sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng cà định dạng của tập đoàn cây dó bầu ( aquilaria sp.) tại hà tĩnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




HOÀNG ĐĂNG HIẾU




SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP
ĐOÀN CÂY DÓ BẦU(AQUILARIA SP.) TẠI HÀ TĨNH




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC







Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG ĐĂNG HIẾU



SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP
ĐOÀN CÂY DÓ BẦU(AQUILARIA SP.) TẠI HÀ TĨNH

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ




Hà Nội - 2012
Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
ii

MỤC LỤC
Trang

M U 1
U 2
1.1. Tng quan v u 2
  cu 2
n c u 3
 kinh t u 5
1.1.4. Thc trng trn th gii 7
 ng ti kh o tro 9
1.2. Mt s  dng trong vinh danh nh quan h di
truyn 10
1.3. DNA barcode - m mi 12
1.3.1. Gii thiu DNA barcode 12
n c barcode 13
1.4. Mt s c s d thc vt 14
  14
 15
1.4.3. T gen luc lp 15
 gen rbcL 17
 gen matK 17
 gen rpoB rpoC1 17
 gen ycf5 18
 hai gen trnH - psbA 18
 hai gen trnL(UAA) - trnF(GAA) 19
u DNA barcode  thc vt 19
1.6. Mt s kt qu u v du ti Vi gii . 21
T LI 22
2.1.Vt liu 22
2.1.1. Thc vt 22
2.1.2. Chng vi khun 23
Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu

iii

t 23
t b 23
p mi s du 24
u 24
u 24
u 24
T QU O LUN 33
3.1. Kt qu ch DNA tng s 33
3.2.  gn mu ca phn ng PCR 34
3.3. Kt qu n gen vp mu 36
3.3.1. Kt qu n gen rbcL 36
3.3.2. Kt qu n gen rpoB 36
3.3.3 Kt qu n gen psbA-trnH 37
3.3.4. Kt qu n gen ITS 38
3.4. Kt qu  38
3.4.1 Kt qu tinh sch sn ph 38
3.4.2. Kt qu chuy 39
3.4.3. Kt qu bin n  bin E.coli 39
3.4.4 Kt qu chn l  hp 40
3.4.5. Kt qu t  hp 41
3.4.6. Kt qu ct ki hp 42
 nucleotide cn DNA ch th 43
3.5.1. Kt qu  gen trn-psbA 44
3.5.2. Kt qu  gen rpoB 46
3.5.3. Kt qu   c lp rbcL 48
3.5.4. Kt qu  gen ITS 52
KT LUN NGH 58
U THAM KHO 59

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
iv

DANH MỤC BẢNG
Trang
Ba mt s mi DNA Barcode thit k cho h gen lc lp 16
B u 22
B p mn gen barcode 24
Bn dung dm ra 25
Bn dung d 25
Bn phn ng PCR 26
Bng 2.6. Chu k phn ng PCR 26
Bn phn ng ligase 28
Bng chn lc t  hp 29
Bng 2.9. n phn ng PCR kim tra khun lc 30
Bng 2.10. Chu k phn ng PCR- clony 30
B 30
Bn ng ct enzyme 31
Bng 3.1. Nhi bt mc gen cp mu 34
B vùng trnH-psbA intergenic lc lp 45
B c lp rpoB 47
Bng 3.4.  c lp rbcL 50
Bng 3.5. V   i crbcL 51
B ITS 54
B  i cITS 55

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
v

DANH MỤC HÌNH
Trang
u 2
 u 5
 vector pBT 27
t qu n di DNA tng s ca mt s mu 33
. Kt qu chy PCR - gradient ca ch th rpoB  ng nhi t
49
o
C ti 58
o
C 35
  t qu n di sn phm PCR gen rbcLc    u
u 36
  t qu n di sn phm PCR gen rpoB c    u
u 37
t qu n di sn phm PCR gen psbA-trnH c
cu 37
  t qu n di sn phm PCR gen ITS c    u
u 38
t qu tinh sch sn phm PCR gen rpoB 39
t qu bin n h  bin 40
t qu n di sn phm PCR - clony khun lc mi rbcL 41
t qu t 42
t qu n di sn phm ct bng enzyme BamHI mi rbcL. 43
i git qu mi ITS 56

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
vi

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
bp
Base pair
CBOL
Consortium for the Barcode of Life
CTAB
Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
IPTG
Isopropylthio-beta-D-galactoside
ITS-rDNA
Internal Transcribed Spacer-rDNA
Kb
Kilobase
LB
Luria Bertani
PCR
Polymerase Chain Reaction
RNA
Ribonucleic acid
rDNA
Ribosome deoxyribonucleic acid
RAPD

Random Amplyfied Polymorphism DNA
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
Rnase
Ribonuclease
SDS
Sodium dodecyl sulphate
Sol
Solution
STS
Sequence-Tagged Site
TAE
Tris - Acetic acid - EDTA
Taq polymerase
Thermus aquaticus polymerase
TE
Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid
X-gal
X - 5 - brom - 4 - chloro3 - indolyl - - D - galactosidase

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
1

MỞ ĐẦU
(Aquilaria sp) 



               



       A. crassna      
A. baillonii  A. rugosa   A. malaccensis 
A. sinensis A. banaensis  A. crassna 
  









  


“Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định
danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh.”

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây dó bầu
1.1.1. Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu
d(Aquilaria sp.) 

         


 Aquilaria Thymeleaceae, 


u
Aquilaria 
     Aquilaria crassna; A. baillonii; A. sinensis hoặc
A. chinesis; A. borneensis; A. Malaccensi; A. gollocha; A. hirta; A. rostrata;
A. beccariana; A. cummingiana; A. filaria; A. khasiana; A. microcarpa;
A. grandiflora; A. bancana; A. Rugosa.    A. rugosa   


 

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
3




Aquilaria crassna 

1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây dó bầu
- 
60 - 


- 
- 15 x 2,5 - 
 
- 


- 

- 
 
- 
-
- 10 [3], [43].

- 




Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
4

A. crassna

- 6).
A. malaccensis
 
- 
                -
- 28
o

    



A. malaccensis 



A. malaccensis 

- - 70
c
       
- 


         



        

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
5



Cytosphaera mangiferae 
A. Malaccensis   Melanotus flavolives      
A. sinensis [42].


 u
1.1.3. Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dó bầu


       






Theo CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of
Wild Fauna and Flora - 
 
1995 -              
  
 
Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
6

- -


- - 
- 
-  

- 
- - 60 %
[11].


,

   

 Mycobacterium tuberculosis 
Shigella flexneri, 





         






Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
7

 


 


 


1.1.4. Thực trạng trồng và khai thác cây dó bầu trong nước và trên thế giới
 

 


- Trong nước
- 


 

 



-
15/03/2005 c-
- 


Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
8

chung [44].





15.000 -  Nam [4].










- Trên thế giới
Aquilaria crassna


A. subintegra

A. crassna A. subintegra 


Aquilaria
--n [15].


Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
9


 


 






1.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới khả năng tạo trầm nhân tạo



    






 



 


chromone invitro 
Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
10








 
--
-



.
1.2. Một số phƣơng pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan
hệ di truyền
    











 

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
11








m


              
        -   

- RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA)
- AFLP (Amplified Fragment














Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
12

1.3. DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại
1.3.1. Giới thiệu DNA barcode

   cho  
.   DNA    (Arnon,
1993), trong         
   trong . 
  d  DNA (400-800 bp)   
  n    . 
 
 Ngo





          

 
cytochrome c oxidase 
I (COI) [36]. 







 

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
13



     







1.3.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode
   







 


       
               


[45].


Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu

14

              ITS (Internal
    





[14], [29], [19].
Theo Tab

- 

- 

- 

- Th

- 


1.4. Một số locus đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp DNA barcode ở thực vật
1.4.1. Trình tự gen nhân



 


Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
15


[36], [39].
1.4.2. Vùng gen mã hóa ribosome
        


 
ITS1, ITS2 

ITS. 




nrITS ITS 

 

ITS1 ITS2 
c gen



[36], [39] [40].
1.4.3. Trình tự gen luc lạp

- -

- 
- 
Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
16







Mi
 

rbcL
a-f
a-r
ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC


matK
matK 1F
matK 1R
matK 2F
matK 2R
GAACTCGTCGGATGGAGTG
GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG
CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA
TAAACGATCCTCTCATTCACGA





rpoB
rpoB 1
rpoB 2
rpoB 3
rpoB 4
AAGTGCATTGTTGGAACTGG
ATGCAACGTCAAGCAGTTCC
CCGTATGTGAAAAGAAGTATA
GATCCCAGCATCACAATTCC




rpoC1
rpoC1 1
rpoC1 2
rpoC1 3
rpoC1 4
GTGGATACACTTCTTGATAATGG
GGCAAAGAGGGAAGATTTCG
TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC
CCATAAGCATATCTTGAGTTGG





ycf5
(ccsA)
ycf5 1
ycf5 2
ycf5 3
ycf5 4
GGATTATTAGTCACTCGTTGG
ACTTTAGAGCATATATTAACTC
ACTTACGTGCATCATTAACCA
CCCAATACCATCATACTTAC



trnH -
psbA
trnH2
psbAF
trnH(GUG)
psb A
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
GTTATGCATGAAAGTAATGCTC
ACTGCCTTGATCCACTTGGC
CGAAGCTCCATCTACAAATGG




trnL-F
trnL-c
trnL-d

trnL-e
CGAAATCGGTAGACGCTACG
GGGGATAGAGGGACTTGAAC
GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC



trnL-f
trnL-g
trnL-h
ATTTGAACT
GGGCAATCCTGAGCCAA
CCATTGAGTCTCTGCACCTATC









Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
17







1.4.4. Trình tự gen rbcL
rbcL 
- 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO).
rbcL rbcL 
rbcL 
               
CBOL rbcL 

rbcL 
 matK 
[37], [39].
1.4.5. Trình tự gen matK
matK 

     matK  


matK 

matK 
1.4.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1
Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu
18

gen rpoB rpoB 

16S rRNA, rpoB 




rpoC1 
rpoC1 

rpoB rpoC1 

1.4.7. Trình tự gen ycf5
ycf5 hc bo tn
 t c   c v   c kim nghi   p vi DNA
barcode ca m dng
nhia mt DNA barcode [36], [35].
1.4.8. Trình tự hai gen trnH-psbA
Gen trnH-psbA i t
n 1120 bp, trnH-psbA c ch 
Locus trnH-psbA c khu  nhiu thc vt ht
trn. Tuu thc vt htrnH-psbA lc rt ngn (~
c ci ln do s t ca gen rpS19 ho
gen gi nm gia hai gen trnH psbA. Trong nhiu gn
 xut vic s dng trnH-psbA  th c lp cho thc vt hay
kt hp vi matK. CBOL thy rng kh a trnH-psbA 
nht (69%) trong s c th nghi ngh  th
barode b sung. trnH-psbA  s dng trong h thng barcode ba locus khi h
th kh 