Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 160 13

BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠÍ HỌC Dược HÀ NỘI
ĐINH THANH HUYÊN
NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP
KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 160.13
KHÓA LUẶN TÓT NGHIỆP DƯỢC sĩ ĐẠI HỌC
KHÓA 20Õ5-20I0'
Ngưòi hưóng dẫn : ThS Lê Thị Thu Hương
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi Sinh- Sinh Học
Trương Đại Học Dược Hà Nội
HÀ NOl-2010
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến cô giáo
ThS Lê Thị Thu Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn ân cần chỉ bảo giúp đỡ tôi
hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô ban giám hiệu nhà trường, các
thầy cô, cán bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Vi Sinh - Sinh Học, bộ môn Công
Nghiệp Dược, cùng các phòng ban đã nhiệt tinh giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong
quá trình thực nghiệm.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi
trong suốt thời gian qua.
Do thời gian và khả năng bản thân có hạn, nên trong khoá luận này không
tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong được sự chỉ bảo của thầy cô và sự góp ý của
các bạn.
Xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội ngày 17 tháng 5 năm 2010
Sinh Viên
Đinh Thanh Huyền
LỜI CẢM ƠN
CHÚ GIẢI CHỮ VIÉT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
•
CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN 2
1.1: Đại cương về kháng sinh
2
1.1.1; Lịch sử phát triển của kháng sinh 2
1.1.2: Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh
.
2
1.1.4: Sơ đồ tổng quát qui trình sản xuất kháng sinh 3
1.1.5: Phân loại kháng sinh 3
1.2; Đại cương về xạ khuẩn 4
1.2.1.Xạ khuẩn 4
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 4
1.3. Cải tạo giống vi sinh vật 6
1.3.1. Mục đích 6
1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống v s v 6
1.4. Lên men sinh tổng họp kháng sinh 7
1.4.1. Lên men bề mặt 7
1.4.2. Lên men chìm 8
1.5. Chiết tách và tinh chế sản phẩm 9
1.5.1. Chiết xuất 9
1.5.2. Tinh chế sản phẩm 10
1.6. Phổ hồng ngoại (IR), Phổ tử ngoại (UV) 11
MỤC LỤC
1.7. Hạn chế trong sản xuất Doxorubicin từ Síreptomyces peucetius 11
1.8. Nhận dạng và xác định đặc tính của một Streptomyces sp. được phân lập

biểu hiện hoạt lực chống lại Staphylococcus aureus kháng methỉcillỉn


12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯOÍNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
13
2.1.1. Chủng xạ khuẩn 13
2.1.2. Giống v s v kiểm định 13
2.1.3. Các môi trường sử dụng 13
2.1.4. Các vật liệu và thiết bị được sử dụng 16
2.2. Nội dung nghiên cứu

17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Phương pháp gây, giữ giống trong ống thạch nghiêng

17
2.3.2. Đánh giá hoạt tứủi kháng sinh bằng phưong pháp khuy ếch tán

17
2.3.3. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

18
2.3.4. PhưoTig pháp cải tạo và chọn giống 19
2.3.5. Phương pháp lên men gián đoạn 20
2.3.6. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu c ơ

21
2.3.7. Phương pháp sắc kí lóp mỏng 21
2.3.8. Phương pháp cất quay 22
2.3.9. Phưong pháp xác định ảnh hưỏng của pH đến độ bền vững của kháng
sinh:

22
2.3.10. Phương pháp thử khả năng bền nhiệt của kháng sinh

22
2.3.11. Phưcmg pháp tách kháng sinh bằng cột trao đổi ion

22
2.3.12. Phương pháp sắc kí cột 23
2.3.13. Phương pháp phân loại Streptomyces theo ISP 24
CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

26
3.1. Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy thích họp 26
3.2. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 160.13

27
3.3. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 1

28
3.4. Kết quả đột biến lần 2 30
3.5. Kết quả chọn môi trưòng lên men tốt nhất 32
3.6. Kết quả lên men môi trường MT5dd với các biến chủng tốt nhất 32
3.7. Đánh giá ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh

33
3.8. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt túứi kháng sinh

34
3.9. Kết quả chiết kháng sinh bàng các dung môi hữu cơ 34
3.10. Kết quả chiết kháng sinh bằng phương pháp cột trao đổi ion

35
3.11. Kết quả sắc ký lớp mỏng 36
3.12. Kết quả chạy sắc ký cột

37
3.13. Kết quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptomyces 160.13
.

38
3.14. Kết quả đo phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại và nhiệt độ nóng chảy 39
KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 40
Kết luận 40
Kiến nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN PHỤ LỤC
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid Deoxyribonucleic.
D [mm] Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn.
ISP International Streptomyces Project.
MT Môi trường.
MTdd Môi trưòng dung dịch,
s Độ lệch thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh.
KS Kháng sinh,

vsv Vi sinh vật.
Cl, C2 Giống cấp 1, cấp 2.
NST Nhiễm sắc thể.
vđ Vừa đủ.
VK Vi khuẩn,
u v Utra Violet (tử ngoại).
V Thể tích.
Dm Dung môi.
IR Infrared (hồng ngoại).
Gr (-) Gram âm.
Gr (+) Gram dương.
SKLM Sắc ký lórp mỏng.
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên.
ĐB Đột biến.
Bảng 1 : Chủng vi sinh vật kiểm định
Bảng 2: Các môi trường kiểm định
Bảng 3: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/lOOml)
Bảng 4: Các dung môi sử dụng
Bảng 5; Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 160.13 trên các môi trường
Bảng 6 : Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên
Bảng 7: Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 1
Bảng 8 : Kết quả đột biến lần 2
Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men tốt nhất
Bảng 10: Kết quả lên men chìm với các biến chủng tốt nhất
Bảng 11 ; Kết quả thử độ bền pH sau 24h
Bảng 12; Kết quả thử độ bền pH sau 5 ngày
Bảng 13: Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của kháng sinh
Bảng 14; Kết quả phản hấp phụ bằng Hci IN
Bảng 15: Kết quả phản hấp phụ bằng NaOH 0,75N
Bảng 16: Kết quả hoạt tính các phân đoạn sau khi chạy sắc ký cột

Bảng 17: Kết quả thử sắc ký lớp mỏng sau chạy sắc ký cột
Bảng 18; Các đặc điểm của Streptomyces 160.13 và Streptomyces avellaneus
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1; Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
Hình 2: Đặc điểm phát triển của vsv trong môi trường lỏng.
Hình p 1: Chuỗi bào tử
Hình P2: Bề mặt bào tử
Hình P3: Hoạt tính kháng sinh của các chủng đột biến lần 2
Hìrth P4; Hoạt tữứi kháng sinh cửa các phân đoạn 1, 5 sau khi chạy sắc ký cột
Hình P5; Ket quả phổ tử ngoại của kháng sinh do Streptomyces 160.13
sinh tổng họp
Hình P6 ; Kết quả phổ hồng ngoại của kháng sinh do Streptomyces 160.13
sinh tổng hợp
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nền kinh tế thế giới đang có những bước phát triển đáng kể, đi cùng với nó là
sự tiến bộ vượt bậc của khoa học kỹ thuật và trong đó phải kể đến sự phát triển của
công nghệ sản xuất kháng sinh. Nhiều chất kháng sinh được tạo thành bằng con
đường tổng họp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất kháng sinh mới có
nguồn gốc vi sinh vật vẫn luôn được thế giới quan tâm.
Trong số các kháng sinh mà con người đã phát hiện và công bố thì có tới 60%
là do xạ khuẩn sinh ra. Chi Streptomyces là chi có số lượng lớn các xạ khuẩn có khả
năng tạo ra những kháng sinh quan trọng có cấu trúc phức tạp và đa dạng về đặc
điểm kháng khuẩn. Một số loài trong chi này còn có khả năng sinh tổng hợp các
chất chống ung thư, điều trị HIV/AIDS
Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng
họp kháng sinh từ Streptomyces 160.13'” với các mục tiêu sau:
- Bước đầu lựa chọn môi trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy, lên men.
- Nâng cao hiệu suất sinh tổng họrp kháng sinh của chủng Streptomyces 160.13
bằng đột biến cải tạo giống kết hợp với sàng lọc.

- Nghiên cứu sơ bộ về tách chiết và tinh chế.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại, xác định tên
khoa học của chủng Streptomyces 160.13 theo khóa phân loại ISP.
CHƯƠNG 1
TỎNG QUAN
1.1: Đại cương về kháng sinh
1.1.1: Lịch sử phát triển của kháng sinh [10]
Năm 1928 nhà vi khuẩn học người Anh - Alexander Flemming đã tình cờ phát
hiện chủng nấm có khả năng tạo ra chất ức chế các vi khuẩn. Flemming đã phân lập
chủng nấm này và đặt tên là Penicillum notatum.
Năm 1938, hai nhà khoa học Howara Walter Florey và Ernst Boris Chaen chiết
được hoạt chat diệt khuẩn từ môi trường nuôi cấy Penỉcillum notatum và hoạt chất
đó được đặt tên là Penicilin. Đến năm 1941 Penicilin được lên men trên qui mô
công nghiệp để phục vụ điều trị cho thương binh trong chiến tranh. Năm 1944 thì
Waksman phát hiện ra Streptomycin.
Đến nay, hàng chục nghìn chất kháng sinh được tìm ra nhưng chỉ có khoảng 150
loại là được sử dụng rộng rãi (do phần lớn: độc, có tác dụng phụ, phổ kháng khuẩn
hẹp, giá thành sản xuất cao, ).
1.1.2: Định nghĩa kháng sinh [2]
Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng họp hoặc tổng
hợp hóa học. Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh.
1.1.3: Cơ chế tác dụng của kháng sinh [4]
Mỗi kháng sinh đều có đích tác dụng nhất định trong tế bào vi sinh vật mẫn cảm,
tuy nhiên có thể khái quát thành 6 nhóm tác dụng đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm:
+ Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào: P-Lactam, Vancomycin,
+ Tác dụng lên màng tế bào chất: Amphotericin, Valinomycin,
+ Tác dụng vào ADN: Actinomycin, Rifamycin,
+ Tác dụng vào việc tổng hợp protein: Aminoglycosid, Macrolid,
+ Tác dụng vào quá trình trao đổi chất hô hấp: Antimycin,
+ Tác dụng vào quá trình trao đổi chất folat: Sulfamid,

1.1.4: Sơ đồ tổng quát qui trình sản xuất kháng sinh [1], [10]
Hình 1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
1.1.5: Phân loại kháng sinh [1], [2], [4], [7]
Có thể phân loại dựa vào phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, theo nguồn gốc, con
đường sinh tổng hợp hay theo cấu trúc hoá học. Trong đó, phân loại theo cấu trúc
hóa học được xem là phân loại khoa học nhất, bao gồm các nhóm:
- Nhóm Beta lactam: Penicillin, Cephalosporin, Carbapenem, Monobactam
- Nhóm Aminoglycosid (Aminosid): Streptomycin, Gentamicin, Tobramycin

- Nhóm Macrolid: Rythromycin, Clarithromycin, Spiramycin
- Nhóm Lincosamid: Lincomycin, Clindamycin

- Nhóm Phenicol; Cloramphenicol, Thiamphenicol.
- Nhóm Tetracyclin: Tetracyclin, Doxycyclin

- Nhóm Peptid: Vancomycin, Polymycin, Bacitracin.
- Nhóm Quinolon: Acid nalidixic, Ciprofloxacin, Ofloxacin,
- Nhóm Co-trimoxazol: Co-trimoxazol
- Các kháng sinh khác: Rifamicin, kháng sinh chống nấm, chống ung thư
1.2: Đại cương về xạ khuẩn
1.1.1.Xạ khuẩn [4], [5], [6]
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự
nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+) hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi
(khuẩn ty) phân nhánh, có tỷ lệ G + c trong ADN cao hoTi 55%. Một trong những
đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 32%
xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh. Đến nay có khoảng hơn
15000 chất kháng sinh được phát hiện trong đó có tới 60% là do xạ khuẩn sinh ra.
♦ Một số đặc điểm của xạ khuẩn:
- Đường kính khuẩn ty khoảng từ 0,3-l,0|im đến 2-3ụ.m.
- Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới dày từ 10-12nm. Thành tế bào xạ

khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá
trình trao đổi chất và vận chuyển chất qua màng tế bào.
- Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn.
- Màu sắc hết sức phong phú, có thể gặp các màu: da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu,
trắng, vàng, xám
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces [6], [7], [11]
♦ Khuẩn lạc:
- Bề mặt: thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình
phóng xạ vì vậy mới có tên xạ khuẩn.
- Khuẩn lạc có chân vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy.
♦ Khuẩn ty cơ chất;
- Mọc sâu trong môi trường nuôi cấy
- Be mặt nhẵn hoặc sần sùi, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển
- Khuẩn ty cơ chất tiết ra môi trưòng một số loại sắc tố, có sắc tố hòa tan trong
nước, có sắc tố hòa tan trong dung môi hữu cơ.
♦ Khuẩn ty khí sinh:
Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành
những khuẩn ty khí sinh có đường kính 1-1,4 Ịiĩii
♦ Chuỗi bào tử:
Được hình thành từ khuẩn ty khí sinh, có thể mọc đơn hoặc mọc vòng gồm các
hình thái cơ bản như thẳng, cong, móc câu đơn hoặc kép, xoắn lò xo.
♦ Bào tử:
- Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn là bào tử trần
- Được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh, tạo thành
chuỗi bào tử
- Trên mỗi nhánh có từ 10-100 bào tử. Bào tử trần có thể có hình cầu, hình bầu
dục, hình que, hình trụ. Đường kính của bào tử thường tương ứng với đường kính
của khuẩn ty
- Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì mụn cơm, có gai hoặc có tóc.
♦ Streptomyces là vsv dị dưỡng, nguồn cacbon thường dùng là đường, tinh bột

và nhiều chất hữu cơ khác; nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm
men; nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amoni, Khả năng đồng hóa ở các loài khác
nhau là khác nhau.
♦ Streptomyces là loài xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của chúng
thường là 25®C-30*^C, một số loài có thể mọc tốt hơn ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu
thường từ 6,8-7,5.
♦ Khả năng tạo sắc tố:
Sắc tố được tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan,
sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tổ của khuẩn ty cơ chất và sắc tố melanoid.
♦ Phân loại Streptomyces:
về phân loại Streptomyces có nhiều phân loại khác nhau. Trong hội nghị vi
sinh vật học lần thứ 10 (1970) đã thống nhất chọn khoá phân loại của E.B.Shirling
và D.Gottieb làm khoá phân loại chính để phân loại Streptomyces.
Khoá phân loại này dựa vào các đặc điểm sau để phân loại:
- Đặc điểm hình thái: màu sắc khuẩn ty cơ chất, màu khuẩn lạc; hình dạng chuỗi
bào tử; đặc điểm bề mặt bào tử.
- Đặc điểm sinh thái: khả năng tạo sắc tố melanoid, khả năng tiêu thụ các nguồn
đường, sắc tố hoà tan trong môi trường.
1.3. Cải tạo giống vi sinh vật [1], [4], [6], [8], [10]
1.3.1. Mục đích.
Vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên nhiên thường có
hoạt tính thấp. Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi
hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các biện pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện
nuôi cấy thích hợp với các phưong pháp: chọn lọc lai tạo, gây đột biến trong chất
liệu di truyền của tế bào hoặc trong hệ thống điều hòa trao đổi chất. Qua đó đạt
được các mục đích: tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh, cải tạo các đặc
tính lên men, sinh tổng hợp được các sản phẩm mới,

1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống v s v .
1.3.2.1. Chọn lọc ngẫu nhiên

Quần thể v s v luôn xuất hiện các đột biến tự phát theo tần số khác nhau sẽ có
những cá thể có hoạt tính kháng sinh cao hơn 10-20 % so với các cá thể khác.
Nhiệm vụ của phưong pháp này là tuyển chọn các cá thể có hoạt tính kháng sinh
cao để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
1.3.2.2. Đột biến nhân tạo
♦ Cho các chủng vsv chịu tác dụng của các tác nhân gây đột biến mạnh như
ánh sáng ư v , tia X hay các tác nhân hoá học như ethylenimin, nitrosoguanidin,
dimethylsulphat với liều lượng và thời gian thích hợp, phần lớn các v s v sẽ chết,
những cá thể sống sót sẽ xuất hiện các biến đổi (biến đổi ở NST hay thay đổi tính
trạng) dẫn tới làm giảm (mất) khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc làm
tăng hiệu xuất sinh tổng họrp kháng sinh của vsv (đột biến dương tính).
♦ Ánh sáng ư v có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vsv có
kích thước nhỏ (0,3-3,0|am) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân. Vì vậy được dùng
phổ biến trong cải tạo giống.
♦ Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến:
+ Liều lượng chiếu; được đặc trưng bởi 3 yếu tố; thời gian chiếu, khoảng cách
chiếu, độ pha loãng bào tử. Liều lượng chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng
lớn và cuối cùng đạt đến một giới hạn nhất định.
+ Ánh sáng: sau khi chiếu ánh sáng ư v lên tế bào nếu để ngoài ánh sáng thường
thì xảy ra hiện tượng quang phục hoạt làm quá trình đột biến không có ý nghĩa.
+ Ngoài ra các yếu tố nhiệt độ, pH, thành phần môi trường nuôi cấy, trạng thái
sinh lý của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng ư v .
♦ Hiệu quả đột biến: là tỷ số giữa số tế bào đột biến chia cho tổng số tế bào sống
sót sau đột biến. Người ta thường áp dụng đột biến gây chết từ 75-90%, tuy nhiên
trong công nghiệp người ta có thể đột biến gây chết tới 99%.
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [1], [5], [7], [9], [10]
Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện môi trường tối ưu để
sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men. Có hai kiểu lên men
chính hay sử dụng là: lên men bề mặt và lên men chìm.
1.4.1. Lên men bề mặt.

Lên men bề mặt là thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường dịch
thể hoặc môi trưòng bán rắn. v sv hấp thụ các chất của môi trường và sử dụng oxy
không khí để hô hấp trên bề mặt của môi trường dinh dưỡng. Do đó yêu cầu của
môi trường lên men phải rộng và không quá sâu, đồng thời phải giữ độ ẩm môi
trưòng khoảng 60% để tránh khô bề mặt môi trường.
+ ưu điểm; đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp.
+ Nhược điểm; hiệu suất thấp, tốn diện tích, khó cơ giới hóa và tự động hoá.
Phương pháp này chỉ áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm.
1.4.2. Lên men chìm.
Khi lên men chìm, vsv được nuôi cấy ở môi trường dịch thể, phát triển trong
không gian 3 chiều của môi trường.
Tỷ lệ giống trong môi trường lên men là 1-10%. Quy mô giống phụ thuộc vào
quy mô lên men.
Quá trình lên men có thể thay đổi điều kiện ban đầu của môi trường lên men. Do
đó cần theo dõi và điều chỉnh các thông số; sự cấp khí, sự tạo bọt, điều chỉnh pH,
nhiệt độ, nhiên liệu và chất tiền thể.
* ư u điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm
mặt bằng sản xuất, dễ tự động hóa và cơ giới hóa trên quy mô lớn
* Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.
► Các kiểu lên men chìm
* Lên men gián đoạn:
Quá trình lên men gián đoạn được xem như là một hệ thống kín. Trong suốt
thời gian lên men không có tác động hay bổ sung chất dinh dưỡng vào môi trường
lên men trừ việc cung cấp ôxy, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH.
vsv trong bình lên men phát triển qua các giai đoạn: pha tiềm tàng, pha log, pha
Ennh 2: Đặc điểm phát triển của v s v trong môi trường lỏng.
1: pha tiềm tàng, 2 : pha log, 3: pha cân bằng, 4;pha suy vong
x; sinh khối khô vsv, t: thời gian lên men
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp
hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của v s v hoặc việc sinh tổng

hợp chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.
♦ Lên men có bổ sung
Nồng độ ban đầu cao của một số chất (Glucose, các hợp chất nitơ ) ức chế việc
tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Do đó để nâng cao hiệu suất lên men, khi bắt
đầu lên men các thành phần đó được đưa vào với nồng độ thấp và được bổ sung vào
hệ thống trong quá trình lên men.
♦ Lên men bán liên tục
Khi v s v phát triển trong bình đạt đến một nồng độ sinh khối cần thiết thì lấy
bớt dịch lên men rồi bổ xung thêm lượng môi trường mới bằng chính thể tích dịch
lên men đã lấy đi. Việc rút bớt dịch lên men và bổ xung thêm môi trường dinh
dưỡng mới không xảy ra liên tục mà chỉ định kì trong một thời điểm nhất định.
♦ Lên men liên tục
v s v được nuôi trong một thiết bị đặc biệt sao cho khi v s v phát triển đến một
giai đoạn nhất định, khi đó lấy đi liên tục một thể tích môi trường lên men cùng các
tế bào và sản phẩm trao đổi chất của chúng đồng thời bổ xung thêm đúng một thể
tích môi trường dinh dưỡng như thế vào bình nuôi cấy.
1.5. Chiết tách và tinh chế [1], [3], [5], [7], [10]
Các kháng sinh thu được trong dịch lọc dịch lên men thường có nồng độ thấp,
ngoài ra trong dịch lọc dịch lên men còn có nhiều sản phẩm phụ của quá trình trao
đổi chất. Vì vậy, cần phải có phương pháp chiết tách thích họp để có thể thu được
sản phẩm tối đa. Các phương pháp chiết tách sau hay được sử dụng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
- PhưoTig pháp kết tủa.
- Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion.
1.5.1. Chiết xuất.
Chiết thực ra là phương pháp tách dựa vào sự phân bố của chất tan giữa hai pha
không hoà tan vào nhau và luôn tiếp xúc với nhau. Đó là pha dung môi chiết và dịch
10
lọc dịch lên men hay sinh khối để tách riêng chất kháng sinh (có thể là một chất hay
một nhóm chất). Nếu chiết bằng dung môi hữu cơ, cần thỏa mãn các yêu cầu: dung

môi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc, khó cháy, có tính chọn lọc cao và dễ cất thu hồi
1.5.2. Tinh chế sản phẩm.
Là một nhóm các phưong pháp hoá học, vật lý và hoá lý nhằm đi từ một hỗn hợp
phức tạp đến một hỗn họp đơn giản, và từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng
chất.
♦ Sắc kí: là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của
mỗi hỗn hợp. Sự tách sắc kí dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau
và không hoà lẫn vào nhau; một pha tĩnh một pha động. Quá trình sắc ký thường
qua 3 giai đoạn chính: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và
phát hiện các chất.
Theo bản chất hiện tượng sắc kí có thể chia làm bốn loại: sắc kí hấp phụ, sắc kí
phân bố, sắc kí trao đổi ion, sắc kí gel.
+ Sắc kí trao đổi ion: dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong
dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit. Nhựa
có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi anion gọi là
anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật khối lượng.
+ Sắc kí lóp mỏng: kết quả sắc kí lớp mỏng bước đầu cho ta biết mẫu thử có bao
nhiêu thành phần đồng thời lựa chọn được hệ dung môi thích hợp để tách riêng các
thành phần.
Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích: Hệ số Rf
Khoảng cách của chất phân tích di chuyển được
Rf =
Khoảng cách của dung môi di chuyển được
Rf phụ thuộc vào các yếu tố như cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp
thụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký,
lượng chất chấm. Vì vậy người ta sắc ký song song với một chất đã biết để đối
chứng trên cùng một bản mỏng và tính Rf.
11
1.6. Phổ hồng ngoại (IR), Phổ tử ngoại (UV) [3], [11]
► Phổ hồng ngoại

Định nghĩa: Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp phụ bức xạ
hồng ngoại của một chất vào số sóng hoặc bước sóng là phổ hấp phụ hồng ngoại,
thường gọi đơn giản là phổ hồng ngoại của một chất.
Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó bị hấp phụ năng
lượng và thay đổi trạng thái hoạt động thì tạo nên một dải hấp phụ trên phổ IR. Có
mối liên quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp phụ nên có thể dựa vào sự có mặt
của dải hấp phụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có giải hấp
phụ đặc trưng. Đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR.
► Phổ tử ngoại
Phương pháp hấp phụ tử ngoại, khả kiến dựa trên sự hấp phụ năng lượng các
bức xạ ánh sáng vùng UV-VIS bởi các phân tử chất nghiên cứu làm thay đổi mức
năng lượng điện tử (Eq-^ Ei, E2). Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp phụ có
mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có những phân tử nào có điện tử dễ bị kích thích mới hấp
phụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái bị kích thích.
Đó là: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, s, o.
1.7. Hạn chế trong sản xuất Doxorubicin i\s Streptomyces peucetius [12]
Doxorubicin (DXR) được sản xuất bởi Streptomyces peucetius ATCC 27952
biểu hiện khả năng ức chế các khối u, chống lại các dòng tế bào gây ung thư khác
nhau. Một thời gian dài trôi qua kể từ khi quá trình sinh tổng hợp DXR lần đầu tiên
được tổng kết. Dựa trên những nghiên cứu về sinh tổng họp và phân tích sản phẩm,
các nhân tố khác nhau tác động tới sự sản xuất kháng sinh từ chủng S.peucetius
ATCC 27952 đã được xem xét lại để có thể giải quyết những khúc mắc khó khăn
trong sản xuất DXR. Qua đó cung cấp những ý tưởng để tạo ra sự cải tiến về gen
cho những chủng công nghiệp của s. peucetius.
12
1.8. Nhận dạng và xác định đặc tính của một Streptomyces sp. được phân
ỉập biểu hiện hoạt lực chống lại Staphylococcus aureus kháng methicillỉn
(MRSA) [13]
Một vi sinh vật được phân lập từ đất biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn rộng, bao
gồm hoạt tính chống lại MRSA đã được nghiên cửu. Vi sinh vật đó được nhận dạng

nhờ việc sử dụng các kỹ thuật mô phỏng học, kỹ thuật hóa sinh và kỹ thuật gen. Các
trình tự 16S rDNA của chủng phân lập cho thấy nó có liên quan mật thiết tới
Streptomyces lavendulae and Streptomyces gỉobosus. Lai tạp DNA-DNA cho thấy
80% tương đồng với s. globosus DSM41122. Kháng sinh được tinh chế một phần
từ bề mặt nổi của môi trường nuôi cấy nhờ sử dụng kết họp các kỹ thuật than hoạt
tính, kết lắng, trao đổi ion .Kháng sinh được tạo ra có khả năng hòa tan trong nước
và rất bền vững bởi nhiệt độ cao tại pH acid. Đặc biệt kháng sinh tinh chế một phần
này biểu hiện hoạt tính hướng vào Staphylococcus aureus kháng methicillin được
cô lập trên lâm sàng.
13
CHƯƠNG 2
ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Chủng xạ khuẩn:
Giống xạ khuẩn Streptomyces 160.13 do bộ môn Vi sinh- Sinh học trưòng
Đại Học Dược Hà Nội cung cấp.
2.1.2. Giống vsv kiểm định:
Do bộ môn Vi sinh- Sinh học trường đại học dược Hà Nội cung cấp (bảng 1).
Bảng 1: Chủng vi sinh vật kiểm định
VK Gr(+)
VK Gr(-)
Staphylococcus aureus ATCC 1128
Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus pumilus ATCC 10241
Proteus mirabilis B V 108
Bacillus subtilis ATCC 6633
Pseudomonas aeruginosa VM 201
Bacillus cereus ATCC 9946
Salmonella typhi DT 220
Sarcỉna lutea ATCC 9341

Shigella flexneri DT 112
2.1.3. Các môi trường sử dụng:
a) Môi trường nuôi cấy vsv kiểm định có thành phần trình bày ở bảng 2.
Bảng 2: Các môi trường kiểm định
^ ■ \^ à n h phần
MT
NaCl
(%)
Cao thịt
(%)
Pepton
(%)
Thạch
(%)
Nước pH
Canh thang
0,5
0,3 0,5
-
100 ml 7,0-7,4
Thạch thường 0,5 0,3
0,5 1,6 -1,8 lOOml
- Tiệt trùng bằng hơi nước ở 118®C/30 phút.
b) Thành phần các môi trường sử dụng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 3
14
Bảng 3: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/lOOml)
Thành phân
MTl MT2
MT3
MT4 MT5

MT6
MT7
Tinh bột 2
2
2,4
2
Lactoza
3
Glucoza
2
1
Cao ngô
0,5 0,5
Saccaroza
3
Bột đậu tương
1,5
Bột ngô
Pepton
0,3
0,5
Cao thịt
0,3 0,3
KNO3
0,1
KCl 0,05
NaNOs 0,2
NH4NO3
0,2
0,2

(NH4)2S04
0,2
CaCOs
0,3 04 0,4
0,2
FeS0 4 .7H20 0,001
0,05
K2HPO4
0,05
0,1 0,1
0,15
MgS04.7H20 0,05 0,25
0,25
NaCl 0,05
0,1
0,5
Cao nâm men
0,2
Thạch
1,8
2 2 2
2 2
1,8
Nước 100
100 100
100 100 100
100
pH
7,0-7,2 6 ,8-7,2
7,0-7,2

7,0-7,2
7,0-
7,2
7,0-
7,2
7,4-7,6
- Tiệt trùng môi trường bằng hơi nước ở 118-120®C/30 phút.
15
c) Môi trường lên men: là các môi trường trên ở dạng dịch thế (không có thạch).
Ký hiệu: ví dụ MTldd, MT2dd
d) Các môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISPl đến ISP9), tiệt
trùng bằng hơi nước ở 118^C/30 phút.
Dung dịch muối vi lượng của ISP: M11CI2.4H2O 0,lg; FeS0 4 .7H20 0,lg;
ZnS0 4 .7H2Ơ 0,lg; nước cất vđ lOOml; pH = 7,0-7,2.
ISPl: Tripton 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất vđ lOOOml; pH = 7,0-7,2.
ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt 10,Og; glucose 4,0g; thạch 20,Og; nước
cấtvđ lOOOml; pH = 7,3.
ISP3: Yến mạch 20,Og; dung dịch muối vi lượng l,Oml; thạch 18,0g; nước cất vđ
1000ml;pH = 7,2.
ISP4: Tinh bột 10,Og; K2HPO4 l,Og; MgS0 4 .7H2Ơ l,Og; NaCl l,Og; (NH4)2S04
2,0g; CaCOs 2,0g; dung dịch muối vi lưọTig l,Oml; thạch 20,Og; nước cất vđ
lOOOml; pH = 7,0-7,4.
ISP5: L-asparagine l,Og; Glycerin 10,Og; K2HPO4 l,Og; dung dịch muối vi lượng
l,Oml; thạch 20,Og; nước cất vđ lOOOml; pH = 7,0-7,4.
ISP6 ; Dung dịch A: Pepton 20,Og; acid citric 0,384g; FeS0 4 .7H2 0 0.556g; NH4OH
25% 0,264g; Na2S2Ơ3 lOml; K2HPO4 Ig; nước cất vđ lOOOml
ISP6; Dung dịch A 3,6ml; cao nấm men l,Og; thạch 15g; nước cất vđ lOOOml;
pH = 7,0-7,2.
ISP7; Glycerin 15,0g; L-tyrosine 0,5g; L-asparagine l,Og; K2HPO4 0,5g;
MgS0 4 .7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS0 4 .7H20 0,01g; dung dịch muối vi lượng l,Oml;

thạch 20,Og; nước cất vđ lOOOml; pH = 7,2-7,4.
ISP9: Các nguồn đường được tiệt trùng bằng phưomg pháp Tyndal (A).
1. D-Glucose 6 . L-Arabinose
2. Inositol 7. Raffinose
3. D-Xylose 8 . Rhamnose
4. D-Mannitol 9. Saccarose
5. D-Fructose
16
Dung dịch Pridham và Gottlieb (Dung dịch B): CUSO4.5H2O 0,64g; FeS0 4 .7H20
0,1 Ig; M11CI2 .4H2O 0,79g; ZnSƠ4.7H20 0,15g; nước cất vđ lOOOml.
ISP9; (NH4)2SƠ4 2,64g; KH2PO4 2,38g; K2HPO4.3H2O 5,65g; MgSƠ4.7H20 l,Og;
dung dịch B l,00g; thạch 15,0g; nước cất vđ lOOOml; pH = 6,8-7,0.
D*ISP9; ISP9 sau khi đã tiệt trùng để nguội tới 60°c thì cho 1 trong các nguồn
đường A vào từng môi trường ISP9 riêng rẽ sao cho nồng độ đưÒTig trong môi
trường là 1%.
2.1.4. Các vật liệu và thiết bị được sử dụng:
♦ Các dung môi sử dụng: được trình bày trong bảng 4.
Bảng 4; Các dung môi sử dụng
Dung môi
Khôi lượng riêng
Nhiệt độ sôi
Methanol 0,791-0,793
64,5‘'c
Buthyl acetat
0,880-0,885
in-iis^'c
Chloroform
1,470-1,480
60-62'^C
n- Butanol

0,81
116-118^C
NH4OH 25%
0,88
Dichlomethan
1,32
40®c
Ethyl acetat 0,902
lfc
♦ Tác nhân gây đột biến: ánh sáng ƯV( X = 254nm) nguồn phát Toshiba 60W,
điện thế 220V.
♦ Máy móc, thiết bị khác:
- Máy lắc Taitec Bio-Shaker BR 300 LF.
- Tủ ấm 28-29®C, 31^ c (Binder, Memmert).
- Cân kỹ thuật Precisa Bj 210C, Sartorius.
- Tủ cấy Aura VF48, Bassaire.
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030, ALP.
17
- Máy cất quay Buchi WaterBath B480 (Bộ môn công nghiệp Dược- Trưòng ĐH
Dược Hà Nội).
Đĩa Petri, Pipet các loại, ống đong, cốc có mỏ, ống nghiệm
2.2. Nội dung nghiên cứu
+ Nghiên cứu MT nuôi cấy và MT lên men tốt nhất cho chủng xạ khuẩn
Streptomyces 160.13
+ Nghiên cứu các phương pháp cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng
hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 160.13
+ Nghiên cứu các phương pháp tách chiết, tinh chế kháng sinh
+ Tiến hành phân loại chủng xạ khuẩn Streptomyces 160.13 theo khóa phân loại
ISP.
+ Sơ bộ xác định một số nhóm chức của kháng sinh tinh thu được qua phân tích

phổ IR, ư v
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp gây, giữ giống trong ống thạch nghiêng
Chuẩn bị môi trưÒTig phân lập (MT2), tiệt trùng ở 120®C/30 phút rồi đặt thạch
nghiêng. Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các bào tử
Streptomyces 160.13 lên bề mặt thạch nghiêng. Để ở 28*^c trong 6 ngày cho xạ
khuẩn phát triển, sau đó đem cất trong tủ lạnh (2-4‘^C). Định kỳ cấy truyền sau 3-6
tháng.
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán
Nguyên tắc; Mau thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v kiểm
định, kháng sinh từ mẫu thử khuyếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát
triển của v s v kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Tiến hành:
♦ Chuẩn bị môi trưòng cấy vsv kiểm định, vsv kiểm định được cấy vào môi
trường canh thang (đối với vi khuẩn), môi trưòng Sabouraud lỏng (đối với nấm
men) hoặc đưa vào dung dịch Tween 80 hay dung dịch xà phòng 0,1% (đối với nấm
mốc). Nuôi cấy tạo hỗn dịch v s v kiểm định có nồng độ từ 10^-10* tế bào/ml bằng