phân tích vi sinh thực phẩm ướt tính tăng trưởng của clostridium perfrigens trong thịt bò nấu chín dưới nhiệt độ dao động

ƯỚT TÍNH TĂNG TRƯỞNG CỦA CLOSTRIDIUM
PERFRIGENS TRONG THỊT BÒ NẤU CHÍN DƯỚI
NHIỆT ĐỘ DAO ĐỘNG
GVHD: Trần Thị Mỹ Lệ
Phân tích vi sinh thực phẩm

Khái niệm mới dùng để ước tính sự phát triển của vi khuẩn dưới những điều kiện nhiệt độ khác nhau đã được giả
định và đánh giá bằng cách sử dụng Clostridium perfringens để kiểm tra vi khuẩn phương pháp mới này sử dụng dựa
trên kiểu Gompertz để tính toán thời gian phát triển tương ứng với những nhiệt độ khác nhau, ước tính số lượng vi
khuẩn dưới nhiệt độ khác nhau.

Phương pháp mới này đã được kiểm tra trên thịt bò dưới những điều kiện nhiệt độ khác nhau. Ước lượng một cách
chính xác phương pháp này là 1.0 log
10
(cfu/g). mặc dù phương pháp này dựa trên C. perfringens. Có nhiều ứng dụng
nguồn bệnh do độ độc thực phẩm tới dự đoán sự phát triển của vi khuẩn dưới những nhiệt độ khác nhau.
Clostridium perfringens (trước đây gọi là C. welchii) là một vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, vi khuẩn bào tử
thuộc chi Clostridium. Vi khuẩn này phân bố ở khắp nơi trong môi trường và có thể dễ dàng phân lập từ bụi, thịt sống,
gia cầm, và trong đường ruột của người và động vật.
Hình ảnh Clostridium perfrigens
Giới thiệu sơ lược về Clostridium perfrigens

Clostridium perfringens là một tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm nghiêm trọng ở Hoa Kỳ và là một mối
quan tâm lớn cho các công nghiệp thực phẩm.

Các triệu chứng khi nhiễm clostridium perfrigens: viêm dạ dày ruột, đau bụng cấp tính, tiêu chảy

Các triệu chứng thường xuất hiện 8-16h sau khi ăn các thức ăn bị nhiễm khuẩn và có thể kéo dài từ 24-48h.

Bào tử của vi khuẩn này chịu nhiệt cao hơn bào tử của Salmonella và Listeria, chúng có thể sống sót ở nhiệt độ
nấu ăn bình thường hoặc nhiệt độ sản xuất các sản phẩm như giăm bông, thịt bò nướng, thịt bò muối


Điều kiện yếm khí tạo ra như là một kết quả của oxy cạn kiệt trong khi nấu có thể cho phép các bào tử sinh vật
này trong thịt nấu chín và các sản phẩm gia cầm nảy mầm, phát triển nhanh, và nhân rộng đến một liều lượng cao
nguy hiển nếu nhiệt độ sản phẩm không duy trì đúng cách

Clostridium perfringens có thể phát triển ở nhiệt độ từ 6
o
C đến 52
o
C và nhân lên nhanh chóng ở 30
o
C và
47
o
C.

Thịt đỏ và gia cầm dễ bị nhiễm Clostridium perfrigens
Khái niệm thời gian tăng trưởng tương đương (EGT)
1. Đường đẳng nhiệt phát triển của vi khuẩn

Trong việc đánh giá sự an toàn của vi khuẩn các sản phẩm thịt nấu chín, vi sinh vật thường phân quá trình phát
triển của vi khuẩn thành 4 giai đoạn: giai đoạn tiềm phát(lag phase), giai đoạn logarit(log phase) hay pha chỉ số
(exponential phase), giai đoạn ổn định( stationary phase), giai đoạn suy vong(death phase).

Sau giai đoạn cân bằng là giai đoạn suy vong, tuy nhiên người ta thường bỏ qua giai đoạn này kể từ khi thực
phẩm được đánh giá là vi sinh vật vượt quá giới hạn để tiêu thụ sau giai đoạn cố định đặc biệt đối với C.
perfringens.

Do đó, từ quan điểm an toàn thực phẩm, các vi sinh vật tăng trưởng nói chung được mô tả bởi một hàm xích ma,
chẳng hạn như hàm Gompertz (Gibson et al., 1987) và tính theo toán học nó có thể được thể hiện như:

L
(t)
= A+( B –A) exp{- exp[- μ(t - M)]} (1)
Trong đó:
L
(t)
là số lượng tác nhân gây bệnh tại thời điểm t, log10 (cfu / g).
A là nồng độ tế bào ban đầu.
B là nồng độ tế bào tối đa.
M là thời gian mà tại đó tốc độ tăng trưởng là tối đa ( h ).
μ là tốc độ tăng tưởng tương đối tại thời điểm M (h
-1
).

Mặc dù phương trình Gompertz chỉ là phương trình thực nghiệm nhưng nó được ứng dụng rộng rãi và kiểm tra
dự đoán vi sinh vật

Phương trình Gompertz có thể diễn tả chính xác sự phát triển của vi khuẩn từ pha tiềm phát tới pha
log(McDonald and Sun, 1999). Phương trình này thường được ứng dụng nhiều trong vi sinh vật thực phẩm.
2. Giả thuyết của EGT ở nhiệt độ khác nhau

Phương trình Gompertz (phương trình 1) được hình thành dưới điều kiện đẳng nhiệt không thể trực tiếp sử dụng để
tính toán sự phát triển của vi khuẩn khi có sự thay đổi của nhiệt độ.

Sử dụng phương trình Gompertz ước tính sự phát triển của vi khuẩn dưới điều kiện không đẳng nhiệt thì phải dựa
trên giả thuyết EGT hoặc tương ứng với độ tăng thời gian dùng để diễn tả và so sánh sự phát triển vi khuẩn dưới điều
kiện nhiệt độ khác nhau.
Với giới hạn nhiệt độ thấp nhất và cao nhất, sự phát triển và sự nhân lên của tế bào C. perfrigens sau khi sinh ra từ

bào tử nằm trong thịt bò có thể xem như là một quá trình đẳng nhiệt hoặc bất đẳng nhiệt bởi vì không thể dừng sự
phát triển của vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn có thể dừng sự phát triển trong điều kiện nhiệt độ môi trường nằm ngoài
giới hạn nhiệt độ tối thiểu hoặc tối đa…
Giả thuyết cho rằng mẫu ban đầu nằm tại nhiệt độ T
1
tại thời điểm t
1
và sau đó tới nhiệt độ T
2
cho tại thời điểm
khác. Sự phát triển của vi khuẩn trong giai đoạn ủ bệnh có thể được tính toán từ phương trình Gompertz ( Phương
trình 2):
L
1(t)
= A+( B –A) exp {- exp [μ
1
– (t
1
– M
1
)]} (2)
Sau khi nhiệt độ được thay đổi, tế bào vi khuẩn sẽ tiếp tục phát triển và nhân lên từ điểm kết thúc của thời gian ủ bệnh
đầu tiên. Nồng độ tế bào ban đầu cho thời gian ủ bệnh thứ hai nên được L
1
(t).
Để tính toán các vi khuẩn phát triển sau khi nhiệt độ thay đổi, người ta cho rằng sự phát triển ở nhiệt độ T
1
cho thời
gian ủ bệnh của t
1

là tương đương với mức tăng trưởng quá trình ở điều kiện nhiệt độ khác (T
2
) cho một thời gian ủ
bệnh của t
e
, được thể hiện ở phương trình sau:
L
1(t)
= A+( B –A) exp{- exp [- μ
2
- (t
e
– M
2
)]} (3)
Các vi khuẩn tăng trưởng dưới T
2
trong khoảng thời gian ∆t sau khi nhiệt độ thay đổi có thể được xác định từ:
L
2
(t
1
+∆t)= A+( B –A) exp{- exp [- μ
2
– (t
2
+ Δt – M
2
)] (4)
EGT (t

e
) của 2 điều kiện đẳng nhiệt có thể tính toán từ nhiều giai đoạn (tiềm phát, logarit, ổn định ) của vi sinh
vật.
Trong phương trình(3), t
e
là EGT(thời gian tăng trưởng tương đương) và là cơ sở cho việc tính toán của vi khuẩn
phát triển ở nhiệt độ dao động điều kiện.
Nguyên liệu và phương pháp
1. Sinh vật thử nghiệm và mẫu ủ
Có 3 mẫu C.perfrigens là NCTC 8238(Hobbs serotype 2), NCTC 8239 (Hobbs serotype 3) và NCTC 10288 (Hobbs
serotype 3) ở nhiệt độ (-20
o
C) với khối lượng mỗi mẫu là 5.00 gam.
2. Nghiên cứu sự phát triển của C.perfrigens
Các mẫu thịt bò đông lạnh được giải đông qua đêm trong tủ lạnh (4
0
C) tiếp theo gia nhiệt ở 75
0
C trong mỗi cốc
nước trong 20 phút để kích hoạt các bào tử và để vô hiệu hóa bất kì tế bào thực vật gây ô nhiễm.
Sau một thời gian ngắn rửa bằng nước (khoảng 20
0
C trong vòng 1-2 phút) để làm nguội thịt trong túi nhựa, mẫu
được ủ ở 30
0
C, 36
0
C, 45
0
C để có đường cong tăng trưởng đẳng nhiệt

Mẫu từ mỗi nhiệt độ ủ được dùng để xác định nồng độ tế bào vi khuẩn. Ít nhất ba thí nghiệm độc lập được tiến hành
để tạo ra một đường cong tăng trưởng dẳng nhiệt.
Mặc dù thí nghiệm có thể được thực hiện ở bất kì nhiệt độ trong giới hạn của mức tối thiểu và tối đa nhiệt độ
C.perfringens, sinh vật này có thể tăng trưởng ở mức tương đối nhanh ở nhiệt độ lựa chọn trong nghiên cứu này
Mẫu đã được biến đổi giữa 2 quá trình ủ ở 2 phạm vi nhiệt độ (30-45
o
C hoặc 45-36
o
C) của vi khuẩn
C.perfrigens trong thịt bò đã nấu chín
3. Xác định nồng độ tế bào C. perfringens:
Dùng búa cao su đập miếng thịt thành những miếng nhỏ. Sau đó mẫu được cho vào máy MiniMix Stomacher trộn
đều trong vòng 12 phút để đảm bảo tạo sự đồng nhất cho mẫu thịt
Sau khi đồng nhất mẫu, lấy một lương nhỏ (0,1-0,5ml) của phần chất lỏng đem pha loãng với 0,1% vô trùng
peptone nước và được cấy trong một đĩa SFP thạch
Sau khi cấy, cho vào mỗi đĩa SFP 10ml dung dịch vừa chuẩn bị
Khi lớp thạch SFP cứng lại, các đĩa sẽ được đặt trong một buồng yếm khí có CO
2
, N
2
, H
2
(85%:10%:5%) và
ủ ở 37
0
C trong vòng 24-48h. Nông độ lạc khuẩn xác định sẽ được tính và ghi lại sau khi ủ.
4. Phân tích các đường cong tăng trưởng
Số lượng đĩa C. perfringens sẽ được chuyển thành dạng log
10
giá trị và phân tích hồi quy phi tuyến tính để số liệu

tăng trưởng phù hợp với mô hình Gompertz( phương trình 1)
Do sự đồng nhất của các bào tử trong thịt bò mẫu, dựa vào tất cả các số liệu tăng trưởng thực nghiệm độc lập ở
cùng nhiệt độ tăng trưởng cũng tạo ra mô hình Gompertz cho nhiệt độ đó.
Ba mô hình Gompertz cho mỗi điều kiện đẳng nhiệt (30
0
C, 37
0
C, 45
0
C, tương ứng) được tạo ra độc lập trong
nghiên cứu này.
5. Ước tính vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ biến động
Để ước tính sự tăng trưởng của C. perfringens trong thịt bò nấu chín ở điều kiện nhiệt độ dao động, các thời gian
tăng trưởng tương đương được sử dụng tính toán trong phương trình (3):
L
1(t)
= A+( B –A) exp{- exp [- μ
2
- (t
e
– M
2
)]} (3)
Sự phát triển sau khi nhiệt độ thay đổi được sử dụng tính toán trong phương trình (4):
L
2
(t
1
+∆t)= A+( B –A) exp{- exp [- μ
2

– (t
2
+ Δt – M
2
)] (4)
6. Phân tích các lỗi dự đoán
Từ các số liệu tăng trưởng thu được từ thực nghiệm và những sai sót về sự tăng trưởng liên quan đến mô
hình đại diện cho một quá trình tăng trưởng, các lỗi tích lũy và phát triển trong dự đoán sự tăng trưởng của
C. perfringens ở điều kiện nhiệt dao động
Những sai sót trong việc lập đự đoán tốc độ tăng trưởng của C. perfringens có thể được xác định bằng
một phương trình phân tích, được thể hiện:
1. Đường cong tăng trưởng đẳng nhiệt
Số lượng bào tử được cấy ban đầu trung bình là 2,03 log10 ( Cfu/g) với sai số là 0.05%
Tất cả các đường cong tăng trưởng đẳng nhiệt để xây dựng mô hình Gompertz với độ chính xác tương đối cao
Mỗi mô hình Gompertz pha lag (λ ) và tốc độ tăng trưởng ( K) có thể xác định bằng công thức sau
Trong đó : K là tốc độ phát triển,
λ là sự trễ pha
e là cơ số logarit nê pe :
Kết quả và thảo luận

Sự phát triển của vi khuẩn trong giai đoạn đầu ,trong các thí nghiệm ta có thể quan sát được nồng độ vi sinh
vật giảm chậm

Sự suy giảm số lượng tế bào trong pha lag trên đường cong tăng trưởng có thể gây ra vấn đề tính toán khi hồi
quy phi tuyến tính để có được phương trình Gompertz

Nếu nguyên liệu ban đầu được sử dụng , nồng độ tế bào ban đầu ( A ) thấp thì việc tính toán để ước tính sự
tăng trưởng của vi khuẩn theo mô hình bị sai sót

Vì vậy thực tế trong nghiên cứu này bỏ qua sự suy giảm nguyên liệu ban đầu

•
Để kiểm tra giả thuyết EGT dưới các điều kiện đẳng nhiệt khác nhau, một loạt các thí nghiệm đã được tiến hành với sự thay đổi nhiệt
độ ủ bệnh của các vi khuẩn ở các giai đoạn phát triển khác nhau
•
Tiến hành thí nghiệm ở 3 nhiệt độ 30
o
C , 36
o
C , 45
o
C
•
Hình 3 mô tả sự ảnh hưởng của nhiệt độ trên sự phát triển của C.perfringens trong thịt bò nấu chín. Trong tất cả các thí nghiệm này ,
nhiệt độ ban đầu của các mẫu là 30
o
C và cuối cùng là 45
o
C .
•
Sau đây là kết quả nh toán được theo các phương trình trên.

Theo kết quả thì nhiệt độ càng cao giá trị M càng nhỏ tức là thời gian mà tốc độ phát triển đạt cực đại càng ngắn làm
cho tốc độ tăng K càng lớn