Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus lở mồm long móng type o phân lập ở lợn tại việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI





NGUYỄN ANH HƯNG



NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP
Ở LỢN TẠI VIỆT NAM




LUẬN VĂN THẠC SĨ







HÀ NỘI – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI




NGUYỄN ANH HƯNG



NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC
CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP
Ở LỢN TẠI VIỆT NAM



CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y
MÃ NGÀNH : 60.64.01.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN




HÀ NỘI – 2014

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.
Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã
ñược chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 23 tháng 01 năm 2014
Tác giả luận văn


Nguyễn Anh Hưng







Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện bản luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng
hết mình của bản thân còn có sự tận tình hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn
Bá Hiên.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến thầy hướng dẫn, người ñã giành

nhiều thời gian quý báu tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới:
- Ban giám ñốc, tâp thể phòng virus Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc thú y
Trung ương 1.
- Tập thể phòng Hóa sinh - Miễn dịch - Bệnh lý Viện Thú Y Quốc gia.
- Khoa Thú Y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội.
ðã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận văn.
Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ñình,người
thân, bạn bè và ñồng nghiệp - Những người luôn tạo ñiều kiện, ñộng viên,
giúp ñỡ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận văn.
Hà nội, ngày 23 tháng 01 năm 2014
Học viên


Nguyễn Anh Hưng




Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv

MỤC LỤC

Lời cam ñoan ii
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv

Danh mục các chữ viết tắt vii
Danh mục bảng viii
Danh mục hình ix
MỞ ðẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Bệnh LMLM và tình hình bệnh LMLM trên thế giới 3
1.1.1 Bệnh lở mồm long móng 3
1.1.2 Dịch tễ học phân tử của virus LMLM 8
1.1.3 Tình hình bệnh LMLM trên thế giới 10
1.2 Tình hình và nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam 13
1.2.1 Tình hình bệnh LMLM ở Việt Nam 13
1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam 14
1.3 Một số ñặc tính của virus LMLM 15
1.3.1 ðặc tính nuôi cấy 15
1.3.2 Gây bệnh thực nghiệm: 17
1.4 ðặc ñiểm dịch tễ học bệnh LMLM 20
1.4.1 Lứa tuổi mắc bệnh 20
1.4.2 Mùa vụ 20
1.4.3 Khả năng lây lan 20
1.4.4 Tỉ lệ ốm và chết 20
1.4.5 ðường truyền lây 21
1.5 Triệu chứng và bệnh tích bệnh LMLM 21
1.5.1 Triệu chứng 21

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

1.5.2 Bệnh tích 22
1.6 Chẩn ñoán bệnh LMLM 23
1.6.1 Chẩn ñoán lâm sàng 23

1.6.2 Chẩn ñoán phòng thí nghiệm 24
1.7 Phòng bệnh LMLM 28
1.7.1 Phòng bệnh khi chưa có dịch xảy ra 28
1.7.2 Phòng bệnh khi có dịch xảy ra 28
PHẦN II: ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1 ðối tượng nghiên cứu: 30
2.2 Nội dung nghiên cứu: 30
2.3 Nguyên liệu 30
2.3.1 Chủng vi sinh vật, ñộng vật thí nghiệm 30
2.3.2 Tế bào dòng BHK-21 30
2.3.3 Máy, thiết bị 30
2.3.4 Các vật liệu và hóa chất 31
2.4 Phương pháp nghiên cứu 31
2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 31
2.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm virus gây bệnh
LMLM 32
2.4.3 Chuẩn ñộ virus LMLM trên tế bào BHK-21 33
2.4.4 Gây nhiễm ñộng vật thí nghiệm 35
2.4.5 Phương pháp phát hiện kháng thể LMLM trên lợn bằng ELISA
FMDV NSP ELISA. 36
2.4.6 Phương pháp RT-PCR 38
2.4.7 Phương pháp phân tích số liệu 39
2.4.8 Thời gian, ñịa ñiểm 39
PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi

3.1 Nguồn gốc chủng virus lở mồm long móng 40

3.2 Thích nghi chủng virus LMLM type O phân lập trên tế bào
BHK-21 41
3.3 ðặc tính gây bệnh của virus LMLM type O chủng VP02 phân lập
cho ñộng vật thí nghiệm 43
3.3.1 Chuẩn bị ñộng vật thí nghiệm: 43
3.3.2 Xác ñịnh liều gây nhiễm virus LMLM type O chủng VP02 cho lợn 45
3.3.3 Gây nhiễm ñộng vật thí nghiệm bằng chủng virus LMLM type O
chủng VP02 45
3.3.4 Kết quả gây nhiễm ñộng vật thí nghiệm bằng chủng virus LMLM
type O chủng VP02 46
3.4 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trên lợn 55
3.4.1 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trên lợn bằng phương pháp
phân lập trên tế bào BHK-21 55
3.4.2 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM type O chủng VP02 trên lợn
bằng phương pháp RT-PCR 56
4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 60
4.1 Kết luận 60
4.2 Kiến nghị 60
TÀI LIỆU THAM KHẢO 61



Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Acid Deroxyribonucleic
ARN : Acid Ribonucleotit
BHK-21 : Baby Hamster Kidney-21

cDNA : Complementary AND
CPE : Cytopathogen Effect
DMEM : Dulbecco Modified Eagle Medium
DPI : Days Post-Inoculation
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetate
FAO : Food and Agricultural Organization
FCS : Fetal Calf Serum
FMD : Foot and Mouth Disease
FMDV : Foot and Mouth Disease Virus
ID
50
: 50% Infective Dose
LMLM : Lở mồm long móng
OIE : Office International des Epizooties
DPE : Days Post Exposure
PBS : Phosphate Buffered Saline
PD
50
: 50% Protective Dose
PID
50
: 50% Pig Infective Dose
PFU : Plaque Forming Units
P : Trọng lượng
RT-PCR : Reverse Trancription-Polymerase Chain Reaction
TCID
50
: 50% Tissue Culture Infectious Dose
WRL : World Reference Laboratory

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.1 Triệu chứng lâm sàng và ñáp ứng miễn dịch của chuột lang sau
khi gây nhiễm bằng ñường dưới da với các liều khác nhau. 18
3.1 Biến ñộng TCID
50
của virus LMLM type O chủng VP02 qua 10
lần tiếp truyền liên tục 42
3.2 Kiểm tra kháng thể LMLM của lợn trước thí nghiệm 44
3.3 Bố trí gây nhiễm cho lợn bằng chủng virus LMLM type O chủng
VP02 46
3.4 Kết quả gây nhiễm virus LMLM type O chủng VP02 cho lợn 47
3.5 Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn sau khi gây bệnh LMLM 48
3.6 Bệnh tích ở lợn sau khi gây nhiễm chủng virut LMLM type O
chủng VP02 51
3.7 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trong các loại mẫu bệnh
phẩm bằng phương pháp phân lập virus trên tế bào BHK-21 55
3.8 Kiểm tra sự có mặt của virus LMLM trong các mẫu bệnh phẩm
bằng phương pháp RT-PCR 57


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ix

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Bản ñồ bộ gene của vi rút LMLM 4
1.2 Mô hình cấu trúc của hạt virion LMLM 5
1.3 Bản ñồ phân bố các chủng virus LMLM từ năm 2010-2013 13
1.4 ðiểm bệnh tích của lợn thí nghiệm sau ngày gây nhiễm và phơi nhiễm 19
3.1 Phả hệ gene VP1 virus LMLM chủng phân lập tại Việt Nam. 41
3.2 Diễn biến hiệu giá virus LMLM VP02 qua các lần tiếp truyền
trên tế bào BHK21 42
3.3 Hình thái tế bào sau 10 lần tiếp truyền 43
3.4 Biến ñổi lâm sàng và bệnh tích ở chân lợn 49
3.5 Hình ảnh bệnh tích sau khi gây nhiễm 52
3.6 Bệnh tích ở niêm mạc miệng 52
3.7 Bệnh tích hình thành ở lưỡi (loét và hoại tử) 53
3.8 Bệnh tích hình thành ở lách và màng treo ruột 53
3.9 Diễn biến nhiệt ñộ của lợn trong thời gian gây bệnh thực nghiệm 54
3.10 Bệnh tích tế bào BHK-21 gây nhiễm 56
3.11 Kiểm tra sự có mặt của FMDV trong bệnh phẩm, huyết thanh
bằng phương pháp RT-PCR 58



Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1

MỞ ðẦU

1. Tính cấp thiết của ñề tài
Bệnh lở mồm long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở
các loài ñộng vật guốc chẵn (trâu, bò, lợn, dê, cừu ), lây lan rất nhanh, rộng,
bệnh dễ trở thành ñại dịch gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi.
Các tổ chức quốc tế và trong nước ñều ñặt vấn ñề phòng và chống bệnh này lên
ưu tiên số một.
Bệnh LMLM ñược Tổ chức Thú y Thế giới OIE xếp vào danh mục
bảng A, các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gia súc và khai báo bắt buộc
khi có dịch. Hàng năm, bệnh LMLM gây thiệt hại và làm giảm sản lượng
chăn nuôi ở tất cả các nước có dịch bệnh (OIE, TCKHTY, 2000). Bệnh
LMLM trực tiếp gây sảy thai khoảng 25% cái chửa, làm giảm 27% sản
phẩm thịt, 50% sản lượng sữa và 25% sản lượng lông cừu (Cục thú y,
2002), (Blancou J., Ozawa Yoshiro, 1995). Phòng chống dịch bệnh LMLM
luôn là chính sách của mỗi Quốc gia trên Thế giới.
Bệnh LMLM do virus thuộc họ Picornaviridae gây ra, có hướng thượng
bì, gồm 7 serotype: O, A, C, Asia 1, SAT1, SAT2 và SAT3. Trong mỗi
serotype còn có nhiều phân type (subtype) do virus thường ñột biến xuất hiện
chủng mới, hiện nay người ta ñã xác ñịnh ñược hơn 70 subtype của virus
LMLM. Các serotype và subtype gây bệnh có triệu chứng lâm sàng giống
nhau nhưng không có ñáp ứng miễn dịch chéo, văc xin phòng bệnh chỉ có có
khả năng bảo hộ khi phù hợp chủng (có kháng nguyên tương ñồng).
Việt Nam là một nước nằm trong vùng dịch và diễn biến bệnh ngày
càng trở lên phức tạp trong thời gian gần ñây. Dịch lở mồm long móng ở
nước ta hiện nay xảy ra mạnh với nhiều ổ dịch. Vào năm 2012 dịch xảy ra
trên lợn với ñặc tính nhanh, tỉ lệ chết cao, con vật bệnh chết nhanh làm nhiều
nhà chăn nuôi thú y nghĩ ñến 2 vấn ñề: Một là tác nhân thứ phát sau virus lở

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
2

mồm long móng. Hai là sự xuất hiện của serotype mới với ñộc tính cao. Tuy
nhiên, Việt Nam chưa tự sản xuất văc xin LMLM, các văc xin hiện dùng ñều
ñược nhập từ nước ngoài. Do vậy việc nghiên cứu xác ñịnh khả năng gây
bệnh, ñặc tính gây bệnh của virus lở mồm long móng tại các ổ dịch ở Việt
Nam ñể ñưa ra phương thức phòng thích hợp là một yêu cầu cấp thiết trong
tình hình thực tế hiện nay. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành
nghiên cứu ñề tài:
“Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của virus lở mồm long móng
type O phân lập ở lợn tại Việt Nam”
2. Mục tiêu của ñề tài:
Xác ñịnh khả năng gây bệnh của chủng virus LMLM type O phân lập
thực ñịa.
3. Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng trong kiểm nghiệm văc xin lở mồm long móng và ñịnh
hướng nghiên cứu khoa học.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh LMLM và tình hình bệnh LMLM trên thế giới
1.1.1. Bệnh lở mồm long móng
1.1.1.1. Căn bệnh
Bệnh lở mồm long móng (Foot and Mouth Disease) là bệnh truyền
nhiễm cấp tính lây lan nhanh, mạnh và rộng của các loài ñộng vật guốc chẵn
như trâu, bò, lợn, dê, cừu và loài linh dương. Bệnh gây ra do một loài virus
hướng thượng bì, có ñặc ñiểm là sốt cao và hình thành những mụn nước ở
niêm mạc miệng, móng, vú của gia súc cảm thụ. Bệnh LMLM gây bệnh nhẹ ở
ñộng vật trưởng thành nhưng gây bệnh nặng ở ñộng vật non (tỷ lệ chết 90 %)

(Riemann H, 2008).
Bệnh ghi nhận ở châu Âu (Pháp,Ý, ðức…) từ thế kỷ XVII - XVIII, sau
ñó bệnh phát hiện ở khắp toàn cầu (ðào Trọng ðạt, 2000).
Mặc dù xuất hiện như là một thể bệnh nhẹ, tỷ lệ chết ở gia súc trưởng
thành không cao nhưng hậu quả là sư thiệt hại về kinh tế rất trầm trọng.
Gia súc mắc bệnh thường giảm tăng trọng, giảm sản lượng sữa, giảm sức
kéo, gây sảy thai ở ñộng vật có chửa. Virus LMLM có thể gây ra các ổ dịch
lớn, tỉ lệ mắc bệnh cao, bệnh có thể lây lan trong phạm vi một nước hoặc
khắp các châu lục.
1.1.1.2. Hình thái, cấu trúc của virus LMLM
Virus LMLM là loại virus thuộc nhóm Picornavirus, kích thước 20-30
nm, hình ña diện có 30 mặt ñều, qua ñược các màng lọc Berkefeld, Chamberland
và Seitz (Văn ðăng Kỳ và cộng sự, 2000), (Thái Thị Thuỷ Phuợng và cộng sự,
2006), (Tô Long Thành và cộng sự, 2004). Hạt virus chứa 30% acid nucleic,
khoảng 8000 nucleotit, ñó là một ñoạn ARN chuỗi ñơn có khối lượng phân tử là
8.6 KiloDalton. Vỏ capsid có 32 ñơn vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại
protein (VP1, VP2, VP3 và VP4) trong ñó VP1 có vai trò quan trọng nhất trong

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4

việc gây bệnh, cũng như là loại kháng nguyên chính tạo ra kháng thể chống lại
bệnh LMLM (Nguyễn Tiến Dũng, 2000), (Saiz JC và cộng sự, 1991).
Bộ gen của virus có chứa ARN mạch ñơn, ñược bao quanh bởi cấu trúc
bậc 4 của protein ñể tạo thành một lớp vỏ ña diện (Rueckert, R. R, 1996).

Hình 1.1: Bản ñồ bộ gene của vi rút LMLM
(Nguồn:
Vỏ capsid của virus có 32 capsome có hình dạng cân ñối nhau, hạt
virus là phân tử ARN. Qua kính hiển vi ñiện tử, một hạt virus (virion) có dạng

hình tròn, với bề mặt nhẵn, ñường kính khoảng 25nm, trọng lượng phân tử
69KDa, 69% là protein và 31% là ARN (Bachrach, H. L, 1968).
Phân tử ARN là ñơn vị gây nhiễm, ñóng vai trò như một ARN thông
tin. Virion bao gồm 60 bản copy các protein cấu trúc giống nhau là cấu trúc
bậc 4 cả protein (VP1 [1D], VP2 [1B], VP3 [1C] và VP4 [1A]).
Theo Thomson G.R, 1994, VP1 ñóng vai trò quan trọng nhất trong sinh
bệnh học, cũng như là kháng nguyên chính kích thích tạo ra kháng thể chống
lại virus LMLM. Sự khác nhau về bộ gene là nguyên nhân tạo ra các biến
chủng, ñặc biệt thông qua sự ña dạng của phân tử VP1.


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5


(Nguồn:


Hình 1.2: Mô hình cấu trúc của hạt virion LMLM
(Nguồn:
Thành phần hệ gen của virus LMLM luôn luôn biến ñổi, ngay cả trong
cùng một serotype, các chủng phân lập ở các vùng ñịa lý khác nhau có mức
ñộ tương ñồng về thành phần nucleotid và acid amin cũng khác nhau, do vậy
chúng hình thành nên nhiều topotyp khác nhau.
1.1.1.3. Cơ sở phân loại virus LMLM
Virus LMLM ngoài 7 type (A, Asia1, C, O, SAT1, SAT2 và SAT3)
cơ bản, còn có hơn 70 subtype. Một số subtype về mặt dịch tễ học hoàn
toàn khác với type bố mẹ vì thế dùng văc xin chỉ hiệu quả khi virus dùng
chế văc xin ñồng nhất với virus gây bệnh cho gia súc trong ổ dịch (Tô

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6

Long Thành, 2000). Xét về mặt kháng nguyên, virus LMLM không ñồng
nhất, ñiều này xảy ra trong các serotype, mà mỗi serotype ñó có subtype và
các biến chủng hoặc các biến chủng này lại khác nhau về mặt huyết thanh
học. Sự sai khác về bộ gen là nguyên nhân tạo ra các biến chủng, ñặc biệt
là sự ña dạng của phân tử VP1.
Việc phân loại virus thường dựa vào kết quả chẩn ñoán thông qua các
phản ứng trong phòng thí nghiệm. Các phương pháp giám ñịnh, phân biệt hay
ñược dùng: Phân lập virus trên môi trường tế bào, dựa vào kết quả có thể
nhận ñịnh trong bệnh phẩm nghi có phải là virus LMLM hay không. Các
phương pháp miễn dịch học: ELISA, phản ứng kết hợp bổ thể và một số phản
ứng huyết thanh học khác. Phương pháp huyết thanh học dùng ñể xác ñịnh
subtype ñã mang lại nhiều kết quả quan trọng trong quá trình nghiên cứu virus
LMLM. Tuy nhiên, các phản ứng huyết thanh học ñược sử dụng ñều phát hiện
kháng thể kháng protein cấu trúc, protein vỏ của virus nhưng không phân biệt
ñược ñó là kháng thể của ñộng vật ñã ñược tiêm văc xin phòng bệnh hay do
nhiễm virus.
Với sự phát triển của khoa học công nghệ, giám ñịnh virus LMLM
bằng các phương pháp hiện ñại ñược áp dụng. Phương pháp giám ñịnh
bằng cách phân tích protein của virus LMLM xác ñịnh ñặc tính của chủng,
tính ñặc hiệu của chủng cũng như tiến hóa của các biến chủng. Phương
pháp ñiện di trên gel polyacrylamid, xác ñịnh trình tự chuỗi
poligonucleotid. Công nghệ phân tích gen ñược áp dụng nhiều trong công
tác nghiên cứu khoa học. Mullis và cộng sự (1985) phát minh phương
pháp PCR và sau ñó là RT-PCR ñược sử dụng rộng rãi ñã ñem lại cuộc
cách mạng di truyền học phân tử. Kỹ thuật nhân gene cho phép nghiên cứu
và phân tích gen và hệ gen, ñược áp dụng trong nhiều nghiên cứu về văc
xin ADN phòng bệnh LMLM. Các ñoạn axit amin có khả năng kích thích

ñáp ứng miễn dịch trung hòa, tái tổ hợp vào ARN của virus dùng trong sản

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7

xuất văc xin. Khi ADN tái tổ hợp này ñược dùng như văc xin, gia súc tạo
miễn dịch ñặc hiệu chỉ chống lại các protein cấu trúc.
Virus LMLM có 2 ñặc tính ñặc biệt liên quan ñến dịch tễ học, ñó là tính
có ña type và tính dễ biến ñổi kháng nguyên, các type tuy gây ra những triệu
chứng, bệnh tích giống nhau, nhưng lại không gây miễn dịch chéo (Merial-
Pirbright, 2004).
1.1.1.4. Sức ñề kháng của virus LMLM
ðối với ngoại cảnh, sức ñề kháng của virus tương ñối mạnh. Với sức
nóng virus dễ bị diệt: ñun 60 - 70
0
C chết sau 5 - 15 phút, ñun sôi 100
0
C chết
ngay. Trong tủ lạnh, ở 0
0
C virus sống ñược 425 ngày. Virus ñề kháng cao với
sự hanh khô: trong cỏ khô sống 8 - 15 tuần, tổ chức phơi khô sống 7 ngày,
trên lông sống 4 tuần. Trong phân ủ thành ñống ở lớp sâu 15cm bị diệt sau 7
ngày; sâu 50cm bị diệt sau 9 giờ; ngoài mặt, sau 27 ngày về mùa ñông. Trong
ñất ẩm ướt virus sống hàng năm.
Trong tủy xương dài, phủ tạng có thể sống 40 ngày. Trong bắp thịt ñể
lâu hay trong quá trình thối xác chết sản sinh ra axit lactic diệt virus trong
24 giờ. Nhưng trong thịt ướp lạnh tác dụng thối bị kiềm chế nên virus có
thể ñược bảo tồn.
Virus ở trong tổ chức, mô, có sức ñề kháng mạnh với các chất sát trùng

có thể giết ñược vi khuẩn khác.
Trong thịt ngâm muối, virus còn tồn tại sau 35 - 45 ngày.
1.1.1.5. ðộc lực của virus LMLM
Mọi chủng virus LMLM ñều ñược coi là cường ñộc. Về mặt lâm
sàng, gia súc nhiễm virus LMLM có biểu hiện lâm sàng dưới nhiều mức ñộ
khác nhau, từ bệnh rất nghiêm trọng ñến dạng lâm sàng thể ẩn (Nguyễn
Tiến Dũng, 2000).
Về mặt ñộc lực của virus, một chủng virus có cùng một ñặc tính
kháng nguyên nhưng lần này hoặc nơi này thì chỉ gây bệnh cho lợn, nhưng

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8

lần khác hay nơi khác lại chỉ gây bệnh cho bò hoặc gây bệnh cho cả hai
loài. ðiều này ñúng với cả 7 type kháng nguyên của virus LMLM (Nguyễn
Tiến Dũng, 2000).
1.1.1.6. Cơ chế gây bệnh
Thời kì nung bệnh thường từ 1- 3 ngày khi gây bệnh thực nghiệm: 2-
7 ngày hoặc 11 ngày khi gây bệnh trong tự nhiên (Tô Long Thành và cộng
sự, 2004).
Virus LMLM thường xâm nhập vào ñộng vật mẫn cảm theo ñường hô
hấp hoặc theo vết sước trên da, ñầu tiên chúng nhân lên với số lượng nhỏ tại nơi
xâm nhập (Nguyễn Tiến Dũng, 2000), (Sobrino F., Esteban Domingo, 2001).
Vùng yết hầu của ñộng vật nhai lại ñược coi như vùng sinh bệnh ban
ñầu của virus LMLM, sau ñó virus LMLM xâm nhập vào tổ chức lympho
vùng hầu hay các hạch liên quan rồi ñi vào máu (Donalsson A.I, 2000).
Sau khi vào máu virus ñược ñưa ñến các vị trí thứ cấp gồm các cơ quan
tuyến, hạch lympho khác và biểu mô quanh mồm, chân, nơi phát sinh các
mụn nước. Mụn nước dày ñặc sẽ xuất hiện ở viền móng, vòm khẩu cái, mõm,
lưỡi, ñầu vú (Nguyễn Viết Không, 2007). Ở những con non và một số con

trưởng thành bị kế phát sang viêm nội tâm mạc, dẫn ñến suy tim và chết
(ðăng Văn Kỳ, 2000).
Virus LMLM có thể qua ñường sinh dục, qua các niêm mạc khác, qua
da của vành móng.
1.1.2. Dịch tễ học phân tử của virus LMLM
Dịch tễ học phân tử của virus LMLM dựa vào so sánh khác biệt di
truyền giữa các virus. Cây phân loài (dendrograms) ñã ñược công bố thể hiện
liên quan gen di truyền giữa các dòng virus thực ñịa và văc xin của cả bảy
chủng huyết thanh dựa vào kết chuỗi lấy từ gen 1D (mã hóa cho protein VP1
của virus). Quá trình khuếch ñại PCR sử dụng enzyme giải mã ñảo ngược
(Reverse-transcription PCR – RT-PCR) ARN của virus LMLM, tiếp theo là

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9

nhận diện kết chuỗi nucleotide. Nhiều phòng thí nghiệm ñã ñược phát triển
các kỹ thuật ñể thực hiện những nghiên cứu này, các phòng thí nghiệm tham
chiếu hiện nay có dữ liệu của trên 3000 bộ phận kết chuỗi (OIE, 2005).
Phương pháp ñược khuyến cáo ñể:
(1) Chiết xuất ARN của virus LMLM một cách trực tiếp từ huyễn dịch
biểu bì hay từ một mẻ tế bào cấy truyền ít lượt.
(2) Thực hiện một RT-PCR cho toàn bộ gen 1D (hoặc chỉ một phần của
gen 1D, thì các ñầu 3’ của gen là có ích nhất).
(3) Xác ñịnh kết chuỗi nucleotide của sản phẩm PCR (hay ít nhất 170
nucleotides (thích hợp là 420 ñối với các chủng SAT] ở ñầu 3’ của gen này).
Các yếu tố chức năng trong bộ gen ñược chỉ ñịnh bao gồm khu vực
không giải mã 5' (5'UTR), vùng mã hóa cho tất cả virus, 3’ là ñoạn kết thúc
của bộ gen (3'UTR) và axit polyadenylic (pA). Các mARN giải mã sang một
polyprotein ñược xử lý bởi enzyme của virus bao gồm cả 3C
pro

. Quá trình
chuyển dịch từ VP0 vào VP4 và VP2 xảy ra chưa rõ cơ chế.
ðến nay theo các tài liệu nghiên cứu, virus gây bệnh LMLM ñược chia
thành 7 type là O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3, và Asia1. Dưới các type là những
biến chủng virus gọi là phân type và hiện nay ñã phát hiện hơn 70 phân type
virus. Trong số 7 type LMLM, type A là type có tính biến ñổi kháng nguyên
lớn nhất. Dựa vào phân tích cây phát sinh chủng loại của trình tự gen VP1, type
A ñược chia thành 10 genotype chính (I-X). Tương tự type O ñược chia thành
10 genotype, ký hiệu Europe-South America (Euro-SA), Middle East-South
Asia (ME-SA), Southeast Asia (SEA), Cathay (CHY), West Africa (WA), East
Africa 1 (EA-1), East Africa 2 (EA-2), East Africa 3 (EA-3), Indonesia-1 (ISA-
1), và Indonesia-2 (ISA-2). Type Asia 1 ñược chia thành 6 genotypes (I–VI).
Những nghiên cứu gần ñây cho thấy có ñồng thời cả 3 serotype O, A, và
Asia 1 của virus LMLM ñang lưu hành và gây bệnh trên ñàn gia súc của Việt
nam. Trong 3 serotype O, A, và Asia 1 của virus LMLM phân lập ñược tại Việt

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10

Nam lại tồn tại rất nhiều phân type (subtype). Cụ thể có ít nhất 3 topotype là
Southest Asia (SEA), Cathay, PanAsia thuộc serotype O, 2 phân type là nhóm
4 (group IV) và nhóm 5 (group V) thuộc serotype Asia 1, và 1 phân type là
nhóm 9 (genotype IX) thuộc serotype A. Như vậy có thể thấy virus LMLM ở
Việt Nam rất ña dạng và có ít nhất 6 phân type của virus LMLM ñang lưu hành
và gây bệnh tại Việt Nam (Le et al., 2011), (Le et al., 2010a), (Le et al., 2010b),
(Lee et al., 2011).
1.1.3. Tình hình bệnh LMLM trên thế giới
Bệnh LMLM xuất hiện ở hầu hết các nước trên thế giới. Trong khi
bệnh ñược xem là ñã thanh toán ở một số quốc gia trong một thời gian
nhưng cho ñến nay với phạm vi rộng và tính chất lây lan nhanh của bệnh vẫn

là mối quan tâm hàng ñầu. Sau chiến tranh thế giới thứ 2, bệnh xuất hiện ở
hầu hết các châu lục. Thế giới ñã ghi nhận một ñợt dịch lớn kéo dài từ năm
1981-1985, xảy ra trên phạm vi 80 nước, gây tổn hại kinh tế lớn cho các
nước này (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 2001).
Châu Âu:
Dịch LMLM xảy ra vào nhưng năm 1951 - 1954 ở Tây ðức, Hà lan,
Bỉ, Lucxembourg, Pháp, Anh, Ý, Áo, ðan Mạch, Thụy ðiển, Na Uy và Ba
Lan (Tô Long Thành và cộng sự, 2005).
Trong 5 năm 1981-1985, có 804 ổ dịch tại 12 quốc gia do virus type O,
A và C gây ra (Thái Thị Thủy Phượng, 2008).
Năm 2001, dịch LMLM lại khởi phát từ Anh, có mức ñộ nghiêm trọng
ñã xảy ra ở Anh dẫn ñến việc tiêu huỷ trên 10 triệu bò và cừu. Việc này ñã
ảnh hưởng ñến cả tình hình chính trị và sinh hoạt bình thường của nước Anh
(hoãn bầu cử trong thời gian một tháng, huỷ bỏ các hoạt ñộng thể thao vui
chơi giải trí). ðến tháng 8 năm 2007, bệnh LMLM lại xuất hiện tại hai trang
trại vùng Surrey của Anh (Foot and Mouth Disease confirmed in cattle, in
Surrey", DEFRA, 2007-08-03), sau ñó lan sang Pháp, Hà Lan, Ireland qua còn

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
11

ñường vận chuyển gia súc (Văn ðăng Kỳ và cộng sự, 2001), (Hoàng Văn
Năm, 2002).
Cho ñến nay, hầu hết các nước Châu Âu ñều ñược công nhận là ñã
thanh toán ñược bệnh và nhiều quốc gia thuộc liên ñoàn Châu Âu ñã ngừng
sử dụng văc xin LMLM.
Châu Mỹ:
Bệnh xuất hiện lần cuối cùng ở Canada vào năm 1952, Mexico năm
1954. Tại nước Mỹ ñã xảy ra 9 vụ dịch từ 1870 ñến 1929. Nước này ñã công
bố hoàn toàn hết dịch vào năm 1929. Một số nước thuộc Trung Mỹ,

Newzealand, Panama ñược xem là chưa từng có dịch bệnh LMLM, (Hoàng
Văn Năm, 2002), (Health Inspection Service United States Department of
Agriculture, 1991).
Ở Nam Mỹ tại một số nước an toàn dịch như Paraguay, Argentina thì
dịch do virus LMLM type O và A ñã tái bùng phát vào những năm 2000-2002
(Mattion, N. et al, 2004). Dịch vẫn lưu hành và gây thiệt hại kinh tế ở Bolivia
(Rushton, J, 2008).
Trong năm 2005- 2006 xảy ra các vụ dịch ở Argentina, (type O), Brazil
(type O).
Châu Phi
Tình trạng bệnh LMLM ở các nước Châu Phi là không rõ ràng do
không tiến hành ñiều tra hoặc ñiều tra rất ít. Hầu hết các quốc gia ở Tây,
Trung và ðông Phi có khả năng xuất hiện dịch (Hoàng Văn Năm, 2001).
Ở Châu Phi dịch chủ yếu do 3 type: SAT1, SAT2, SAT3 gây ra, riêng
type C gây bệnh thiệt hại nặng tại Kenia và Ethiopia (1984-1985). Năm
1989, theo OIE, dịch LMLM ñã xảy ra ở 53 nước ở các châu Á, Âu, Phi và
Nam Mỹ (Thái Thị Thủy Phượng, 2008).
Ở tây Phi type O lưu hành rộng rãi, dịch xảy ra dịch ở các nước Gambia,
Senegal, Uganda, Tanzania Malawi, và Kenia. Năm 1999 dịch từ Mali theo

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12

ñường vận chuyển bò qua Sahara lan ñến Algeria, Marocco và Tunisia. Virus
LMLM type SAT2 lưu hành ở Uganda, Zambia và Kenia, SAT1 có ở Kenia
(OIE, 2005).
Năm 2001, virus LMLM type O xuất hiện ở Kenya, Mauritania,
Uganda và Senegal. Trong tháng 1/2001 tại Swaziland xuất hiện một ổ dịch
do virus LMLM type SAT1 gây ra trên bò ở miền bắc vùng Hhohho theo dọc
biên giới Nam Phi, trong một vùng an toàn dịch LMLM từ lâu ở Swaziland.

Trong tháng 2/2001, xuất hiện một ổ dịch do virus LMLM type SAT2 ở một
quận của tỉnh Mhana, phía bắc của Nam Phi. Zimbabue thống kê có 18 ổ dịch
do virus LMLM type SAT2 gây ra từ tháng 8 ñến tháng 10 năm 2001 tại các
tỉnh Metabeland và Masvingo (Hoàng Văn Năm, 2001).
Châu Á
Trong những năm 1981-1985, ở châu Á, 11 nước có dịch LMLM do
type Asia1 gây ra (Thái Thị Thủy Phượng, 2008).
Năm 1997, dịch LMLM xảy ở ðài Loan làm cho nước này phải thiêu
hủy hơn 4 triệu con lợn, gây thiệt hại vô cùng lớn cho ñất nước này, làm
ngừng ngay xuất khẩu vào thị trường Nhật Bản và Hàn Quốc (gây thiệt hại
trên 4 tỉ USD, 90% trong số này bị mất từ lợi nhuận xuất khẩu) (R.P.
Kitching, 2008).
Năm 1998, Campuchia, Lào, Thái Lan thông báo có các ổ dịch type
Asia1 (Hoàng Văn Năm, 2000).
Năm 2001, dịch xảy ra tại Thổ Nhĩ Kỳ với các ổ dịch type O, A và
Asia1. Ổ dịch do virus type Asia1 cũng ñược báo cáo ở Iran, Afganistan,
Georgia và Azerbaijan (Hoàng Văn Năm, 2001).
Cuối năm 1999 ñầu 2000, hàng loạt ổ dịch ñã nổ ra ở các nước ðông
Á. Các nước bị ảnh hưởng của dịch lần lượt là Trung Quốc năm 1999 và tiếp
ñó ðài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mongolia và một phần ðông nước Nga.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13


Hình 1.3. Bản ñồ phân bố các chủng virus LMLM từ năm 2010-2013
(Nguồn:
upload/eufmd/docs/FMD monthly
reports/June2013_FMD_global_report.pdf)

1.2. Tình hình và nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình bệnh LMLM ở Việt Nam
Bệnh LMLM ñược phát hiện lần ñầu tiên ở Việt Nam vào năm 1898 tại
Nha Trang và sau ñó là ở Nam Bộ (năm 1920).
Năm 1996, 1997 dịch xảy ra nặng một số tỉnh Duyên hải miền Trung
và Tây Nguyên.
Năm 2001, bệnh LMLM trên trâu bò còn xảy ra và tái phát ở 11 tỉnh, 23
huyện, 35 xã làm 2.078 trâu bò mắc bệnh (trong ñó 7 tỉnh miền núi phía Bắc).
Năm 2006 dịch LMLM xảy ra hầu hết các tỉnh thành trong cả nước, cụ
thể trên trâu bò dịch xảy ra ở 47 tỉnh, làm 116.015 con mắc bệnh, tiêu huỷ
4.916 con.
Năm 2009, ñã có 21 tỉnh có dịch LMLM trên trâu, bò và lợn, số mắc ở
trâu là 1.439 con, bò là 1.768 con và lợn là 238 con. Những tỉnh có số trâu bò
lợn mắc và tiêu hủy nhiều là Kon Tum, Quảng Bình, Quảng Ngãi, Sơn La…

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14

Năm 2010, dịch xảy ra ở 30 tình trên cả nước trên trâu, bò và lợn; số
trâu, bò mắc bệnh là 7.111 con, số lợn mắc bệnh là 743 con.
Năm 2012, dịch xảy ra trên 7 tỉnh với tổng số trâu, bò, lợn dê mắc bệnh
là 3.317 con.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam
Năm 2003, Hồ ðình Chúc cùng cộng sự ñã dùng phản ứng ELISA với kit
3ABC ñể phát hiện kháng thể của trâu bò mang virus LMLM, phân biệt với
kháng thể do văc xin LMLM tạo nên (Hồ ðình Chúc và cộng sự, 2003).
Kỹ thuât RT-PCR ñã ñược áp dụng trong chẩn ñoán, ñịnh type virus
LMLM. Năm 2004, Tô Long Thành và cộng sự ñã phân lập thành công virus
LMLM trên tế bào BHK-21. Sử dụng kỹ thuật RT- PCR với cặp mồi chung

1F/1R ñặc hiệu cho 7 type của virus LMLM gây bệnh LMLM và cặp mồi
P33/P38 ñặc hiệu cho type O ñã ñược xác ñịnh virus LMLM phân lập ñược là
virus LMLM type O (Tô Long Thành và cộng sự, 2004).
Năm 2005, Nguyễn Viết Không và cộng sự, bằng phương pháp RT-PCR
lần ñầu tiên phát hiện type Asia1 tại Khánh Hòa (Nguyễn Viết Không và cộng
sự, 2006).
Năm 2006, Thái Thuỷ Phượng và Lê Thanh Hoà ñã tách dòng, giải
trình tự và phân tích chuỗi gene từ các mẫu bệnh phẩm từ bò lai và lợn ðồng
Tháp ñã phát hiện ra topotype khác biệt của virus LMLM.
Năm 2006, ở nước ta xác ñịnh có 3 type virus LMLM: O, A, Asia1 (Tô
Long Thành và cộng sự, 2006).
Các ổ dịch LMLM do serotype O gây ra từ 2005- 2007 chủ yếu là do:
Virus LMLM serotype O_Cathay chỉ gây bệnh trên lợn; Virus LMLM
serotype O_SEA-May98 gây bệnh cho cả trâu, bò và lợn. Giai ñoạn 2008-
2012 hầu hết các ổ dịch LMLM xảy ra do type O. Cuối năm 2008 type A xuất
hiện tại tỉnh Nghệ An.
Năm 2012, kết quả giám sát lâm sàng và giải trình tự gene ñể giám sát

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
15

biến ñổi virus cho thấy mẫu virus trong 49 ổ dịch tại 22 tỉnh, thành phố trải
ñều khắp trong cả nước thuộc type O Pan-Asia.
1.3. Một số ñặc tính của virus LMLM
1.3.1. ðặc tính nuôi cấy
1.3.1.1. Nuôi cấy virus ÊLMLM trên môi trường tế bào
Virus LMLM là virus có tính hướng thượng bì, nên nhiều tác giả ñã
nuôi cấy chúng trên da của thai lợn, thai bò còn sống (giữ thai sống bằng
phương pháp nhân tạo).
Mô ñộng vật nuôi cấy thích hợp nhất với virus LMLM là thượng bì lưỡi

bò trưởng thành. Lưỡi bò tươi thu thập ngay sau khi giết mổ bò, bảo quản
ngay trong lạnh 2
0
C - 3
0
C không quá 8 ngày. Virus LMLM phát triển ở
thượng bì gây nhiễm hình thành mụn nước; các mảnh thượng bì lưỡi có mụn
nước là vât liệu chứa virus ñược dùng ñể tiếp ñời hoặc thu virus ñể chế văc
xin. Virus LMLM có thể giữ nguyên ñộc lực sau khi tiếp ñời virus trên mô
thượng bì lưỡi bò sau vài chục lần, phương pháp thường ñược dùng ñể nhân
virus chế văc xin vô hoạt.
Nuôi cấy virus LMLM trên môi trường tế bào, tốt nhất là tế bào lấy từ
tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bào thận bê hoặc thận cừu non hoặc các
dòng tế bào có ñộ nhạy tương ñương, như tế bào thận của chuột Hamster non
gọi tắt là tế bào BHK. Sau khi cấy virus LMLM vào các môi trường tế bào
này ñể tủ ấm 37
0
C trong 24, 48, 72 giờ trong ñiều kiện có 5% CO
2
, virus sẽ
làm huỷ hoại tế bào nuôi (Nguyễn Như Thanh và cộng sự, 2001).
Loeffer và Frosch ñã nghiên cứu về ñặc tính nuôi cấy virus ngay từ khi
phát hiện ra virus LMLM. Nhiều tác giả ñã nuôi cấy virus LMLM trên da của
thai lợn, thai bò còn sống hoặc tiêm virus LMLM vào phúc xoang chuột nhắt
con, tính kháng nguyên của virus này không thay ñổi, có khả năng gây bệnh
và tạo miễn dịch ñối với bò khi ñã tiếp 20 ñời qua chuột nhắt trắng và thường
dùng ñể chế văc xin nhược ñộc.