Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 52.13

B Y T
TRƯNG ĐI HC DƯC H NI



NGUYỄN THANH TÂM

GÓP PHẦN NGHIÊN CU LÊN MEN
TNG HP KHNG SINH NH
STREPTOMYCES 52.13

KHA LUN TT NGHIP DƯC S



H NI-2013


B Y TÊ
TRƯNG ĐI HC DƯC H NI



NGUYỄN THANH TÂM


GP PHẦN NGHIÊN CU LÊN MEN
TNG HP KHNG SINH NH
STREPTOMYCES 52.13

KHA LUN TT NGHIP DƯC S



Ngưi hưng dn: DS Tạ Thu Lan
Nơi thc hin: B môn Vi sinh & Sinh hc





H NI-2013



LI CẢM ƠN
Tôi xin gi li c m ơn sâu sc nht đn cô gio DS -Tạ Thu Lan ngưi đ tn tnh
hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi hon thin kha lun ny.
Tôi xin chân thnh cm ơn cc thy cô gio , cc cn b , k thut viên ging dạy ,
công tc tại B môn Vi sinh - Sinh hc, B môn Công nghip dưc trư ng Đại hc Dưc
H Ni, B môn Ha vt liu- khoa Ha trưng Đại hc Khoa hc tự nhiên H Ni đ
gip đ tôi trong thi gian lm thực nghim.
Nhân dp ny tôi cng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng ton th cc
thy cô gio trưng Đại hc Dưc H Ni đ dạy d v tạo mi điu kin thun l i cho
tôi trong thi gian tôi hc tp tại trưng.
V cui cng l li cm ơn tôi gi ti gia đnh v bạn b đ đng viên , gip đ tôi
trong sut thi gian thực hin kha lun.
Do thi gian lm thực nghim cng như kin th c ca bn thân c hạn, kha lun
không th trnh khỏi nhiu thiu st. Tôi rt mong nhn đưc sự gp  ca cc thy cô ,
bạn b đ kha lun đưc hon thin hơn.

Tôi xin chân thnh cm ơn!
H Ni, ngày 18, tháng 5, năm 2013.
Sinh viên
Nguyễn Thanh Tâm






Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1.Đại cương v khng sinh 2
1.1.1 Đnh nghĩa khng sinh 2
1.1.2.Tiêu chuẩn đi vi mt khng sinh 2
1.1.3.Đnh gi tc dụng: 3
1.1.4 Phân loại khng sinh 3
1.1.5. Cơ ch tc dụng ca khng sinh 4
1.1.6.Cc ng dụng ca khng sinh 5
1.2.Đặc đim ca xạ khuẩn chi Streptomyces 6
1.2.1.Đặc đim hnh thi: 6
1.2.2.Đặc đim sinh l: 7
1.2.3.Đặc đim cu tạo: 7
1.2.4.Kh năng tạo sc t: 7
1.3.Tuyn chn, ci tạo v bo qun ging xạ khuẩn 8
1.3.1.Chn chng c HTKS cao bằng sng lc ngu nhiên 8
1.3.2.Đt bin ci tạo ging 8
1.3.3.Bo qun ging xạ khuẩn 9
1.4.Sự sinh tổng hp khng sinh ở xạ khuẩn 9

1.4.1 Sự hnh thnh KS ở xạ khuẩn 9
1.4.2.Mt s yu t nh hưởng ti qu trnh sinh tổng hp KS 10
1.4.3.Lên men sinh tổng hp khng sinh t Streptomyces 11
1.5.Chit tch v tinh ch khng sinh t dch lên men 12
1.5.1.Vai trò ca chit tch v tinh ch khng sinh 12
1.5.2.Cc phương php chit tch 13
1.6.Bưc đu nghiên cu cu trc khng sinh 14
1.6.1.Phổ t ngoại - kh kin 144
1.6.2.Phổ hồng ngoại 14
1.6.3.Khi phổ 14
1.7. Mt s kt qu nghiên cu v KS 15
1.7.1.Ảnh hưởng ca Panamycin - 607 lên cc sn phẩm chuyn ha th cp sn
xut bởi Streptomyces spp. 15
5
1.7.2. Cc polyene macrolid mi h hng vi nystatin c vng polyol ci bin
thông qua công ngh sinh tổng hp S. noursei 15



1.7.3.Acid pivalic- đơn v khởi đu trong sinh tổng hp acid béo v khng sinh
ở Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces 166

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 177
2.1 Nguyên vt liu v thit b 177
2.1.1Nguyên vt liu 177
2.1.2My mc thit b 199
2.2 Ni dung nghiên cu 20
2.2.1. Sng lc, ci tạo ging 20
2.2.2 Lên men, chit tch khng sinh 20
2.2.3 Sơ b xc đnh mt s tính cht ca khng sinh tinh khit thu đưc 20

2.3 Phương php thực nghim 20
2.3.1Nuôi cy v gi ging xạ khuẩn 20
2.3.2.Đnh gi hoạt tính khng sinh bằng phương php khuch tn 21
2.3.3.Phương php ci tạo ging 222
2.3.4.Lên men chm tổng hp khng sinh 244
2.3.5.Chit khng sinh t dch lên men bằng dung môi hu cơ 255
2.3.6. Sơ b xc đnh thnh phn trong khng sinh bằng sc k lp mỏng . 255
2.3.7. Thu khng sinh thô bằng phương php ct quay 266
2.3.8. Tinh ch khng sinh thô bằng sc k ct 266
2.3.9.Kt tinh lại KS 277
2.3.10. Sơ b xc đnh khng sinh tinh khit thu đưc 277
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 278
3.1.Nâng cao kh năng sinh tổng hp KS ca chng Streptomyces 52.13 288
3.1.1.Kt qu sng lc ngu nhiên 288
3.1.2.Kt qu đt bin nâng cao kh năng sinh tổng hp khng sinh ca
Streptomyces 52.13 299

3.1.2.1.Đt bin bằng nh sng UV 29
3.1.2.2.Đt bin bằng ha cht: 311
3.2.Kt qu chn dung môi hu cơ v pH chit KS t dch lc 322
3.3. Lên men dch th sinh tổng hp khng sinh 333
3.3.1. Chn môi trưng lên men tt nht 333
3.3.2.Chn bin chng lên men tt nht: 333
3.4.Chit xut v bưc đu tinh ch cht khng sinh t dch lên men 344
3.4.1.Kt qu sc k lp mỏng 344
3.4.2.Kt qu tinh ch khng sinh bằng sc k ct 355
3.4.3.Kt qu kt tinh: 40
3.4.4.Kt qu đo phổ xc đnh cu trc ca KS tinh khit 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 411

1.Kt lun: 411
2.Kin ngh 422
Ti liu tham kho
Phụ lục

DANH MỤC CC CHỮ VIT TẮT
ADN Acid 2’- deoxyribonucleic
B.subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633
CLNN Chn lc ngu nhiên
CW Thnh t bo- Cell wall
DM Dung môi
DMHC Dung môi hu cơ
ĐB Đt bin
Gr Gram
IR Hồng ngoại- Infrared
KS Kháng sinh
L-DAP L- diaminopimelat
MTdt Môi trưng dch th
P.mirabilis Proteus mirabilis BV 108
SKLM Sc k lp mỏng
SLNN Sàng lc ngu nhiên
TB T bo
TĐC Trao đổi cht
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vt

UV T ngoại ultra violet







DANH MỤC CC BẢNG
Bng 2.1: Cc VSV kim đnh
Bng 2.2: Môi trưng nuôi cy xạ khuẩn
Bng 2.3: Cc môi trưng nuôi cy VSV kim đnh
Bng 2.4: Các dung môi đ s dụng
Bng 3.1: Kt qu th HTKS sng lc ngu nhiên chng Streptomyces 52.13
Bng 3.2: Kt qu th HTKS đt bin bằng UV ln 1
Bng 3.3: Kt qu th HTKS đt bin bằng UV ln 2
Bng 3.4: Kt qu th HTKS đt bin ha hc
Bng 3.5: Kt qu chn dung môi v pH chit
Bng 3.6: Kt qu chn môi trưng lên men chm
Bng 3.7: Kt qu chn bin chng lên men chm tt nht
Bng 3.8: Kt qu chạy sc kí lp mỏng
Bng 3.9: Kt qu th HTKS cc phân đoạn sau chạy sc kí ct ln 1
Bng 3.10: Kt qu sc kí lp mỏng cc phân đoạn sau chạy sc kí ct ln 1
Bng 3.11: Kt qu th HTKS cc phân đoạn sau chạy ct ln 2
Bng 3.12: Kt qu sc kí cc phân đoạn sau chạy sc kí ct ln 2

DANH MỤC CC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ cơ ch tc dụng ca cc h KS chính
Hình 1.2: Cc khuẩn ty ở xạ khuẩn
Hình 1.3: Đưng cong biu diễn sự sinh trưởng v pht trin ca xạ khuẩn
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự pht hin ra tc dụng ca khng sinh ln đu tiên ca nh bc sĩ ngưi
Anh Alexander Flaming vo thng 10 năm 1928 l mt thnh tựu vĩ đại ca y hc.
Sự xut hin ca khng sinh đ gip con ngưi chng lại sự tn công ca cc loi
vi khuẩn nguy him v lm gim tỉ l t vong cho ngưi bnh. Song, do bn năng
sinh tồn, vi khuẩn luôn tm mi cch bin đổi đ trở nên khng thuc. Mt ví dụ
đin hnh c th k đn l vic vi khuẩn c th tạo ra β- lactamase mt loại enzym
do vi khuẩn tit ra c th ph hy cu trc ca penicillin v vô hiu ha tc dụng
khng khuẩn ca cc khng sinh c cu trc vòng β-lactam. Tc đ bin đổi như
v bo hin nay ca vi khuẩn c th tạo ra hng loạt cc loại siêu vi khuẩn đa
khng thuc khin cho th gii lâm vo tnh trạng không c phương php cu cha
cho nhiu loại bnh.Chính v vy vic tm ra, pht trin cc loại khng sinh mi c
hoạt tính khng khuẩn v hiu qu điu tr cao đang l mt vn đ ht sc bc thit
ca ngnh công nghip khng sinh hin nay.
Như chng ta đ bit trong s cc khng sinh đưc bit đn hin nay mt tỉ
l ln đu c nguồn gc t xạ khuẩn. Bên cạnh đ theo cc kt qu điu tra 65%
khng sinh nguồn gc xạ khuẩn l do chi Streptomyces sn xut ra. Đ l cơ sở đ
cc nh khoa hc nưc ta hin nay tp trung nghiên cu vo chi xạ khuẩn ny.
Tại b môn Vi sinh – sinh hc trưng đại hc Dưc H Ni chng tôi đ
chn đ ti : “Gp phn vo nghiên cu lên men tổng hp khng sinh t

Streptomyces 52.13”. Ni dung ca kha lun mong mun đạt đưc cc mục tiêu
sau đây:
- Nghiên cu cc bin php ci tạo ging Streptomyces 52.13 nhằm lm tăng kh
năng sinh tổng hp khng sinh.
- Nghiên cu điu kin lên men, nuôi cy v chit xut thích hp.
- Tìm điu kin tinh ch KS thích hp, bưc đu nghiên cu cu trc ca KS
2

CHƯƠNG I: TNG QUAN
1.1.Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh
Năm 1928, Alexander Fleming pht hin ra kh năng khng khuẩn ca
Penicillin notatum mở đu cho nghiên cu v s dụng khng sinh. Năm 1938,
Florey v Chain đ thực nghim penicillin trong điu tr. [6]
Năm 1942, Waksman đưa ra đnh nghĩa: “Khng sinh hay mt cht c tính
khng sinh l mt cht do cc vi sinh vt sn xut ra, c kh năng c ch sự pht
trin hoặc thm chí tiêu dit cc vi khuẩn khc”. Năm 1950, Baron bổ sung gii
hạn đnh nghĩa như sau: “Khng sinh l nhng cht đưc tạo ra bởi cơ th sng, c
kh năng c ch sự pht trin hay sự tồn tai ca mt hay nhiu chng vi sinh vt ở
nồng đ thp”. [8]
Nghiên cu, sn xut, s dụng khng sinh đ pht trin mạnh do tc dụng
hơn hẳn trong điu tr cc bnh nhiễm khuẩn so vi cc thuc khng khuẩn khc.
Hin nay, gii khoa hc quan nim rằng: “Kháng sinh là những sản phẩm
đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh
học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi
sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở
nồng độ thấp”.[15]
Cn phân bit mt s cht cng do vi sinh vt tạo ra nhưng không đưc gi
l khng sinh (rưu ethylic, cc acid hu cơ, …) v chng tc dụng lên vi sinh vt
khc không mang tính chn lc v ở nồng đ cao.

1.1.2.Tiêu chuẩn đối vi mt kháng sinh
Nhng yêu cu ca y hc đi vi 1 khng sinh l:
- Khng sinh phi không đc hoặc rt ít đc vi cơ th.
3

- Hoạt tính khng khuẩn phi nhanh v mạnh đi vi VSV gây
bnh.
- Dễ hòa tan trong nưc v bn vng khi bo qun lâu di.
- Hoạt tính khng khuẩn không b gim khi tip xc vi dch cơ
th. [11]
1.1.3.Đánh giá tác dụng:
- Theo đơn v tc dụng (IU) :thưng dng cho c sn phẩm thiên
nhiên v không tinh khit.
- Theo khi lưng cht chuẩn (g,mg ): thưng dng cho cc ch
phẩm bn tổng hp v tinh khit. [8]
1.1.4 Phân loại kháng sinh
C nhiu cch phân loại khng sinh: theo nguồn gc, theo tính nhạy cm
ca vi khuẩn vi khng sinh, theo cơ ch tc dụng, theo cu trc ha hc… Phân
loại khng sinh theo cu trc ha hc l khoa hc nht v n gip cho ngưi nghiên
cu nhanh chng đnh hưng đưc cc đặc đim ca cht khng sinh mi pht hin
khi bit đưc cu trc ha hc ca n, trnh lng phí thi gian đ nghiên cu v
cc đặc đim khc.[8]
Phân loại khng sinh theo cu trc ha hc thưng chia ra cc nhm cht
sau đây:
- Cc khng sinh c cu trc β-lactamase
+ Penicillin: oxacillin, ampicillin
+ Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim…
+ Cc β-lactamase khc: carbapenem, cht c ch β-lactamase
- Các kháng sinh nhóm phenicol (chloramphenicol )
- Các khng sinh c cu trc aminosid (streptomycin, gentamicin…)

- Các KS nhóm lincosamid (lincomycin, clindamycin…)
4

- Các KS nhóm quinolon (acid nalidixic…)
- Các KS nhóm Co – trimoxazol (co-trimoxazol )
- Các kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline…)
- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…)
- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…)
- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…)
- Các kháng sinh khác (rifapicin…) [8], [18]
1.1.5. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các khng sinh tc dụng ch yu qua vic c ch cc phn ng tổng hp
khc nhau ca t bo vi sinh vt gây bnh bằng cch gn vo cc v trí chính xc
hay cc phân t đích ca t bo vi sinh vt, lm bin đổi cc phn ng đ. Mi
nhóm kháng sinh tác dụng lên cc đích khc nhau. Cc kiu ch yu:
- Tc dụng lên vic tổng hp thnh t bo : c ch tổng hp vch t bo vi
khuẩn lm VK b tiêu dit. Mt s KS như vancomcin, β- lactamase… tác
dụng theo cơ ch ny.
- Tc dụng lên mng nguyên sinh cht: KS lm thay đổi tính thm ca mng
dn đn lm ri loạn qu trnh trao đổi cht gia t bo VK vi môi trưng
lm VK b tiêu dit.
- Tc dụng lên sự tổng hp ADN: c ch sự tổng hp ADN t qu trnh sao
chép và phiên mã. VD: actinomycin, rifampicin
- Tc dụng lên sự tổng hp protein:
+ Gn vo tiu đơn v 30S hoặc 50S, lm gin đoạn qu trnh tổng
hp protein c kh năng km hm vi khuẩn. VD: Cloramphenicol,
tetracycline macrolid và lincosamid…
+ Gn vo tiu đơn v 30S ca ribosom lm sai lch qu trnh tổng
hp protein c kh năng tiêu dit VK. VD: các aminosid, spectinomycin…
5

- Tc dụng lên sự trao đổi cht trung gian: c ch tổng hp acid folic. VD:
Co-trimoxazol.
- Tc dụng lên h hô hp [18]
Hnh sau đây gii thiu sơ đồ cơ ch tc dụng ca cc h khng sinh
chính.[18]



Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các h kháng sinh chính
1.1.6.Các ứng dụng của kháng sinh
- Trong y học: Khng sinh đưc s dụng đ điu tr cc bnh nhiễm khuẩn,
nhiễm nm v mt s bnh ung thư.
- Trong chăn nuôi: Điu tr cc bnh nhiễm trng ở đng vt như dng
griseofulvin đ điu tr viêm phổi cp, viêm v ca trâu bò ; dng cloramphenicol
đ điu tr cc bnh do Brucella gây ra.
6

- Trong nông nghiệp: Khng sinh đưc s dụng đ dit nm, vi khuẩn, virus
gây bnh cho cây trồng: Validamycin dng đ dit nm Rhizostonia solani gây
bnh khô vằn hại la rt hiu qu.
- Trong công nghiệp thực phẩm: Khng sinh đưc dng đ bo qun thực
phẩm nh tc dụng tiêu dit vi sinh vt c trong thực phẩm: khng sinh subtilin (do
Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra).[4], [7]
1.2.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
1.2.1.Đặc điểm hình thái:
Streptmyces l 1 chi thuc lp phụ Actinomycetales, phân b rng ri trong
tự nhiên. Nơi sng ca cc loi thuc chi Streptomyces rt đa dạng (đt, thy
vực…). Chng thuc VK tht pht trin dạng si phân nhnh l cc VK Gr(+), c
tỉ l G+C>55% .[17]

H si ca xạ khuẩn gồm c khuẩn ty cơ cht v khí sinh.
+ Khuẩn ty cơ cht: mc sâu vo môi trưng nuôi cy, không phân ct trong
sut qu trnh pht trin, b mặt nhẵn hoặc sn si, c th tit ra môi trưng mt s
loại sc t, c sc t tan trong nưc, c sc t chỉ tan trong dung môi hu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ cht pht trin di ra trong không khí.
Sau mt thi gian pht trin trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xut hin chui bo t.
+ Chui bo t (si bo t) c rt nhiu hnh dạng khc nhau: thẳng, sng,
mc câu, xon… Chui bo t phân ct tạo thnh cc bo t trn, l cơ quan sinh
sn ch yu ca xạ khuẩn. B mặt bo t c th c dạng trơn nhẵn (sm), x x da
cóc (wa), c gai (sp) hoặc c tc (ha).Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sn vô
tính.[7], [17]
Hnh 4 dưi đây th hin cc loại khuẩn ty ở xạ khuẩn. [17]
7


`Hình 1.2: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
1.2.2.Đặc điểm sinh lý:
Streptomyces l sinh vt d dưng, c tính oxi ha cao. Đ pht trin, chng
phân gii cc hydratcarbon lm nguồn cung cp vt cht v năng lưng, đồng thi
thy phân cc hp cht như gelatin, casein, tinh bt, kh nitrat thnh nitrit.
Streptomyces l loại xạ khuẩn hô hp hiu khí. Nhit đ ti thích ca chng l 25-
30°C, pH ti ưu thưng l 6,8-7,5. [4], [7]
1.2.3.Đặc điểm cấu tạo:
Cu tạo ca Streptomyces chia lm 3 phn: thnh t bo, mng t bo cht,
t bo cht.
- Thành t bo: dạng kt cu lưi, dy khong 10 – 20nm. Thnh t bo
thuc nhm CW I, c cha L – DAP và glycin.
- Mng t bo cht: dy 7,5 – 10 nm, không cha cellulose v kitin.
- Meosome: nằm phía trong t bo cht hnh phin,bng hay hnh ng.[16]
1.2.4.Khả năng tạo sắc tố:

Sc t tạo thnh t Streptomyces đưc chia lm 4 loại: sc t hòa tan, sc t
ca khuẩn ty cơ cht, sc t ca khuẩn ty khí sinh, sc t melanoid. [7]
8

1.3.Tuyển chn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên
VSV c sự bin d tự nhiên theo tn s khc nhau trong ng ging thun
khit, c c th c hoạt tính KS tăng 20 - 30 % so vi nhng c th khc. Cn phi
chn c th c hoạt tính cao nht trong ng ging đ nghiên cu tip. [11]
Trong thực t, vic chn lc tự nhiên cc c th c HTKS cao chỉ đ nghiên
cu ban đu, n không c gi tr p dụng vo sn xut. Đ thu đưc nhng chng
c kh năng siêu tổng hp khng sinh, ngưi ta p dụng cc phương php đt bin
nhân tạo.
1.3.2.Đt biến cải tạo giống
Cc tc nhân gây đt bin c th đưc chia lm 3 nhm: ha hc
(ethylamine, acid nitrơ…), vt lí (UV, tia X…) v sinh hc. Trong đ, các tác nhân
vt l v ha hc vi liu lưng v thi gian thích hp sẽ git cht hu ht cc
VSV. Nhng c th còn sng st sẽ c sự ĐB gen, lm thay đổi cc tính trạng dn
đn hoặc lm mt kh năng tạo KS (đt bin âm) hoặc lm tăng hiu sut sinh tổng
hp khng sinh lên mạnh (ĐB dương). [4]
- Đt bin bằng UV:
Ánh sng UV c kh năng đâm xuyên kém nhưng vi cc t bo VSV c
kích thưc nhỏ th tia UV c th xuyên thu ti vng nhân. Tia UV c th lm cho
các base pyrimidin trên cng 1 mạch ca ADN hnh thnh cc cu trc dimer T-T,
C-C, T-C. Cc dimer nh hưởng ti sự ghép đôi bổ sung trong sao chép đ lại 1 vt
khuyt trên mạch bổ sung gây ra ĐB gen.[14]
- Đt bin bằng HNO
2
:
Axit nitrơ l cht gây ĐB mạnh. N c tính oxy ha mạnh lm loại nhm

amin (NH
2
) ra khỏi A, G v C. Phn ng ny lm thay đổi amino thnh keto v
lm thay đổi liên kt hydro ca cc base ny. A sau loại amin c xu hưng liên kt
9

vi C; C sau khi chuyn thnh U c xu hưng liên kt vi A; G chuyn thnh
xanthin nhưng xanthin vn liên kt vi C nên trưng hp ny không gây ĐB.[16]
Đ tạo ra cc chng c hiu sut sinh tổng hp khng sinh cao phi tin
hnh đt bin bc thang, kt hp vi cc phương php di truyn phân t.
1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn
Mục đích: gi ging VSV c tỷ l sng st cao, cc đặc tính di truyn
không b bin đổi v không b tạp nhiễm bởi cc vi sinh vt lạ.
Thông thưng, c th s dụng 4 phương php sau đ bo qun cc chng
VSV: cy chuyn (bo qun trong l hoặc ng môi trưng, đnh kỳ cy chuyn
sang môi trưng mi), lm khô (trn t bo VSV vi gi mang v lm khô ở nhit
đ phòng), đông khô (phân tn t bo VSV trong MT cht bo qun rồi đông lạnh,
lm khô mu đông lạnh), đông lạnh (huyn dch t bo trong cht bo qun đưc
đông lạnh nhanh v bo qun ở nhit đ thp). Đ gi ging xạ khuẩn trong phòng
thí nghim, cch đơn gin nht l nuôi cy xạ khuẩn trên môi trưng thạch nghiêng
thích hp, ct ng thạch nghiêng trong t lạnh v đnh kỳ 6 thng cy lại 1 ln.[13]
1.4.S sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn
1.4.1 S hình thành KS ở xạ khuẩn
Cc nh nghiên cu hnh thnh lên nhiu quan đim khc nhau v sự sinh
tổng hp khng sinh ở xạ khuẩn. Mt s cho rằng sự hnh thnh KS l do sự cạnh
tranh trong môi trưng dinh dưng. Mt s khc lại cho rằng vic hnh thnh KS
gip cho sự tồn tại ca VK trong điu kin sng khc nghit. Tuy nhiên hu ht
đu đồng  công nhn KS l sn phẩm chuyn ha th cp, đưc hnh thnh vo
cui pha sinh trưởng đu pha cân bằng ca chu kỳ sinh trưởng.
Mặc d KS c cu trc khc nhau v VSV sinh ra chng cng đa dạng

nhưng qu trnh tổng hp chng chỉ theo mt s con đưng nht đnh:
10

- KS đưc tổng hp t mt cht chuyn ha sơ cp, thông qua mt chui
phn ng enzyme.
- KS đưc hnh thnh t 2 hoặc 3 cht chuyn ha khc nhau.
- KS đưc hnh thnh bằng con đưng polymer ha cc cht chuyn ha sơ
cp, sau đ tip tục bin đổi qua cc phn ng enzyme khc.
Hnh dưi gii thiu đưng cong sinh trưởng, pht trin ca vi sinh vt tri
qua 4 giai đoạn ni tip: pha tim tng, pha ly tha, pha cân bằng v pha suy
tàn.[11].

Hình 1.3: Đưng cong biểu diễn s sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn

Mt s chng xạ khuẩn c th tổng hp đưc nhiu loại khng sinh c cu
trc v tc dụng tương tự nhau. Vic tổng hp ny do cc cơ ch điu khin đa
gen, ngoi gen v cc gen chu trch nhim tổng hp cc tin cht, enzyme,
cofactor qui đnh.[13], [15]
1.4.2.Mt số yếu tố ảnh hưởng ti quá trình sinh tổng hợp KS
a) Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và chủng giống sử dụng[11], [24]
- Nhiệt độ: nhit đ ti ưu cho qu trnh sinh tổng hp KS l 22 – 28ºC
- pH môi trưng: thưng pH thích hp nht l pH trung tính.
- Độ thông khí: xạ khuẩn l loi hiu khí, cn đm bo thong khí tt đặc bit l ở
giai đoạn nhân ging tc 6 – 12 gi đu ca qu trnh nuôi cy. Nồng đ O
2
thích
hp cho sinh tổng hp KS l 2 – 8 ml O
2
/ 100ml.
11

- Tuổi giống: tuổi ging cy truyn vo môi trưng lên men cho hiu sut sinh tổng
hp cao nht l 36 – 72 gi tuổi. Lưng ging 2 – 10 %
b) Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men:[11] , [24]
- Nguồn Carbon: c  nghĩa hng đu trong sinh trưởng v hnh thnh KS. Nguồn
carbon thưng đưc s dụng nht l tinh bt. Tuy nhiên, ty tng chng khc nhau
m s dụng cc loại khc nhau. C th l: glucose, fructose…hoặc 1 s cc loại
acid hu cơ hay cht béo khc.
- Nguồn nitơ: gồm nitơ hu cơ v vô cơ. Nguồn nitơ hu cơ c th l cc hp cht
t thực vt như bt đu tương, cao ngô. Nguồn vô cơ thưng l mui amoni.
- Nguồn phosphate vô cơ : đng vai trò l tc nhân điu hòa sự tổng hp KS. Nồng
đ thích hp: 10mg/ml.
- Các yếu tố vi lượng: Nu môi trưng lên men c nguồn gc dinh dưng tự nhiên
th hu ht cc yu t vi lưng đu đ c sẵn không cn bổ sung thêm. Vic bổ
sung thêm cc hp cht giu yu t vi lưng vo môi trưng sẽ lm thay đổi đng
k kh năng sinh tổng hp ca KS ca nhiu loại xạ khuẩn.
1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
a.Định nghĩa: Lên men l qu trnh phân gii hydratcarbon đưc tin hnh do hoạt
đng sng ca VSV nh xc tc ca enzyme vi mục đích cung cp năng lưng v
cc hp cht trung gian cn cho chng.[5] , [12]
b.Các phương pháp lên men
- Phương pháp lên men bề mặt: MT dng trong phương php ny ở th rn
hay th lỏng ty loi VSV. VSV hp thu dinh dưng t MT v s dụng oxi không
khí đ hô hp trên b mặt MT.
+ Ưu đim: đơn gin, dễ thực hin, đu tư trang thit b thp.
+ Nhưc đim: din tích s dụng ln, kh tự đng ha quy trnh sn xut,
hiu sut s dụng thp.
- Phương pháp lên men chìm: VSV nuôi trong MT lỏng, pht trin 3 chiu.
12

+ Ưu đim:
Hiu sut s dụng không gian cao, lưng hoạt cht tổng hp trong 1 th tích
môi trưng cao, hiu sut lên men cao.
Môi trưng nuôi cy l 1 th thng nht, v vy c th kim sot quy trnh
lên men 1 cch dễ dng. Thit b tự đng ha tit kim đưc mặt bằng v nhân lực.
+ Nhưc đim
Đu tư trang thit b ban đu ln
Cn thit b chu p lực.
C 4 kiu lên men chm như sau:
+ Lên men mẻ (lên men c chu kỳ): VSV đưc nuôi c đnh trong bnh lên
men vi 1 th tích MT xc đnh. VSV pht trin theo giai đoạn v tạo ra sn phẩm.
Kt thc qu trnh, ngưi ta thu ly sn phẩm.
+ Lên men c bổ sung: trong qu trnh nuôi cy c bổ sung thêm môi trưng
dinh dưng đ lm cho mt đ t bo trong bnh tăng lên. Do đ, nâng sao hiu qu
s dụng bnh lên men.
+ Lên men liên tục: Thit b đưc cu tạo đặc bit sao cho khi VSV đ pht
trin đn mt giai đoạn thích hp th sẽ ly đi mt th tích dch lên men v đồng
thi bổ sung đồng lưng MT mi vo bnh.
+ Lên men bn liên tục: trong qu trnh lên men, vic bổ sung thêm MT
dinh dưng v rt bt dch lên men không đưc thực hin liên tục m đnh kỳ sau
nhng khong thi gian nht đnh.[11], [13]
1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Giai đoạn ny c vai trò rt quan trng bởi sn phẩm thu đưc sau khi lên
men thưng không bn vng, hm lưng KS trong dch lên men thưng thp. Do
đ, cn tch riêng KS khỏi cc tạp cht khc v tinh ch sn phẩm đạt cc tiêu
13

chuẩn cn thit. Công đoạn tinh ch gp phn quyt đnh gi thnh ca sn
phẩm.[12]

1.5.2.Các phương pháp chiết tách
a.Chiết xuất
Chit xut l qu trnh chuyn cht tan t pha ny sang pha khc ( thưng
dng DMHC hay hn hp) đ tch ly mt cht hay mt nhm cht hn hp cn
nghiên cu.[3]
Nguyên tc: Dựa vo sự phân b cht tan gia 2 pha không hòa ln vo
nhau.
b.Tách và tinh chế sản phẩm
Tch sn phẩm l sự kt hp ca nhiu phương php ha hc, vt lí, ha l
nhằm đi t 1 hn hp phc tạp đn nhng hn hp gin đơn v t hn hp gin
đơn tch riêng tng cht. Tinh ch l qu trnh tạo sn phẩm tinh khit dng cho
nghiên cu tip theo. [19]
Phương php thưng đưc s dụng hin nay đ tch v tinh ch sn phẩm l
sc k.
Các phương pháp sắc ký hay dùng:[1], [9]
+ Sc k lp mỏng: L phương php tch cc cht trong hn hp dựa trên
kh năng b hp phụ (l ch yu) khc nhau ca chng trên cc b mặt mt cht rn
(cht hp phụ). Cht hp phụ ở đây đưc trng đu thnh mt lp mỏng trên gi
đ. Đại lưng đặc trưng cho mc đ di chuyn ca cc cht phân tích l h s R
f
.
+ Sc k lỏng trên ct: L phương php tch xc đnh cc cht dựa trên sự
phân b khc nhau ca cc cht gia hai pha: pha tĩnh l cht lỏng bao bc tạo
thnh tm phim mng mỏng trên b mặt mt cht rn trơ (gi l cht mang c c
hạt nhỏ) đưc nhồi vo ct, pha đng l DM thm qua ton b b mặt pha tĩnh.
Ngoi ra đ tinh ch còn hay dng phương php kết tinh: phương php ny
dựa trên sự hòa tan c gii hạn ca mt cht trong dung dch [10]. T đ c th p
14

dụng hòa tan cht (cht ny c th chưa tinh khit) vo 1 DM sau đ thêm 1 dung

môi th 2 vo. Do đ tan trong dung môi th 2 khc nên cc tinh th ca cht sẽ
kt tinh v ta c th tch chng ra 1 cch dễ dng. Đ tinh khit ca cht đ đ
tăng.
1.6.Bưc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến
Cc bc xạ UV-VIS c năng lưng kh ln nên c kh năng lm thay đổi
mc năng lưng ca cc electron t trạng thi cơ bn lên trạng thi kích thích.
Gia cu trc ha hc ca phân t cht cn nghiên cu vi quang phổ hp thụ c
mi quan h chặt chẽ (Ví dụ: Nhng phân t no cng c nhiu liên kt đôi th sự
hp thụ cng chuyn v bưc sng di hơn, đặc bit l cc h liên hp). Cc phân
t c đặc đim: ni đôi liên hp, nhân thơm, d t N, S, O c kh năng hp thụ
năng lưng nh sng UV-VIS. [2] , [9]
1.6.2.Phổ hồng ngoại
Năng lưng ca bc xạ hồng ngoại không đ ln đ lm thay đổi trạng thi
năng lưng ca electron m chỉ đ đ thay đổi trạng thi dao đng ca phân t.
Phổ IR đưc s dụng đ pht hin cc nhm chc đặc bit trong phân t. Mi bưc
sng hp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho mt nhm chc.[1], [9]
1.6.3.Khối phổ
Nguyên tc: Khi phổ l k thut đo trực tip tỷ s khi lưng v đin tích
ca ion (m/z) tạo thnh trong pha khí t phân t hoặc nguyên t ca mu. Dng
chm đin t c năng lưng trung bnh (50 – 100 eV) bn phân ph phân t hu cơ
ở chân không cao (10
-6
mmHg). Trong qu trnh đ cc cht hu cơ b ion ha v b
ph v thnh cc mnh. Cc tín hiu thu đưc tương ng vi cc ion sẽ th hin
bằng mt s vạch pic c cưng đ khc nhau tp hp thnh khi phổ đồ.[1], [20]
15

1.7. Mt số kết quả nghiên cứu về KS
1.7.1.Ảnh hưởng của Panamycin - 607 lên các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp

sản xuất bởi Streptomyces spp.
Sự nh hưởng ca Panamycin – 607 lên sự pht trin ca khuẩn ty khí sinh
v cc cht khng sinh đưc sn xut bởi Streptomyces đ đưc chng minh. Tip
xc vi 6,6 µg Panamycin – 607 kích thích lm tăng 2,7 ln puromycin đưc sn
xut bởi Streptomyces alboniger NBRC 1278, trong đ trưc tiên l n lm tăng
khuẩn ty khí sinh. Panamycin – 607 cng kích thích lm tăng sn xut sn phẩm
tương ng streptomycin ca S.griseus NRBC 12875 v cirenubin A v B ca
S.tauricus JCM 4837 ln lưt l 1,5; 1,7 v 1,9 ln. Khng sinh đưc sn xut bởi
Streptomyces sp. 91-a đưc xc đnh l virginiamycin M1, v kh năng tổng hp
ca n đ tăng lên 2,6 ln bởi panamycin -607. Kt qu ny đ chng minh rằng
không chỉ khôi phục hay kích thích sự pht trin ca khuẩn ty khí sinh m còn lm
tăng sn phẩm chuyn ha th cp.[21]
1.7.2. Các polyene macrolid mi h hàng vi nystatin có vùng polyol cải biến
thông qua công ngh sinh tổng hợp S. noursei
Nystatin l mt khng sinh nhm polyene macrolid c phổ khng nm rng,
hiu qu cao v ít c xu hưng khng thuc. Tuy nhiên, KS ny c đc tính tương
đi cao, đặc bit l đi vi cc t bo thn. Nystatin đưc sn xut bởi S.noursei.
Cu trc ca nystatin tương tự amphotericin B. Amphotericin B c 7 liên kt đôi
trong phn polymer trong khi nystatin c 4 liên kt đôi. Sự khc bit ny dn đn
kh năng khng nm ca nystatin cao hơn amphotericin do sự tương tc k nưc
vi mng sterol hiu qu hơn. Tin hnh đt bin gen GG5073SP ca S. noursei,
sn xut heptaneic nystatin đồng đẳng S44HP đ ci thin đng k kh năng khng
nm nhưng lại tăng đc tính so vi nystatin. Bt hoạt gen nysN P450
monooxygenase ca bin chng GG5073SP mang lại bin chng S.noursei đt
bin c kh năng sn xut nystatin đồng đẳng BSG005 (16 decarboxy – 16 –
16

methyl – 28, 29 – didehydronystatin).Hoạt cht ny c kh năng khng nm cao
hơn ca S44HP v gim đc tính hơn.[23]
1.7.3.Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh

ở Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces
Mt con đưng sinh tổng hp s dụng acid pivalic như l đơn v khởi đu
đ đưc pht hin ở ba loi vi khuẩn Alicyclobacillus acidoterrestris, Rhodococcus
erythropolis và Streptomyces avermitilis. Khi thêm acid pivalic đưc đnh du
bằng đồng v Deuteri vo môi trưng dinh dưng ca A. acidoterrestris và R.
erythropolis, n sẽ kt hp vi cc acid béo đ tạo thnh acid béo c thêm nhnh
tert- butyl (t- FAs). Thêm vo đ, trong R. erythropolis, acid pivalic chuyn ha
thnh hai đơn v khởi đu l acid isobutyric v acid 2- methylbutyric, tương ng l
tin cht ca iso-FAs và anteiso- FAs. Sự sinh tổng hp khng sinh ở loi S.
avermitilis khi c thêm acid pivalic mang lại ba nhnh FAs. Ngoi con đưng ny,
c acid pivalic v acid 2- methylbutyric cng đưc kt hp trong sinh tổng hp
kháng sinh avermectin. [22]