Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme

Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
LỜI MỞ ĐẦU
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh
sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực
phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường.
Nghiên cứu, sản xuất enzyme và ứng dụng của enzyme được phát triển rất mạnh từ
đầu thế kỷ 20 đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận rất lớn
cho nhiều nước. Việt Nam là một trong nhiều nước có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng
enzyme. Tuy nhiên, nền công nghiệp enzyme của ta chưa thực sự phát triển.
Lysozyme là một loại enzyme có nhiều tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực
phẩm và trong y học. Đồ án này nhằm tìm hiểu về enzyme lysozyme, các tính chất và cơ
chế tác dụng của enzyme này với cơ chất cũng như phương pháp tinh sạch và các ứng
dụng của nó. Đây là đồ án mang cái nhìn tổng quát về enzyme lysozyme.
Trong quá trình thực hiện đồ án này, em xin chân thành cám ơn sự hướng dẫn tận tình
của cô Đống Thị Anh Đào, cùng với sự giúp đỡ của các bạn trong việc tìm và chia sẻ tài
liệu.
Sinh viên thực hiện
Phạm Thị Bích Ngọc
I. Giới thiệu về lysozyme
1
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Lysozyme (ký hiệu E.C.3.2.1.17) là một enzyme thủy phân liên kết β – 1,4 glycosidic
giữa N – acetylmuraminic acid và N – acetylglucosamine trong polysaccharide, là thành
phần chủ yếu trong thành tế bào một số vi khuẩn. Lysozyme cũng thủy phân liên kết β –
1,4 glycosidic giữa N – acetylglucosamine trong chitin, một polymer của N –
acetylglucosamine.
Lysozyme còn có các tên khác như: 1,4-N-acetylmuramidase, L-7001, N,O-
diacetylmuramidase, GlobulinG1, GlobulinG, Mucopeptide N-acetylmuramoylhydrolase,
Mucopeptide glucohydrolase và Muramidase.
Lysozyme phân bố rộng rãi ở hầu hết các loài động vật và thực vật. Trong đó,
lysozyme trong lòng trắng trứng gà là được nghiên cứu nhiều nhất (lysozyme “c”). Một

loại lysozyme khác có trong lòng trắng trứng của ngỗng nuôi là lysozyme “g” (Prager và
cộng sự 1974). Lysozyme cũng được tìm thấy trong chất tiết và mô của các loài động vật
có vú, nước bọt, nước mắt, sữa, đờm, bạch cầu, quả cật …. Ở thực vật, lysozyme được
tìm thấy trong mủ của cây sung và cây đu đủ có tính chất hóa học khác với lysozyme
trong lòng trắng trứng (Meyer và cộng sự 1956).
Trong virus (hay bacteriophase), lysozyme là một tác nhân để xâm nhập vào tế bào vi
khuẩn vật chủ. Lysozyme có ở đuôi của virus (hay bacteriophase) phá hủy peptidoglycan
của thành tế bào vi khuẩn và tiêm ADN của nó vào. Khi vi khuẩn nguyên phân, rất nhiều
phân tử lysozyme được tạo thành để phá hủy thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nhiều
virus nữa.
1. Lịch sử của lysozyme
Lysozyme được Alexvàer Fleming phát hiện năm 1922 một cách tình cờ trong phòng
thí nghiệm của ông. Ông vô tình bị chảy nước mũi vào đĩa petre có canh trường vi khuẩn
và ông thấy những vi khuẩn này bị phân giải. Hiện tượng này được ông nghiên cứu cẩn
thận và enzyme lysozyme đã được xác định.
Năm 1965, David Chilton Phillips khám phá ra cấu trúc của lysozyme bằng cách phân
tích X quang ở độ phân giải 2 angstrom. Trong nhiều năm, phân tích X quang là phương
pháp phân tích lysozyme tốt nhất vì những tính chất đặc biệt của loại enzyme này. Thứ
nhất, lysozyme rất dễ được tinh sạch từ lòng trắng trứng. Thứ hai, lysozyme rất dễ kết
tinh, không giống như hầu hết các lại protein khác. Người ta dựa vào tính chất này của
lysozyme để tinh sạch enzyme này. Và cuối cùng, những tinh thể lysozyme làm nhiễu xạ
tia X với độ phân giải rất cao, hiện nay là loại cấu trúc protein có độ phân giải cao nhất:
0,94 angstrom.
2. Phân loại lysozyme
2
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Lysozyme đã được lấy ra từ nhiều nguồn: vi sinh vật, virus, côn trùng, cây, động vật.
Người ta phân loại lysozyme thành những nhóm nhỏ dựa trên nguồn gốc, thứ tự các acid
amin và chiều dài.
Lòng trắng trứng là nguồn giàu lysozyme nhất, chứa khoảng 0,3 – 0,4 g lysozyme

trong một quả trứng. Lysozyme trong lòng trắng trứng là đại diện cho họ các lysozyme
và được gọi là lysozyme type-c. Những nghiên cứu đã cho thấy rằng lớp biểu bì và vỏ
trứng chứa ít lysozyme trong khi màng ngoài và màng trong thì nhiều lysozyme.
Lysozyme type-g có mặt trong các loài chim. Lysozyme type-c và lysozyme type-g có
khối lượng phân tử khác nhau và trạng thái khác nhau.
Lysozyme cũng có mặt trong mô động vật, huyết thanh và các cơ quan. Lá lách của
gia súc chứa một lượng lysozyme lớn nhất. Lysozyme trong sữa bò có cùng khối lượng
phân tử với lysozyme lòng trắng trứng nhưng hoạt độ thì gấp 2 lần. Lysozyme type-v
(viral) là lysozyme của virus, được xác định là khác với những lysozyme khác ở chỗ đây
là loại transglycosidase. Lysozyme từ thực vật là lysozyme type-h và type-b tùy thuộc
vào nguồn gốc của lysozyme.
Bảng 1: Các loại lysozyme
Loại lysozyme Nguồn Tài liệu tham khảo
type-c (chicken) Lòng trắng trứng gà Chipman và Sharon, 1969
type-g (goose) Các loài chim Prager và Jolles, 1996
type-h (hevamine) Thực vật Beintema và cộng
sự,1996
type-b (barley) Thực vật Beintema và cộng
sự,1996
type-i (invertebrate) Động vật thân mềm, côn
trùng
Jolles và Jolles, 1975
Bảng 2: Hàm lượng lysozyme trong các nguồn khác nhau
Loại lysozyme Hàm lượng Tài liệu tham khảo
3
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Lysozyme trong chất lỏng của cơ thể
• Nước mắt
• Nước bọt
• Nước tiểu

• Sữa người
2,6 mg/l
0,13 mg/ml
Vết
0,2 – 0,4 mg/ml
Grossowicz và Ariel, 1983
Lysozyme trong trái cây và rau:
• Bông cải
• Đu đủ
• Bắp cải
• Củ dền
• Củ cải
• Bông cải xanh
27,6 µg/ml
7,9 µg/ml
2,3 µg/ml
3,3 µg/ml
1,8 µg/ml
8,1 µg/ml
Ereifej và Markakis, 1980
II. Cấu trúc, đặc tính hóa lý
Lysozyme là một polypeptide dạng hình cầu có 129 acid amin với 4 cầu nối disulfure
là hỗn hợp của globulin G
1
, G
2
và G
3
, chủ yếu loại G
1

có trọng lượng phân tử khoảng 14,7
kDa ở các vị trí Cys6-Cys127, Cys30-Cys115, Cys64-Cys80 và Cys76-Cys94. Khi các
cầu nối disulfure bị cắt, lysozyme mất hoạt tính và để duy trì hoạt tính thì ít nhất phải còn
2 cầu nối disulfure. Phân tử lysozyme chia làm 2 phần: α và β, nối với nhau bởi đường
xoắn ốc α chứa trung tâm hoạt động của lysozyme.
4
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Hình 1: Cấu tạo của lysozyme. Chuỗi acid amin được đánh dấu từ đầu N đến đầu C.
Đường chấm gạch thể hiện 4 cầu nối disulfure.
Lysozyme phá vỡ liên kết giữa C1 của N-acetylmuramic acid (NAM) và C4 của N-
acetylglucosamine (NAG).
Hình 2: Cơ chất của lysozyme (Liên kết β 1,4 glucosidic giữa N-acetylmuramic acid
và N-acetylglucosamin được khoanh tròn.)
Quan sát hình cơ chế hoạt động của lysozyme (hình 3).
Phản ứng thủy phân diễn ra ở trong khe có chứa các nhóm hoạt động của lysozyme.
Các nhóm hoạt động của lysozyme là mạch nhánh –COOH của glutamic acid 35 (Glu35)
và –COO– của aspartate 52 (Asp52). Nhóm đường của thành tế bào nằm ở giữa 2 acid
amin này. Phản ứng bắt đầu khi Glu35 cho Oxy của nhóm glycoside 1 proton, làm biến
dạng phân tử đường D từ dạng ghế thông thường bền vững thành dạng mới nguyên tử
carbon 1 và 2, nguyên tử oxy 5 đều ở cùng trên một mặt phẳng, gây sự biến dạng trong
cấu tạo cơ chất làm cho liên kết bị yếu đi đưa đến cắt đứt liên kết glycosidic giữa oxy và
nguyên tử carbon 1 của đường, tạo ra một C
+
.
C
+
được ổn định bằng cách kết hợp với điện tích âm của Asp52 để tạo thành sản phẩm
trung gian. Sản phẩm trung gian này sau đó phản ứng với phân tử nước tạo ra sản phẩm
của phản ứng thủy phân và giải phóng enzyme. Các monosaccharide được ký hiệu là C,
D, E. Các mạch nhánh của đường được ký hiệu như: R

1
là –CH
2
OH, R
2
là –NH–C–CH
2
.
||
O
5
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Hình 3: Cơ chế tác dụng của lysozyme trong quá trình thủy phân polysaccharide
1. Tính chất của lysozyme có trong lòng trắng trứng gà
6
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Khối lượng phân tử: 14 388 (Jollés 1969).
Gồm: 129 acid amin (21 aspartic acid, 5 glutamic acid, 12 alanine, 11 arginine, 8
cysteine, 3 phenylalanine, 12 glycine, 6 isoleucine, 1 histidine, 8 leucine, 6 lysine, 2
proline, 2 methionine, 12 serine, 3 tyrosine, 7 threnonine, 6 tryptophan và 6 valine.
pH tối ưu: 6,2 (Davies và cộng sự 1969).
Điểm đẳng điện: pH 11 (Alderton và cộng sự 1945)
Nét đặc trưng:
Chất ức chế: các chất hoạt động bề mặt như dodecyl sulfate, cồn và các acid béo, các
dẫn xuất của nhóm imidazole và indole
Độ bền: lysozyme bảo quản ở điều kiện khô lạnh hay dạng bột tinh thể ở nhiệt độ 2 –
8
o
C thì bền trong vòng 1 năm. Dạng dung dịch pH 4 – 5 để ở nhiệt độ lạnh thì bền trong
vòng nhiều tuần, nếu để nhiệt độ môi trường thì bền trong vài ngày.

2. Tính chất ức chế vi khuẩn của lysozyme lòng trắng trứng gà
Cơ chất tự nhiên của lysozyme là màng peptidoglycan của thành tế bào, thành tế bào
có vai trò tạo hình dáng tế bào, bảo vệ tế bào chống lại áp suất thẩm thấu. Vì thế, sự thủy
phân màng peptidoglycan dẫn đến sự phân giải tế bào. Thành phần hóa học của thành tế
bào vi khuẩn Gram âm khác với vi khuẩn Gram dương. Thành tế bào vi khuẩn Gram
dương có cấu tạo bởi một lớp peptidoglycan dày cùng với teichoic acid và lipoteichoic
acid. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm thì được cấu tạo bởi 2 lớp, lớp trong là một lớp
peptidoglycan đơn không có teichoic acid và lớp ngoài là một lớp lipopolysaccharide
dày. Lớp ngoài của vi khuẩn Gram âm ngăn cản sự tiếp xúc giữa lysozyme và
peptidoglycan, vì thế vi khuẩn Gram âm ít mẫn cảm với lysozyme hơn (Salton, 1958).
Tuy nhiên, những nghiên cứu cho rằng cơ chế tiêu diệt vi khuẩn Gram dương thì độc lập
với hoạt động enzyme mà chủ yếu là do tính chất kỵ nước và tích điện dương của
lysozyme (Pellegrini và cộng sự, 1992). Những nghiên cứu cho thấy rằng hoạt động
enzyme và hoạt động dung giải thì không liên quan với nhau vì lysozyme đã biến tính
vẫn có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn (Pellegrini và cộng sự, 1992; Ibrahim và
cộng sự, 1996; Ibrahim và công sự, 2001).
a. Hoạt động ức chế vi khuẩn Gram dương
Lysozyme lòng trắng trứng có hoạt động hiệu quả đối với một số loài vi khuẩn trong
thực phẩm (Proctor và Cunningham, 1998). Lysozyme dung giải tế bào vi khuẩn bằng
cách thay đổi tính chất của cấu trúc bề mặt trên thành tế bào. Những quan sát trên kính
hiển vi cho thấy rằng có sự phồng ra của tế bào trước khi tế bào bị dung giải và nguyên
nhân của sự phồng ra này là do sự thay đổi cấu trúc trong thành tế bào (Salton, 1957). Cơ
chế hoạt động của lysozyme được nghiên cứu bởi Salton năm 1957. Ông sử dụng ba vi
khuẩn Gram dương và lysozyme hoàn toàn dung giải thành tế bào của chúng. Khi
Micrococcus lysodeikticus, Sarcina lutea, và Bacillus megaterium bị dung giải bởi
7
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
lysozyme, có sự giải phóng các đường acetyl amio. Hoạt động của lysozyme đã được xác
định bằng cách đo sự giảm mật độ của thành tế bào và bằng cách ước tính lượng chất
mạch ngắn được giải phóng. Những chất đó là một hỗn hợp phức tạp gồm rất nhiều chất

có kích thước phân tử khác nhau, tính chất điện khác nhau. Chất chính trong hỗn hợp này
là các disaccharide của acetlyglucosamine và acetyl muramic acid. Acid amin của thành
tế bào và đường đơn không được tìm thấy trong hỗn hợp này (Salton, 1958). Điều này
chứng tỏ là lysozyme cắt đứt liên kết glycoside của đường amino thành tế bào, vì thế giải
phóng ra các disaccharides của acetylglucosamine và acetylmuramic acid (Salton, 1958).
b. Hoạt động ức chế vi khuẩn Gram âm
Những nghiên cứu gần đây trên một số vi khuẩn Gram âm nhất định cho thấy khi tách
thành tế bào của các vi khuẩn này và để ủ với lysozyme, mật độ thành tế bào của chúng
chỉ giảm một ít. Dung dịch thu được gồm các chất chủ yếu là alanine, acid glytamic,
diaminopimelic acid (DAP), glycosamine và một lượng nhỏ acid muramic và một vài
acid amin khác (Salton, 1958).
Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng hoạt động của lysozyme trên vi khuẩn Gram
âm không phụ thuộc vào hoạt động enzyme mà phụ thuộc vào sự chuyển pha cấu trúc
(Ibrahim và cộng sự, 2001). Có chứng cứ của một phần chống vi sinh vật đặc biết gọi là
phần 98-112 có liên quan đến hoạt động chống vi sinh vật Gram dương và Gram âm của
lysozyme (Ibrahim và cộng sự, 2001). Hoạt động chống vi sinh vật của lysozyme độc lập
với hoạt động enzyme của nó. Lysozyme lòng trắng trứng biến tính nhiệt được dùng để
nghiên cứu khả năng chống vi sinh vật của lysozyme và người ta tìm ra rằng sau khi bị
biến tính lysozyme chống lại vi khuẩn Gram âm mạnh hơn với một phần mạch đuỗi ra,
hoạt tính enzyme bị vô hoạt và cấu trúc kỵ nước (During và cộng sự, 1999). Người ta giải
thích điều đó là do sự lồng cấu trúc đối xứng 2 bên của lysozyme vào màng tế bào dẫn
đến sự phá vỡ màng.
III. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lysozyme, ví dụ như: pH, nhiệt độ,
các ion, khả năng tiếp cận với liên kết để phá hủy trong thành tế bào vi khuẩn…
1. pH
Đối với lysozyme lòng trắng trứng, khi các thí nghiệm được tiến hành ở dung dịch
trung tính và dung dịch acid, hoạt động của lysozyme trong dung dịch acid luôn luôn
mạnh hơn so với trong môi trường trung tính. Sự ức chế hoạt động của lysozyme bắt đầu
tại pH 5,7, pH tối ưu của lysozyme khoảng 6,2 và khả năng dung giải tốt nhất ở pH 6,0-

7,0 (Boasson, 1938; Smolelis và Hartsell, 1949)
Đối với lysozyme của hào, pH tối ưu là 5,5-6,0 (Xue và cộng sự, 2004).
2. Nhiệt độ
8
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Sự dung giải tế bào vi khuẩn của lysozyme lòng trắng trứng tăng khi tăng nhiệt độ
đến 60
o
C (Smolelis và Hartsell, 1949). Hoạt động của lysozyme tinh sạch từ huyết tương
của hào tăng cùng với sự tăng nhiệt độ từ 0 – 45
o
C và sau đó giảm ở nhiệt độ lớn hơn
55
o
C.
3. Sự có mặt của chất điện ly
Hoạt động dung giải của lysozyme lòng trắng trứng tốt nhất khi có sự có mặt của
muối Ka với lực ion khoảng 0,1 (Salton, 1957) . Lysozyme dung giải ít hơn trong dung
dịch muối Mg hay Ca so với dung dịch muối K và Na (Smolelis và Hartsell, 1949).
Đối với lysozyme hào, lực ion khoảng 0,18 – 0,2 (Xue và cộng sự, 2004).
4. Điều kiện canh trường
Sự dung giải tế bào vi khuẩn bao gồm sự phá vỡ cấu trúc bề mặt của tế bào. Vì thế,
yếu tố ảnh hưởng đến sự bền của cấu trúc bề mặt tế bào hay bất cứ chất nào ngăn cản sự
tiếp xúc giữa lysozyme và cơ chất của nó đều ảnh hưởng đến hoạt động dung giải của
lysozyme (Salton, 1957).
IV. Phương pháp xác định hoạt tính của lysozyme
Tính chất xúc tác của lysozyme có thể được xác nhận nếu lysozyme đó thỏa mãn 3
tính chất sau:
a. Lysozyme đó có thể làm giảm tính dày đặc của cấu trúc thành tế bào phân lập ra.
b. Lysozyme đó có thể dung giải các tế bào vi khuẩn.

c. Lysozyme đó có thể giải phóng ra phức của đường acetylamino của glucosamine
và acidic hexosamine và acid muramic.
Nồng độ protein được đo bằng phương pháp Micro BCA Protein Assay (Pierce
Biotechnology, Rockford, IL). Tất cả các phép đo được tiến hành 3 lần. Hoạt tính
của lysozyme được đo bằng phương pháp quang phổ (Xue và cộng sự, 2004). 20µL mẫu
được trộn với 180µL Micrococcus lysodeikticus đã được làm yếu trong 0,2M acetate
buffer ở pH 5,8 trong đĩa micro để ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở bước
sóng 450nm bằng microtiter plate reader (Dynatec, Chantilly, VA.). Sự hấp thu được đo
sau khi đọc ban đầu 5 phút và sự giảm của độ hấp thu ở bước sóng 450nm mỗi phút cũng
được tính toán. Lysozyme được cho là có chất lượng khi một đơn vị lysozyme gây ra sự
giảm độ hấp thu của hỗn hợp trên là 0,001/phút.
V. Cách tinh chế, tinh sạch
Việc nghiên cứu thành công của một enzyme không phải ở việc chiết xuất, xác định
đặc tính, yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme mà phải tinh chế được enzyme dạng
tinh sạch, để chế phẩm có hoạt độ cao trên 1mg chế phẩm. Thông thường của phương
9
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
pháp tinh chế bằng sự kết tủa nhiều lần để thu được chế phẩm enzyme có hoạt tính cao.
Để tiện lợi và nhanh hơn, nhiều enzyme được chiết xuất lại qua sắc ký cột trao đổi ion
như CMC (carboxyle methyl cellulose), sắc ký rây lọc phân tử Sephadex, sắc ký ái lực
cho phép tách đặc hiệu enzyme khi phần cánh tay của sắc ký ái lực gắn với cơ chất đặc
hiệu. Đối với một số enzyme có phân tử nhỏ xác định như lysozyme 14000 đơn vị có khả
năng chui qua màng siêu lọc, người ta có thể tách lysozyme của lòng trắng trứng từ hỗn
hợp các loại globulin lòng trắng trứng bằng phương pháp siêu lọc có hiệu suất rất cao.
Việc tinh chế enzyme hết sức cần thiết bởi làm cho enzyme tinh sạch ít còn lẫn tạp chất,
protein không phải enzyme, nâng cao hoạt tính enzyme so với dạng thô nhiều lần, thuận
lợi cho nghiên cứu, bảo quản, nhất là nguyên liệu dùng làm thuốc trong điều trị và sản
xuất.
1. Sắc ký trao đổi ion
Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước và tác nhân trao

đổi ion, người ta áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzyme. Người ta
thường sử dụng các tác nhân trao đổi ion sau:
- Nhựa trao đổi ion
- Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-
cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose.
Người ta thường sử dụng DEAE-cellulose hơn cả. Ưu điểm của DEAE-cellulose là
ngoài tạp chất protein, các loại nucleic acid đều được loại khỏi enzyme.
- Sephadex là dẫn xuất của polysaccharide dextran. Trong chất này, các phân tử của
chúng thường liên kết với nhau bởi các liên kết ngang nhờ tác dụng của
epiclohydrin, tạo thành “sàng phân tử”. Số lượng liên kết ngang càng nhiều, kích
thước sàng phân tử càng nhỏ.
Khi tiến hành lọc, các chất phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong các
hạt sephadex đã được ngâm trong buffer. Các phân tử có kích thước lớn hơn không có
khả năng đi vào các hạt sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột. Phương pháp này được ứng
dụng rộng rãi trong kỹ thuật enzyme.
Đề án: Tinh sạch và mô tả đặc điểm của lysozyme
Phần: Sắc ký trao đổi ion
10
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Giới thiệu về đề án
Tinh sạch lysozyme từ lòng trắng trứng gà bằng sắc ký trao đổi ion. Sử dụng phân
tích định lượng protein và enzyme, bạn sẽ xác định được lượng lysozyme thu được, và
mở rộng qui mô tinh sạch. Cuối cùng, sử dụng sự dịch chuyển điện tử, bạn sẽ khảo sát chi
tiết sự tách enzyme bằng phương pháp sác ký, nhận ra được những loại protein lòng trắng
11
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
trứng khác có thể tách ra được lysozyme. Thêm vào đó, bạn sẽ sử dụng kết quả của sự
dịch chuyển điện tử để xác định khối lượng phân tử của lysozyme.
Thông tin chung về lysozyme
Lysozyme của lòng trắng trứng gà là một chuỗi polypeptide đơn gồm 129 acid amin,

khối lượng phân tử 14600 daltons. Lysozyme là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc
bằng phương pháp tinh thể học X quang. Ở động vật có vú, lysozyme có trong nước mắt,
vì thế không dễ dàng tách được một lượng lớn lysozyme. Lòng trắng trứng là một nguồn
giàu lysozyme.
Nhìn tổng thể về thời gian biểu của đề án
- Ngày 1: lập đường cong chuẩn của phương pháp biuret, cho phép bạn xác định
được nồng độ của dung dịch protein.
- Ngày 2: tiến hành chạy sắc ký trao đổi ion salt-gradient dịch chiết lòng trắng
trứng, thu dung dịch ra khỏi cột vào một hũ nhỏ.
- Ngày 3: xác định thành phần của dung dịch trong hũ bao gồm: nồng độ protein
(phương pháp biuret) và nồng độ của lysozyme (sử dụng phương pháp phân tích
định lượng).
- Ngày 4: sử dụng SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) polyacrylamide trao đổi ion để
nghiên cứu thành phần của chất chiết lòng trắng trứng chi tiết hơn.
Giới thiệu phần 2: Sắc ký trao đổi ion dương sử dụng Gradient muối
Trong thí nghiệm này, pha tĩnh sử dụng là carboxymethyl-Sephadex, một loại
polysaccharide thương mại có các nhóm -CH
2
-COOH. Khi pH lớn hơn 3, những nhóm
này mang điện tích âm (-CH
2
-COO-), và vì thế sẽ giữ chặt những chất tan tích điện
dương, làm chậm sự chuyển động của chúng ra khỏi cột. Đối với loại cột này, các chất
tan tích điện âm sẽ được rửa ra trước, theo sau là các chất tan trung hòa điện. Các chất tan
tích điện dương sẽ được rửa ra sau cùng, hoặc chúng bị giữ lại trong cột cho tới khi bị
thay bằng các ion muối, hay khi thay đổi pH để làm thay đổi sự tích điện của cột hay của
chất tan.
pH đẳng điện của lysozyme là 11. Ở pH này, phân tử lysozyme trung hòa về điện. Ở
pH 8,2, pH tiến hành sắc ký, phân tử lysozyme tích điện dương, và vì thế lysozyme sẽ
được giữ lại trong cột. Nhiều loại protein lòng trắng trứng khác có pI dưới 8,0. Vì thế, khi

bạn áp dụng chạy sắc ký ở pH 8,2, mong muốn là giữ lại hầu hết các protein khác trên
cột. Sau đó, bạn rửa giải bằng dung dịch có nồng độ muối tăng dần (gọi là gradient –
phương pháp này gọi là phương pháp rửa giải gradient). Những protein không liên kết
với cột sẽ được rửa giải nhanh chóng, và những protein còn lại được rửa giải theo ái lực
12
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
của chúng với cột: ái lực yếu ra trước, tại nồng độ muối thấp; ái lực mạnh trong đó có
lysozyme ra sau khi nồng độ ion Cl
-
trong dung dịch rửa giải đủ lớn.
Nguyên liệu
Thuốc thử
Buffer A: Tris buffer 0.05M, pH 8,2, chứa 0.05M NaCl.
Buffer B: Tris buffer 0.05M, pH 8,2, chứa 1M NaCl.
Sephadex CM-52 trong buffer A.
Nguồn lysozyme
Trứng
Vải lọc (cheesecloth)
Dụng cụ
Cột sắc ký, 1,5x10cm.
Chương trình rửa giải gradient.
Mối nguy
Lòng đỏ trứng chứa một lượng cholesterol, không được lấy lòng đỏ trứng.
Các bước tiến hành
Tạo dịch chiết từ lòng trắng trứng:
1. Đập trứng, tách lòng trắng trứng ra khỏi lòng đỏ trứng vào một cái cốc 250mL.
Lọc lòng trắng trứng qua 4 lớp vải mỏng cho vào cốc 100mL. Lưu ý: không sử
dụng áp suất ép lòng trắng trứng đi qua lớp vải, chỉ nhẹ nhàng vuốt túi lọc. Một
chất lỏng loãng thu được có thể sẽ làm nghẽn cột sắc ký sau này. Sau khi thu được
khoảng 15mL chất lỏng trong suốt và loãng trong cốc, bỏ vải lọc.

Lưu ý: Buffer A và buffer B khác nhau ở nồng độ mol của NaCl.
2. Chuyển 10mL phần lòng trắng trứng sau khi lọc vào một cái cốc 100mL khác và
pha loãng bằng 70mL buffer A (0,05M Tris-HCl buffer, pH 8,2, chứa 0,05M
NaCl). Cho hỗn hợp này qua một cái phễu chứa bông thủy tinh. Nếu bạn có thể
nhìn thấy cặn trong phần lọc được, lọc lại lần nữa bằng một cái phễu chứa nhiều
bông thủy tinh hơn. Chất lỏng sau cùng phải trong suốt và loãng, không cặn và
không có cấu trúc gel. Chất lỏng này được gọi là chất chiết lòng trắng trứng. Lưu
ý rằng chất chiết lòng trắng trứng loãng 1:8 so với lòng trắng trứng nguyên chất.
Trong tính toán cuối cùng, bạn sẽ xác định lượng protein và enzyme trong lòng
trắng trứng nguyên chất, từ sự đo lường chất chiết lòng trắng trứng.
3. Kiểm tra cột sắc ký bằng cách cho vào một lượng nước và chắc chắn rằng nước
chảy qua dễ dàng. Nếu có nhiều cột sắc ký thì chọn cột nào mà tốc độ nước chảy
ra nhanh nhất. Lắp vào cột sắc ký một cột ngắn và một cái van để điều chỉnh
lượng nước qua cột. Ở đáy cột có lưới bằng plastic để lọc giữ lại môi trường của
13
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
sắc ký (chromatography medium (Sephadex CM-25), cho phép buffer đi qua.
Khóa van lại. Tháo nắp cột ra và thay thế bằng một cái phễu. Lắp chặt phễu vào
cột để tránh bị rỉ chất lỏng. Kiểm tra sự rỉ của chất lỏng bằng cách cho nước vào
phễu và cột.
4. Đặt một cái khuấy từ lên cái vòng ở trên cột, đặt dụng cụ rửa giải gradient lên trên
cái khuấy. Dụng cụ rửa giải gồm có 2 cốc: một cốc nhập liệu và một cốc trộn, nối
với nhau bằng ống nhập liệu (Xem hình). Đặt một cái khuấy từ vào trong cốc trộn.
5. Ước tính thể tích của CM-25 cần dùng để chiều cao nó chiếm trong cột sắc ký là
10cm. Khuấy đều CM-25 để đảm bảo đồng nhất, tránh tạo bọt khí. Cho vào cốc
nhỏ có chia độ lượng thể tích CM-25 gấp 2 lần so với lượng thể tích vừa tính
được.
6. Cho 5mL buffer A vào cột (van đang đóng). Trộn đều CM-25 (tránh tạo bọt khí)
và cho vào cột sử dụng một đũa thủy tinh để dẫn dòng chảy và tránh tạo bọt khí.
Bọt khí sẽ tạo nên những lỗ hổng trong pha tĩnh, làm giảm hiệu năng của cột, vì

buffer có xu hướng đi theo những lỗ hổng, không tiếp xúc được với pha tĩnh.
7. Để gel ổn định trong 2-3 phút. Sau đó, đặt một cái cốc nhỏ ở dưới cột, mở van,
cho buffer chảy qua từ từ. Khi pha tĩnh đã ổn định, mở van hoàn toàn vài giây để
kiểm tra dòng chảy (ít nhất là 20 giọt/phút), sau đó khóa van lại.
8. Đo chiều dài của pha tĩnh trong cột.
Cho mẫu vào và rửa cột như sau:
9. Cho 20mL dịch chiết lòng trắng trứng vào cột theo thứ tự sau. Bỏ đi phần buffer
thừa bằng cách hút nhẹ nhàng, tránh làm nhiễu loạn đến phần đỉnh của pha tĩnh.
Sau đó cho buffer chảy ra khỏi cột tới khi chỉ còn 1-2mm buffer ở phần trên của
pha tĩnh. Đóng van lại. Dùng Pasture pipet cho từ từ dịch chiết lòng trắng trứng
vào đỉnh cột.
10.Đặt một cái erlen sạch 50mL ở dưới cột, mở van cho các chất chảy ra khỏi cột vào
erlen cho tới khi còn ít hơn 1-2mm dịch chiết lòng trắng trứng ở phía trên pha tĩnh.
Đóng van lại và nhẹ nhàng rửa các mặt bên của cột bằng 0,5 ml buffer Tris/NaCl.
Mở van và cho chất rửa chảy qua cho tới khi còn lại ít hơn 1-2mm dịch chiết lòng
trắng trứng ở phía trên pha tĩnh. Lập lại thao tác tháo và rửa này thêm 1 lần nữa
với 0,5 ml Tris buffer. Dòng chất lỏng chảy vào cốc gọi là chất rửa cột.
11.Sau khi rửa cột lần thứ 2, cho buffer A vào đầy cột. Đổ 25ml buffer A bộ phận
phối trộn của hệ thống gradient. Bắt đầu dòng chảy của buffer qua ống chích mẫu
của hệ thống gradient, kẹp ống chích mẫu lại để ngăn chặn dòng chảy ngay tại
miệng ống, gắn ống vào đỉnh cột.
12.Chuẩn bị 25 ổng thí nghiệm sạch có nắp đậy. Lấy 3 ml nước vào 1 ống và đánh
dấu mực nước. Đánh dấu tất cả các ống ở cùng mức này. Xếp các ống thành hàng
sao cho ống số 1 sẽ nhận chất rửa cột. Mở ống nối giữa bộ phận khuấy trộn và cột.
14
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Mở van ở đáy cột và thu chất rửa cột và ống thí nghiệm số 1. Khi ống đã chứa đầy
3ml, chuyển sang ống tiếp theo.
13.Cho buffer A từ bộ phận khuấy trộn chảy qua cột vào erlen cho tới khi thu được 7
phần. Nếu dòng chảy quá khó có thể mở nắp cột và khấy nhẹ trên khoảng 1cm

đỉnh cột. Sau khi thu được 7 phần, ngừng dòng chảy bằng cách khóa van ở đáy cột
lại.
14.Cho thêm buffer A vào bộ phận khuấy trộn cho được thể tích là 25ml. Mở van
giữa 2 bộ phận khuấy trộn đủ để 1 ít buffer A chảy qua ống chích mẫu vào bộ
phận trộn mẫu và bài hết khí trong ống. Sau đó đóng van chặt lại. Không được có
bọt khí trong ống chích mẫu. Tiếp theo, đổ 25ml buffer B (0.050 M Tris/1.0 M
NaCl, pH 8.2) và bộ phận trộn mẫu. Hệ thống rửa giải gradient đã sẵn sàng.
15.Mở van giữa các bộ phận trộn mẫu và bắt đầu khuấy nhẹ. Mở khóa cột, tiếp tục
thu 3ml các phần cho tới khi hầu hết các dung dịch gradient đã được dùng hết. Khi
dòng buffer nồng độ muối thấp chảy qua bộ phận phối trộn, dòng buffer nồng độ
muối cao chảy vào từ bộ phận trộn mẫu và được trộn với nhau.
16.Tiếp tục thu hồi 3ml các phần cho tới khi dung dịch gradient hết (tổng cộng có 20-
25 phần).
2. Phương pháp kết tinh tinh thể lysozyme 4 cạnh
Kết tinh lysozyme trong lòng trắng trứng
Có rất nhiều cách để kết tinh lysozyme trong lòng trắng trứng. Đặc điểm phổ biến
chính của của các phương pháp này được đề cập dưới đây.
Chú ý: để bảo vệ các mẫu thử khỏi bị nhiễm vi khuẩn và nấm, phải cho 0,02% (w/v)
Sodium azide (NaN
3
) trong tất cả các dung dịch sử dụng. Lọc tất cả các dung dịch này
qua giấy lọc 0,22μm.
Có 2 kỹ thuật kết tinh lysozyme chính, không chỉ sử dụng để kết tinh lysozyme mà
còn sử dụng cho hầu hết các loại protein khác là: hanging drop và sitting drop. Điểm khác
nhau cơ bản giữa 2 kỹ thuật này là thể tích của giọt protein lớn lên trong mỗi tinh thể.
Đối với hanging drop, thể tích trung bình của giọt protein vào khoảng 1-5μL, còn đối với
sitting drop thì thể tích này vào khoảng 10-20μL.
 Phương pháp kết tinh lysozyme 1
Những tinh thể thu được bằng phương pháp này thích hợp cho non-frozen X-Ray data
collection.

1. Chuẩn bị 75mg/ml mẫu lysozyme trong NaAc 0,1M pH 4,8.
15
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
2. Pha dung dịch gồm 1ml của dung dịch NaCl 6,5% (w/v) và dung dịch NaAc 0,1M
pH 4,8.
3. Cho vào dụng cụ tạo giọt 5-7μL dung dịch lysozyme và 5-3μL dung dịch đã pha ở
bước 2. Tổng cộng là 10μL.
4. Bịt kín dụng cụ tạo giọt bằng mỡ hoặc dầu.
5. Tinh thể sẽ phát triển trong vòng 1-2 ngày.
Nên làm một loạt các khay kết tinh với nhiều tỷ lệ protein/dung dịch và với các nồng
độ lysozyme từ 50mg/ml và 75mg/ml.
 Phương pháp kết tinh lysozyme 2
Các tinh thể tạo thành theo các điều kiện này thích hợp với phương pháp thu hồi X-
Ray nhiệt độ thấp (low temperature X-Ray data collection), vì sự có mặt của hợp chất
cryo-protective trong điều kiện kết tinh lysozyme.
1. Chuẩn bị 75mg/ml mẫu lysozyme trong dung dịch NaAc 0,1M pH=4,8.
2. Dung dịch pha gồm 1 ml dung dịch NaCl 10% (w/v), NaAc pH 4,8 và ethylene
glycol 25% (w/v).
3. Cho vào dụng cụ tạo giọt 6-7μL dung dịch lysozyme và 4-3μL dung dịch đã pha ở
bước 2. Tổng cộng là 10μL.
4. Bịt kín dụng cụ tạo giọt bằng mỡ hoặc dầu.
5. Tinh thể sẽ phát triển trong vòng 1-2 ngày, rồi mang đi làm lạnh.
Nếu kích thước tinh thể không thích hợp cho sự phân tích sau này, nên thực hiện một
loạt các khay với nhiều tỷ lệ protein/dung dịch và với các nồng độ lysozyme từ 50mg/ml
và 75mg/ml.
16
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme

Hình 4: Tinh thể lysozyme 4 cạnh
Bảng 3: Tính chất của 2 loại tinh thể lysozyme

Name: Triclinic Lysozyme Tetragonal Lysozyme
Space group: P 1 P 4
3
2
1
2
Length a (Å): 26,5 79,0
Length b (Å): 31,0 79,0
Length c (Å): 33,5 38,0
Alpha (°): 88,0 90,0
Beta (°): 107,0 90,0
Gamma (°): 112,0 90,0
VI. Những quy định về sản phẩm
Tùy mục đích sử dụng enzyme và tùy từng nước, những quy đình về sử dụng enzyme
trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khi sử dụng như phụ gia thực phẩm là phức tạp
nhất, và chặt chẽ hơn khi sử dụng enzyme trong các quá trình công nghiệp khác.
Đối với các enzyme tách từ các cơ thể biến đổi di truyền (GMO), còn có thêm các quy
định bổ sung khác. Ví dụ: mô tả cách thiết kế gen, trong sản phẩm phải không có GMO.
Độ sạch của chế phẩm enzyme dùng trong thực phẩm cũng được quy định nghiêm ngặt.
17
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Ví dụ: Luật của Pháp quy định về hàm lượng các chất, vi sinh vật, kim loại nặng trong
chế phẩm như sau.
Bảng 4: Quy định của Pháp về chế phẩm enzyme
Cadmium, thủy ngân < 0,5 mg/kg
Arsen < 3 mg/kg
Chì < 10 mg/kg
Aflatoxin < 0,005 mg/kg
Tổng số vi sinh vật < 50 000/g
Samonella Không có trong 25g

Coliforms < 30/g
Staphylococcus aureus Không có trong 1g
Hoạt tính kháng sinh Không có
Bảng 5: Chỉ tiêu chất lượng của lysozyme
Nguồn Lòng trắng trứng gà
Cảm quan Bột vô định hình
Tro ≤ 2%
Độ ẩm ≤ 8%
pH 3,0 – 4,5
Độ tan ≥ 95%
Bulk Density ≥ 0,34g/ml
Chloride ≤ 3,5%
Tổng số vi khuẩn hiếu khí ≤ 100/g
Tổng nấm men, mốc ≤ 10/g
Hoạt độ ≥ 95%
18
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
 Một số sản phẩm lysozyme từ lòng trắng trứng
1. Số hiệu sản phẩm L6876 (thẩm tách, làm khô lạnh, hoạt độ 50000 un/mg)
Đặc điểm vật lý Bột khô lạnh
Khối lượng phân tử Mạch đơn 14,7 kDa
Thành phần Protein ≥90%
Nhiệt độ bảo quản -20
o
C
Hình dạng Tinh thể 3 chiều
Ứng dụng Phá hủy thành tế bào vi khuẩn, dùng để tạo tế bào trần.
Xác định hoạt tính Một đơn vị hoạt độ sẽ tạo ra một sự thay đổi độ hấp thu của hỗn
hợp gồm Micrococcus lysodeikticus đã đình chỉ hoạt động trong
2,6ml hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 450nm là 0,001/phút.

Độ tinh sạch Được thẩm tách và làm lạnh khô, có chứa muối Natri acetate và
Natri chloride
2. Số hiệu sản phẩm L7651 (rây phân tử, làm khô lạnh, hoạt độ 50000 un/mg)
Đặc điểm vật lý Bột khô lạnh
Khối lượng phân tử Mạch đơn 14,7 kDa
Thành phần Protein ≥90%
Nhiệt độ bảo quản -20
o
C
Hình dạng Tinh thể 3 chiều
Ứng dụng Phá hủy thành tế bào vi khuẩn, dùng để tạo tế bào trần.
Xác định hoạt tính Một đơn vị hoạt độ sẽ tạo ra một sự thay đổi độ hấp thu của hỗn
hợp gồm Micrococcus lysodeikticus đã đình chỉ hoạt động trong
2,6ml hỗn hợp phản ứng pH 6,24 nhiệt độ 25
o
C ở bước sóng
450nm là 0,001/phút.
Độ tinh sạch Có độ tinh sạch cao do kết tinh và thẩm tách nhiều lần.
Không có muối trong sản phẩm.
19
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
3. Số hiệu sản phẩm L7001 (làm khô lạnh, hoạt độ 50000 un/mg)
Đặc điểm vật lý Bột khô lạnh
Khối lượng phân tử Mạch đơn 14,7 kDa
Thành phần Protein ≥85%
Nhiệt độ bảo quản -20
o
C
Hình dạng Tinh thể 3 chiều
Ứng dụng Phá hủy thành tế bào vi khuẩn, dùng để tạo tế bào trần.

Xác định hoạt tính Một đơn vị hoạt độ sẽ tạo ra một sự thay đổi độ hấp thu của hỗn
hợp gồm Micrococcus lysodeikticus đã đình chỉ hoạt động trong
2,6ml hỗn hợp phản ứng pH 6,24 nhiệt độ 25
o
C ở bước sóng
450nm là 0,001/phút.
Độ tinh sạch Bột khô lạnh có chứa Natri acetate và Natri chloride.
4. Số hiệu sản phẩm L7773 (filled vô trùng, làm khô lạnh, hoạt động 50000 un/mg)
Đặc điểm vật lý Bột khô lạnh
Khối lượng phân tử Mạch đơn 14,7 kDa
Nhiệt độ bảo quản -20
o
C
Hình dạng Tinh thể 3 chiều
Ứng dụng Phá hủy thành tế bào vi khuẩn, dùng để tạo tế bào trần.
Xác định hoạt tính Một đơn vị hoạt độ sẽ tạo ra một sự thay đổi độ hấp thu của hỗn
hợp gồm Micrococcus lysodeikticus đã đình chỉ hoạt động trong
2,6ml hỗn hợp phản ứng pH 6,24 nhiệt độ 25
o
C ở bước sóng
450nm là 0,001/phút.
5. Số hiệu sản phẩm L2879 (Chloride, làm khô lạnh, hoạt độ 60000 un/mg)
Đặc điểm vật lý Bột khô lạnh
Khối lượng phân tử Mạch đơn 14,3 kDa
Thành phần Protein ~90%
20
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
Nhiệt độ bảo quản -20
o
C

Hình dạng Tinh thể 3 chiều
Ứng dụng Phá hủy thành tế bào vi khuẩn, dùng để tạo tế bào trần.
Xác định hoạt tính Một đơn vị hoạt độ sẽ tạo ra một sự thay đổi độ hấp thu của hỗn
hợp gồm Micrococcus lysodeikticus đã đình chỉ hoạt động trong
2,6ml hỗn hợp phản ứng pH 6,24 nhiệt độ 25
o
C ở bước sóng
450nm là 0,001/phút.
Độ tinh sạch Bột khô lạnh có chứa Natri acetate và Natri chloride.
VII. Ứng dụng
1. Trong Công nghệ thực phẩm
Lysozyme được sử dụng trong công nghệ thực phẩm như là một chất bảo quản.
Lysozyme được sử dụng rộng rãi ở Nhật, người Nhật có rất nhiều bằng sáng chế về cách
sử dụng lysozyme trong thực phẩm (Proctor và Cunningham, 1991). Ở Mỹ, lysozyme
đang chờ được chấp nhận sử dụng và đã được xếp vào loại an toàn nói chung (GRAS:
Generally Recognized as Safe) bởi FDA. Năm 1968, Yajima tìm ra rằng lysozyme là một
chất ức chế mạnh vi khuẩn hiochi trong rượu sake. Hoạt động enzyme của lysozyme
không bị mất trong suốt quá trình thanh trùng và giữ nguyên trong vòng 1 năm ở nhiệt độ
phòng. Hỗn hợp Lysozyme-glycine ở nồng độ 1,5% được sử dụng để kéo dài thời hạn sử
dụng của salad khoai tây ở nhiệt độ 35-37
o
C từ 23h đến 43h (Nakagawa và Maeshigi,
1980).
a. Trong sản xuất phô mai
Vi khuẩn sinh acid butyric Clostridium trybutyricum là một vấn đề trong công nghiệp
sản xuất phô mai vì nó có thể sống sót ở nhiệt độ xử lý nhiệt bình thường của sữa sử dụng
trong ngành công nghiệp sản xuất phô mai, gây ra sự nở hoa muộn (late blowing) trong
phô mai. Sự nở hoa muộn là sự tạo thành khí trong suốt quá trình lên mên butyric xảy ra
trong quá trình ủ chín phô mai tạo nên những kết quả không mong muốn như: lỗi trong
21

Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
cấu trúc thông qua sự phát triển của những mắt có hình dáng không đúng (irregular-
shaped eyes), tạo mùi vị không mong muốn và khối phô mai có thể bị vỡ ra hoàn toàn.
 Lợi ích của việc sử dụng lysozyme trong sản xuất phô mai
• Có thể thay thế cho các chất bảo quản nhân tạo khác như nitrate.
• Giữ được hương vị trong quá trình chín.
• Loại trừ được nghiễm chéo về sau khi sử dụng máy móc để loại bỏ vi khuẩn ví
dụ như máy ly tâm.
• Có thể thêm một lượng nhỏ lysozyme vào máy móc loại bỏ vi khuẩn để chống
nhiễm chéo trong suốt quá trình làm phô mai.
• Không cần đầu tư cao mà vẫn chống lại vi khuẩn gây nở hoa muộn một cách
hiệu quả.
 Loại phô mai sử dụng lysozyme: Caciocavallo, Edam, Appenzeller, Swiss, Baby
Swiss, Tilsit, Provolone, Gouda, Emmental, Svecia, Parmesan, Spalen, Montasio, Danbo,
Sapsago, Asiago, Trappist, Romano…
b. Trong chế biến thịt
Sử dụng lysozyme trong thịt đã được nghiên cứu rộng rãi. Lysozyme đã được sử dụng
để bảo quản các sản phẩm của thịt, có thể dùng một mình hoặc kết hợp với các chất khác
như NaCl hay NaNO
2
.
c. Màng chống vi sinh vật trong bảo quản các sản phẩm từ cá
 Màng bao có thể ăn được
Những biến đổi về vật lý, hóa học và vi sinh học xảy ra trong suốt quá trình bảo quản
các sản phẩm sẵn sàng ăn ngay làm ảnh hưởng đến chất lượng và thời gian bảo quản của
những sản phẩm này khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Những sản phẩm này thường bị nhiễm
chéo làm giảm thời gian bảo quản (Cha và Chinnan, 2004).
Nguyên nhân chính của ngộ độc thực phẩm là do sự phát triển của các vi sinh vật trên
bề mặt của sản phẩm. Màng bao chống vi sinh vật có tác dụng bảo vệ làm chậm trễ sự hư
hỏng của thực phẩm khi màng này kết hợp chặt chẽ với tác nhân chống vi sinh vật, do đó

làm tăng thời gian bảo quản của sản phẩm thực phẩm. Tác dụng của tác nhân chống vi
sinh vật trong màng là tạo ra một môi trường bên trong màng ngăn cản sự phát triển của
vi sinh vật trên bề mặt của sản phẩm. Các tác nhân chống vi sinh vật được liên kết chặt
chẽ vào màng có thể ăn được và được giải phóng lên bề mặt của thực phẩm. Màng này
cũng có tác dụng chống thấm nước và oxy. Những màng này có tác dụng bảo vệ rất tốt
ngay cả khi đã mở bao gói thực phẩm.
Các chất chống vi sinh vật có thể được gắn lên bề mặt của vật liệu bao gói thực phẩm
hoặc bao trực tiếp lên bề mặt thực phẩm. Sau đó enzyme được giải phóng vào thực phẩm
22
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
từ vật liệu bao gói do đó ức chế được sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. Ngoài tác
dụng chính chống lại vi sinh vật gây bệnh, những màng ăn được còn có tác dụng kiểm
soát sự lưu thông khí làm giảm sự oxy hóa đối với những sản phẩm nhạy cảm với oxy.
Những màng này cũng có tác dụng giữ lại hương vị của sản phẩm trong suốt thời gian
bảo quản và cải thiện các đặc tính cơ lý của sản phẩm. Các tính chất cảm quan như màu
sắc và sự bóng sáng cũng được cải thiện.
Màng ăn được này có thể là màng polysaccharide, protein hay lipid. Polysaccharide
thường được sử dụng là alginate. Alginate tách ra từ tảo nâu thuộc lớp Phaephyceae.
Alginate là muối của alginic acid, đây là một polymer mạch thẳng của D-mannuronic và
L-guluronic acid. Tác động qua lại giữa alginate và các cation hóa trị 2 và 3 dẫn đến sự
tạo thành màng alginate, thường sử dụng nhất là ion calcium. Gel alginate Ca liên kết với
tác nhân chống vi sinh vật đã được sử dụng để bảo quả sản phẩm thực phẩm chống lại
những vi sinh vật không mong muốn.
2. Trong y học
Như đã biết, lysozyme là chất kháng khuẩn tự nhiên có trong các chất lỏng của cơ thể
như nước mắt, nước bọt, máu… Một vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo các đường: mắt,
mũi, vết cắt…sẽ gặp phải hệ thống miễn dịch của người trong đó có lysozyme. Tác dụng
kháng khuẩn này của lysozyme đã được khai thác trong ngành công nghiệp dược bằng
cách sản xuất ra các viên thuốc hay thuốc con nhộng có chứa enzyme này chữa các bệnh
nhiễm khuẩn. Lysozyme cũng là một thành phần quan trong trong thuốc nhỏ mắt, kem

đánh răng và kẹo ngậm chống đau cổ.
VIII. Thành tựu khoa học: Cố định lysozyme trên NaY zeolite
Lysozyme đã được cố định trên rất nhiều chất rắn không tan. Gần đây, zeolite và
những vật liệu có liên quan đến zeolite được xem là một vật liệu mới đầy triển vọng cho
việc cố định enzyme. Loại vật liệu này có những ưu điểm như:
- Chiều dài lớn mà không bị co lại hay phồng lên.
- Có thể dễ dàng sản xuất một lượng lớn.
- Thời gian tái sinh ngắn.
- Dễ dàng tiệt trùng ở nhiệt độ cao và rẻ tiền.
- Có thể cho vào các dung dịch hữu cơ để tinh sạch các enzyme không ưa nước
bằng phương pháp màng.
Người ta thường sử dụng zeolite A, X và Y để cố định enzyme. Các loại zeolite này
có cấu trúc tinh thể aluminosilicate tích điện âm với công thức hóa học là
[Na
x
(AlO
2
)
x
(SiO
2
)
y
].zH
2
O, gồm các tam diện SiO
4
và tứ diện AlO
4
-

liên kết với nhau bằng
cách chia sẻ 1 nguyên tử O tạo thành khung tích điện âm với những cái lỗ hổng chứa các
cation hoặc nước. Kích thước tinh thể của zeolite khoảng 0,5 – 1,0µm. Tổng diện tích bề
mặt của zeolite X và Y khoảng 800m
2
/g và đường kính mỗi lỗ khoảng 7 – 8Å, gấp 2 lần
so với zeolite A. Tỷ số Si/Al trong zeolite A, X và Y lần lượt là 1,0; 1,23 và 2,43. Cấu
23
Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
trúc và và thành phần của zeolite có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính xúc tác và có
một tỷ số Si/Al tối ưu. Người ta đã chứng minh được rằng loại zeolite NaY có tính bền
cao.
Cho đến bây giờ, cơ chế hấp phụ protein trên zeolite vẫn chưa được nghiên cứu chi
tiết và có rất ít thí nghiệm nghiên cứu về việc tinh sạch protein bằng vật liệu zeolite, cũng
như có chế và mô hình hấp phụ lysozyme trên zeolite NaY chưa được nghiên cứu. Trong
nghiên cứu này, lysozyme cố định trên zeolite NaY có tác dụng hiệu quả đối với việc phá
vỡ tế bào Micrococcus lysodeikticus. Sự hấp phụ lysozyme trên zeolite NaY được nghiên
cứu ở các điều kiện pH, lực ion của dung dịch đệm và nhiệt độ khác nhau. Tính chất hấp
phụ phản ánh khả năng hấp phụ cực đại và độ mạnh của liên kết với Zeolite NaY.
IX. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, Công nghệ sinh học tập 3: Enzyme và
ứng dụng, NXB Giáo dục, 2006.
2. Đại học dược Hà Nội Bộ môn Hóa sinh, Hóa sinh học, NXB Tin học, 2004.
3. Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, Công nghệ enzyme, NXB Nông Nghiệp TP.HCM,
1998.
4. />5. />6. />7. />Key_Resources/Lysing_Enzymes.html
8. />9.
10. />11. />12.
13.
14. />15. />16. />24

Đồ án chuyên ngành công nghệ thực phẩm Tìm hiểu về enzyme lysozyme
KẾT LUẬN
Đồ án chuyên ngành đã giúp em làm quen với việc tìm, phân tích và dịch tài liệu,
biết cách áp dụng những kiến thức đã học trong các môn học hóa sinh, sinh học và phân
tích thực phẩm, học hỏi được nhiều kinh nghiệm của thầy cô và tìm hiểu được một số
kiến thức mới.
Đối với bài đồ án này, việc tìm hiểu và tổng hợp tài liệu ở nhiều nguồn khác nhau
và cũng có một số ý kiến khác biệt giữa các tài liệu vì thế không thể tránh khỏi sai sót.
Trong quá trình thực hiện đồ án này, em xin chân thành cám ơn sự chỉ dẫn tận tình
của cô Đống Thị Anh Đào và em mong được sự hướng dẫn và góp ý thêm của các thầy
cô, để đồ án được hoàn chỉnh hơn.
25