Tình hình nhiễm Enterococcus Faecalis trên bệnh nhân có hội chứng tiết dịch ở âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 10-2014 - 3- 2015

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hội chứng tăng tiết dịch âm đạo là tình trạng âm đạo tăng tiết dịch do sự
phát triển quá mức của các loại vi sinh vật có trong âm đạo. Hội chứng này do
rất nhiều nguyên nhân gây ra, nhưng được biết đến với ba nguyên nhân chính
là vi khuẩn, vi rút và kí sinh trùng. Trong số những nguyên nhân kể trên có
một nguyên nhân mà ít được biết đến nhưng gây hậu quả không kém phần
quan trọng, đó là do loài vi khuẩn Enterococcus faecalis (E. faecalis) gây nên.
E. faecalis trước đây được phân loại vào nhóm liên cầu D, là một vi
khuẩn bắt màu Gram dương, thuộc họ vi khuẩn chí bình thường của đường
ruột. E. faecalis là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra nhiễm trùng
bệnh viện [1], chúng gây nhiễm trùng đường tiết niệu sinh dục, nhiễm khuẩn
huyết, viêm nội tâm mạc…Tại Việt Nam, theo một nghiên cứu tại bệnh viện
quân y 103, trong vòng 3 năm, trên tổng số 49 bệnh nhân nhiễm trùng đường
tiết niệu, tỉ lệ E. faecalis phân lập được là 55,1 % [2].
Ở phụ nữ nhiễm E. faecalis đường sinh dục gây hội chứng tiết dịch âm
đạo, bệnh nhân có biểu hiện tăng tiết dịch âm đạo, gây cảm giác ngứa ngáy
khó chịu, ảnh hưởng tới chất lượng cuộc sống và nếu điều trị không đúng
cách thì bệnh có thể để lại di chứng nặng nề, chẳng hạn vô sinh, tăng nguy cơ
chửa ngoài tử cung, viêm vùng chậu dai dẳng nếu bệnh nhân không được phát
hiện sớm và điều trị kịp thời [3]. Bệnh nhân có thể dễ dàng được điều trị bệnh
bằng cách sử dụng các loại kháng sinh như penicillin, ampicillin, và
vancomycin Tuy nhiên có một điều đáng lo ngại là gần đây số lượng các
chủng E. faecalis kháng với các loại kháng sinh này ngày càng tăng, đặc
biệt là kháng vancomycin khiến cho việc điều trị bệnh gặp nhiều khó khăn
[4]. Để góp phần vào chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn, giúp cho
2
bệnh nhân cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống, chúng tôi thực hiện
nghiên cứu: “Tình hình nhiễm Enterococcus Faecalis trên bệnh nhân có
hội chứng tiết dịch ở âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung
ương từ 10/2014 - 3/2015” Với mục tiêu:

1. Xác định tỷ lệ nhiễm Enterococcus faecalis trên bệnh nhân có hội
chứng tiết dịch âm đạo đến khám và điều trị tại Bệnh viện Da liễu
Trung ương từ 10/2014 -03/2015.
2. Đánh giá sự kháng kháng sinh của các chủng Enterococcus faecalis
phân lập được.
3.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Liên cầu khuẩn:
1.1.1. Lịch sử về liên cầu khuẩn:
Liên cầu được Billroth mô tả lần đầu tiên vào năm 1874 từ mủ của các
tổn thương viêm quầng và các vết thương bị nhiễm trùng.
Năm 1880, Pasteur phân lập được liên cầu ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết.
Sau đó Ogston (1881), Rosenbach (1884) đã nghiên cứu kỹ về tổ chức
bệnh lý.
Năm 1919, Brown đã xếp loại liên cầu theo những hình thái tan máu
khác nhau khi chúng phát triển trên môi trường thạch máu:
+ Tan máu (β): vòng tan máu trong suốt, hồng cầu bị phá hủy hoàn toàn.
Hình thái tan máu này gặp chủ yếu ở liên cầu nhóm A, ngoài ra còn có thể gặp
ở các nhóm B, C, G, F.
+ Tan máu (α): tan máu không hoàn toàn, xung qunh khuẩn lạc có vòng
tan máu màu xanh, thường gặp ở liên cầu viridans.
+ Tan máu (γ): xung quanh khuẩn lạc không nhìn thấy vòng tan máu.
Hồng cầu trong thạch vẫn giữ màu hồng nhạt, thường gặp đối với liên cầu
nhóm D.
Năm 1930, Lancefield dựa vào kháng nguyên C (Carbohydrat) của vách
tế bào vi khuẩn để xếp liên cầu thành các nhóm A, B, C, … R.
Sherman dựa vào tính chất sinh hóa xếp liên cầu thành các nhóm:

+ Streptococcus pyogenes.
+ Streptococcus viridans.
+ Streptococcus faecalis (hiện nay là Enterococcus faecalis).
4
1.1.2. Tình hình nhiễm E. faecalis và sự kháng kháng sinh của E. faecalis
trên thế giới.
1.1.2.1. Tình hình nhiễm E. faecalis trên thế giới
Trong một cuộc khảo sát được thực hiện tại Hoa Kỳ từ năm 1986 đến
năm 1997, E. faecalis xuất hiện ở vị trí thứ hai trong danh sách năm tác nhân
gây bệnh hàng đầu [5]. E. faecalis gây ra 80-90% trường hợp nhiễm khuẩn
đường ruột [6].
1.1.2.2. Tình hình kháng kháng sinh của E. faecalis trên thế giới
Enterococci là vi khuẩn đề kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh như
các kháng sinh thuộc phân nhóm cephalosporin, các kháng sinh nhóm
aminoglycoside (trừ các aminoglycoside có nồng độ cao), clindamycin và co-
trimoxazol nên hiệu quả lâm sàng của các kháng sinh này trong việc điều trị
nhiễm khuẩn do Enterococci là kém, mặc dù kết quả kháng sinh đồ trên
invitro có thể là nhạy cảm.
Enterococci là vi khuẩn nhạy cảm tự nhiên với penicillin G và ampicilin
nhưng so với các Streptococci khác chúng kém nhạy cảm 10 - 1000 lần. Khả
năng đề kháng của vi khuẩn này ngày càng tăng, kể cả với các kháng sinh
penicillin.
Vancomycin là thuốc được lựa chọn để thay thế khi bệnh nhân bị dị ứng
với penicillin trong điều trị nhiễm trùng E. faecalis, tuy nhiên hiện nay tình
hình E. faecalis kháng vancomysin đang đến mức báo động. Kể từ khi báo
cáo đầu tiên vào năm 1988, tỉ lệ Enterococci kháng vancomycin đã tăng từ
0,3% chủng trong 1989-1993 đến 12% trong 1998-2002 [7], dữ liệu gần đây
cho thấy rằng có đến 3% của E. faecalis kháng vancomycin [8], đặt ra thách
thức trong điều trị .
5

1.1.3. Tình hình nhiễm E. faecalis và sự kháng kháng sinh của E. faecalis
tại Việt Nam.
1.1.3.1. Tình hình nhiễm E. faecalis tại Việt Nam
Nghiên cứu tại bệnh viện quân y 103, trong số 31 trường hợp nhiễm
trùng tiết niệu có liên quan đến gia cầm, đã phát hiện 7 trường hợp (23%)
dương tính với E. faecalis [9]. Cũng một nghiên cứu khác được thực hiện tại
đây, trong tổng số 49 bệnh nhân nhiễm trùng đường tiết niệu, E. faecalis là
nguyên nhân gây ra 55,1% số ca nhiễm khuẩn [1].
1.1.3.2. Tình hình kháng kháng sinh của E. faecalis tại Việt Nam
Theo một nghiên cứu tại bệnh viện Hoàn Mỹ, Đà Nẵng, thì oxacillin và
azithromycin đều bị kháng ở các mẫu thử nghiệm với Enterococci, các kháng
sinh còn hiệu lực tốt với Enterococci là ofloxacin, piperacillin/tazobactam,
vancomycin và teicoplanin: nhạy cảm 100%; cefoperazon/sulbactam và
moxifloxacin: nhạy cảm 75%. Còn lại các kháng sinh thường dùng khác đều
bị đề kháng từ 33-50% [10].
1.1.4. Đặc điểm sinh học
1.1.4.1. Hình thể và tính chất bắt màu
6
Hình 1.1. Vi khuẩn E. faecalis nhuộm Gram
E. faecalis là những cầu khuẩn bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi
dài ngắn khác nhau, không di động, đôi khi có vỏ, đường kính 0,6 – 1 μm .
1.1.4.2. Tính chất nuôi cấy
E. faecalis là những vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện. Môi trường nuôi cấy
cần nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường,vv E. faecalis phát
triển thuận lợi trong khí trường có oxy hoặc có 5 – 10 % CO
2.
Nhiệt độ thích hợp cho E. faecalis sinh trưởng và phát triển là 30 - 35
o
C.
E. faecalis có thể sống sót trên các môi trường: pho mát- 180 ngày, đất lên

đến 77 ngày. Chúng không chịu được sự thanh trùng, ở môi trường có pH <
6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng. E. faecalis không tạo độc tố, lên men
glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường.
Hình 1.2. Khuẩn lạc của E. faecalis trên thạch máu
7
Sau khi nuôi cấy trong môi trường thạch máu 24h, E. faecalis tạo thành
những khuẩn lạc có đường kính từ 1-2mm mặc dù cũng xuất hiện nhiều kích
cỡ nhỏ hơn. E. faecalis gây tan máu beta trên thạch máu.
Trên môi trường lỏng, E. faecalis phát triển hình thành các chuỗi đến khi
đủ lớn thì tạo thành những hạt nhỏ hoặc những hạt như bông rồi lắng xuống
đáy ống. Vì vậy, sau 24h nuôi cấy, môi trường phía trên trong suốt, đáy ống
có nhiều hạt lắng cặn.
Các môi trường được sử dụng để nuôi cấy E. faecalis hiện được sử dụng
là: thạch máu, môi trường giàu dinh dưỡng (môi trường Columbia, môi
trường Todd – Hewitt), môi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn và các
loại môi trường chọn lọc giàu chất dinh dưỡng (môi trường selective LIM,
môi trường selective Todd – Hewitt).
1.1.4.3. Tính chất hóa sinh học
E. faecalis không có men catalase, chúng có khả năng phát triển trong
môi trường có mật, muối mật hoặc ethyl – hydrocuprein.
1.1.4.4. Cấu trúc kháng nguyên
E. faecalis là liên cầu có cấu trúc kháng nguyên phức tạp.Vì vậy ở đây
chỉ đề cập đến những kháng nguyên quan trọng liên quan đến độc lực, cơ chế
gây bệnh của liên cầu.
Kháng nguyên C: đặc hiệu nhóm
Đây là kháng nguyên nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Dựa vào carbohydrate
C, Lancefield xếp liên cầu thành các nhóm từ A đến R.
Kháng nguyên M: đặc hiệu typ
Kháng nguyên M cũng nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên
này, Lancefield xếp liên cầu nhóm A thành 80 type huyết thanh khác nhau.

Protein M nằm rải rác trên bề mặt tế bào, gắn ở rìa tế bào nên dễ dàng kết
hợp với kháng thể kháng protein M thậm chí ngay cả khi có mặt của acid
8
hyaluronic.
Ngoài ra, protein M có khả năng chống lại thực bào, vì vậy nó có liên
quan trực tiếp tới độc lực của liên cầu.Kháng nguyên M bị thủy phân bởi men
trypsin hoặc pepsin.
Những kháng nguyên khác của liên cầu
Kháng nguyên T: là protein của vách tế bào vi khuẩn, bị phá hủy bởi
nhiệt độ ở PH acid.
Kháng nguyên P: bản chất là nucleoprotein. Kháng nguyên này có phản
ứng chéo với nucleoprotein của tụ cầu.
Kháng nguyên R: bản chất là protein, nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Kháng
nguyên R có ở các typ M 2, 3, 28, 33, 43 và 48 của liên cầu nhóm A giống
như một số typ huyết thanh của nhóm khác như: nhóm B, G, C, L chúng có
phản ứng chéo giữa các typ huyết thanh hoặc giữa các nhóm.
Kháng nguyên R đề kháng với trypsin.
Glycerol teichoic acid: chiếm xấp xỉ 1% trọng lượng khô của tế bào, là
kháng nguyên đặc hiệu của nhóm D và N, không có ở các nhóm khác.
1.1.4.5. Các enzym và độc tố
Streptokinase
Năm 1939 Tillett và Garner đã mô tả streptokinase gồm 2 phân tử
nhỏ A và B.
Kháng nguyên này tìm thấy ở liên cầu nhóm A và một số liên cầu nhóm
khác. Streptokinase là kháng nguyên có khả năng kích thích cơ thể hình thành
kháng thể antitreptokinase. Streptokinase có khả năng làm tan tơ huyết, hoạt hóa
xung quanh vùng tổn thương vì thế tạo điều kiện để liên cầu lan tràn nhanh.
Streptodornase
Tillett đã mô tả enzyme treptodornase có 4 loại A, B, C, D và 4 loại này
là những kháng nguyên khác nhau, có khả năng kích thích cơ thể hình thành

9
kháng thể đặc hiệu. Streptodornase có khả năng phân hủy AND, do đó làm
lỏng mủ, nhưng nó chỉ có tác dụng khi có mặt của ion Mg.
Hyaluronidase
Thủy phân acid hyaluronic của tổ chức, tạo điều kiện cho vi khuẩn lan
tràn sâu rộng vào các mô. Enzym này là một kháng nguyên có khả năng kích
thích cơ thể hình thành kháng thể antistreptohyaluronidase.
DPNase
Được tìm thấy ở liên cầu nhóm A, C, G, là enzym có khả năng diệt bạch
cầu.Enzym này có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể.
Proteinase
Có khả năng thủy phân protein và có khả nang kích thích cơ thể hình
thành kháng thể.
Dung huyết tố
Liên cầu tan máu β có khả năng hình thành hai loại dung huyết tố:
Streptolysin O: dễ bị mất hoạt tính bởi oxy, vì thế trên môi trường nuôi
cấy, chúng gây tan máu ở phía sâu trong thạch. Độc tố này mang tất cả các
tính chất của một ngoại độc tố: đặc biệt là có tính kháng nguyên mạnh, vì thế
có khả năng kích thích cơ thể hình thành kháng thể (antistreptolysin O). Trong
chẩn đoán bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp, việc định lượng kháng thể
kháng streptolysin O là rất có giá trị.
Streptolysin S: có vai trò gây tan máu ở bề mặt của môi trường nuôi cấy.
Độc tố này không bị mất hoạt tính bởi oxy, tính kháng nguyên kém, vì vậy
không kích thích cơ thể hình thành kháng thể.
Độc tố hồng cầu
Bản chất là protein gây phát ban trong bệnh tinh hồng nhiệt.
Cơ chế hoạt động của độc tố chưa rõ rang, nhưng khi tiêm vào trong da
của trẻ em dễ mẫn cảm, có thể gây nên phản ứng ban đỏ tại chỗ, phản ứng đạt
10
cao nhất 24h sau khi tiêm. Khi bệnh nhân có kháng độc tố thì phản ứng ở da

âm tính (Disk test). Phản ứng Schultz – Charton: tiêm trong da một lượng
kháng độc tố tương ứng lúc cao điểm của bệnh tinh hồng nhiệt thì chỗ tiêm
mất ban đỏ.
1.1.5. Khả năng gây bệnh
E. faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thường của người, chúng là
một trong những nguyên nhân gây các nhiễm trùng cơ hội, đặc biệt là ở người
cao tuổi, bệnh nhân có các bệnh nặng và suy giảm miễn dịch, bệnh nhân nhập
viện trong thời gian dài, bệnh nhân được điều trị với thiết bị xâm lấn, hoặc
được điều trị với các kháng sinh phổ rộng. Các vi sinh vật này bắt đầu được
công nhận là nguyên nhân của nhiễm khuẩn bệnh viện với tần số lớn vào cuối
năm 1970, E. faecalis đã nổi lên như là một trong những thách thức hàng đầu
trong điều trị khi nó kết hợp với các nhiễm trùng nghiêm trọng hơn đe dọa tới
tính mạng con người. E. faecalis đã trở thành nguyên nhân xếp hàng thứ hai,
hoặc thứ ba của các nhiễm khuẩn bệnh viện đường tiết niệu, gây nhiễm trùng vết
thương (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng), và nhiễm khuẩn huyết [11].
1.1.6. Cơ chế bệnh sinh
Âm đạo là một xoang mở của cơ thể, chứa dịch tiết của đường sinh dục
nên trở thành môi trường sống lý tưởng của các vi sinh vật bao gồm cả các
loại vi khuẩn của da và các vi sinh vật từ đường ruột. Mỗi ml dịch âm đạo
chứa 108 -109 vi khuẩn bao gồm các vi khuẩn thường trú không gây bệnh và
những vi sinh vật cơ hội. Các tác nhân cơ hội (E. faecalis) sẽ gây bệnh khi
chúng hiện diện với số lượng cao và hoặc khi có đường vào. Các vi sinh vật
gây bệnh khi xâm nhập sẽ luôn gây ra tổn thương. Để tự bảo vệ, ngoài sự bền
vững của biểu mô vẩy, âm đạo còn cần có sự hiện diện và phát triển ưu thế
của chủng vi khuẩn bảo vệ là Lactobacilli (khoảng 7 loại, là trực khuẩn Gram
dương hiếu khí có nguồn gốc từ đường ruột).
11
Dưới tác dụng của estrogen trong lứa tuổi sinh đẻ, biểu mô âm đạo phát
triển với sự hình thành thêm lớp tế bào trung gian và lớp tế bào bề mặt chứa
nhiều glycogen. Khi tế bào bề mặt bong ra, Lactobacilli sử dụng nguồn

glycogen này và chuyển hóa thành acid lactic, làm cho môi trường âm đạo có
PH = 3,8 – 4,7. Ngoài nồng độ PH thấp giúp ngăn cản sự phát triển của các vi
sinh vật gây bệnh, trong âm đạo còn có những loại Lactobacilli tạo ra H
2
O
2
góp phần tiêu diệt các tác nhân gây bệnh khác. Thói quen thụt rửa âm đạo với
dung dịch sát khuẩn hoặc tự ý dung thuốc đặt âm đạo sẽ phá hủy phổ vi trùng
bình thường, tạo điều kiện cho các tác nhân gây bệnh phát triển.
Lượng Lactobacilli trong âm đạo của phụ nữ mang thai nhiều hơn phụ nữ
không mang thai. Tuy nhiên, sự cung cấp máu cho âm đạo tăng khi mang thai
làm tăng sự thẩm thấu của huyết thanh, kết quả là khí hư sinh lý cũng như
tính acid của âm đạo tăng lên. Ngoài ra, thai phụ có những thay đổi sinh lý
khác như tình trạng ức chế miễn dịch và nồng độ progesterone tăng làm tăng
khả năng kết dính của các tác nhân gây bệnh vào tế bào biểu mô âm đạo.
1.1.7. Chẩn đoán Enterococcus faecalis trong phòng thí nghiệm
Chẩn đoán E. faecalis gây hội chứng tiết dịch âm đạo là phát hiện hình
thể của vi khuẩn, nuôi cấy phân lập và phát hiện kháng nguyên, kháng thể.
Các phương pháp chẩn đoán E. faecalis trong phòng thí nghiệm được sử
dụng hiện nay bao gồm: nhộm soi, nuôi cấy phân lập, miễn dịch và sinh học
phân tử, cụ thể là:
+ Nhuộm Gram: Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn có hình cầu bắt
màu Gram dương, xếp thành chuỗi.
+ Nuôi cấy phân lập: Bệnh phẩm dịch tiết âm đạo được cấy vào môi
trường thạch máu, sau 24h, E. faecalis tạo thành những khuẩn lạc có đường
kính từ 1-2mm. E. faecalis gây tan máu beta trên thạch máu.
12
+ Thử nghiệm Catalase: giúp phân biệt với Staphylococci (cũng là cầu
khuẩn Gram dương).
+Thử nghiệm Bile Esculin: dương tính

+ Phản ứng ngưng kết Latex hoặc thử nghiệm huỳnh quang miễn dịch: để
định nhóm liên cầu khuẩn theo phân loại Lancefield.
13
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
Là 510 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám tại bệnh viện
Da liễu Trung Ương từ 10/2014 – 3/2015.
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn
Tất cả các bệnh nhân nữ có hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám và
đồng ý tham gia nghiên cứu và thực hiện đúng quy trình nghiên cứu.
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ
- Đang dùng thuốc kháng sinh trước thời điểm lấy bệnh phẩm ít hơn 7 ngày.
- Bệnh nhân HIV- AIDS có hội chứng tiết dịch âm đạo.
- Bệnh nhân đang hành kinh, rong kinh, rong huyết, xuất huyết âm đạo.
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.4. Vi khuẩn nghiên cứu
Vi khuẩn gây hội chứng tiết dịch âm đạo được đề cập đến trong nghiên
cứu là vi khuẩn Enterococcus faecalis.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Trang thiết bị - dụng cụ - hóa chất – sinh phẩm
2.2.1.1. Dụng cụ:
- Bàn khám phụ khoa.
- Săng phụ khoa.
- Mỏ vịt.
- Que cấy.
- Tăm bông vô trùng.
- Ống nghiệm vô trùng.
14

- Pipet vô trùng.
- Găng tay.
- Kính hiển vi với vật kính dầu.
- Lam kính.
- Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn.
- Đèn cồn.
- Thước đo vòng ức chế của kháng sinh với vi khuẩn.
2.2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm:
- Nước muối sinh lý 0,9 %.
- Nước cất vô trùng.
- Chủng khuẩn kiểm tra kháng sinh đồ: Enterococcus faecalis do WHO
cung cấp.
- Bộ thuốc nhuộm Gram.
- Các khoanh giấy kháng sinh.
Hình 2.1. Trang thiết bị, dụng cụ và sinh phẩm sử dụng cho
chẩn đoán E. faecalis.
Bảng 2.1. Các khoanh giấy kháng sinh
15
STT Kháng sinh Kí hiệu Nồng độ (µg) Hãng sản xuất
1 Penicillin P 10 OXOID
2 Ampicillin AM 10 OXOID
3 Vancomycin VA 30 OXOID
4 Erythrommycin E 15 OXOID
5 Tetracyclin TE 30 OXOID
6 Ciprofloxacin CIP 5 OXOID
7 Chloramphenicol CL 30 OXOID
8 Ceftriaxone CRO 30 OXOID
9 Cefotaxim CTX 30 OXOID
- Bộ xét nghiệm PathoDxtra Strep Grouping Kit
Thành phần bộ Kit gồm:

+ Que trộn phản ứng
+ Card phản ứng (1 gói DR0720G)
+ Card procedure
+ Latex: Nhóm latex
Strep A Grouping Latex (DR0701G)
Strep B Grouping Latex (DR0702G)
Strep C Grouping Latex (DR0703G)
Strep D Grouping Latex (DR0704G)
Strep F Grouping Latex (DR0705G)
Strep G Grouping Latex (DR0706G)
16
Sáu chai nhỏ giọt, mỗi loại đặc trưng cho mỗi nhóm A, B, C, D, F và G,
mỗi chai chứa hạt latex xanh nhạy cảm với kháng thể IgG của thỏ, hiệu quả
cho 60 test, với 0,098% sodium azide và 0,05% chất bảo quản ProClin 300.
Bảo quản 2 - 8
0
C; ổn định cho đến ngày hạn sử dụng ghi trên nhãn. Trước khi
dùng, hòa tan các hạt bằng cách vortex nhẹ nhàng chai hoặc bằng cách trộn
đảo ngược.
+ Đối chứng dương (DR0707G).
Một chai nhỏ giọt chứa 2,8ml kháng nguyên đa giá đối chứng bao gồm
chiết xuất kháng nguyên streptococci của những chủng đại diện cho nhóm A,
B, C, D, F và G. Dung dịch chứa 0,098% sodium azide như là chất bảo quản.
Bảo quản 2 - 8
0
C; ổn định cho đến ngày hạn sử dụng ghi trên nhãn.
+ Thuốc thử 1 (DR0709A)
Một chai chứa 4,0ml dug dịch sodium nitrite có màu xanh dương với
0,098% sodium azide như là chất bảo quản. Giữ thẳng đứng và vặn chặt nắp;
ổn định ở nhiệt độ phòng (15-30

0
C) cho đến hạn sử dụng ghi trên nhãn.
+ Thuốc thử 2 (DR0709B)
Một chai chứa 4,0ml dug dịch acid nhẹ (dung dịch acid acetic) và chỉ
thị màu tím. Giữ thẳng đứng và vặn chặt nắp; ổn định ở nhiệt độ phòng (15-
30
0
C) cho đến hạn sử dụng ghi trên nhãn.
+ Thuốc thử 3 (DR0709C)
Hai chai chứa 10ml dung dịch trung hòa không màu với 0,098%
sodium azide như là chất bảo quản. Giữ thẳng đứng và vặn chặt nắp; ổn định
ở nhiệt độ phòng (15-30
0
C) cho đến hạn sử dụng ghi trên nhãn.
17
2.2.2. Môi trường phân lập vi khuẩn Enterococus faecalis
E. faecalis là các vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện. Các môi trường để nuôi
cấy E. faecalis ủ ở 37
0
C ở tủ ấm bình thường hoặc tủ ấm có 5 – 10 % CO
2
.
- Môi trường thạch máu
- Môi trường Uriselect 4.
- Canh thang Todd – Hewitt.
2.2.3. Môi trường xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
Môi trường Mueller – Hinton.
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp mô tả cắt ngang
Các bước tiến hành:
Tư vấn

Giải thích rõ cho bệnh nhân hiểu về đề tài nghiên cứu, hướng dẫn điền
thông tin vào phiếu điều tra.
Phổ biến cho bệnh nhân kỹ thuật và vị trí lấy mẫu bệnh phẩm.
Kỹ thuật lấy bệnh phẩm [12][13]
Theo tài liệu Xét nghiệm Da liễu, Bộ y tế, Bệnh viện Da liễu Trung
ương, quy trình kỹ thuật lấy bệnh phẩm của WHO (1999):
Ở nữ giới: Lấy bệnh phẩm chủ yếu ở niệu đạo và cổ tử cung. Ngoài ra còn lấy
bệnh phẩm ở hai tuyến Skène, 2 tuyến Bartholin.
• Lấy bệnh phẩm ở cổ tử cung:
- Làm ẩm mỏ vịt bằng nước cất vô trùng, đặt mỏ vịt để bộc lộ cổ tử cung.
Dùng tăm bông vô trùng đưa nhẹ nhàng vào trong cổ tử cung sâu 2-3 cm,
xoay nhẹ tăm bông để 5-10 giây cho dịch thấm vào tăm bông, dàn mỏng bệnh
phẩm lên tiêu bản.
- Hai bên tuyến Skène và tuyến Bartholin: Lấy bệnh phẩm bằng que cấy
hoặc tăm bông vô trùng rồi dàn đều bệnh phẩm lên tiêu bản.
Chú ý khi lấy bệnh phẩm:
18
Đối với bệnh nhân chưa có gia đình hoặc bệnh nhân có thai không nên đặt
mỏ vịt mà chỉ dùng que cấy hoặc tăm bông lấy bệnh phẩm ở thành âm đạo.
Ở những phụ nữ đã cắt bỏ tử cung, mẫu được lấy ở cùng đồ sau của âm đạo.
2.3.5. Xác định vi khuẩn E. faecalis
- Kỹ thuật nhuộm Gram [12]
(1) Dàn bệnh phẩm lên trên lam kính sạch.
(2) Cố định bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội.
(3) Nhuộm:
Nhỏ dung dịch tím gentian, phủ kín nơi dàn đồ phiến, duy trì 1 phút.
Đổ dung dịch tím gentian, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.
Nhỏ dung dịch lugol, để 30 giây.
Đổ dung dịch lugol, rủa nước.
Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn 90% lên tiêu bản, nghiêng đi nghiêng lại để

cho cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia. Khi thấy màu tím trên lam kính vừa
phai thì rửa nước ngay.
Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin, để 1 phút.
Rửa nước kỹ, để tiêu bản khô, soi kính hiển vi.
- Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn:
Lấy bệnh phẩm như đối với kỹ thuật lấy bệnh phẩm nhuộm soi trực tiếp.
• Cấy bệnh phẩm trên môi trường thạch máu bằng kỹ thuật cấy phân
vùng hoặc cấy theo đường zíc zắc.
• Để đĩa thạch vào tủ ấm ở nhiệt độ 35-36
0
C, khí trường 3-10% CO2,độ
ẩm > 70%.
• Sau 18-24 giờ, quan sát xem đã mọc khuẩn lạc chưa, nếu chưa mọc, để
thêm 24 giờ nữa.
- Test Catalase:
Nhỏ 1 giọt hydroxyl peroxide 30% lên khuẩn lạc vi khuẩn đặt lên lam kính.
19
Nhận định kết quả: Staphylococci: có men catalase gây hiện tượng sủi
bọt (phản ứng dương tính) còn Streptococci: không có men catalase không
gây sủi bọt (phản ứng âm tính).
- Phản ứng xác định nhóm liên cầu khuẩn
Nguyên lý của kỹ thuật: Trong quy trình PathoDxtra, kháng thể đặc hiệu
trên các hạt latex phản ứng với kháng nguyên nhóm liên cầu khuẩn được chiết
xuất từ thành tế bào vi khuẩn và xảy ra ngưng kết. Trong trường hợp có mặt
kháng nguyên liên cầu khuẩn, các hạt nhạy cảm tạo thành một khối ngưng kết
hạt riêng biệt và có thể đọc được rõ ràng, ngược lại sự xuất hiện một màu
trắng đục đều là phản ứng âm tính.
Các bước tiến hành:
- Quá trình chọn khuẩn lạc có thể được xem là đủ khi lượng khuẩn lạc có
mặt đáp ứng được yêu cầu thử nghiệm (4 khuẩn lạc cho mỗi nhóm thuốc thử

hoặc 20 khuẩn lạc cho toàn bộ nhóm).
- Dùng tăm lấy mẫu 4 khuẩn lạc phân lập được (lấy nhiều hơn 4 khuẩn
lạc nếu lượng khuẩn lạc ít hoặc ít hơn 18h nuôi cấy).
- Dàn trải toàn bộ khuẩn lạc vào trung tâm của vòng tròn trên thanh
PathoDxtra.
- Lặp lại bước 1, 2 cho mỗi thuốc thử được sử dụng.
- Thêm 1 giọt Strep A Latex bằng cách bóp nhẹ vào chai theo vị trí thẳng
đứng vào ô tròn đầu tiên, sau đó nhỏ 1 giọt Strep B Latex vào ô thứ hai. Tiếp
tục tương tự, thêm Strep C, D, F, G Latex vào 4 ô còn lại.
- Trộn đều latex bằng một thanh que trộn, và sau đó làm sạch xung
quanh các ô tròn.
- Giữ thanh PathoDxtra dưới ánh sáng thích hợp và di chuyển nhẹ nhàng
qua lại. Phản ứng ngưng kết với thuốc thử latex thường xảy ra trong thời gian
khoảng 10 giây. Dừng lại khi có phản ứng rõ ràng xảy ra mà ta có thể quan sát
20
được và ghi lại kết quả. Không di chuyển thanh PathoDxtra dưới ánh sáng
quá 60 giây.
Cách đọc kết quả :
- Kết quả dương tính: Phản ứng dương tính xảy ra khi có thể nhìn thấy được
ngưng kết của các hạt latex trên nền thẻ trong khoảng 60 giây.
- Kết quả âm tính: Có màu xanh nhạt đồng bộ và không có ngưng kết sau 60
giây.
- Không có kết quả: Nếu ngưng kết xảy ra với hơn một loại thuốc thử, vấn đề
có thể được giải quyết như sau:
+ Ngưng kết yếu với nhiều loại thuốc thử latex và ngưng kết mạnh với
một loại thuốc thử. Giải thích: những phản ứng yếu thường là do một phản
ứng không đặc hiệu (ví dụ: Staphylococcus aureus) và phản ứng mạnh hơn
đặc hiệu là nhóm Streptococcal.
+ Ngưng kết xấp xỉ bằng với hơn một loại thuốc thử latex (hiếm có
trường hợp hơn hai). Giải thích: hai nhóm streptococcal với hình thái tương

tự và có khả năng tán huyết β-haemolysis cùng xuất hiện trên đĩa cấy. Kiểm
tra lại, sử dụng khuẩn lạc tinh khiết sau khi phân lập lại.
+ Có hơn một nhóm kháng nguyên có mặt trong thử nghiệm.
- Ngưng kết không đặc hiệu: Có ít nhất hai loại ngưng kết không đặc
hiệu có thể quan sát trong thử nghiệm latex.
Một vài chủng vi khuẩn có bao nhầy có thể không ngưng kết đặc hiệu
trên latex, có thể do bẫy vật lý của các hạt trong nguyên liệu được chiết xuất.
Điều này liên quan nhiều hơn khi sử dụng khuẩn lạc trực tiếp.
Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn E. faecalis:
- Nhuộm soi: bằng phương pháp nhuộm Gram, trên tiêu bản nhuộm, vi
khuẩn có hình cầu bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi.
21
- Nuôi cấy: Sau 18-24 giờ nuôi cấy, E. faecalis tạo thành những khuẩn lạc màu
tro xám, có đường kính khoảng 1 mm, dạng S, tròn, lồi, nhẵn, bóng. E.
faecalis gây tan máu beta trên thạch máu. Lấy khuẩn lạc nhuộm soi thấy cầu
khuẩn xếp chuỗi, bắt màu Gram dương. Trên môi trường thạch Uriselect 4, E.
faecalis cho khuẩn lạc màu xanh nhạt.
Hình 2.2. Vi khuẩn E. faecalis trên môi trường thạch Uriselect 4.
- Test Catalase:âm tính
- Phản ứng xác định nhóm liên cầu khuẩn: Quy trình PathoDxtra âm
tính
- Thử nghiệm Bile Esculin: dương tính
 Mục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin
và glucose khi có sự hiện diện của muối mật.
 Môi trường Bile Esculine Agar
22
Hình 2.3. Khuẩn lạc E. faecalis trên môi trường Bile Esculine Agar.
Đủ những tiêu chuẩn trên kết luận: E. faecalis (+).
Kỹ thuật kháng sinh đồ [12]
Nguyên lý: Kháng sinh được thấm vào những khoanh giấy tròn, thường

có đường kính là 6 mm, được đặt tại một điểm trên mặt đĩa thạch. Kháng sinh
từ khoanh giấy khuếch tán ra xung quanh. Độ khuếch tán phụ thuộc vào tính
chất từng loại kháng sinh và độ dày của môi trường.Vì vậy, càng xa nơi đặt
khoanh giấy nồng độ kháng sinh càng thấp và ngược lại, càng gần nơi đặt
khoanh giấy nồng độ kháng sinh càng cao.
Để chọn được kháng sinh thích hợp cho điều trị, cần phải đặt đủ cho 8
nhóm kháng sinh, mỗi khoanh giấy thấm một kháng sinh với hàm lượng nhất
định (tùy theo hãng sản xuất), mỗi đĩa petri (đường kính 90 mm) thường đặt 6
khoanh giấy kháng sinh.
Cách tiến hành:
 Sử dụng môi trường Mueller – Hinton để tiến hành kỹ thuật.
 Lấy khuẩn lạc E. faecalis nuôi cấy 18-24 giờ, hòa đều với nước muối
sinh lý 0,9%, so với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5 (tương đương
với 3x10
8
vi khuẩn/1ml). Dùng pipette Pasteur hút huyền dịch láng đều
23
lên bề mặt đĩa thạch có đường kính 9 cm với độ dày 4 cm. Hút bỏ
huyền dịch thừa trên mặt đĩa thạch.
 Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng.
 Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt đĩa thạch (đường kính 9 cm,
đặt 6 khoanh). Khoanh giấy cách thành đĩa thạch 1 cm.
 Để khoảng 10 phút cho kháng sinh khuếch tán đều.
 Ủ ở tủ ấm 35-36
0
C, 3-10% CO
2
.
 Đọc kết quả sau 18-24 giờ, đo đường kính vùng ức chế tính bằng mm.
Đọc kết quả:

Trước hết kiểm tra mật độ khuẩn lạc: nơi không có kháng sinh hoặc nồng
độ kháng sinh thấp không đủ ức chế được vi khuẩn, chúng sẽ mọc thành
những khuẩn lạc dày sát nhau, nhưng không được dày quá, thành các thảm
hoặc thưa quá, còn khe hở giữa các khuẩn lạc. Vì mật độ vi khuẩn quá dày sẽ
thu nhỏ đường kính vùng ức chế và ngược lại quá thưa sẽ mở rộng đường
kính vùng ức chế so với chuẩn, điều này sẽ làm sai lệch kết quả.
Dùng thước đo đường kính vùng ức chế tính ra mm.
Đo và nhận định kết quả các chủng mẫu bằng cách so vào bảng giới hạn
dành cho chủng mẫu để kiểm tra chất lượng xét nghiệm bao gồm nhiều yếu tố
kỹ thuật; ví dụ: hoạt tính của khoanh giấy kháng sinh, nếu đạt yêu cầu mới
đọc kết quả của các chủng phân lập được.
Đo đường kính vùng ức chế ở các chủng phân lập được từ người bệnh so
vào bảng giới hạn đường kính vùng ức chế xếp loại độ nhạy cảm của vi khuẩn
với kháng sinh (CLSI, 2010) để xếp loại “đề kháng – resistan – R” hoặc
“trung gian – intermediate – I” hoặc “nhạy cảm – susceptible – S” cho mỗi
khoanh ở các đĩa kháng sinh đồ đã chuẩn bị sẵn.
24
Bảng 2.2. Các loại kháng sinh và giới hạn đường kính vòng vô khuẩn
xếp loại mức độ nhạy cảm của E. faecalis.
STT Kháng sinh
Đường kính vòng vô khuẩn
S I R
1 Penicillin ≤ 14 - ≥ 15
2 Ampicillin ≤ 16 - ≥ 17
3 Vancomycin ≤ 14 15 - 16 ≥ 17
4 Erythrommycin ≤ 13 14 - 22 ≥ 23
5 Tetracyclin ≤ 14 15 - 18 ≥ 19
6 Ciprofloxacin ≤ 15 16 - 20 ≥ 21
7 Chloramphenicol ≤ 12 13 - 17 ≥ 18
8 Ceftriaxone ≤ 14 15 -20 ≥ 21

9 Cefotaxim ≤ 25 26 - 27 ≥ 28
2.3. Y đức trong nghiên cứu
• Tư vấn cho bệnh nhân: Lấy bệnh phẩm và thông tin chỉ để phục vụ cho
mục đích chẩn đoán, định hướng điều trị và theo hướng có lợi cho bệnh nhân.
• Được sự đồng ý hợp tác của bệnh nhân trước khi tiến hành lấy thông tin
của bệnh nhân phục vụ cho công tác nghiên cứu.
• Tuyệt đối giữ bí mật các thông tin bệnh nhân cung cấp cũng như các
thông tin về bệnh của bệnh nhân như tên, tuổi, số điện thoại, địa chỉ, nghề
nghiệp
2.4. Địa điểm nghiên cứu
Khoa xét nghiệm, Bệnh viện Da Liễu Trung Ương, 15A – Phương Mai –
Đống Đa – Hà Nội.
2.5. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo chương trình Excell 2010.
25
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. faecalis trên những bệnh nhân có hội chứng
tiết dịch âm đạo tới khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ tháng
10/2014 đến tháng 3/2015 xác định bởi kỹ thuật nuôi cấy phân lập
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. faecalis xác định bằng kỹ thuật nuôi cấy phân
lập
Trong tổng số 510 bệnh nhân, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy phân lập và các
tiêu chuẩn chẩn đoán vi khuẩn E. faecalis trong phòng xét nghiệm, chúng tôi
đã xác định được 78 bệnh nhân dương tính với nhiễm trùng E. faecalis.
Biểu đồ 3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập vi khuẩn E. faecalis (n=78)
Nhận xét: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. faecalis xác định bằng kỹ thuật nuôi cấy
phân lập là 15,29%.
3.1.2. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E. faecalis xác định theo nhóm tuổi
Bảng 3.1. Số lượng bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo tới

khám phân bố theo nhóm tuổi (n= 510)
Nhóm tuổi Số lượng Tỉ lệ %
<19 10 1.96
19-29 257 50.39
30-39 110 21.57