón casein dẫn đến đổi màu môi trường từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị
pH Litmus. Sau đó, các đám vẩn acid bị vỡ nứt ra do sự hình thành hơi.
Môi trường Egg yolk: Vi khuẩn phát triển sản sinh men lecithinase
phân giải lecithine tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc.
Phản ứng CAMP test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C. perfringens và S.
agalactiae trên môi trường thạch máu thành một đường vuông góc thì các khuẩn lạc

của S. agalactiae sản sinh ra yếu tố có khả năng khuếch tán sẽ làm rõ hơn vùng
dung huyết không hoàn toàn tạo ra bởi độc tố alpha của C. perfringens.
Môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh làm
đục môi trường.
1.2.3. Đặc tính di truyền
Trong các loài có khả năng gây độc của chi Clostridium, C. perfringens là
loài điển hình cho các nghiên cứu di truyền vì tốc độ tăng trưởng nhanh và khả năng
thao tác di truyền dễ dàng. Năm 2002, cấu trúc genome hoàn chỉnh của chủng C.
perfringens đã được công bố bởi Shimizu và cộng sự. Bộ nhiễm sắc thể của chủng
10

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
này gồm 3031430 bp, với 2660 vùng mã hóa cho các protein và 10 loại rRNA, tổng
hàm lượng G + C là 28,6%.
Khi cấu trúc genome của C. perfringens được so sánh với genome của
những vi khuẩn không gây bệnh như C. acerabutylicum, sự khác biệt rõ ràng nhất
có liên quan đến các gene sinh độc tố của C. perfringens. Ngoài các gene độc tố đã
biết, Shimizu cũng tìm thấy nhiều gene gây độc khác kết hợp trong hệ gene của C.
perfringens. Năm gene dung huyết đã được xác định dựa trên sự tương đồng về khả
năng dung huyết đã được mô tả trong các loài vi khuẩn đã phân loại trước đây. Hai
type có gene quy định protein liên kết với fibronectin là tương đồng với gene của vi
khuẩn Listeria monocytogenes và Bacillus subtilis đã cho thấy có sự liên quan đến
các yếu tố gây độc.
Trình tự genome của C. perfringens cho thấy các gene độc lực không có tác
động cộng gộp với nhau. Chỉ có một vài yếu tố di truyền di động có thể được phát
hiện và những dấu hiệu của gene theo chiều ngang là khó phát hiện trong genome
của C. perfringens. Do đó, có thể thấy rằng các type độc tố khác nhau của C.
perfringens được tiến hóa từ type A bằng cách nhiễm vào các yếu tố ngoài nhiễm
sắc thể nhẹ plasmid và gene nhảy.

Gene mã hóa độc tố alpha và theta nằm trên nhiễm sắc thể, nhiều gene mã
hóa các loại độc tố khác cũng nằm trên plasmid. Gene mã hóa độc tố enterotoxin có
thể nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid.
Biểu hiện của alpha toxin và theta toxin được quy định bởi một hệ thống
dẫn truyền tín hiệu hai thành phần (VirR/ VirS), một bộ cảm biến histidine kinase,
VirS và các yếu tố cần thiết cho một phản ứng, VirR. Cơ chế điều hòa xảy ra ở cấp
độ phiên mã các các đột biến có thể thay đổi việc sản sinh cả độc tố alpha và theta.
1.3. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens
Vi khuẩn C. perfringens có ở khắp nơi trong thiên nhiên và là một phần của
hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của người và động vật. Thường có hai dạng
cơ bản hình thành nên bệnh là vi khuẩn có sẵn trong ruột hoặc thức ăn bị nhiễm vi
khuẩn này. Ngoài ra, những thay đổi về thành phần môi trường, khẩu phần thức ăn
thay đổi đột ngột như cho ăn quá nhiều, thức ăn chứa quá nhiều protein và năng
lượng cũng là những nguyên nhân gây bệnh. Hoặc do vận động quá mức đã làm
11

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
chậm nhu động ruột, giữ lại lâu các vi khuẩn trong ruột làm tăng sự hấp thụ của độc
tố. Carbonhydrate không tiêu hóa được là môi trường thuận lợi cho C. perfringens
phát triển nhanh chóng.
Một số tác giả khác lại cho rằng C. perfringens thường xuyên sống cộng
sinh ở dạ dày. Bình thường vi khuẩn này cũng có nhiều ở ruột già, nhưng trong
những điều kiện thuận lợi thì nó phát triển quá mức, có thể xâm nhập lên ruột non
và sản sinh ra một lượng lớn độc tố ruột gây nhiễm độc máu và trở thành tác nhân
chính gây bệnh.
1.4. Các loại độc tố của C. perfringens [15]
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringens sản sinh ra hơn 17
loại độc tố khác nhau như alpha, beta, epsilon, iota, beta 2… Dựa vào khả năng sản
sinh 4 loại độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota người ta phân chia vi khuẩn C.

perfringens thành 5 type độc tố khác nhau là A, B, C, D và E. Trong đó type A sản
sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố
alpha, beta; type D sản sinh độc tố alpha, epsilon và type E sản sinh độc tố alpha,
iota. Gene mã hóa các loại độc tố có thể nằm ở nhiễm sắc thể, ở plasmid hoặc ở cả
nhiễm sắc thể/ Plasmid.
Bảng 1.1. Vị trí gene mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. Perfringens
Độc tố
Gene
Vị trí của gene
Alpha
Cpa
Nhiễm sắc thể
Beta
Cpb
Plasmid
Espilon
Etx
Plasmid
Iota
iA
Plasmid
Beta 2
Cpb2
Plasmid
Enterotoxin
Cpe
Nhiễm sắc thể/ Plasmid
1.4.1 Alpha toxin
Đây là loại độc tố gây chết chính, có hoạt tính enzyme phospholipase C. Nó
có khả năng thủy phân màng phospholipid của các loại tế bào khác nhau, làm tan

màng hoặc tạo ra dạng cytotoxicity. Vai trò của độc tố này là gây xuất huyết, hoại
tử với hoạt tính kết dính tiểu cầu và gây ảnh hưởng đến tính thấm của mao mạch.
12

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
Alpha toxin tinh chế có khối lượng phân tử là 43kDa và pH ở điểm đẳng
điện là 5,4. Năm 1989 ba phòng thí nghiệm ở Anh, Mỹ và Nhật Bản đã đồng thời có
báo cáo về việc nhân dòng gene alpha toxin từ C. perfringens. Titball và cộng sự ở
Anh đã chèn đoạn gene mã hóa độc tố alpha của vi khuẩn này vào plasmid của E.
coli và phát hiện vi khuẩn E. coli mang plasmid tái tổ hợp có phản ứng phân giải
lecithinase trên môi trường Egg yolk. Các gene mã hóa cho một loại protein có khối
lượng 44,5 kDa và dường như giống với alpha toxin cũng được mô tả. TSO và
Seibel tại Mỹ cũng với phương pháp tương tự đã phát hiện độc tố alpha được sản
xuất từ plasmid của các sinh vật có phản ứng dung huyết trên môi trường thạch
máu. Họ đã tìm thấy một đoạn gene dài 2 kb chèn vào plasmid của C. perfringens
có chứa một chuỗi dài 1197 nucleotide mã hóa cho 399 amino acid với khối lượng
phân tử là 43 kDa. Okabe và cộng sự ở Nhật Bản đã thành công trong việc nhân
dòng gene vô tính alpha toxin của C. perfringens và cũng cho biết chiều dài của
gene cpa và trình tự acid amin trùng với hai gene nói trên.
1.4.2. Beta toxin
Đây là loại độc tố gây chết người lớn, được sản xuất bởi cả type B và type
C. Beta toxin là một protein mẫn cảm cao với trypsin gây hoại tử tế bào biểu mô
ruột và tế bào màng trong ruột. Ngoài ra độc tố Beta còn tác động đến mô thần kinh
làm ảnh hưởng đến trao đổi Ca
2+
của màng gây ra rối loạn chức năng thần kinh bình
thường. Loại độc tố này có thể được thu hồi từ môi trường lỏng và tinh chế bằng
phương pháp sắc ký ái lực, sử dụng một cột có chứa kẽm nhiệt phân, cột thứ hai
bằng nhựa vinyl ưa nước. Độc tố Beta tinh chế có trọng lượng phân tử 40 kDa và

pH đẳng điện là 5,6. Gene mã hóa Cpb gồm 1113 nucleotide mã hóa cho 371 amino
acid.
Nó có tính chất tương tự alpha toxin, do đó rất khó để tách riêng hai loại độc
tố này. Beta toxin có độc tính rất mạnh: Khi tiêm vào chuột gây tăng huyết áp và
nhịp tim, liều gây chết LD 50 cho chuột trưởng thành là 310 và 4500 ng/kg và chỉ
cần 2 ng độc tố này có thể gây bệnh trên lợn con.
1.4.3. Epsilon toxin
Epsilon toxin được sản sinh ra dưới dạng một tiền độc tố và được hoạt hóa
bằng men proteolytic ở lượng thấp. Đích của nhóm độc tố này là nhóm lipid:
13

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
Cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của động vật Eukaryote vì vậy
độc tố này tập trung ở não và thận. Độc tố gây hoại tử và gây chết.
Epsilon toxin được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type B và type D. Nó
là một protein gồm 311 acid amin với trọng lượng phân tử là 34,25 kDa. Loại độc tố
này chủ yếu làm ảnh hưởng đến ruột bằng việc tăng tính thấm của thành mạch. Do
đó, tăng cường sự hấp thu độc tố và đóng vai trò như là một chất độc gây chết
người. Sau khi lưu thông vào các cơ quan bên trong cơ thể, nó gây sưng thận, phù
nề ở phổi, màng ngoài tím và làm cho lượng chất lỏng dư thừa.
Ảnh hưởng của việc tăng tính thấm thành mạch có thể được chứng minh
bằng cách tiêm loại độc tố này vào một vị trí sau đó nó sẽ đi vào hệ tuần hoàn.
Buxton đã đề xuất một cơ chế hoạt động của độc tố Epsilon trực tiếp hoặc gián tiếp
liên quan đến hệ thống adenylcyclase ( hệ thống xúc tác tổng hợp AMP mạch vòng
từ ATP) trong các tế bào bị ảnh hưởng. Kỹ thuật ELISA đã phát hiện được độc tố
Epsilon và được đề xuất này thay thế việc gây chết chuột và thử nghiệm cho việc
sản xuất một loại kháng thể đặc hiệu.
1.4.4. Iota toxin
Có 2 vị trí là vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và vị trí hoạt hóa

enzyme (Ia). Sau khi độc tố được gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, Ia
xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào. Độc tố làm tăng tính thấm của mao
mạch và tác động lên màng tế bào.
Độc tố này được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type E. Ia và Ib được
phân cách bởi điểm đẳng điện. Ia có pH đẳng điện là 5,2 và khối lượng phân tử 47,5
kDa. Ib có pH đẳng điện là 4,2 và khối lượng phân tử là 71,5 kDa. Một hỗn hợp
gồm cả hai thành phần Ia và Ib cần thiết cho hoạt động sinh học quan trọng được đo
bằng việc gây chết. Chuỗi nhẹ Ia là một enzyme làm nhiệm vụ tổng hợp ADP, cơ
vân và protein actin không co rút.
1.4.5. Enterotoxin (CPE)
Là một độc tố đường ruột được sản xuất bởi chủng vi khuẩn C. perfringens
type A. Nhiều nghiên cứu cho thấy CPE còn là nguyên nhân gây nên bệnh tiêu
chảy, viêm ruột và viêm ruột hoại tử ở động vật. Gene mã hóa cho CPE là cpe nằm
trên cả nhiễm sắc thể và plasmid của vi khuẩn C. perfringens. CPR là một đoạn
14

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
polypeptide mạch đợn nặng 35 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,3 và tồn tại ở pH 5 - 12.
Khi bị nhiễm độc CPE các triệu chứng xuất hiện bao gồm: tiêu chảy, nôn mửa, sốt
kéo dài trong vòng 1 ngày, thời gian ủ bệnh từ 6 – 24 giờ, thường từ 10 - 12 giờ.
1.4.6. Delta toxin
Được sản sinh bởi vi khuẩn C. perfringens type B và C. Gene mã hóa độc tố
này có trọng lượng phân tử khoảng 42kDa và pI = 7,1. Độc tố Delta là chất gây nên
hiện tượng tiêu máu ở cừu, dê và heo. Tuy nhiên, độc tố này lại bị ức chế bởi các
hạch bào có ở người, ngựa, chuột và các động vật có vú khác.
1.4.7. Theta toxin
Được tạo ra bởi tất cả các type của vi khuẩn C. perfringens. Là yếu tố tạo
nên một trong hai vòng dung huyết của khuẩn lạc vi khuẩn C. perfringens khi nuôi
cấy chúng trên môi trường thạch máu. Độc tố này có khả năng tiêu hủy tế bào và rất

dễ bị biến đổi hoạt tính khi có oxy. Gene mã hóa của theta nằm trên nhiễm sắc thể
của vi khuẩn.
1.5. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens và khả năng gây
bệnh
C. perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau, người ta dựa vào 4
loại độc tố chính để chia thành 5 type độc tố.
Bảng 1.2. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens
Type
Alpha
Beta
Epsilon
Iota
A
+
-
-
-
B
+
+
+
-
C
+
+
-
-
D
+
-

+
-
E
+
-
-
+
1.5.1. Type A
Các chủng C. perfringens thuộc type này được tìm thấy nhiều nhất ở ruột,
môi trường sống của những động vật máu nóng và đất. Độc tố type A gây nên sự
viêm nhiễm các vết thương gây hoại tử và còn là yếu tố chính gây nên các bệnh về
đường ruột ở động vật. Các chủng type A cũng thường được phân lập từ vùng tai
giữa, dạ múi khế ở dê mắc bệnh. Triệu chứng thường thấy ở những con vật này là
15

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
xuất huyết niêm mạc dạ múi khế. Cũng có thể xuất hiện một vài hiện tượng của
bệnh tiêu chảy nhưng những thương tổn đường ruột thường không thể nhận thấy vì
quá trình tự phân diễn ra rất nhanh.
C. perfringens type A cũng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Triệu chứng
đầu tiên khi gà mắc bệnh là giảm cân, sau đó suy nhược, biếng ăn, tiêu chảy. Những
triệu chứng trên thường diễn ra trong thời gian ngắn, khó quan sát được hiện tượng
và khi phát hiện bệnh thì gà đã chết. vi khuẩn type A thường tồn tại trong đường
tiêu hóa của gà, đất, bụi cùng những phần thức ăn ôi thiu. Chế độ ăn uống không
hợp lý cũng có thể làm gia tăng số lượng vi khuẩn C. perfringens trong ruột gà tăng
lên, dẫn tới bị bệnh. Số lượng gà chết do vi khuẩn C. perfringens sẽ là rất ít nếu
chúng được tiêm chủng với hai loại vi khuẩn Lactobacillus acidophilus hoặc
Enterococcus faecalis. Việc phát triển một trong hai loại vi khuẩn này trong đường
ruột gà sẽ ngăn chặn khả năng sản sinh độc tố alpha của vi khuẩn C. perfringens.

Bệnh đường ruột do type A gây nên cũng được phát hiện ở lợn sữa, với
những triệu chứng thường thấy như rụng lông hay hoại tử đường ruột dạng nhẹ.
Hiện tượng trên thường phát triển ở những vùng ruột nhỏ của lợn như ruột chay và
ruột hồi. Khi nuôi cấy vi khuẩn từ những vùng tổn thương này thì số lượng vi khuẩn
C. perfringens thấy được là rất lớn.
1.5.2. Type B
C. perfringens type B là tác nhân chính gây nên bệnh lị ở cừu non và cả cừu
trưởng thành. Cừu non mắc bệnh lị ngay từ những ngày đầu tiên khi mới sinh ra.
Nguyên nhân là do sự lây nhiễm vi khuẩn này từ cừu mẹ và môi trường sang cừu
con. Lúc này, vi khuẩn trong đường ruột sẽ tăng lên một cách nhanh chóng, đặc biệt
là khi cừu con bú sữa mẹ. Kết quả là ruột cừu sẽ bị loét và xuất huyết rồi chết một
cách nhanh chóng. Triệu chứng cấp tính có thể nhận thấy là cừu không ăn uống, đau
bụng, cộng với hiện tượng tiêu chảy ra máu, nằm nghiêm, hôn mê và chết chỉ trong
vòng 24 giờ. Tỷ lệ mắc bệnh này ở cừu thường khoảng 30%, trong một vài trường
hợp tỷ lệ này có thể lên đến 100%. Bệnh mãn tính ở những con cừu trưởng thành
cũng kèm theo chứng đau bụng mãn tính nhưng sẽ không bị tiêu chảy. Ngoài ra,
type B cũng là nguyên nhân gây nên chứng xuất huyết đường ruột ở dê, bê, lừa và
ngựa.
16

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
Vẫn còn rất ít nghiên cứu về khả năng gây bệnh của vi khuẩn type B này đối
với động vật. Khả năng gây bệnh của chúng là đơn lẻ hay cộng gộp với các loại độc
tố khác vẫn còn là vấn đề đang được tranh cãi.
1.5.3. Type C
Vi khuẩn C. perfringens type C gây nhiễm độc tố ở heo, cừu, ngựa, gà chó
và cả người. Gia súc, gia cầm mới sinh là những đối tượng dễ bị lây nhiễm nhất . Vi
khuẩn gây tổn thương tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật chủ. Sự
thay đổi thành phần thức ăn đột ngột của những động vật còn nhỏ là một yếu tố

thuận lợi cho sự nhiễm vi khuẩn C. perfringens type C vào cơ thể vật chủ. Tỷ lệ lây
nhiễm thường khác nhau ở những bày đàn, chuồng trại khác nhau thông thường
khoang 30 – 50%, nếu không được chữa trị hay ngăn chặn kịp thời trong vòng 24
giờ thì tỷ lệ đó có thể lên đên 50 – 100%. Lơn con là loài dễ bị lây nhiễm hơn cả,
bệnh xuất hiện khi lợn con mới chỉ từ 1 đến 2 ngày tuổi. Triệu chứng đi kèm là suy
nhược cơ thể, tiêu chảy, bệnh lỵ, xuất hiện máu và những tế bào ruột bị hoại tử ở
trong phân. Đối với lợn được 1 đến 2 ngày tuổi, khi mắc bệnh thời gian điều trị sẽ
phải kéo dài, vì lúc này các triệu chứng bệnh đã nặng và phức tạp hơn nhiều như
mất nước, tiêu chảy cấp, niêm mạc ruột có màu đỏ sậm sau đó là bị hoại tử. Hoại tử
không chỉ xuất hiện ở niêm mạc ruột mà nó còn lan rộng đến cả màng cơ nhẵn trong
một số tổ hợp màng nhầy khác. Triệu chứng bệnh cũng được thấy tương tự ở dê, bò
và cừu như đau bụng, tiêu chảy, kêu rống, điên cuồng, mất phương hướng.
1.5.4. Type D
Độc tố type D được biết đến là một trong những nguyên nhân chính gây nên
các bệnh đường ruột, hay đột tử ở cừu và môt số động vật khác. Ngoài độc tố alpha,
vi khuẩn type D còn có khả năng sản sinh một loại độc tố khác, độc tố espsilon, một
loại độc tố rất độc. Đích của độc tố này là nhóm lipid, vì vậy độc tố này thường tập
trung ở não và thận. Khi tác động vào các con vật độc tố sẽ gây tổn thương não, làm
rối loạn các chức năng thần kinh bình thường, con vật sẽ bị mù, la hét, mất phương
hướng và không còn khả năng ăn uống… Thận cũng sẽ bị phân giải, xuất huyết,
kèm theo một loạt các triệu chứng thông thường khác và cuối cùng là dẫn đến chết
nếu không được điều trị kịp thời.
17

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
Cừu khoảng từ 3 đến 10 tuần tuổi hay những con cừu cái đang cho con bú sẽ
rất dễ mắc bệnh do độc tố type D gây ra. Cừu non sau khi cai sữa sẽ không sử dụng
sữa mẹ như là thức ăn chính nữa mà thay vào đó là những loại cây cỏ hay thức ăn
có hàm lượng tinh bột cao. Chính sự thay đổi thành phần, hàm lượng các chất có

trong thức ăn làm rối loạn hoạt động của đường ruột trong một thời gian ngắn. Vì
vậy, đây là lúc mà con vật dễ bị tiêm nhiễm độc tố type D nhất. Độc tố này cũng
gây nên các bệnh tương tự ở dê, bò, bê, ngựa. Tuy nhiên, riêng đối với dê, còn xuất
hiện một số triệu chứng khác như viêm chảy, tơ huyết, xuất huyết đường ruột nhưng
lại không bị mềm thận như ở cừu.
1.5.5. Type E
Trước đây khả năng gây bệnh của type vi khuẩn này còn chưa được nhiều tác
giả nói đến, vì chưa có nhiều nghiên cứu về type này. Tuy nhiên trong những năm
gần đây, việc xác định được các gene mã hóa độc tố của Iota của vi khuẩn C.
perfringens type E đã tạo nên những bước ngoặt mới. Khả năng gây độc của độc tố
Iota ở C. perfringens cũng tương tự như những độc tố ở vi khuẩn C. spiroforme,
một loại vi khuẩn đã được nghiên cứu rất nhiều. Ngoài khả năng gây nhiễm độc tố
đường ruột ở bê, bò, chuột lang và thỏ, thì độc tố này có khả năng gây nên bệnh lỵ ở
cừu.
Mỗi type độc tố khác nhau gây ra các loại bệnh khác nhau trên các đối tượng
khác nhau. Các type độc tố gây bệnh được trình bày ở bảng 1.3.
Bảng 1.3. Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn
C. perfringens
Type
Độc tố
Bệnh
Đối tƣợng gây bệnh
A
α
- Hoại thư sinh hơi
- Viêm ruột hoại tử
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Ngộ độc thực phẩm
- Viêm ruột kết
- Viêm dạ dày xuất huyết

- Người, động vật, gà
- Heo, gà
- Bò và cừu non
- Người
- Ngựa
- Chó
B

- Bệnh lỵ
- Cừu non
18

GVHD: TS. Lê Lập SVTH: Lại Nhật Linh
TS. Vũ Ngọc Bội
α, β, ε
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Ngựa non, cừu và dê
C

α, β
- Viêm ruột hoại tử
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Người
- Cừu, bê con, cừu con,
heo con
D

α, ε
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Cừu con, cừu (mềm

thận), dê và trâu bò
E

α, ι
- Viêm ruột
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Thỏ
- Bê con và cừu con
1.6. Phản ứng PCR [3] [5]
PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện
đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử. PCR được Kary
Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, PCR có lẽ là một phát minh quan trọng
nhất trong sinh học phân tử. Vì từ khi xuất hiện nó đã nhanh chóng trở thành một
phương pháp phổ biến ở mọi phòng thí nghiệm sinh học phân tử để nghiên cứu,
chuẩn đoán và phân tích di truyền.
PCR được sử dụng để thúc đẩy nhanh quá trình khám phá bộ gene người và
phát hiện sớm các bệnh virus. PCR làm thuận lợi cho việc tạo dòng các trình tự
DNA và tạo thành một cơ sở tự nhiên cho việc giải trình tự bằng phương pháp
Sanger. Ngoài việc để tổng hợp lượng lớn mạch khuôn để giải trình tự, PCR đã
được sử dụng để xây dựng bản đồ nhiễm sắc thể và để phân tích những thay đổi lớn
nhỏ trong cấu trúc nhiễm sắc thể.
1.6.1. Nguyên tắc phản ứng
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được dùng
để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotide
(dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn
DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại
được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ số lượng, số lượng đoạn DNA nói
trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích
trình tự hoặc tạo dòng. Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’ – 5’ được gọi là
primer xuôi (forward primer, ký hiệu là F). Primer ở bên phải tác động trên sợi

DNA 5’ – 3’ được gọi là primer ngược (reverse primer, ký hiệu là R).