Sử dụng phương pháp phân tử xây dựng kít để chuẩn đoán các loài ký sinh trùng chủ yếu ở Việt Nam

BỘ Y TẾ



BÁO CÁO
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI




Tên đề tài:

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ XÂY DỰNG KIT ĐỂ
CHẨN ĐOÁN CÁC LOÀI KÝ SINH TRÙNG CHỦ YẾU Ở
VIỆT NAM


Chủ nhiệm đề tài




PGS.TS LÊ THANH HÒA
Cơ quan chủ trì đề tài




BỘ Y TẾ

9574



Hà Nội - 2012



1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới, đặc biệt sinh học phân
tử đã có những định hướng phát triển vượt bậc. Một trong những thành tựu lớn là sự
phát triển kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) ứng dụng cho giám định, chẩn
đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh vật, trong đó có ký sinh
trùng (Blair et al., 2005; Chandler, Colitz, 2006). PCR đã trở nên một công cụ
không
thể thiếu được trong công tác giám định, phát hiên sinh vật, kể cả ký sinh trùng gây
bệnh bằng kỹ thuật cao. Dễ làm, có tính nhạy và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một
lượng rất ít khuôn ADN của đối tượng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trưởng nào, PCR
đã có thể cho sản phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật nghiên cứu. Do đó, với lợi
thế như vậy, PCR
đã được ứng dụng rộng rãi trong mọi lĩnh vực, trước hết là chẩn đoán
các loài gây bệnh (Ishmael, Stellato, 2008).
Thành phần loài ký sinh trùng (KST) ở Việt Nam rất phong phú gồm ký sinh trùng
đường ruột, đường hô hấp, thường gây bệnh đối với cộng đồng nghèo (bao gồm: sán lá
gan lớn, nhỏ; sán lá phổi; sán dây và ấu trùng sán lợn) và phân bố đa nhiễm trong cơ

thể, đặc biệt là ở đường ruột, tồn tại ở dạng trưở
ng thành hoặc/và các dạng đang phát
triển khác. Một số loại KST nói trên còn có giai đoạn tồn tại phát triển tại vật chủ trung
gian (cá, ốc, cua, tôm) duy trì nguồn gen ký sinh. Nếu sử dụng các phương pháp truyền
thống là hình thái học hoặc/và huyết thanh học để chẩn đoán xác định, thì sẽ có nhiều
lúc chưa chính xác, đặc biệt có một số KST gây bệnh có biểu hiện bệnh lý tương tự
nhau, có hình thái gần giống nhau hoặc đ
ang ở trong vật chủ trung gian ở dạng ấu trùng
(metacercaria) rất khó phân biệt. Bất kỳ ở đâu, đơn hay đa nhiễm, dạng trứng, ấu trùng
hay trưởng thành, riêng rẻ hay lẫn lộn (ví dụ: trong đường ruột gồm trứng/con trưởng
thành của nhiều loại khác nhau; hay tập hợp metacercaria trong cá/cua/tôm), KST đều
cung cấp nguồn gen đích làm khuôn cho phản ứng phát hiện gen đặc hiệu của từng loài.
Multiplex-PCR, một loại hình chẩn đ
oán phân tử đa gen và đa mồi, ứng dụng phát hiện
cùng lúc gen đặc hiệu của nhiều loài, sẽ cho kết quả chính xác từng loài KST gây bệnh
để có hướng chẩn đoán nhanh nhất, tiết kiệm nhất, điều trị và phòng chống đúng đắn
nhất.


2
Đề tài cấp Bộ: “Sử dụng phương pháp phân tử xây dựng kit để chẩn đoán các
loài ký sinh trùng chủ yếu ở Việt Nam”, đã được Bộ Y tế phê duyệt, cấp kinh phí, cho
thực hiện trong giai đoạn 2010 – 2011, với một số chủ đích như sau:
Mục tiêu chung của đề tài: Có được các bộ kit chẩn đoán đa gen đối với một số
ký sinh trùng thường gặp.
Cụ th
ể:
1. Xây dựng được kit sinh học phân tử chẩn đoán và phân biệt đối với ký sinh
trùng thường gặp trên người ở Việt Nam là sán lá gan lớn (fascioliasis), sán lá gan nhỏ
(clonorchiasis), sán lá ruột nhỏ (haplorchiasis), sán lá phổi (paragonimiasis), sán dây và

ấu trùng sán lợn (taeniasis).
2. Trên cơ sở đã chuẩn hoá bộ kit, có thể tiến hành ứng dụng chẩn đoán trên một
số bệnh nhân ở Việt Nam diện hẹp trước khi phát triển ứng dụng qui mô lớn.
Từ mụ
c tiêu như vậy, đề tài đã đưa ra một số luận giải cơ bản cho quá trình
thực hiện thiết kế phương pháp và xây dựng kit multiplex-PCR, như sau:
i) Phải có mồi đặc hiệu và nhạy
cho mỗi một vùng gen đối tượng, do vậy, phải
có trình tự nucleotide của vùng gen đó;
ii) Phải khoanh nhóm đối tượng
chẩn đoán, trước hết là nhóm xuất hiện trong
đường ruột (trứng/KST trưởng thành của các loài sán lá sán dây), đường hô hấp (sán lá
phổi), metacercaria trong cá/cua, thậm chí ấu trùng trong ốc/vật chủ trung gian;
iii) Kit phải có độ đặc hiệu và độ nhạy
cao và cần thử nghiệm đánh giá;
iv) Mẫu bệnh phẩm sử dụng phải là loại lấy từ vật chất thu thập dễ dàng
của
đối tượng (ví dụ: sán trưởng thành, trứng, phân, đờm, metacercaria trong cá, cua;
cercaria trong vật chủ trung gian);
v) Kit phải được kiểm nghiệm
bằng phương pháp giả nghiệm từ các nguồn
khuôn đã xác định trộn lẫn với nhau (in vitro) và có thể được thử nghiệm
thực tế (in
vivo), nếu có điều kiện;
vi) Xây dựng qui trình
bảo quản, sử dụng đáp ứng yêu cầu;
vii) Triển khai ứng dụng chẩn đoán
trên bệnh phẩm của bệnh nhân ở qui mô
hẹp, nếu có điều kiện thực hiện.
Trong điều kiện thực tế thực hiện đề tài (2010-2011), chúng tôi đã xây dựng

được các kit multiplex-PCR chẩn đoán ký sinh trùng đăng ký trong đề tài: 2 loài sán lá
gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), 2 loài sán lá gan lớn (Fasciola


3
gigantica; F. hepatica), 2 loài sán lá phổi (Paragonimus heterotremus; P. ohirai), 2
loài sán lá ruột nhỏ (Haplorchis taichui; H. pumilio), 3 loài sán dây/ấu trùng sán lợn
(Taenia solium; T. saginata; T. asiatica). Gen đích chủ yếu tập trung vào chỉ thị phân
tử hệ gen ty thể
, dựa vào dữ liệu nucleotide của toàn bộ hệ gen ty thể sán lá gan nhỏ
(Clonorchis; Opisthorchis); của sán lá gan lớn Fasciola spp; của sán lá ruột nhỏ
Haplorchis spp; và của sán lá phổi Paragonimus spp.
Cơ sở dữ liệu gen/hệ gen ty thể có thể tìm thấy tại GOBASE (xem:
/>) (O’Brien et al., 2009), bao gồm nhiều dữ liệu do
chúng tôi và đồng nghiệp xây dựng (Le et al., 2002; Hu, Gasser, 2006). Mặt khác,
nhiều dữ liệu gen/hệ gen ty thể được cập nhật trong quá trình thực hiện đề tài của sán lá
ruột nhỏ Haplorchis spp (Le et al., chưa công bố; De and Le, 2011). Sử dụng chỉ thị
phân tử ty thể từ nguồn dữ liệu này, các bộ kit đã được nghiên cứu và thực hiện.
Tám bộ kit
đã được xây dựng, đó là:
i) Bộ kit số 1, ký hiệu bộ kit A(Cs+Ov), 2 loài: Giữa sán lá gan nhỏ Clonorchis
sinensis và Opisthorchis viverrini;
ii) Bộ kit số 2, ký hiệu bộ kit B(Fg+Fh), 2 loài: Giữa sán lá gan lớn Fasciola
hepatica và F. gigantica;
iii) Bộ kit số 3, ký hiệu bộ kit C(Ht+Hp), 2 loài: Giữa sán lá ruột nhỏ Haplorchis
taichui và H. pumilio;
iv) Bộ kit số 4, ký hiệu bộ kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg), 4 loài: Giữa sán lá gan nhỏ
C. sinensis và
O. viverrini và sán lá gan lớn F. gigantica và F. hepatica;
v) Bộ kit số 5, ký hiệu bộ kit AC(Cs+Ov+Hp+Ht), 4 loài: Giữa sán lá gan nhỏ

C. sinensis và O. viverrini và sán lá ruột nhỏ H. pumilio và H. taichui;
vi) Bộ kit số 6, ký hiệu bộ kit BC(Fh+Fg+Ht+Hp), 4 loài: Giữa sán lá gan lớn F.
hepatica và F. gigantica và sán lá ruột nhỏ H. pumilio và H. taichui;
vii) Bộ kit số 7, ký hiệu bộ kit D(Tso+Tsa +Tas), 3 loài: Giữa sán dây T. solium
và T. saginata và T. asiatica;
viii) Bộ kit số 8, ký hiệu bộ kit
E(Ph+Po), 2 loài: Giữa sán lá phổi P. heterotremus
và P. ohirai.
Mỗi một bộ kit, bao gồm 100 phản ứng đã được sản xuất và trình bày bao gói
theo yêu cầu của đề tài.


4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ĐÁNH GIÁ VỀ BỆNH KÍ SINH TRÙNG THƯỜNG GẶP THUỘC ĐỐI TƯỢNG
NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
1.1.1 Đánh giá tình hình chung về bệnh kí sinh trùng
Hiện nay, đã có hàng trăm loại bệnh KST, trước hết là các bệnh do sán lá
(trematode), sán dây (cestode), giun tròn (nematode) và KST đơn bào (protozoa) ở
người hoặc truyền từ động vật sang người rồi gây bệnh (zoonotic infection), đã được
nghiên cứu sâu sắc ở mọi góc độ nguyên nhân, sinh thái học, hình thái học, đặ
c tính
truyền lây, cơ chế sinh bệnh, vòng đời, điều trị, phòng chống, chẩn đoán ký sinh trùng
học, huyết thanh học, gen học và mối quan hệ phả hệ thành phần loài (McCarthya,
Moore, 2000; Macpherson, 2005; Graczyk, Fried, 2007; Littlewood, 2008; De Lellis et
al., 2008). Nhiều loại bệnh KST mới xuất hiện hoặc tái xuất hiện ((re)-emerging
parasitic infections) ở nhiều quốc gia, trong đó có nhiều loại rất nguy hiểm, kháng thuốc
nhanh và mức độ kháng thuốc cao đã trở thành mối quan tâm hàng đầu của y t

ế thế giới.
Sự bùng nổ/tái xuất/đa nhiễm/kháng thuốc/đột biến của nhiều loài KST gây bệnh đã đặt
ra yêu cầu cần có nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác, kinh tế và tiết
kiệm thời gian (Hotez et al., 2008; King, Bertino, 2008).
Một số đối tượng KST thường gặp gây bệnh ở Việt Nam gồm các loài truyền lây
từ động vật sang người qua thức ăn (foodborne trematodes/cestodes), là đối tượng để

xây dựng kit chẩn đoán multiplex-PCR thuộc phạm vi đề tài này. Hơn nữa, các đối
tượng nghiên cứu ở đây thuộc loại tồn tại trong thức ăn (cá, cua, tôm) và có nhiều dạng
sinh trưởng tồn tại trong ruột (trứng, sán trưởng thành), rất thuận lợi cho việc phát hiện
phân tử bằng kit PCR đa mồi.
1.1.2 Một số bệnh thường gặp là đối tượng nghiên cứu của đề tài

1.1.2.1 Sán lá gan nhỏ và bệnh sán lá gan nhỏ
Sán lá gan nhỏ làm đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm 2 loài. Clonorchis
sinensis phân bố ở Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và phía
Đông nước Nga. Opisthorchis viverrini phân bố ở Đông Nam Châu Á, gặp trên người
Thái Lan, Lào, Malaysia, Việt Nam, Campuchia và Trung Quốc. Bệnh thường gặp nhất
và có vai trò dịch tễ học quan trong nhất của châu Á và thế giới là bệnh sán lá gan nhỏ


5
(clonorchiasis/opisthorchiasis) do C.sinensis và Opisthorchis viverrini gây ra. Một điều
đặc biệt hết sức lưu ý là O. viverrini và C. sinensis được coi là yếu tố tham gia tích cực
trong cơ chế tiến triển gây ung thư biểu mô túi mật (cholangiocarcinoma) với gần như
100% tử vong ở người (Sripa, 2007). Xu hướng phân bố của cả hai loài này là ở châu Á,
trong đó C. sinensis là ở vùng Đông – Bắc và O. viverrini ở vùng Đông – Nam của châu
Á. Việt Nam là vùng địa lý có sự tồ
n tại cả hai loài, cho đến nay, C. sinensis phát hiện ở
các tỉnh phía Bắc đến Nghệ An; O. viverrini phát hiện ở các tỉnh miền trung và phía

Nam từ Quảng Trị, Thừa Thiên – Huế đến Phú Yên, Đắc Lắc (Le et al., 2006; Nguyễn
Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2006). Vùng giao nhau có thể là các tỉnh Quảng Bình, Quảng
Trị, Thừa Thiên Huế, đó cũng là việc cần xác định thêm cho chính xác (Le et al., 2006),
điều này càng có ý nghĩa khi sử dụng kit multiplex-PCR để sàng lọc nguồn bệ
nh trên
đối tượng là người và cá tại các địa bàn có thể có giao nhau của 2 loài (Lê Thanh Hoà
và cs, 2006).







Hình 1.1. Sán lá gan nhỏ C. sinensis trưởng thành (A) và trứng sán C. sinensis trên tiêu bản thu nhận
bằng phương pháp Kato-Katz (B).









Hình 1.2. Sán lá gan nhỏ O. viverrini trưởng thành (A) và trứng sán O. viverrini trên tiêu bản thu nhận
bằng phương pháp Kato-Katz (B).

Sán lá gan nhỏ C. sinensis có dạng hình lá, thân dẹt, màu đỏ nhạt, dài từ 10 – 20
mm, chiều ngang từ 2 – 4 mm, có hai mồm hút. Mồm hút phía trước có đường kính

A
B
A
B

A
B
A
B


6
khoảng 600 µm, đường kính của mồm hút phía sau khoảng 500 µm. Ống tiêu hoá chạy
dọc hai bên thân. Lỗ sinh dục ở gần mồm hút vùng giữa. Tinh hoàn chia nhánh gần
chiếm hết phía thân sau. Buồng trứng ở khoảng giữa thân, tử cung là một ống ngoằn
nghèo gấp khúc (Hình 1.1A). Trứng sán C. sinensis thường có hình bầu dục hoặc hình
bóng đèn điện, màu vàng nâu, kích thước trung bình khoảng (27 x 15) µm (Hình 1.1B).
Số lượng trứng C. sinensis đẻ hàng ngày phụ thuộc vào vậ
t chủ và thời gian nhiễm.
Sán lá gan nhỏ O. viverrni trưởng thành còn sống màu trong suốt và có màu hồng
hoặc màu đỏ, đầu phía trước nhỏ có hấp khẩu miệng nằm gần tận cùng, một hấp khẩu
bụng hình chén nằm ở mặt bụng, khoảng 1/5 về phía trước cơ thể. Kích thước trung
bình của sán trưởng thành dài 7,4 mm (5,5 – 9,55 mm) và rộng 1,47 mm (0,77 – 1,65
mm) (Hình 1.2A). Trứng của sán lá gan nhỏ O. viverrini và C. sinensis rất giống nhau,
khó phân biệt về hình thái. Trứng hình oval hay bóng
đèn, màu vàng nhạt, có nắp nhô
lên, kích thước trung bình (27 – 15 µm) ( Hình 1.2B).
1.1.2.2. Sán lá gan lớn và bệnh sán lá gan lớn
Bệnh sán lá gan lớn là bệnh chung của người và gia súc chủ yếu do hai loài

Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 và Fasciola gigantica Cobbold, 1856 (thuộc họ
Fasciolidae) gây nên. Fasciola spp. gây bệnh chủ yếu trên động vật ăn cỏ trâu, bò, cừu,
dê… tuy nhiên Fasciola spp. vẫn thích ứng và gây bệnh cho người (Kumar, 2001; Lofty
et al., 2008; Nguyen et al., 2009). Sự phân bố của hai loài F. hepatica và F. gigantica
khác nhau trên thế giới, loài F. hepatica gây bệnh ở các vùng có nhiệt độ ôn đớ
i trong
khi F. gigantica có mặt rộng rãi ở các châu lục, đặc biệt ở vùng có khí hậu nhiệt đới
(Mas-Coma et al., 2005; 2009). Sự phân bố theo vùng như thế này không phải là tuyệt
đối, vì cả hai loài F. hepatica và F. gigantica đều cùng tồn tại ở một số nước thuộc
vùng Trung và Đông Nam Á như: Pakistan, Iran, Nhật Bản và Trung Quốc (Kumar,
2001; Ashrafi et al., 2006; Mas-Coma et al., 2009). Những nghiên cứu gần đây ở Nhật
Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Hàn Quốc, Iran khẳng định sán lá gan lớ
n thuộc loài
lưỡng bội, tam bội và đa bội (diploid, triploid và “mixoploid”), nhiều khi tồn tại ở dạng
hình thái học trung gian (intermediate form) và hầu như thuộc loại khuyết sản (Itagaki
et al., 2005; Xuan et al., 2005; Le et al., 2007; 2008; Nguyen et al., 2009; Choe et al.,
2011). Tại Việt Nam, trường hợp người bị nhiễm sán lá gan lớn được ghi nhận càng
ngày càng nhiều bằng phương pháp chẩn đoán hình thái học, huyết thanh học và sinh
học phân tử (Tran et al., 2001), trong đó có một số trường hợp có sự di chuyển hế
t sức


7
đặc biệt của chúng ở người (Xuan et al., 2005; Le et al., 2007). Nghiên cứu di truyền
học hệ gen ty thể và hệ gen nhân cho thấy có sự lẫn tạp di truyền và lai tự nhiên giữa F.
hepatica và F. gigantica trong quần thể sán lá gan lớn ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn
Quốc và Việt Nam (Agatsuma et al., 2000; Itagaki et al., 2011; Le et al., 2008). Do vậy,
việc thẩm định loài F. hepatica và F. gigantica, đặc biệt đối với các mẫu sán có hình
dạng trung gian nhất thiết cần sử dụ
ng phương pháp sinh học phân tử (Huang et al.,

2004; Itagaki et al., 2005; Le et al., 2008; Mas-Coma et al., 2009). Toàn bộ hệ gen ty
thể của F. hepatica và F. gigantica đã được giải mã (Le et al., 2001; 2002) cũng như rất
nhiều chuỗi ITS-2 trong Ngân hàng gen cung cấp dữ liệu quan trọng và chính xác để
thẩm định loài của quần thể Fasciola spp (xem Le et al., 2008).







Hình 1.3. Sán lá gan lớn F. hepatica trưởng thành (A), F. gigantica trưởng thành (B) và trứng sán
Fasciola spp trên tiêu bản thu nhận bằng phương pháp Kato-Katz (B).

Sán lá gan lớn trưởng thành hình chiếc lá, thân dẹt, bờ mỏng, kích thước 20-30 x
10-12 mm, màu trắng hồng hoặc xám đỏ; ở người, sán ký sinh trong đường mật, bất
thường có thể ký sinh lạc chỗ như trong cơ bắp, dưới da, phúc mạc (Le et al., 2007;
2008) (Hình 1.3A,B). Sán lá gan trưởng thành tồn tại 2 thể: nhị bội (diploid) và tam bội
(triloid), đẻ trứng theo đường mật xuống ruột và ra ngoài theo phân. Trứng có dạng hình
oval thường chụm lại với nhau (Hình 1.3C). Trứng xuống nước, nở
ra ấu trùng lông
(miracidium), khi nhiệt độ thích hợp (15 - 25°C), trong vòng 9 - 21 ngày. Miracidium
tiếp tục ký sinh trong ốc thuộc giống Lymnaea và phát triển thành ấu trùng đuôi
(cercaria), sau đó cercaria rời khỏi ốc và bám vào các thực vật thủy sinh để tạo nang
trùng (metacercaria) hoặc bơi tự do trong nước (khoảng 1 giờ). Người hoặc trâu bò ăn
phải thực vật thủy sinh hoặc uống nước lã có ấu trùng này sẽ bị nhiễm sán lá gan lớn
(Mas-Coma et al., 2005; 2009; Ashrafi et al., 2006). Metacercaria vào vật chủ
chính qua
đường miệng, thoát kén, xuyên thành ruột, xuất hiện trong ổ bụng, tiếp tục xuyên vào
gan, đến gan vào ngày thứ 6 sau khi thoát kén, sau đó chúng di hành đến ký sinh trong

AB CAB C


8
đường mật, trưởng thành đẻ trứng và tiếp tục vòng đời. Tuổi thọ của sán lá gan lớn ở
người từ 9 - 13,5 năm (Kumar, 2001). Do vòng đời với nhiều giai đoạn phát triển tại
nhiều vật chủ khác nhau, việc chẩn đoán sinh học phân tử phát hiện và phân biệt
Fasciola spp là thuận lợi (Mas-Coma et al., 2005; 2009).
1.1.2.3. Sán lá ruột nhỏ và bệnh sán lá ruột nhỏ
Sán lá ruột nhỏ phần lớn truyền qua cá phổ biến
ở nhiều nước trên thế giới, bao
gồm 69 loài sán lá ruột nhỏ được biết là ký sinh ở người, đáng chú ý nhất là sán lá ruột
truyền qua cá chủ yếu thuộc họ Heterophyidae và Echinostomatidae (WHO/WR, 2002).
Trong họ Heterophyidae các loài trong giống Haplorchis được đặc biệt quan tâm. Đối
với Haplorchis spp, trong những năm gần đây, về dịch tễ học ở các nước châu Á có số
lượng người nhiễm ngày càng tăng, do sự phân bố rộng trên thế
giới và phương thức
truyền lây qua cá nước ngọt, một nguồn protein chủ yếu ở các nước đang phát triển. Có
5 loài thuộc giống Haplorchis được thông báo gây bệnh trên người, bao gồm H. taichui,
H. pumilio, H. yokogawai, H. pleurolophocerca, and H. vanissimus. Haplorchis pumilio
Loss, 1986 được phát hiện ký sinh trên người ở Đài Loan, Trung Quốc, Philippines, Ai
Cập, Thái Lan, Australia, Việt Nam (De, Le, 2011) (Hình 1.4A). Haplorchis taichui
Nishigori, 1924 được phát hiện ký sinh trên người ở Philippines, Thái Lan, Lào, Đài
Loan, Bangladesh, Việt Nam (Dung et al., 2007) (De, Le, 2011) (Hình 1.4B).
Haplorchis yokogawai Katsuta, 1932 được phát hiện ký sinh trên người ở Philippines,
Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan.

Hình 1.4. Sán lá ruột nhỏ trưởng thành và trứng của H. pumilio (A); Sán trưởng thành và trứng của H.
taichui (B).

Haplochis spp. là loài sán lá ruột nhỏ để hoàn thành vòng đời chúng phải trải qua
nhiều loài vật chủ phức tạp (vật chủ chính, vật chủ trung gian) nên thường ít được quan
tâm (kể cả y tế, thú y và thủy sản). Sán trưởng thành ký sinh ở ruột, đẻ trứng và trứng
theo phân ra ngoài, rơi vào môi trường nước, trứng nở ra ấu trùng lông chui vào ốc để
A
B
A
B


9
phát triển thành ấu trùng đuôi. Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cá nước ngọt, rụng đuôi
phát triển thành nang trùng rồi ký sinh ở trong thịt hoặc mang của cá (mắt thường khó
nhìn thấy). Người hoặc động vật ăn phải cá có ấu trùng nang chưa được nấu chín, ấu
trùng này chui vào dạ dày, đến ruột phát triển thành sán trưởng thành và ký sinh tại đây.
1.1.2.4. Sán dây và ấu trùng sán lợn
Dịch tễ, bệnh học, chẩn đoán và đi
ều trị sán dây và ấu trùng sán lợn trên toàn thế
giới đã được nghiên cứu khá đầy đủ (Hoberg, 2006). Họ sán dây Taeniidae Ludwig,
1886 có rất nhiều loại, gồm các loài thuộc giống Taenia; giống Multiceps; giống
Echinococcus. Trong đó, quan trọng nhất là giống Taenia với sán dây lợn T. solium và
ấu trùng sán dây lợn (cysticercosis), sán dây bò T. saginata và sán dây người T. asiatica
(Willingham, Engels, 2006; Eom, 2006). Taenia có người là vật chủ chính duy nhất và
vật chủ trung gian là trâu bò (T. saginata) và lợn (T. solium và T. asiatica) là một trong
nh

ững bệnh ký sinh trùng từ động vật truyền sang người (parasitic zoonosis). Hiện nay
loài T. solium gây bệnh ấu trùng sán lợn ở người, gọi là bệnh ấu trùng sán lợn
(cysticercosis) được coi là bệnh nguy hiểm nhất do sán dây gây ra (Willingham, Engels,
2006; Willms, 2008). Trong thời gian rất lâu, loài T. saginata và T. asiatica chưa được
phân biệt thành hai loài riêng biệt và T. asiatica được coi là dưới loài của T. saginata
với tên gọi là T. saginata asiatica (Eom, 2006). Trong 5 năm trở lại đây, loài sán dây T.
asiatica được chính thức phân loại là sán dây gây bệnh trên ng
ười, tuy nhiên vòng đời
và một số đặc tính sinh học của loài mới này vẫn đang còn nghiên cứu (Eom, 2006).
Các phương pháp SHPT đã được áp dụng trong việc giải mã hệ gen ty thể và nhiều hệ
gen nhân tế bào và những chỉ thị phân tử có giá trị trong chẩn đoán, phân loại và nghiên
cứu di truyền quần thể và thẩm định các loài đã có và loài mới phát hiện (Le et al.,
2002; Yamasaki et al., 2006).
a) Sán dây bò Taenia saginata: T. saginata dài khoảng 2 – 12 m, gồm 1000 –
2000 đốt, đầu không có chùy và không có vòng móc, có 4 giác bám, tử cung chia 12 –
32 nhánh. Nang ấ
u trùng sán dây bò hình bầu dục, màu hồng, kích thước 0,6 – 0,8 x 0,3
– 0,5 cm chứa dịch màu đỏ và đầu sán với 4 giác bám không có vòng móc (Hình 1.5).
Nang ấu trùng sán dây không ký sinh ở người (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010).
b) Sán dây lợn Taenia solium: Sán dây lợn T. solium dài khoảng 4 – 8 m, có
khoảng 900 đốt gồm 3 phần (phần đầu, phần cổ là nơi sinh ra đốt non, phần thân chứa


10
trứng và bộ phận sinh dục). Vật chủ trung gian là lợn (ký sinh chủ yếu ở cơ và não)
(Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010).
c) Sán dây châu Á Taenia asiatica: T. asiatica dài khoảng 3,9 m (1,35 – 8,21 m)
gồm 600 đốt (186 – 1148 đốt). Đầu hình cầu, kích thước 0,959 mm (0,525 – 1,975 mm)
x 0,790 mm (225 – 1800 mm), có mỏ chày (lồi hoặc lõm) và có 2 vòng móc nhỏ bao
quanh, có 4 giác bám. Trứng sán dây có hình cầu, kích thước 20 – 50 micromet, có vỏ

dày, màu sẫm, nhân có vết móc (Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010).
d) Ấu trùng sán lợn: Bệnh ấu trùng sán lợn (cysticercosis) ở người do ăn phải
trứng sán dây lợ
n, ấu trùng chủ yếu ký sinh ở cơ vân, cơ tim, trong não, trong mắt, dưới
da. Nang ấu trùng hình bầu dục, màu trắng đục, chứa dịch trắng đục và đầu sán với 4
giác bám và 2 vòng móc. Ấu trùng sán lợn ở lợn có kích thước 0,3 mm sau gây nhiễm 6
ngày; kích thước 6 – 9 mm sau gây nhiễm 60 – 70 ngày; kích thước 8 – 15 mm sau gây
nhiễm 177 – 325 ngày. Nang ấu trùng sán lợn khi ký sinh ở người có kích thước to hơn
khi ký sinh ở lợn, nang dưới da kích thước từ 0,5 x 1,5 – 2 mm, có nang sau hàng chục
năm phát triển tới kích thước 10 – 15 cm và chứa 50 ml dị
ch (Nguyễn Văn Đề, Lê
Thanh Hòa, 2010).
Bệnh sán dây/ấu trùng sán lợn phân bố rải rác nhiều nước trên thế giới với
khoảng 100 triệu người nhiễm bệnh, bắt đầu tăng mạnh vào những năm 1980. Một số
quốc gia ở châu Âu có số ca mắc cao là Tây Ban Nha, Mexico.





Hình 1.5. Sán dây trưởng thành (A) và trứng của sán dây bò T. saginata (B).
Hiện nay, tại Việt Nam, theo báo cáo từ các nhà khoa học đã phát hiện có ít nhất
51 tỉnh, thành có ca bệnh sán dây/ấu trùng sán lợn, bao gồm các tỉnh Lai Châu, Lào Cai,
Hà Giang, Sơn La, Yên Bái, Bắc Cạn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Lạng Sơn,
Tuyên Quang, Hòa Bình, Hà Tây, Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên, Bắc Giang, Ninh Bình,
Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ
An, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Đăk Lăk, Khánh Hòa,
Lâm Đồng, Bình Thuận, Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Bình Dương, thành phố Hồ
AB

11
Chí Minh, Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Vĩnh Long, Đồng Tháp, An Giang,
Cần Thơ, Sóc Trăng, Cà Mau, Kiên Giang. Điều tra cộng đồng tại Bắc Ninh, tỷ lệ
nhiễm sán dây 12% và nhiễm ấu trùng sán lợn 5,7% (Nguyễn Văn Đề và cs, 2006).
Sán dây trưởng thành sống ký sinh trong ruột người. Sán lưỡng tính và những đốt
sán ra ngoài môi trường bị thối rữa giải phóng trứng. Trâu, bò, lợn ăn phải trứng và đốt
sán phát tán trong môi trường hoặc ăn phân người có sán, trứng vào dạ dày và ruột (c
ủa
trâu, bò, lợn), nở ra ấu trùng; chui qua thành ống tiêu hóa vào máu và tới các cơ vân tạo
kén ở đó, gọi là “bò gạo”, “lợn gạo”. Người ăn phải thịt “bò gạo”, “lợn gạo” còn sống
thì ấu trùng sán vào ruột nở ra sán dây trưởng thành. Lúc mới nở sán dây chỉ có đầu và
một đoạn cổ. Sán lớn lên và phát triển bằng cách nẩy chồi, sinh đốt mới từ đốt cổ và sán
dài dần ra (Hình 1.5) (Nguyễn V
ăn Đề, Lê Thanh Hòa, 2010).
1.1.2.5. Sán lá phổi và bệnh sán lá phổi
Bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) là bệnh ký sinh trùng do giống sán lá phổi
Paragonimus gây nên, có tới trên 50 loài thuộc giống Paragonimus (Digenea:
Paragonimidae) đã được mô tả, trong đó hơn 10 loài ký sinh gây bệnh ở người, đó là các
loài P. westermani, P. skrjabini, P. heterotremus, P. ohirai và một số loài khác (Blair et
al., 1999; 2005). Bệnh thường xảy ra ở nơi có tập quán ăn các món ăn có cua, tôm sống
hoặc cua hoặc tôm sống làm thuốc chữa bệnh. Bệnh
được phân bố chủ yếu ở Châu Á,
Châu Phi, Nam Mỹ. Trung Quốc là nước ở Châu Á có nhiều triệu người mắc bệnh và
nhiều loài gây bệnh nhất thế giới, ngoài ra Paragonimus còn được phát hiện ở Nhật
Bản, Triều Tiên, Đài Loan, Thái lan, Lào, Philippin, Việt Nam (Liu et al., 2008). Tại
Việt Nam, loài chính thức gây bệnh trên người được giám định là P. heterotremus (Le
et al., 2006), một số loài mới khác cũng được phát hiện gần đây trên vật chủ trung gian
là P. proliferus và P. vietnamensis
sp. nov. (Doanh et al., 2007; 2008), đặc biệt gần đây

là loài P. westermani phát hiện trên vật chủ trung gian (Doanh et al., 2009). Như vậy
cho đến nay, ít nhất có 4 loài, trong đó có một loài (P. heterotremus) gây bệnh trên
người tại Việt Nam. Do đặc điểm địa lý, Việt Nam có thể còn có một số loài gây bệnh
trên người khác cần phát hiện, kể cả P. westermani và P. ohirai (Doanh et al., 2009).
Sán lá phổi trưởng thành dài 8 – 16 mm, chiều ngang 4 – 8 mm, dày 3 – 4 mm,
có màu nâu đỏ, có thể thấy bằng mắt thường và rất giố
ng như một hạt cà phê (Hình 1.5).
Trứng sán rất nhỏ và có nắp, màu sẫm, dài từ 80 – 100 cm, chiều ngang từ 50 – 67 cm,
chỉ phát hiện được dưới kính hiển vi (Hình 1.5).


12






Hình 1.6. Sán lá phổi trưởng thành (A); và trứng của sán (B) (Nguồn: CDC).

Sán lá phổi trưởng thành thông thường khu trú ở phổi của ký chủ ký sinh cuối
cùng là các loài có vú, trong đó có người, chủ yếu là ở các nước châu Á, một số nước
Nam Mỹ và vài nước châu Phi. Ước tính có khoảng 20 triệu người bị nhiễm sán phổi
(Toscano et al., 1995) ngày nay có thể trên 30 triệu (Blair et al., 2005). Loài quan trọng
nhất gây nhiễm hàng chục triệu người ở châu Á là P. westermani Kerbert, 1878, tiếp
đến là P. skrjabini Chen, 1959 và P. heterotremus Chen and Hsia, 1964. Cho đến nay,
có nhiều các bài viết đề cập đến sán lá ph
ổi với nhiều khía cạnh khác nhau của sán phổi
(Paragonimus) và bệnh sán phổi (paragonimiasis), do tầm quan trọng ngày càng lớn của
loại ký sinh trùng này và có trên 1000 công trình nghiên cứu về sán phổi được công bố

trong hơn 40 năm qua (Blair et al., 2005).
1.2. ĐÁNH GIÁ VỀ MULTIPLEX-PCR
1.2.1. Đặt vấn đề sử dụng multiplex-PCR
Khi KST cùng tồn tại ở một vị trí, một vùng trong cơ quan của cơ thể (ví dụ: cùng
ở trong máu, cùng trong đường/khoang ruột, cùng trong phổi/dịch phổi, cùng trong vật
chủ
trung gian ), thì việc cùng lúc phát hiện và phân biệt nhiều loài gây bệnh mang lại
tính kinh tế và lợi ích cao hơn nhiều so với thực hiện đơn lẻ (Edwards, Gibbs, 1994).
Mỗi một lần làm chẩn đoán sử dụng PCR đơn gen (uniplex-PCR) để phát hiện thì tiêu
tốn thời gian, nguồn khuôn, công sức, tiền của và chưa được kinh tế, hơn nữa làm chậm
tiến độ chẩn đoán. Do vậy, gần đây người ta đã phát triển ứng d
ụng PCR đa mồi phát
hiện đa gen (multiplex-PCR) cùng lúc phát hiện sự có mặt của nhiều sinh vật trong một
nguồn bệnh phẩm, cho dù đó là khuôn DNA tổng số gồm nhiều loại khác nhau, lấy từ
các cá thể khác nhau cần chẩn đoán (Elnifro et al., 2000). Nhiều trường hợp, người ta sử
dụng mồi phát hiện một lúc 6 nguồn khuôn (hexaplex-PCR) (Singh, 2003), hay xác định
7 loài khác nhau (Fernandez et al., 2003), thậm chí có nhiều kit phát hiện đến 14 loại
virus khác nhau với độ nhạy và chính xác cao (Coiras et al., 2004) .


A
B


13
Về nguyên tắc, trong multiplex-PCR đa mồi, cùng lúc các chuỗi gen của cùng
đối tượng gây bệnh hay của các đối tượng khác đều có thể nhân lên được, bằng cách sử
dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu trong một phản ứng. Mỗi một cặp mồi đặc hiệu sẽ tìm
kiếm chính xác vùng gen đích và nhân vùng gen đó để cho sản phẩm. Nếu thiết kế cặp
mồi đặc hiệu cho mỗi vùng gen đích cầ

n chẩn đoán (của cùng loài hay khác loài), nếu
sản phẩm PCR thu được có kích thước chênh lệch nhau, thì khi hiển thị sản phẩm trên
agarose, rất dễ dàng đánh giá phân biệt (Deng et al., 2000; Kaderali, 2007). Nhờ những
lợi thế đó, multiplex-PCR đã chứng tỏ là phương thức chẩn đoán phân tử tiết kiệm thời
gian, công sức, nguồn khuôn từ bệnh phẩm, đa dụng, phát hiện đa bệnh, dễ làm, tiện ích
(Edwards, Gibbs, 1994; Elnifro et al., 2000). Chính vì vậy, ngày nay, chẩn
đoán phân tử
dựa trên cơ sở chuỗi nucleotide (DNA và RNA) bằng kỹ thuật đa mồi PCR (đối với
khuôn là DNA) hoặc/và RT-PCR (đối với khuôn là RNA), kể cả kỹ thuật định lượng
nguồn gen (real-time PCR) đã được ứng dụng, trong đó có phân tích gen/hệ gen, phân
tích đa hình, chẩn đoán và phân tích nhiễm sắc thể, chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh, ký
sinh trùng, nấm, vi khuẩn, độc tố, kháng thuốc, định lượng RNA, đánh giá chất l
ượng
sản phẩm, xác định sinh vật chuyển gen và nhiều mục đích khác (Deng et al., 2000;
Kubista et al., 2006; Ono et al., 2007; De Lellis et al., 2008).
1.2.2. Những điều kiện với multiplex-PCR được lưu ý khi thực hiện đề tài
1.2.2.1. Điều kiện về mồi
Sử dụng trong multiplex-PCR ít nhất có số lượng từ 3 mồi (primer) trở lên, nhiều
trường hợp có vài cặp mồi trong cùng một phản ứng. Do vậy, mồi thiết kế phải tuân thủ

một số điều kiện :
i) Có kích thước khoảng 20 – 24 nucleotide, tỷ lệ (%) GC trong tổng số
nucleotide của mồi chiếm khoảng 40 – 60%, để đảm bảo tính bắt cặp (pairing) với
khuôn được tốt ; nhiệt độ nóng chảy của mồi không quá 65
o
C và chênh lệch không quá
4 – 6
o
C (ví dụ : trong 4 mồi sử dụng, mồi có nhiệt độ chênh lệch thấp nhất cho phép là
55

o
C, mồi cao nhất là không quá 60
o
C.
ii) Các mồi không được bắt cặp với chính chuỗi mồi hoặc với các mồi khác, nếu
trường hợp này xảy ra, mồi sẽ bị vô hiệu hoá, không cho sản phẩm PCR dễ dẫn đến âm
tính giả.
iii) Tính đặc hiệu của mồi phải đạt cao nhất, tránh bắt nhầm khuôn, hoặc nhầm
gen đích, vì nguồn khuôn sử dụng là hỗn hợp, dễ cho dương tính giả; do vậy, sau khi


14
xây dựng, kit multiplex-PCR phải được thử nghiệm/khảo nghiệm giả nghiệm hoặc thực
tế, trên nhiều loại đối tượng khuôn có thể, để đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy cho
phép.
1.2.2.2. Chất lượng nguồn khuôn
Chất lượng khuôn DNA có vai trò quyết định đến kết quả đối với multiplex-
PCR. Nguồn khuôn kém chất lượng cho sản phẩm PCR không đồng nhất, đặc biệt khi
nhân đo
ạn gen có kích thước dài so với đoạn gen có kích thước ngắn. Khi sử dụng cặp
mồi với gen đích cho sản phẩm ngắn hơn, thông thường rất dễ dàng nhận được sản
phẩm so với sản phẩm có kích thước dài hơn; và như vậy, ảnh hưởng đến kết quả.
1.2.2.3. Số lượng nguồn khuôn
Phản ứng multiplex-PCR phụ thuộc vào số lượng nguồn khuôn ban đầu và hiệ
u
ứng kết quả được xác định bằng cách tăng số chu kỳ và điều chỉnh điều kiện phản ứng.
Chuẩn độ số lượng khuôn hay nói cách khác, đánh giá độ nhạy của multiplex-PCR cần
thực hiện cùng với số lượng khuôn tương đương của đối chứng, số chu kỳ phản ứng và
tính toán hiệu ứng ngăn cản của sản phẩm (số DNA sinh ra) sau mỗ
i chu kỳ thực hiện.

Khi vùng gen đích của một đối tượng có thể có đột biến (đứt đoạn hoặc thêm vào) trong
tế bào, thì nguồn khuôn tổng số sẽ chứa 2 hay nhiều vùng đích khác nhau cho
multiplex-PCR. Do vậy, rất có thể hoặc số lượng băng DNA sẽ giảm, hoặc số lượng số
băng ước tính không thay đổi, nhưng hàm lượng DNA của một số băng DNA thay đổi.
1.2.2.4. Số l
ượng chu kỳ multiplex-PCR
Số lượng chu kỳ để thực hiện multiplex-PCR cũng cần xác định để sử dụng, vì
nếu số chu kỳ quá nhiều, số lượng DNA sinh ra sẽ bị bão hoà, do vậy, hàm lượng DNA
của mỗi băng DNA sẽ khác nhau và cũng có trường hợp một số băng DNA biến mất
hoặc một số khác xuất hiện. Một số phản ứng PCR ngược (RT-PCR) đa năng s
ử dụng
nguồn khuôn là RNA (bao gồm RNA của hệ gen hay RNA thông tin), cũng giống như
multiplex-PCR sử dụng nguồn khuôn là DNA, rất phụ thuộc vào số lượng khuôn ban
đầu. Nếu số lượng chu kỳ thực hiện, điều kiện phản ứng không chuẩn hoá, thì kết quả
sinh ra sẽ không phản ánh trung thực thực tế.
1.2.2.5. Hiệu suất multiplex-PCR
Phản ứng multiplex-PCR cùng lúc có thể cho kết quả phát hiện ít nhất 2 gen đích
cần chẩn đoán, do vậy, multiplex-PCR tiết kiệm nguồn khuôn, thời gian, kinh phí, hoá
chất so với sử dụng đơn lẻ từng phản ứng PCR (uniplex-PCR). Tính hiệu quả kinh tế


15
còn ở chỗ chỉ cần một lần tách chiết DNA tổng số làm khuôn, hoặc được sử dụng riêng
rẽ với các cặp mồi tìm kiếm vùng đích trên một khuôn này; hoặc trộn lẫn nhiều khuôn
để thực hiện multiplex-PCR với nhiều cặp mồi tìm kiếm vùng đích trên một hay nhiều
khuôn có trong một phản ứng.
1.2.2.6. Kích ứng và tăng cường multiplex-PCR
Do có nhiều thành phần, đặc biệt là khuôn DNA tổng số có th
ể không được tinh
khiết 100%, lẫn một số vết protein hoặc chuỗi xoắn kép của khuôn có nhiều cấu trúc

bậc hai (secondary structure) làm cản trở mồi bám và hoạt động của enzyme DNA-
polymerase, phản ứng multiplex-PCR cần bổ sung một số thành phần kích ứng. Thành
phần được sử dụng nhiều nhất đối với các loại PCR (kể cả RT-PCR) là DMSO
(Dimethyl sulfoxide) có công thức là (CH
3
)
2
SO. DMSO cho vào phản ứng khoảng 5%
cho thấy chất lượng sản phẩm PCR tăng rất cao, hàm lượng DNA nhiều gấp 1,5 – 2 lần
(Frackman et al., 1998). Điều này rất có ý nghĩa đối với phản ứng đa mồi, đa khuôn như
multiplex-PCR.
1.3. ƯU ĐIỂM CỦA MULTIPLEX-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỀU LOÀI KÝ SINH
TRÙNG
Do đặc tính sinh học, sinh thái, cơ chế bệnh sinh, biểu hiện bệnh lý của các loài
KST gây bệnh ở người có nhiều nét đặc thù riêng và khó ch
ẩn đoán chính xác nguyên
nhân gây bệnh nên việc nghiên cứu kit chẩn đoán đa mồi multiplex-PCR là cần thiết,
mới, độc đáo và khoa học do có độ chính xác ở mức cao, bởi lẽ:
i) Chẩn đoán phân tử, trong đó có multiplex-PCR chỉ cần một lượng khuôn DNA
nhỏ làm khuôn, nếu tinh sạch thì tốt, nếu có bị lẫn tạp (rất dễ xảy ra trong thực tế) thì
multiplex-PCR đặc hiệu vẫn thực hiện được, với
bất kỳ vùng DNA nào trong hệ gen
cùng hay khác loài. Tất cả mọi phương pháp chẩn đoán truyền thống (hình thái học, tổ
chức học, bệnh tích học, huyết thanh học, gây nhiễm thực nghiệm ) đều đòi hỏi đối
tượng chẩn đoán phải tồn tại và sinh trưởng phát triển với số lượng lớn và bắt buộc phải
có biểu hiện các sản phẩm cho các đặc tính kiểu hình.
ii) Ch
ẩn đoán phân tử sử dụng multiplex-PCR cũng dễ dàng thực hiện ngay cả khi
lượng vật chất đối tượng cần chẩn đoán có rất ít, dưới bất kỳ trạng thái sinh trưởng nào
của đối tượng (ví dụ: trứng sán lẫn tạp nhiều loài, ký sinh trùng lẫn với tổ chức vật chủ,

KST trong vật chủ trung gian). Đối tượng cung cấp khuôn DNA chẩn đ
oán còn là thể
cộng sinh/ký sinh trong KST (ví dụ: Wolbachia pipientis cộng sinh trong nematode),


16
hoặc các gen “độc” của các loài gây bệnh chuyển nạp vào vi khuẩn thông qua plasmid,
cũng như các gen kháng thuốc hỗn hợp trong việc phát hiện đa kháng. Đây cũng là các
tính độc đáo có hiệu quả và là lợi thế của chẩn đoán multiplex-PCR mà không có
phương pháp nào đối sánh được.
iii) Chẩn đoán bằng kit đa gen (multiplex PCR) có tính chính xác rất cao, đặc biệt
có thể phân biệt một lúc nhiều loài ký sinh trùng nhiễm phối hợp trong cùng một bệnh
phẩm, thể hiện tính ưu việt trong ứng dụng.
iv) Cho đến nay, ở Việt Nam, phương pháp multiplex-PCR, còn rất ít được ứng
dụng. Một số bệnh ở người, ở động vật lây sang người, bệnh mới nảy sinh ở Việt Nam,
bệnh gây thiệt hại nặng nề đối với sức khoẻ và nền kinh tế mà lẽ ra nếu được chẩn đoán
sớm sẽ tránh
được rủi ro, thiệt hại và lây lan. Áp dụng chẩn đoán multiplex-PCR ở Viêt
Nam trên một số bệnh giun sán thường gặp và tiếp tục thực hiện trên các loại hình bệnh
tật khác ở người và động vật truyền sang người sẽ là loại hình mới ứng dụng trong thực
tế.
Từ những năm 2000 đến nay, nhiều nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng bằng
hình thái học kết hợp thẩm định bằng sinh họ
c phân tử và phát triển kit chẩn đoán để
xác định một số loài sán lá, sán dây chủ yếu ở Việt Nam. Kết quả bước đầu đã có hàng
chục công trình nghiệm thu và hàng trăm bài báo đăng tải trên tạp chí, tuy nhiên, vẫn
còn rất ít các kit multiplex-PCR xây dựng và ứng dụng. Một số kit chẩn đoán virus và vi
khuẩn đã có kết quả thành công nhất định, trong đó cũng có những phát triển kit chẩn
đoán phân biệt ký sinh trùng (Le et al., 2006).
Đối với KST, cho đế

n nay đã có hàng chục phương pháp và kit chẩn đoán
multiplex-PCR sử dụng phát hiện nhiều loài gây bệnh. Multiplex-PCR đã được xây
dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loài sán lá sán dây (platyhelminth), bao
gồm sán lá gan nhỏ C. sinensis and O. viverrini (Le et al., 2006); sán lá gan lớn F.
hepatica từ ốc vật chủ trung gian (Magalhães et al., 2004; 2008); sán lá phổi
Paragonimus spp (Sugiyama et al., 2006; Le et al., 2006); sán dây T. saginata, T.
solium, T. asiatica và ấu trùng sán lợn (González et al., 2004; Yamasaki et al., 2004;
Trachsel et al., 2007); sán chó Echinococcus multilocularis (Davidson et al., 2009).
Multiplex-PCR cũng được sử dụng phát hiện và phân biệt các loại giun tròn
(nematode) trong đó có Trichinella và nematode đường ruột (Zarlenga et al., 1999;
2001a,b); phân biệt Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Oesophagostomum


17
bifurcum (Verweij et al., 2007) hoặc các loài Oesophagostomum spp ở lợn (Lin et al.,
2008); phát hiện và phân biệt Brugia malayi và Wuchereria bancrofti với nhau (Mishra
et al., 2007) và với ký sinh trùng sốt rét (Rao et al., 2008); hay các loài giun tròn khác
cũng được phát hiện bằng multiplex-PCR trong đó có Toxoplasma gondii (Ajzenberg et
al., 2005; Nowakowska et al., 2006).
Multiplex-PCR tỏ ra sử dụng rất hữu hiệu chẩn đoán phân biệt nhiều nhóm ký
sinh trùng đơn bào (protozoa), chủ yếu tập trung vào nhóm ký sinh trùng đơn bào
đường ruột như Cryptosporidium và Giardia (Guy et al., 2003); Cyclospora và Eimeria
(Fernandez et al., 2003); đặc biệt là
ký sinh trùng đơn bào máu, chủ yếu tập trung ký
sinh trùng sốt rét Plasmodium spp, trước hết là phân biệt 4 loài gây bệnh chủ yếu ở
người đó là P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale, theo từng nhóm hoặc cả 4
loại từ máu (Veiga et al., 2006; Rao et al., 2008) hoặc từ vector là muỗi Anopheles
(Lardeux et al., 2008). Một loại KST khác thường có trong máu là Leishmania spp cũng
được chẩn đoán phân biệt bằng multiplex-PCR từ máu, dưới da hay từ nguồn truyền lây
vector là loài muỗi cát Lutzomyia (de Pita-Pereira et al., 2008) hay KST đường máu lê

dạng trùng Babesia caballi và B. equi
ở động vật (Alhassan et al., 2005).
Multiplex-PCR còn được ứng dụng chẩn đoán lỵ amíp do khả năng phát hiện nhanh,
chính xác phân biệt các loài gây bệnh với nhiều loài khác có hình thái tương tự, trước hết là
Entamoeba histolytica và Entamoeba dispar từ phân người bệnh (Haque et al., 2007).
1.4. CÁC LOẠI UNI-, MULTIPLEX-PCR VÀ CHỌN LỰA GEN ĐÍCH TRONG
NGHIÊN CỨU
1.4.1. Các loại PCR
Được sử dụng nhiều nhất là loại phản ứng multiplex-PCR sử dụng nhiều cặp
mồi, mà mỗi cặp phát hi
ện đặc hiệu mỗi một gen đích với độ nhạy cao, nhưng nhờ sản
phẩm PCR thu được có kích thước khác nhau, do vậy, khi điện di trên thạch agarose các
sản phẩm phân biệt dễ dàng ứng với mỗi loài đích cần chẩn đoán (Deng et al., 2000).
Nghiên cứu phát triển multipex-PCR theo hướng này, đòi hỏi thiết kế mồi và thử/kiểm
nghiệm phản ứng phải hết sức chuẩn xác (Kaderali et al., 2007).
PCR đơn
mồi (uniplex-PCR) sử dụng một cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên một
nguồn khuôn từ một loại KST; PCR đa mồi (multiplex-PCR) sử dụng nhiều cặp mồi (ít
nhất 3 mồi trở lên), tìm kiếm sản phẩm trên nhiều vùng đích khác nhau của cùng một
khuôn; hoặc của nhiều nguồn khuôn khác nhau; do đó cùng lúc chẩn đoán, phát hiện


18
nhiều gen của nhiều loại KST khác nhau. Tuỳ theo số lượng gen đích cần chẩn đoán mà
multiplex-PCR được chia làm các loại là duplex-PCR, phát hiện 2 vùng đích; triplex-
PCR, phát hiện 3 vùng đích; quadruplex-PCR, phát hiện 4 vùng đích; pentaplex-
PCR, phát hiện 5 vùng đích; hexaplex-PCR, phát hiện 6 vùng đích và có thể nhiều hơn
(Edwards, Gibbs, 1994; Kaderali, 2007). Nói chung, khi sử dụng hơn một cặp mồi để
phát hiện 2 vùng đích trở lên, đều gọi là PCR đa mồi và loại hình multiplex-PCR này
chính là ph

ương pháp làm nền của việc xây dựng kit chẩn đoán phân tử đáp ứng mục
tiêu của đề tài đặt ra trong nghiên cứu này.
1.4.2. Chọn lựa gen đích cho multiplex-PCR
Để có vùng gen đích chẩn đoán, nhiều tác giả chọn lựa khai thác hệ gen nhân tế
bào trong đó hướng tới đối tượng gen 18S rRNA phân biệt cầu trùng Eimeria với
Cyclospora (Orlandi et al., 2003), giám định và phân biệt các loài Cryptosporidium
(Patel et al., 1999), phát hiện các loài KST sốt rét Plasmodium (Rougemont et al.,
2004); hay đối tượng là gen pfcrt, pfmdr1, pfdhfr ở KST sốt rét (Veiga et al., 2006) và
nhiều vùng gen hay vùng giao gen khác; hoặc khai thác đích là hệ gen ty thể

(mitochondrial genome), ví dụ chẩn đoán phân biệt sán dây Taenia spp (Trachsel et al.,
2007; Yamasaki et al., 2004; 2006; Jeon et al., 2009); sán lá gan nhỏ C. sinensis và O.
viverrini (Le et al., 2006); sán lá gan lớn F. hepatica (Magalhães et al., 2004; 2008);
phân biệt định loài động vật trong thức ăn thực phẩm (Ono et al., 2007).
Clonorchis
(sinensis)
Opisthorchis
(viverrini)
A
Haplorchis
(taichui)
Haplorchis
(pumilio)
C
Fasciola
(gigantica)
Fasciola
(gigantica)
B
AB

AC
BC
Taeni a
(solium)
Taeni a
(saginata)
Ta enia
(asiatica)
D
Paragonimus
(heterotremus)
Paragonimus
(westermani)
E
PHÂN, CHẤT THẢI ĐƯỜNG RUỘT (STOOL)
ĐỜM, CHẤT THẢI
ĐƯỜNG HÔ HẤP
(SPUTUM)

Hình 1.7. Các bộ kit multiplex-PCR dự kiến xây dựng giữa các giống và loài; và giữa các loài trong cùng giống.
A. Giữa C. sinensis và O. viverrini; B Giữa F. gigantica và F. hepatica; C. Giữa H. taichui và H. pumilio; D.
Giữa T. solium, T. saginata và T. asiatica; E. Giữa P. heterotremus và P. westermani; AB. Giữa C. sinensis, O.
viverrini và Fasciola spp; AC. Giữa : C. sinensis, O. viverrini và Haplorchis spp; BC. Giữa Fasciola spp và
Haplorchis spp.



19
Các loài KST đã lần lượt được giải mã gen/hệ gen ty thể và đăng ký vào Ngân
hàng gen thế giới ()

tạo cơ sở dữ liệu để có thể truy cập
ứng dụng trong thiết kế mồi đặc hiệu loài cho multiplex-PCR và so sánh phân biệt trong
chẩn đoán, giám định và phân loại. Hàng trăm hệ gen ty thể đã được giải trình và phân
tích, bao gồm nhiều loài quan trọng từ bậc thấp đến bậc cao, từ động vật đơn bào đến
động vật đa bào, cung cấp một hệ thống dữ liệu quan trọ
ng cho các quá trình nghiên cứu
gen, protein, tiến hoá, lịch sử tiến hoá, di truyền quần thể, quan hệ về loài, giống và
nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng khác, trong đó có sử dụng dữ liệu để thiết kế mồi
cho multiplex- PCR. Ngoài ra còn có thể sử dụng các gen đích của hệ gen nhân trong
chiến lược thiết kế multiplex-PCR để chẩn đoán phân biệt.
Hướng sử dụng gen ty thể trong multiplex-PCR được coi là có cơ sở vững vàng
trong
điều kiện hiện nay, do hệ gen ty thể có kích thước nhỏ, nhiều bản sao trong một tế
bào (vài trăm/tế bào), cấu trúc vòng DNA khép kín bền vững, cấu trúc đơn gen, thuận
lợi cho PCR hoạt động (Robin, Wong, 1988). Hơn nữa, một tế bào cho nguồn khuôn
DNA gấp hàng trăm lần so với hệ gen nhân nên PCR có độ nhạy cao hơn. Điều này có ý
nghĩa khi sử dụng tế bào trứng giun/sán làm nguồn khuôn DNA cho multiplex-PCR, vì
chỉ cần một tế
bào trứng đã cho hàng trăm phân tử DNA hệ gen ty thể làm khuôn (Le et
al., 2012). Nhiều công trình thiết kế multiplex-PCR phát hiện DNA trong trứng
giun/sán, tận dụng tính đơn giản khi thu mẫu (chỉ cần phân người bệnh, đối với nhiều
KST ở phủ tạng và đường ruột; hay đờm, đối với sán lá phổi), và tận dụng hệ gen ty thể
làm vùng gen đích đã được thực hiện với các loài sán dẹt (Le et al., 2006; Trachsel et
al., 2007; Davidson et al., 2009).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định xây dựng kit multiplex-PCR dự
a trên
chỉ thị phân tử hệ gen ty thể (Hình 1.7). Cụ thể, chúng tôi đã có dữ liệu nucleotide của
toàn bộ hệ gen ty thể sán lá gan nhỏ C. sinensis, O. viverrini; của sán lá gan lớn F.
gigantica; sán dây Taenia spp, phần lớn hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ H. taichui và
H. pumilio (Lê Thanh Hoà, số liệu chưa công bố); của sán lá phổi P. heterotremus và

một số loài khác.


20
Chương 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu là các loài KST được thu thập có định hướng dịch tễ và hình
thái học (Bảng 2.1), thông qua hợp tác đề tài với:
- Bộ môn Ký sinh trùng, Trường Đại học Y Hà Nội;
- Khoa Sinh học phân tử, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng và Côn trùng Qui Nhơn;
- Viện Thú y trung ương và một số cơ sở khác.
Bảng 2.1. Các loài sán lá sán dây được sử dụng trong nghiên cứu của đề tài
Loài Ký hiệu
Dạng mẫu
Nguồn gốc
C. sinensis CsND
SLG nhỏ trưởng thành
Nam Định (Việt Nam)
C. sinensis CsHB
SLG nhỏ trưởng thành
Hòa Bình (Việt Nam)
O. viverrini OvQT
SLG nhỏ trưởng thành
Quảng Trị (Việt Nam)
O. viverrini OvBD
SLG nhỏ trưởng thành
Bình Định (Việt Nam)
F. hepatica FhAUS

SLG lớn trưởng thành
Geelong (Australia)
F. gigantica FspT4V
SLG lớn trưởng thành
Huế (Việt Nam)
H. taichui HtYB
SLR nhỏ trưởng thành
Yên Bái (Việt Nam)
H. pumilio HpPT
SLR nhỏ trưởng thành
Phú Thọ (Việt Nam)
T. solium TsoN1b
SD trưởng thành
Bắc Ninh (Việt Nam)
T. saginata TQN
SD trưởng thành
Quy Nhơn (Việt Nam)
T. asiatica TaN3
SD trưởng thành
Hà Nội (Việt Nam)
P. heterotremus PhVN
SLP trưởng thành
Lai Châu
*P. ohirai PoJP
SLP trưởng thành
Nhật Bản (được cung cấp)
Ghi chú: *Thay vì sán lá phổi P. westermani (do không có nguồn khuôn), chúng tôi sử dụng P. ohirai
(do phía Nhật Bản cung cấp). SLG: sán lá gan; SLR: sán lá ruột; SD: sán dây; SLP: sán lá phổi. Một số
mẫu phân có trứng sán lá gan nhỏ C. sinensi, O. viverrini, sán lá ruột nhỏ H. taichui, H. pumilio, sán lá
gan lớn F. gigantica, Taenia spp, riêng biệt hoặc hỗn hợp cũng được nghiên cứu, nhưng không liệt kê ở

đây và không mô tả kết quả.

Hợp tác với quốc tế, cụ thể Trường Đại học Y khoa Kochi, Nhật Bản (GS.TS
Takeshi Agatsuma); Trường Đại học Khon Kaen, Thái Lan (PGS.TS Banchob Sripa;
PGS.TS Paiboon Sithithaworn); Trường Đại học Seoul, Hàn Quốc (PGS.TS Min-Ho
Choi; GS.TS Sung-Tae Hong), trong nghiên cứu.
Mẫu thu thập ở dạng sán trưởng thành, trứng và metacercaria, phần lớn bảo quản
trong cồn 70%, một số thu tươi và vận chuyển trong đá lạnh về phòng thí nghiệm. Mẫu
sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý. Mẫ
u được cho vào cồn 70
o
C hoặc dạng tươi
và bảo quản lạnh – 20°C, cho đến khi sử dụng.



21
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU
2.2.1. Dụng cụ, thiết bị phục vụ nghiên cứu
+ Máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D).
+ Máy PCR (PTC-100) của MJ. Research Inc (Mỹ).
+ Máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), có kèm theo máy vi tính.
+ Máy tính và các phần mềm tin – sinh học.
+ Thiết bị dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR của hãng Bio-Rad.
+ Máy ổn nhiệt, máy lắc có điều nhiệt để nuôi tế bào.
+ Lò vi sóng Samsung, box laminair vô trùng, tủ lạnh -20
0
C và tủ ấm (SANYO-
Nhật Bản), Máy Vortex.
+ Bộ pipetman (10µl, 20µl, 200µl, 1000µl) và đầu côn các loại, ống Eppendorf

các loại, đĩa Petri, lọ đựng môi trường, ống nuôi vi khuẩn.


Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu xây dựng kit multiplex-PCR.

2.2.2. Các hóa chất cần thiết cho nghiên cứu
+ Hoá chất bao gồm: Yeast Extract (DIFCO-Mỹ), Trypton (DIFCO-Mỹ), EDTA
(Sigma-Mỹ), axit acetic (Merk-Đức), Kanamycin, Ampicilin (Merk-Đức), X-gal
(Sigma-Mỹ), agarose (Sigma-Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo-Pháp)…
+ Bộ kit tách chiết DNA tổng số “AccuPrep
®
Genomic DNA Extraction Kit” (hãng
BIONEER) và hoá chất do hãng BIONEER cung cấp.


22
+ Các mồi dùng cho phản ứng PCR
+ Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Invitrogen cung cấp.
+ Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR, “AccuPrep
®
PCR Purification Kit”, của hãng
BIONEER (Hàn Quốc).
+ Môi trường dinh dưỡng SOC được cung cấp với bộ “TA-cloning Kit”.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu được trình bày tại Hình 2.1.
2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
2.3.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô sán trưởng thành hoặc ấu trùng
(metacercaria)
DNA tổng số của sán lá và sán dây các mẫu nghiên cứu được tách chiết bằng bộ
sinh phẩm “AccuPrep

®
Genomic DNA Extraction Kit” (hãng BIONEER, Hàn Quốc).
Nguyên lý tách chiết DNA tổng số từ mô: Mẫu sán khi xử lý được nghiền trong
bộ cối chày nhựa, để phá vỡ mô. Huyền dịch thu được gồm thành phần chính tế bào và
protein hoặc có thể có RNA nên cần phải loại bỏ chúng. Loại bỏ protein bằng cách bổ
sung proteinase-K, phá huỷ RNA bằng RNase A. Các thành phần khác của nguyên sinh
chất cần tách riêng khỏi DNA, bằng isopropanol và một số hóa chất khác, rồi thu DNA
khi cho lọc trên màng lọc tích điện d
ương.
Cách thực hiện:
Bước 1: Mẫu vật sau khi xử lý được nghiền trong bộ cối chày nhựa.
Bước 2: Thêm 200 µl dung dịch Tissue Lysis buffer (ATL) và tiếp tục nghiền
cho đến khi thành huyễn dịch đồng nhất. Bổ sung 20 µl Proteinase-K (50mg/ml), ủ
60
o
C trong 3 giờ cho đến khi mô được ly giải hoàn toàn.
Bước 3: Bổ sung 4 µl RNase-A (100mg/ml) và 200 µl dung dịch Binding buffer
(AL hoặc GC), lắc mạnh rồi ủ ở 70
o
C trong 30 phút
Bước 4: Thêm 200 µl dung dịch Isopropanol (96 – 100%), rung lắc trong 15
giây. Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 5: Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm 10.000 vòng/phút
trong 1 phút, loại bỏ phần dung dịch bên dưới.
Bước 6: Thêm 500 µl dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa cột
lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới.


23
Bước 7: Thêm 500 µl dung dịch (Washing buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa, ly

tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới. Ly tâm lại 13.000
vòng/phút trong 1 phút (để làm khô màng).
Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 60 µl dung dịch Elution
buffer (EL), để ở nhiệt độ phòng trong 2 – 5 phút. Sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong
2 phút. Bỏ cột, giữ lại dịch bên dưới.
Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 20
0
C cho đến khi sử dụng.
2.3.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu hỗn hợp trứng trong phân
Tách DNA tổng số từ phân (stool) sử dụng bộ sinh phẩm AccuPrep® Stool DNA
Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc). Cụ thể tóm tắt như sau:
- Mẫu phân bảo quản trong lạnh được lấy ra và cho 100 mg mẫu vào ống
Eppendorf, bổ sung 400 µl dung môi SL buffer, rồi lắc xoáy (vortexing) trong 30 giây,
sau đó ủ trong tủ ấm ở 60
o
C trong 10 phút.
- Sau khi ly tâm 13.000 vòng trong 5 phút, chuyển dịch nổi bên trên
(supernatant) được sang ống Eppendorf mới và cho vào đó 400 µl dung môi Binding
buffer, rồi ủ trong tủ ấm ở 60
o
C trong 10 phút.
- Sau khi cho 100 µl isopropanol vào, ống mẫu được lắc xoáy (vortexing) trong 5
giây và ly tâm nhanh trong vài giây.
- Chuyển dịch nổi bên trên sang màng của cột lọc (binding column) đã lắp trong
một ống hứng (collection tube), thực hiện ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Chuyển cột lọc sang ống mới, cho vào màng lọc 500 µl dung môi Washing
buffer 1 (W1) để rửa và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó tiếp tục cho lên
màng lọc dung môi Washing buffer 2 (W2) để rửa lần 2 và ly tâm 13.000 vòng/phút
trong 1 phút.
- Cuối cùng, chuyển cột lọc sang ống mới, cho lên màng lọc 100 µl dung môi

Elution Buffer để ở nhi
ệt độ trong 5 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột,
giữ lại dịch bên dưới, đó chính là DNA tổng số tách được từ trứng có trong phân
Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 20
0
C cho đến khi sử dụng.
2.3.2. Thiết kế các cặp mồi
Thiết kế mồi dựa trên nguyên tắc cặp mồi nhân vùng gen cho sản phẩm có độ dài
chênh lệch nhau giữa các đối tượng chẩn đoán, để đánh giá sử dụng phương pháp điện


24
di. Cặp mồi (primer) dùng trong nhân bản DNA đích bằng phản ứng PCR được thiết kế
trên cơ sở các trình tự khác nhau khi so sánh các chuỗi của các loài với nhau.

Bảng 2.2. Thành phần nucleotide các mồi dùng trong phản ứng multiplex-PCR
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’ → 3’)
Độ dài
(bp)
Độ dài của sản phẩm
thu được
OV5F TACGCAGGTGGTTTGGTTG 19
OVN3R GCTCAATAAAGAGACCACGAAC 22
OV5F-OVN3R: 818 bp
(O. viverrini)
CSF ATACCTTTGCGTGGTGGGAG 20
CSR CATACTCAACAAGCCCAATG 20
CSF-CSR: 489 bp
(C. sinensis)
TASF GGGTTTAAGTTATAAATGTGATGT 24

TSOF CTAGGCCACTTAGTAGTTTAGTTA 24
TSAF ACTACATTTGGTTTGTTTTTGTAG 24
TASSR CATAAAACACTCAAACCTTATAGA 24
TASF-TASSR: 706 bp
(T. asiatica).
TSAF-TASSR: 629 bp
(T. saginata)
TSOF-TASSR: 474 bp
(T. solium)
HPUF TCTTGGGGTTGGTAGTGTTGAC 22
HPUR TCACGAAGCAACATAACGCTC 21
HPUF-HPUR: 400 bp
(H. pumilio)
HTAF CGTGTGTCATAAGAGATGGTCCG 23
HTAR CCCCAACTAAATCCCCCTTC 20
HTAF-HTAR: 250 bp
(H. taichui)
FHF GTTTTTTAGTTGTTTGGGGTTTG 23
FGF TGTTATGATTCATTGTTTGTAG 22
FHGR ATAAGAACCGACCTGGCTCAC 21
FHF-FHGR: 1031 bp
(F. hepatica)
FGF-FHGR: 615 bp
(F. gigantica)
PHEF GGTTCTGTTTTGAGGTCAAAATC 23
POHF ATGATTTGCAGGAGATTTCGGAC 23
PHOWR CGGTATGTACCCCAACTAAATC 22
PHÈ-PHOWR: 598 bp
(P. heterotremus)
POHF-PHOWR : 433 bp

(P. ohirai)

2.3.3. Thực hiện PCR đơn (uniplex-PCR) và đa mồi (multiplex-PCR)
Phản ứng PCR đơn loài (sử dụng một cặp mồi) được bố trí với dung tích là 25 µl.
Mỗi loại đều sử dụng 1 µl (10 pmol/µl) cho mỗi phản ứng. Nếu là phản ứng uniplex-
PCR, chỉ sử dụng 1 cặp mồi; nếu là duplex-PCR sử dụng 2 cặp mồi hoặc 3 mồi (có thể
có 1 mồi chung); nếu là triplex-PCR thì sử dụng 3 cặp mồi hoặc 4 mồi (có 1 m
ồi
chung) cho hỗn hợp trong cùng một phản ứng (Bảng 2.3) với chu trình nhiệt đã được
thử nghiệm (Bảng 2.4).
Khuôn DNA tổng số (50 ng/µl) được sử dụng 1 µl cho đơn loài và 2 - 3 -4 µl
DNA khuôn trộn chung cho 2 hoặc 3 loài hoặc 4 loài (1 µl cho mỗi loài) theo tỷ lệ
bằng nhau (1:1). Các thành phần khác không thay đổi, còn mồi thì tùy loại PCR (uni-,
duplex-, triplex-PCR) mà cho các mồi và điều chỉnh nước cho phù hợp dung tích 25 µl
hay 50 µl (Bảng 2.3). Thành phần được bổ sung DMSO (dimethyl sulfoxide), có tác
dụng tăng cường hoạt động củ
a phản ứng PCR và cho sản phẩm chất lượng cao
(Frackman et al., 1998).