Nhân đoạn gen mã hóa 16s rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối conus bằng kỹ thuật PCR

i
LỜI CẢM ƠN


Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn
Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Để hoàn thành đồ án tốt
nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thu
Thủy, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, TP.
Nha Trang - Khánh Hòa. Cô đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình thực hiện để hoàn thành đồ án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học
Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng trang thiết bị, hóa chất và các
dụng cụ thí nghiệm.
ThS. Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ nghiên cứu và thầy Ứng Trọng
Thuấn, Bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi về kỹ thuật.
Các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha
Trang.
Các bạn trong lớp 48CNSH, Trường Đại học Nha Trang.
Cuối cùng xin kính chúc mọi người sức khoẻ, hạnh phúc và thành công.

Nha Trang, tháng 6 năm 2010
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tiến Lâm



ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH iv
LỜI NÓI ĐẦU 1
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Khái quát về ốc cối 4
1.1.1. Phân loại 4
1.1.2. Đặc điểm chung 4
1.2. Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại các
động vật thân mềm 12
1.2.1. Chỉ thị ty thể 12
1.2.2. Chỉ thị nhân 13
1.3. Tình hình nghiên cứu phân loại ốc cối 14
1.3.1. Trên thế giới 14
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18
Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Nguyên vật liệu 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20
2.1.2. Hoá chất 20
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 22
2.2.2. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24
2.2.3. Điện di gel agarose 27
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. Tách chiết DNA tổng số ốc cối 29
3.2. Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các mẫu ốc cối bằng kỹ thuật
PCR 32

iii
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40





















iv

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH


Danh mục bảng:
Bảng 1.1: Các siêu họ gen mã hóa peptide độc tố ốc Conus 12
Bảng 1.2: Các peptide độc tố được thử nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng 13

Bảng 3.1: Danh sách các loài ốc cối Conus đã tách chiết được DNA 32
Bảng 3.2: Các thông số của mồi 33
Bảng 3.3: Danh sách các loài ốc cối đã nhân gen 36
Bảng 3.4: Danh sách các loài ốc cối đã giải trình tự đoạn gen 16S rDNA 36


Danh mục hình:
Hình 1.1: Ảnh minh họa các loài ốc cối Conus 09
Hình 1.2: Bản đồ địa lý về sự phân bố ốc cối Conus tại các vùng biển Việt Nam 10
Hình 1.3: Cấu trúc tổng quát đoạn chèn ITS2 16
Hình 1.4: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 19
Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 26
Hình 3.1: Ảnh minh họa vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA 30
Hình 3.2: Ảnh điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối 32
Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các mẫu ốc cối 35






1
LỜI NÓI ĐẦU

Loài ốc cối Conus sống tại vùng biển nhiệt đới vốn nổi tiếng là nguồn
nguyên liệu sản xuất "thần dược" chữa các cơn đau mạn tính, ung thư và nhiều
bệnh khác. Các nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy độc tố ốc cối
(conotoxin) có hiệu quả giảm đau cao gấp 10.000 lần so với morphine mà không
gây nghiện hoặc các phản ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất cả các loại thuốc
giảm đau hiện nay. Vì vậy, trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 cuộc nghiên

cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng
của các độc tố chiết xuất từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào.
Tuy nhiên cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới chiết xuất và phân tích
được khoảng 100 độc tố từ nguồn tiềm năng chứa tới 70.000 độc tố của ốc cối.
Do vậy, các nghiên cứu sâu hơn về ốc cối và độc tố ốc cối vẫn đang và sẽ được
tiếp tục tiến hành trong đó có các nghiên cứu phát sinh chủng loại ốc cối.
Hơn thế nữa, các loài ốc cối có quan hệ di truyền gần nhau thường chứa
các peptide độc tố giống nhau hơn là các loài có mối quan hệ xa nhau. Do vậy,
các nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối không chỉ làm cơ sở cho việc
phát hiện các loài ốc cối mới, mà còn góp phần quan trọng vào quá trình nghiên
cứu các conotoxin mới, nhằm phát huy hết tiềm năng vốn có của chúng.
Bên cạnh giá trị đối với y học, các loài ốc cối còn có giá trị kinh tế cao. Do
có màu sắc và hoa văn đẹp, vỏ của các loài ốc cối thường được khai thác để làm
đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm. Tình trạng khai thác một cách
bừa bãi các loài ốc cối đòi hỏi các nhà khoa học phải có các nghiên cứu bảo tồn
một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài nguyên này.
2
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự đa dạng
loài của ốc cối. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ dừng
lại ở mức độ thống kê các loài đặc hữu và mô tả các đặc điểm hình thái giải
phẫu. Hiện chưa có một nghiên cứu nào về ốc cối ở mức độ phân tử. Vì vậy,
nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp
sinh học phân tử là điều rất cần thiết.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nhân đoạn gen mã hóa
16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối Conus bằng kỹ thuật PCR”,
làm cơ sở cho việc xây dựng cây phát sinh chủng loại và tìm kiếm các loài ốc cối
mới ở Việt Nam.
Đề tài này nhằm các mục tiêu chính sau đây:
 Tách chiết DNA tổng số của các loài ốc cối Việt Nam thu thập tại hai
khu vực: Đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi và Cù Lao Chàm, Quảng Nam.

 Nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của các loài ốc cối
bằng kỹ thuật PCR, làm cơ sở cho việc giải trình tự gen nhằm xác định
loài và xây dựng cây phát sinh chủng loại.
Sự thành công của đề tài này sẽ góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn
và khai thác hợp lý nguồn gen các loài ốc cối Việt Nam.






3








Chương I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4
1.1. Khái quát về ốc cối
1.1.1. Phân loại
Họ ốc cối Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một trong
những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mềm. Cho đến nay,
trên thế giới người ta đã xác định được khoảng 700 loài, trong đó chủ yếu thuộc
chi Conus.
Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758)
Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795)
Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997)
Liên họ: Conoidea (Fleming, 1822)
Họ: Conidae (Rafinesque, 1815)
Chi: Conus (Linnaeus, 1758)
(
1.1.2. Đặc điểm chung
Ốc cối có vỏ dạng hình thoi, tháp vỏ thấp, tầng thân lớn, miệng vỏ hẹp dài,
trục vỏ thẳng, không có nếp uốn vặn, với màu sắc sặc sỡ, hoa văn đa dạng, mép
trong và mép ngoài miệng vỏ đơn giản, nắp vỏ bằng chất sừng, da vỏ có vân
màu, kích thước rất khác nhau tùy theo loài (loài lớn nhất có thể dài đến 23 cm)
(Ngô Anh Tuấn, 2009) (Hình 1.1). Chúng phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt
đới và vùng biển ấm như Philíppin, Indonesia, Australia, Mexico, Florida,
Hawaii…Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một số loài có thể thích ứng
với sự thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam
Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ. Hầu hết các loài ốc Conus
nhiệt đới sống trong hoặc gần các rạn san hô, trong khi các loài cận nhiệt đới
5
được tìm thấy chủ yếu tại vùng dưới triều ở độ sâu từ 10-30m và dưới các tảng

đá ở vùng triều nông (Stewart và Gilly, 2005).


Hình 1.1: Ảnh minh họa các loài ốc cối Conus
(o)
Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực
Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (như Trường
6
Sa, Hoàng Sa, Côn Đảo, ) (Hình 1.2). Các loài phổ biến là ốc cối địa lý (Conus
geographus) và ốc cối hoa lưới (Conus textile).
7
Hình 1.2: Bản đồ địa lý về sự phân bố ốc cối Conus tại các vùng biển Việt Nam
(Nguyễn Ngọc Thạch, 2007)


8
Chú giải hình 2.1
Danh sách vùng ven biển Việt Nam


1: Hạ Long 12:

Đại Lãnh 23: Vũng Tàu
2: Hải Phòng 13:

Vạn Gĩa 24: Cần Giờ
3: Hà Nam 14:

Hòn Khói 25: Mỹ Tho
4: SầmSơn 15:

Nha Trang 26: Cần Thơ
5: Cửa Lò 16:

Cam Ranh 27: Hà Tiên
6: Huế 17:

Phan Rang 28: Hòn Chồng
7: HộiAn 18:

Phan Rí 29: Rạch Gía
8: Sa Huỳnh 19:

Mũi Né 30: An Biên
9: Quy Nhơn 20:

Phan Thiết 31: Cái Nuốc
10:

Sông Cầu 21:

Long Hải 32: Sông Đốc
11:

Tuy Hòa 22:

Bà Rịa

Danh sách các đảo Việt Nam
I: Đảo Cát Bà IV:

Đảo Bãi Miếu VII: Đảo Côn Sơn
II: Đảo Cù Lao V: Đảo Phú Qúy VIII:

Đảo Phú Quốc
III:

Đảo Lý Sơn VI:

Đảo Trường Sa IX: Đảo Nam Du
X: Đảo Thổ Chu



Danh sách các tỉnh ven biển Việt Nam


A: Quảng Ninh J: Thừa Thiên Huế S: Bà Rịa - Vũng Tàu
B: Thái Bình K: Tp.Đà Nẵng T: Tp. Hồ Chí Minh
C: Nam Định L: Quảng Nam U: Bến Tre
D: Ninh Bình M: Quảng Ngãi V: Trà Vinh
E: Thanh Hóa N: Bình Định W: Sóc Trăng
F: Nghệ An O: Phú Yên X: Bạc Liêu
G: Hà Tĩnh P: Khánh Hòa Y: Cà Mau
H: Quảng Bình Q: Ninh Thuận Z: Kiên Giang
I: Quảng Trị R: Bình Thuận

9
Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), chúng ăn mồi sống. Thức ăn chính
của chúng là các loài cá nhỏ (piscivorous), giun biển (vermivorous), nhuyễn thể
(molluscivorous), và ngay cả các loài ốc cối khác ( Terlau và Olivera, 2004;
Olivera và cs, 2002). Do di chuyển chậm nên khi bắt một số con mồi di chuyển
nhanh như cá, chúng sử dụng độc tố để tấn công, làm tê liệt con mồi. Độc tố ốc
cối được tiết ra từ cơ quan miệng có răng sừng dạng kim và một ống xoắn gắn
với một túi chứa dạng bầu có thể co bóp. Khi tiếp cận con mồi, vòi của chúng
thò ra và bộ phận hình mũi tên (răng sừng) đâm con mồi rồi phóng chất độc vào.
Độc tố ốc cối (conotoxin) là những đoạn peptide nhỏ dài 12 - 46 aa, giàu
liên kết disulfide. Tùy theo cấu trúc, chúng được chia làm các nhóm chính sau,
mỗi nhóm được mã hóa bởi một siêu họ gen (bảng 1.1). Các độc tố trong một
siêu họ có thể có các đích tác dụng khác nhau như ức chế hoặc kìm hãm đối với
một kênh ion hoặc receptor gắn với protein G đặc trưng (Becker và Terlau,
2008).
Bảng 1.1: Các siêu họ gen mã hóa peptide độc tố ốc Conus
STT
Siêu
họ gen

Mô hình Cystein Họ dược lý Đích tác dụng
1 A
CC-C-C

Thụ thể Nicotin

Thụ thể Adrenergic
CC-C-C-C-C


A
Thụ thể Nicotin

A
Kênh K
+
?
2 M CC-C-C-CC

Kênh Na
+


Kênh K
+


Thụ thể Nicotin
3 O C-C-CC-C-C
ω Kênh canxi

Kênh K
+


Kênh Na
+

4 T
CC CC Chưa xác định Chưa biết

CC -CXOCb

Vận chuyển Catecholamine
10
5 S
C-C-C-C-C-C-C
C-C-C

Thụ thể Serotonin

S
Thụ thể Nicotin
6 P C-C-C-C-C-C Chưa xác định Chưa biết
7 I1/I2 C-C-CC-CC-C-C Chưa xác định Kênh K
+

8 J C-C-C-C Chưa xác định Kênh K
+
?
(Olivera và cs, 2006)

Tín hiệu thần kinh từ tủy sống đưa lên não cần có sự vận chuyển các ion
canxi qua lại màng tế bào trước synap qua các kênh canxi. Kênh canxi có nhiều
loại: L, T, P, R, Q, … Đặc biệt kênh canxi loại N có nhiều ở các mô cơ thần kinh
đóng vai trò quan trọng trong sự nhạy cảm với các cơn đau. Kênh canxi này bao
gồm 5 tiểu đơn vị, trong đó, tiểu đơn vị α
2
-δ có ái lực mạnh với các độc tố, ví dụ
ω-conotoxin MVIIA. Độc tố ω-conotoxin MVIIA đi vào cơ thể sẽ liên kết với
tiểu đơn vị α

2
-δ, làm thay đổi cấu hình của tiểu đơn vị này, dẫn tới kìm hãm sự
vận chuyển ion canxi qua màng tế bào, sự truyền tín hiệu của các nơron thần
kinh bị khóa. Khả năng ngăn chặn này rất chính xác, làm cho tín hiệu đau đớn
không tới não được mà thần kinh vẫn làm việc bình thường (Becker và Terlau,
2008; Olivera và cs, 1987; Hillyardetal, 1992). Do vậy, các độc tố ốc cối được sử
dụng trong điều trị các cơn đau mạn tính, các bệnh thần kinh như Parkinson,
bệnh thuộc hệ thần kinh tự động, ung thư, tim mạch và nhiều bệnh khác. Cho
đến nay, có 6 độc tố ốc cối đã được thử nghiệm lâm sàng, trong đó, Prialt (tên
thường gọi là Ziconitide), ω-conotoxin MVIIA từ Conus magus, đã được cấp
phép sử dụng trong điều trị các cơn đau bởi Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ (FDA) vào tháng 12 năm 2004. Ngoài ra, 2 độc tố khác cũng đang
được thử nghiệm cận lâm sàng (bảng 1.2).


11
Bảng 1.2: Các peptide độc tố được thử nghiệm lâm sàng và cận lâm
sàng
Peptide độc tố Ứng dụng Công ty Thử nghiệm
ω-MVIIA
(Prialt; Zicontide)
Điều trị các cơn đau

Elan
(Neurex)
Được cấp phép bởi Cục quản lý thực
phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ
ω -CVID
(AM336)
Điều trị các cơn đau

Amrad Thử nghiệm pha I
Contulakin-G
(CGX-1160)
Điều trị các cơn đau

Cognetix
Thử nghiệm pha I

-MrIA
(derivative)
(Xen-2174)
Điều trị các cơn đau

Xenome
Thử nghiệm pha I

-Vc1.1
(ACV-1)
Điều trị các cơn đau

Metabolic
Thử nghiệm pha I
Conantokin-G
(CGX-1007)
Điều trị các cơn
đau, động kinh
Cognetix
Thử nghiệm pha I


-PVIIA
(CGX-1051)
Nhồi máu cơ tim Cognetix
Thử nghiệm cận lâm sàng

O-MrVIB
(CGX-1002)
Điều trị các cơn đau

Cognetix Thử nghiệm cận lâm sàng
Các loài ốc cối cung cấp nguồn dược phẩm quan trọng nhất và lớn nhất so
với bất kỳ loài sinh vật nào trong tự nhiên (Chivian và cs, 2003). Mặc dù vậy,
cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới chiết xuất và phân tích được khoảng 100
độc tố từ nguồn tiềm năng chứa tới ~70.000 peptide độc tố ốc cối. Trong đó,
95% nghiên cứu chỉ được thực hiện trên 3 loài trong số 700 loài ốc cối (Espiritu
và cs, 2001; Chivian và cs, 2003). Vì vậy, các nghiên cứu nhằm khám phá các
độc tố mới vẫn đang được tiệp tục tiến hành. Do các loài ốc cối có quan hệ gần
gũi thường chứa các peptide độc tố giống nhau. Vì vậy, các nghiên cứu phát sinh
chủng loại ốc cối góp phần quan trọng làm sáng tỏ quan hệ loài và phát hiện các
độc tố mới.
12
1.2. Sử dụng chỉ thị phân tử trong phân loại và xây dựng cây phát sinh
chủng loại các động vật thân mềm
Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các
đặc điểm hình thái giải phẫu (mà chủ yếu là kích thước, màu sắc, hoa văn vỏ, cấu
tạo của hệ thống tiêu hóa, …) đôi khi mang lại kết quả không chính xác, đặc biệt
là đối với các loài có quan hệ gần gũi và do vậy có nhiều đặc điểm hình thái giải
phẫu giống nhau. Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và
xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần
thiết.

Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự
một gen hoặc một họ gen. Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn,
chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhau. Với những loài
có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các
vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng. Song với các loài có quan
hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA
hay một protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng. Để tăng độ tin cậy, các
nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ
với vùng DNA có độ biến thiên cao). Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường
được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân.
1.2.1. Chỉ thị ty thể
Đối với các động vật thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công
cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài. Các chỉ thị (marker) của DNA ty
thể thường được sử dụng là các gen mã hóa rRNA, cytochrome b, cytochrome
oxydase, tRNA, và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3,
13
atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs, 2008; Michael và
Robert, 2005).
Việc sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể cũng nâng cao độ phân giải và ý
nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ. Năm 2006, trình tự
DNA ty thể hoàn chỉnh của động vật thân mềm có độc đầu tiên được công bố -
của loài ốc độc Lophiotoma cerithiformis, có chiều dài 15.380 nucleotide, mã
hóa 13 protein ty thể, 2 rRNA và 22 tRNA. Các mRNA, rRNA và 13 tRNA được
phiên mã từ cùng một sợi trong khi các tRNA còn lại được phiên mã từ sợi còn
lại (Bandyopadhyay và cs, 2006). Sự sắp xếp các gen ty thể của L. cerithiformis
có sự giống nhau đáng kể so với hệ gen ty thể của hai loài ốc Haliotis rubra,
Katharina tunicate, và loài bạch tuộc Octopus vulgaris. Trình tự DNA ty thể của
L. cerithiformis là cơ sở để các nhà nghiên cứu giải mã trình tự DNA ty thể và
nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc độc khác.
1.2.2. Chỉ thị nhân

Trong nghiên cứu phát sinh chủng loại, do marker nhân có mức độ tiến
hóa thấp hơn nhiều nên việc sử dụng marker nhân để bổ sung thông tin di truyền
nhằm giải quyết mức độ tiến hóa của các loài có mối quan hệ gần nhau. Do vậy
sử dụng kết hợp giữa marker nhân và marker ty thể trong nhiều trường hợp cho
thấy mối quan hệ tiến hóa giữa các loài được rõ ràng hơn (Espiritu và cs, 2002).
Một số marker nhân đã được khảo sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA,
28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin và vùng không mã hóa như các đoạn
chèn ITS1 (Internal Transcribed Spacer 1) và ITS2 (Internal Transcribed Spacer
2) nằm giữa các gen mã hóa rRNA (xem hình 1.3).

14

Hình 1.3: Cấu trúc tổng quát đoạn chèn ITS2
Trong đó, đoạn chèn ITS2 đã được Cylinder và Darioconus khẳng định là
thành phần quan trọng trong việc khám phá và mô tả các đoạn peptide mới từ
tuyến độc của các loài động vật thân mềm mà trước đây sử dụng chỉ thị ty thể
không thể phân định một cách rõ ràng.
1.3. Tình hình nghiên cứu phân loại ốc cối
1.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu phát sinh chủng loại các
loài ốc cối. Tuy nhiên, cho tới nay mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài
thuộc chi ốc cối vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để, do các marker phân
tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin cậy khi mức bảo thủ của chúng quá cao trong việc
áp dụng để xác định vị trí phân loại của các loài mới tách ra (Duda và cs, 2001;
Duda và Kohn, 2005). Vì vậy, trong các nghiên cứu gần đây, các marker DNA ty
thể thường được sử dụng kết hợp với các marker nhân có tốc độ tiến hóa thấp
hơn và trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn.
Một ví dụ điển hình là các nghiên cứu phát sinh chủng loại các loài ốc cối
thu thập được tại quần đảo Cape Verde thuộc Đại Tây Dương, phía tây Senegal -
một trong những khu vực có số lượng loài ốc cối đa dạng trên thế giới (với

khoảng 50 loài đã được thống kê).
Năm 2005, Duda và Rolan đã sử dụng gen mã hóa cytochrome oxidase I
để phân tích phát sinh chủng loại của 90 loài ốc cối Conus, trong đó có 30 loài
đặc hữu của Cape Verde. Kết quả cho thấy, các loài này được phân làm 2 nhánh
(Duda và Rolan, 2005).
15
Cũng trong năm này, Cunha và cs đã sử dụng các gen ty thể (gen mã hóa
12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val, cytochrome b) kết hợp với một gen nhân (gen
mã hóa một lipoprotein giống megalin) để xây dựng cây phát sinh chủng loại của
49 loài ốc cối thuộc Cape Verde, trong đó có 3 loài chưa được định danh. Kết
quả một lần nữa khẳng định nghiên cứu trước đó của Duda và Rolan, các loài ốc
cối này cũng được chia làm hai nhánh chính: nhánh thứ nhất bao gồm các loài ốc
cối có vỏ lớn và nhánh thứ hai bao gồm các loài có kích thước nhỏ hơn. Cả hai
nhánh đều chứa các loài đặc hữu và di cư, điều này chứng tỏ tổ tiên của chúng đã
di cư tới Cape Verde một cách độc lập (Cunha và cs, 2005).
Cunha và cs, 2008 tiếp tục nghiên cứu phát sinh chủng loại của 4 loài ốc
thuộc nhánh có vỏ lớn là C. ateralbus, C. pseudonivifer, C. trochulus, và C.
venulatus sử dụng các gen coxI (mã hóa cytochrome oxidase I) và nad4 (mã hóa
tiểu đơn vị 4 của NADH dehydrogenase) (tiến hành trên 200 mẫu ốc thu thập tại
16 địa điểm thuộc các đảo Sal, Boavista và Maio). Kết quả cho thấy, các mẫu ốc
thuộc 4 loài này được chia làm 3 nhánh rõ ràng, tương đối cách xa nhau mà việc
phân loại dựa vào màu sắc vỏ và hoa văn không thể thấy được (Cunha và cs,
2008).
Duda và cs, 2001, sử dụng chỉ thị 16S và calmodulin đã xây dựng phát
sinh chủng loại của 76 loài ốc cối Conus, trong đó 75 loài có nguồn gốc từ các
vùng biển Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và 1 loài có nguồn gốc từ Đông Đại
Tây Dương (Duda và cs, 2001).
Duda và Kohn, 2005 đã sử dụng gen mã hóa 16S rRNA (ty thể) và protein
calmodulin (gen nhân) để nghiên cứu phát sinh chủng loại của 138 loài ốc cối
Conus thu thập tại các vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương, Đông Thái Bình

Dương, Đại Tây Dương (Duda và Kohn, 2005).
16
Duda và cs, 2008 đã sử dụng các gen ty thể (mã hóa 16S rRNA và
cytochrome oxidase) và một gen nhân để phân định và mô tả một số loài ốc
trong giống Conus spp: Conus sponsalis, Conus nanus, Conus ceylanensis,
Conus musicus và Conus parvatus tại miền tây Ấn Độ - Thái Bình Dương và
Conus nux đông Thái Bình Dương mà trước đây biện pháp mô học thông thường
chưa thực hiện được. Kết quả trong sự phân tích phát sinh của Conus nanus và
Conus sponsalis cho thấy sự tiến hóa khác biệt, hoàn toàn phù hợp với hình thái
khác nhau của chúng, và cũng đã xác định được một vài loài bí ẩn mà mức độ
loài tiến hóa khác nhau. Ba hình thái xuất hiện đại diện cho C.nanus nhưng khác
nhau về kích thước vỏ đối với các loài lớn hoặc khác nhau về màu vỏ (Duda và
cs, 2008).
Nam và cs, 2009 sử dụng đoạn gen ty thể và gen nhân ITS2 để giải quyết
mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối có mối quan hệ gần gũi mà chưa được
hiểu biết một cách cặn kẽ khi sử dụng 16S rRNA ty thể. Kết quả cho thấy các
loài này được chia làm 3 nhánh riêng biệt Conus (Nam và cs, 2009).
Năm 2008, trình tự DNA ty thể của Conus textile đã được giải mã hoàn
toàn (hình 1.4) có chiều dài 15.562 nucleotide và có cấu trúc tương tự như DNA
ty thể loài ốc L. cerithiformis (Bandyopadhyay và cs, 2008). Hệ gen ty thể Conus
textile bao gồm 15.562 nucleotide mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA.
Trong đó, các gen mã hóa protein ty thể bao gồm: các gen coxI-III mã hóa cho
cytochrome oxidase 1-3; các gen atp6 và atp8 mã hóa cho các tiểu đơn vị 6 và 8
của ATPase; các gen nad1-6 và nad 4L mã hóa cho các tiểu đơn vị 1-6 và 4L của
NADH dehydrogenase; gen cob mã hóa cho cytochrome b. Các gen khác bao
gồm 2 gen mã hóa rRNA (gen rrnS mã hóa 12S rRNA và gen rrnL mã hóa cho
16S rRNA) và 22 gen mã hóa các tRNA. Hai tiểu đơn vị lớn và nhỏ của rRNA
17
được sao chép từ cùng một sợi trong khi các tRNA cho M, Y, C, W, H, G, E, và
T được sao chép từ các sợi bổ sung.

Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile. Hệ gen ty thể của Conus textile là
một phân tử DNA dạng vòng, có chiều dài 15.562 nucleotide, mã hóa cho: 13 protein ty thể [3
cytochrome oxidase (các gen coxI, coxII, coxIII); cytochrome b (gen cob); tiểu đơn vị 6 và 8
của ATPase (gen atp6 và atp8); các tiểu đơn vị từ 1-6 và tiểu đơn vị 4L của NADH
dehydrogenase (các gen nad1-nad6 và nad4L)]; 2 rRNA; 22 tRNA [D, V, L (1), L (2), P, S
(1), S (2), H, F, K, A, R, N, I, M, Y, C, W, H, G, E và T] (Bandyopadhyay và cs, 2008).

Khoảng cách giữa các gen thay đổi từ 0 - 35 nucleotide trừ hai vùng liên
gen coxI - coxII và tRNA
Phe
- coxIII tương đối lớn có kích thước tương ứng là
165 và 126 nucleotide. Từ hệ gen trên để làm cơ sở cho việc nghiên cứu các loài
ốc cối khác.
18
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu phân loại ốc cối ở mức độ
phân tử, và đã có nhiều thành công trong việc xác định loài mới cũng như khám
phá, mô tả các conotoxin mới như đã giới thiệu ở trên.
Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ đang
dừng lại ở mức độ mô tả đặc điểm hình thái, giải phẫu, thống kê loài (Nguyễn
Anh Tuấn, 2009) cũng như các thông tin cảnh báo về loài ốc cối có thể gây ngộ
độc cho con người. Theo Đào Việt Hà và cs, ở Việt Nam hiện đã thống kê được
76 loài ốc cối, chủ yếu là ốc cối hoa lưới (C. textile) và ốc cối địa lý (C.
geographus). Đây cũng chính hai loài ốc cối đã được Viện hải dương học Nha
Trang xếp vào danh mục “các loài hải sản độc hại gây chết người” (Đào Việt Hà
và cs, 2006).
Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu nào về ốc cối Việt Nam được tiến hành
ở mức độ phân tử. Vì vậy, việc nghiên cứu về định danh loài cũng như xây dựng

cây phát sinh chủng loại các loài ốc cối ở Việt Nam là điều rất cần thiết.

19




Chương II
NGUYÊN LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU





20
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các loài ốc cối thu được tại vùng biển thuộc Đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi) và
Cù Lao Chàm (Quảng Nam): Conus textile, Conus striatus, Conus vexillum,
Conus capitaneus, Conus miles, Conus litteratus, Conus caracteristicus, Conus
distans, Conus quercinus, Conus magus, Conus arenatus, Conus tessulatus,
Conus marmoreus.
2.1.2. Hoá chất
a) Hóa chất tách chiết DNA
 Bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System
 Dung dịch phá tế bào (Digestion Solution Master Mix)
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện bảo quản
Dung dịch phá nhân
(nucleic lysis solution)

200 Nhiệt độ phòng
EDTA 0.5M (pH 8.0) 50 Nhiệt độ phòng
Protenase K 20 mg/ml 20 Nhiệt độ phòng
Rnase A 4 mg/ml 5 Nhiệt độ phòng
Tổng 275

 Dung dịch đệm (Wizard
®
SV Lysis Buffer) bảo quản ở nhiệt độ phòng
 Dung dịch rửa (Wizard
®
SV Wash Solution) bảo quản ở nhiệt độ
phòng (chứa ethanol 95%)
 Nước sạch nuclease
 Cột Wizard
®
SV Minicolumn bảo quản ở nhiệt độ phòng
 Ống thu mẫu 1,5 ml
21


 Bộ kít tách chiết DNA của công ty Nam Khoa
Tên hóa chất Điều kiện bảo quản
Dung dịch P/C/I (phenol, chloroform,
isoamylalcohol)
-20
0
C
Natriacetate 3M, pH 5.2 4
0

C
Ethanol 100% 4
0
C
Ethanol 70% 4
0
C
Đệm TE 1X (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM) 4
0
C
Dung dịch Proteinase K -20
0
C
b) Hóa chất PCR
Tên hóa chất Nhà sản xuất Điều kiện bảo quản
Các cặp mồi IDT, USA -20
0
C
Các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) Fermentas, USA -20
0
C
Taq buffer 10X (MgCl
2
) Fermentas, USA -20
0
C
MgCl
2
25mM Fermentas, USA -20
0

C
Taq polymerase 5u/ml Fermentas, USA -20
0
C

c) Hóa chất điện di
 Agarose 1% và 1.5%
 Dung dịch đệm TBE 0.5X (Tris - Axit boric - EDTA)
 Dung dịch nhuộm Ethidium bromide
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng
 Block nhiệt (VWR, Mỹ)