phân tích vi sinh thực phẩm tìm hiểu phương pháp pcr

L.O.G.O
MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

ĐỀ TÀI: TÌM HiỂU PHƯƠNG PHÁP PCR
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
THÀNH VIÊN NHÓM
•

•

•

•
 !"
•
#$
•
%&'()
Nội dung
*+,-!.
*+/!012!% 345678
**+9!3&
***+7:; <!% =>!?@678
Phương pháp PCR
Phương pháp PCR
+7:/!A4BC51D
1. Định nghĩa
•
6786 E=F%GF78FH I645J!%2K3L345

?/;<FL+
•
678E=>!?M!N!3O0/!% G3(!PQ=?/;<=>!
; <R=?&GP1D:GCN!GA+
2.Lịch sử
•
63:3S04<678;KT%UEEG3:!=S="$+
•
V;&?M!N!W35!<3C;X!HYZ93:!.=-CY
F[=F3 E=F%GF.!=33:3!%B;4\]^:C
%_HY+
II. Những thành phần
DNA mẫu làm khuôn
DNA mẫu làm khuôn
Enzyme DNA-polymerase
Enzyme DNA-polymerase
Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi
Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi
Các nuleoFt
Các nuleoFt
1
2
3
4
Ion Mg
2+
Ion Mg
2+

Nước:

Nước:
1;.=
1;.=
5
6
7
1. DNA mẫu làm khuôn:
•
Đây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuếch đại.
•
Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài
khoảng 1÷1,5kb.
•
Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, tuy nhiên, kỹ thuật chuẩn đoán bằng phương pháp này vẫn đạt kết quả tốt
trong trường hợp mẫu DNA không có độ tinh sạch cao.
2. Enzyme DNA-polymerase
•
Chất lượng của phương pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzyme polymerasevới sự phát hiện enzyme Taq-
polymerase có nguồn gốc vi khuẩn (Thermus aquaticus).
•
Với enzyme này cho phép nhận được các sản phẩm DNA tinh sạch.
•
Nhược điểm:
+ không tổng hợp được trình tự DNA dài quá 3kb
+ enzyme này không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép.
3. Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi
- Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng
hợp DNA. Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA
mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản.

- Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao.
* Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây:
- Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, và cũng không tạo những cấu trúc kẹp
tóc.
- Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
- Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb).
- Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu. Còn mồi
dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng ở bước 3.
- T
m
mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thưòng trong khoảng từ 4÷5°C, và nhiệt độ nóng chảy của
mồi khoảng 72°C.
4. Các nuleotit
Cần phải có bốn loại nucleotide dạng triphosphat như: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ mỗi loại nucleotide phải ở dạng cân bằng,
ứng với khoảng 20÷200µM cho mỗi loại nucleotide.
5. Ion
-
Ion Mg
2+
là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ Mg
2+
tối ưu để thực hiện PCR từ 150÷200µM.
L.O.G.O
6. Nước:
- Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào. Không được chứa các enzyme cắt hạn
chế và các enzyme phân hủy axit nucleic.
7. Dung dịch đệm:
- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl
2
1.5mM.

-
Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween
hay formamide.
6. Nước:
- Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào. Không được chứa các enzyme cắt hạn
chế và các enzyme phân hủy axit nucleic.
7. Dung dịch đệm:
- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl
2
1.5mM.
-
Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween
hay formamide.
`.!;>!SE"a"bc7;d!:GKR%+V-E0/e\f3:Cg&A1% F
AGKR+%-?h\R!Z;K0/e;/!Z=BJ;d;4=04 =iR
C=j;K3(!: ! CkW1<GK;+ZIa3l!
`m?GKR!:%\.!;>;K<!n3^A;d=jf!dXC GKR;+V-
EX=j+.!;>; <3D!>C ; <=jC!Z!n3.!;>0/ec7
oabc7`+mP1DG.!;>!% ; <1i;/C.; <=j?X ! C R
=i\X=>!:!2H.+ZIa3l!+
`R3 E=F%GFXH/3C GK!%A+f0X!;&0:=C C <!;>1!F GKR+V-
E?p 1+.!;>?p 13D!>Ra3 E=F%GF+Z0-3D!>C 4Ra
3 E=F%GFCY1=4R&?/;<+=>!q!Xr\03s3l!+
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước:
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
Hỗn hợp PCR được chuẩn bị trên khay lạnh. Quần áo bảo hộ là không cần thiết, nhưng nếu bảo hộ tốt thì phản ứng sẽ diễn ra trong
điều kiện vô trùng
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Các phản ứng PCR được nạp vào máy luân nhiệt
Các máy luân nhiệt bị khóa đóng và được lập trình.
Máy luân nhiệt gồm 2 phận:
+ phần màu đen là một bộ bốn, trong đó có 4 bộ 96 mẫu có thể được chạy đồng thời.
+ phần màu trắng gồm 4 màu trắng nhỏ hơn, mỗi cái có thể chứa 96 giếng.
Tùy thuộc vào kích thước của các sản phẩm PCR ta sẽ phân loại bằng trực quan theo 2 cách thường dùng:
+ ngang - agarose gel
+ dọc - acrylamide trình tự gel .
Ở đây, các sản phẩm đang được chạy trên một gel agarose- ngang.
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
Gel acrylamide có thể được chạy trong một trong hai đơn vị: độc lập hoặc một trình tự tự động.
(Trong cả 2 hai trường hợp việc chuẩn bị gel phải theo trình tự và khá phức tạp để thiết lập )
Ở đây, kính đang được làm sạch và lau trước khi chuẩn bị gel cho một trình tự tự động.
Kính thủy tinh đang được đưa vào khung và được kẹp lại
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
7:?]!H;K?t3C C!%]\C! 0>!n=?];K
u0GvG C.;OFE+
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
Gel acrylamide lỏng được đổ vào khuôn. Vì acrylamide là một chất gây ung thư nên cần phải mặc quần áo
bảo hộ.
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
Tt3w!3]1-!n=!xH;dSwGy%W%kFE+
U>!CN!1DA/EK;K;C 3]!%FE;d!< %:/C ;f:=iGz;K<3C +
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
m?=i;K<3\!n=?]5=i;K;w!C =:4!%@!y
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
{n=iC-=>!;33F!+
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
r++C<3C :/FE+

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
(E=>!N4!|:054!%-;f+{}?]!-C2~/C;33F!\E= ff!d<3
=>!GAEKE-:=iC =JFE+
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
U>!0>3N.!;K;w!C-FE;d;4=04 .!;>O;+
III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR
,FE;.=;K<3C 0d!%+