Nghiên cứu tổng hợp kháng sinh từ streptomycin 184.225

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



NGÔ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP
KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES
184.225

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


HÀ NỘI – 2015



BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI




NGÔ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP
KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES
184.225


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Nguyễn Liên Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh - Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội


HÀ NỘI – 2015




LỜI CẢM ƠN
Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo ThS. Nguyễn
Liên Hương - người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình để giúp tôi hoàn
thành khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên
đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp
Dược trường Đại học Dược Hà Nội. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các
thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập tại trường.
Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên,

hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu khoa học.
Do điều kiện nghiên cứu, thời gian có hạn và trình độ của bản thân còn hạn
hẹp nên không thể tránh khỏi những sai sót trong bài luận. Vì vậy, tôi rất mong
nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện
hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015
Sinh viên


Ngô Thanh Huyền






MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh 2
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 3
1.3. Cải tạo giống và bảo quản giống vi sinh vật 5
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 7
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh 8
1.6. Sơ lược một số phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. 10
1.7. Một số nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces. 11
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Đối tượng nghiên cứu 13
2.1.1. Giống xạ khuẩn 13

2.1.2. Vi sinh vật kiểm định 13
2.1.3. Các loại môi trường nuôi cấy 13
2.1.4. Dụng cụ, hóa chất 15
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.2.2. Chọn lọc và cải tạo giống 17
2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh 17
2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 17
2.3. Phương pháp thực nghiệm 18
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống 18
2.3.2. Phương pháp xác định hình thái xạ khuẩn 18
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 19


2.3.4. Phương pháp chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 20
2.3.5. Phương pháp cải tạo và chọn giống 20
2.3.6. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23
2.3.7. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh trong dịch lọc
dịch lên men 24
2.3.8. Các phương pháp chiết tách kháng sinh 24
2.3.8.2. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 24
2.3.9. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 26
2.3.10. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 26
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 27
3.1. Xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184.225 27
3.2. Kết quả chọn MT nuôi cấy thích hợp và xác định tác dụng của kháng sinh 27
3.3. Kết quả cải tạo giống 28
3.3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 28
3.3.2. Kết quả đột biến 29
3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 32
3.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh

trong dịch lọc 33
3.6. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh 34
3.7. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng. 36
3.8. Kết quả chạy sắc kí cột 37
3.9. Sơ bộ xác định cấu trúc hóa học và một số đặc điểm của KS thu được. 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
AND
Acid 2'- deoxyribonucleic
B.subtilis
Bacillus subtilis
DM
Dung môi
DMHC
Dung môi hữu cơ
ĐB
Đột biến
Gr(-)
Gram âm
Gr(+)
Gram dương
HTKS
Hoạt tính kháng sinh
ISP
International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces
quốc tế)

KS
Kháng sinh
KTCC
Khuẩn ty cơ chất
KTKS
Khuẩn ty khí sinh
MC
Mẫu chứng
MT
Môi trường
MTdt
Môi trường dịch thể
P.mirabilis
Proteus mirabilis
s
Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
SLNN
Sàng lọc ngẫu nhiên
TB
Tế bào
UV
Ultra violet (tử ngoại)
V
Thể tích
VSV
Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG, DANH MỤC PHỤ LỤC
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 2
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định 13
Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) 14
Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 15
Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng và một số đặc tính của nó 15
Bảng 3.1. Các đặc điểm của Streptomyces 184.225 27
Bảng 3.2. Kết quả thử HTKS với 10 VSV kiểm định. 27
Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 29
Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. 29
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. 30
Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học. 31
Bảng 3.7. Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men. 32
Bảng 3.8. Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trên MT2dt. 32
Bảng 3.9. Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh. 33
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh trong dịch lọc. 34
Bảng 3.11. Kết quả chiết kháng sinh bằng DMHC ở các pH khác nhau. 35
Bảng 3.12. Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM 36
Bảng 3.13. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 1. 37
Bảng 3.14. Kết quả SKLM với các phân đoạn 2-18. (hiện hình bằng B.subtilis) 38
Bảng 3.15. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2. 39
Bảng 3.16. Kết quả SKLM các PĐ 2-15 của lần chạy cột lần 2 tách KS1, KS2. 40
Bảng 3.17. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 3. 41
Bảng 3.18. Kết quả SKLM các PĐ 2-12 của lần chạy cột lần 3 tách KS2, KS3. 41


Phụ lục 1. Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 49

Phụ lục 2. Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. 50
Phụ lục 3. Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. 52
Phụ lục 4. Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học. 54
Phụ lục 5. Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh. 56
Phụ lục 6. Ống nghiệm chứa Streptomyces 184.225 sau 6 ngày nuôi cấy. 56
Phụ lục 7. Kết quả thử HTKS Streptomyces 184.225 bằng PP giếng thạch. 57
Phụ lục 8. Kết quả thử HTKS Streptomyces 184.225 bằng PP khoanh giấy lọc. 57
Phụ lục 9. SKLM các phân đoạn tách các chất kháng sinh. 58
Phụ lục 10. Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces
184.225 58
Phụ lục 11. Phổ tử ngoại vết KS2 của Streptomyces 184.225 59
Phụ lục 12. Phổ hồng ngoại vết KS2 của Streptomyces 184.225. 60
Phụ lục 13. Phổ khối lượng vết KS2 của Streptomyces 184.225. 60










1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1928 khi Alexander Fleming ngẫu nhiên phát hiện ra sự ức chế phát triển
S.aureus của Penicillin notatum, đến năm 1941, ông đã chiết ra được Penicillin từ
chủng Penicilium chrysogenium có hoạt tính cao hơn nhiều lần và đã cứu được hàng

ngàn thương binh trong chiến tranh thế giới lần 1. Từ đó, các công trình nghiên cứu
kháng sinh liên tục được tiến hành, ứng dụng rộng rãi trong y học lâm sàng, và
ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh đã ra đời.
Mặc dù đã có rất nhiều thành công trong việc phát hiện ra kháng sinh và những
tiến bộ trong kỹ thuật sản xuất kháng sinh, nhưng hiện nay các bệnh nhiễm khuẩn
vẫn đang là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới,
khoảng hơn 17 triệu người chết mỗi năm. Tự sử dụng thuốc và lạm dụng kháng sinh
là một yếu tố quan trọng gây hiện tượng kháng kháng sinh, giảm tuổi thọ của thuốc.
Do đó thấy được sự cấp thiết phải liên tục cho nghiên cứu và phát triển các loại
thuốc kháng sinh mới.
Khí hậu Việt Nam có điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của hệ
VSV, đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong số đó
55% là do chi Streptomyces sản xuất. Chi này còn có nhiều VSV ngoài khả năng
sinh tổng hợp kháng sinh còn tổng hợp các chất khác: chất điều trị ung thư
(actinomycin D), chất kích thích tăng trưởng được sử dụng nhiều trong chăn nuôi…
Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ
Streptomyces 184.225” với các mục tiêu sau:
- Sơ bộ xác định hình thái của Streptomyces 184.225 theo ISP.
- Cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế KS.
- Sơ bộ xác định một vài đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tổng hợp được.


2


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Theo quan niệm truyền thống: "Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất

tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt
chọn lọc đối với các vi sinh vật khác".
Theo quan niệm hiện nay: Kháng sinh đại diện cho tất cả các hợp chất có
nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với
các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như cả với tế bào ung thư) ở nồng độ thấp, mà
không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con
đường cung cấp chung. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp chỉ được sinh
tổng hợp mạnh mẽ ở giai đoạn phát triển sau (pha logarit muộn, pha dừng, hoặc pha
suy tàn) của sinh trưởng VSV [9].
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng,…trong
đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng phổ biển nhất vì nó giúp người
nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới
phát hiện thông qua cấu trúc hóa học của nó. Các chất được phân loại theo cấu trúc
hóa học chia làm 10 nhóm theo bảng 1.1 [8], [5].
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học.
Nhóm kháng sinh
Ví dụ
β – lactam
Penicillin, cephalosporin,…
Quinolon
Ciprofloxacin, ofloxacin,…
Aminoglycosid
Streptomycin, gentamicin
Tetracyclin
Tetracyclin, doxycyclin
Macrolid
Erythromycin, clarithromycin, …
Polypeptid
Polymycin, vancomycin,

Imidazol
Metronidazol,…
Lincosamid
Lincomycin, clindamycin,
Sulphonamid
Cotrimoxazol


Nhóm khác
Mupirocin
3


1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Khái quát theo đích tác dụng của kháng sinh:
- Tổng hợp thành tế bào: β –lactam, vancomycin…
- Màng tế bào chất: Polyen, amphotericin,…
- Tổng hợp ADN: Actinomycin, anzamycin.
- Tổng hợp protein: Aminoglycosid (ribosome), macrolid (liên kết t-ADN)…
- Trao đổi chất hô hấp: Antimycin,…
- Trao đổi chất folat: Sulfamid,…
Sơ đồ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ở phụ lục 5 [9].
1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn.
- Sự hình thành chất kháng sinh của xạ khuẩn: kháng sinh là sản phẩm chuyển
hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của quá trình
sinh trưởng.
- Ảnh hưởng của thành phần lên men: nguồn carbon, nguồn nitơ, phosphat vô
cơ và các yếu tố vi lượng.
- Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy: độ thông khí, nhiệt độ, pH, tuổi giống [9].
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn (Actinomycetes)

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rộng rãi trong tự
nhiên. Trước kia chúng được xếp vào Tản thực vật, nhưng ngày nay, chúng được
xếp vào vi khuẩn (Schizomyces).
Đa số là vi khuẩn Gr (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh
(khuẩn ty), tỷ lệ G+C > 55%. Chúng có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao
đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzym, vitamin,… Vì thế, chúng được nghiên
cứu nhiều. Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây hại cho người hoặc động vật
4


[4], [9],[11].
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces
Streptomyces là một chi của vi khuẩn Gram (+).
- Khuẩn lạc của xạ khuẩn Streptomyces: khá đặc biệt, thường có dạng khô ráp,
dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, dùng que
cấy không di chuyển được khuẩn lạc xạ khuẩn vì KTCC bám sâu vào trong thạch.
- Khuẩn ty xạ khuẩn: Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ
0,3-1,0 µm đến 2-3µm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn, màu sắc
khuẩn ty rất phong phú: đỏ, cam, đen, lục cam, nâu, KTCC có thể tiết vào môi
trường một số loại sắc tố như: sắc tố tan trong nước, sắc tố tan trong DMHC, đặc
biệt có loài tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen.
- KTCC phát triển một thời gian dài ra trong không khí thành KTKS. Sau một
thời gian phát triển, trên đỉnh KTKS sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử mọc đơn hay
mọc vòng (thẳng, uốn cong, xoắn lò xo, ).
- Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của chi xạ khuẩn Streptomyces. Bề
mặt bào tử có thể nhẵn, sần sùi da cóc, có gai, có tóc,…với các hình dạng phong
phú: hình cầu, hình ellipsoic, hình trụ…[9],[11].
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn
- Thành tế bào: có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm, có chức năng duy
trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Chi Streptomyces thuộc nhóm CWI có

chứa L-DAP (L- diaminopimelic acid) và glycin.
- Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5-10nm. Chúng có cấu trúc và chức năng
giống vi khuẩn nói chung.
- Mesosom nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay
hình ống. Mesosom làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào chất và qua đó làm
tăng cường hoạt tính enzym, tăng vận chuyển điện tử…
5


- Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat,
các hạt polysaccarid [9],[11],[16].
1.2.3. Đặc điểm sinh lý
Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân
giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy
phân các hợp chất như gelatin, casein, chúng có thể khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ tối thích thường là 25-30
0
C,
pH tối thích thường từ 6,8-7,5. Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4
nhóm: sắc tố hòa tan, sắc tố của KTCC, sắc tố của KTKS, sắc tố melanoid [9].
1.2.4. Xác định hình thái xạ khuẩn
Xác định hình thái chuỗi bào tử dựa vào cách phân loại theo ISP.
Tại hội nghị vi sinh vật thế giới lần thứ X (1970), khóa phân loại do Shirling
& Gottlieb đề xuất đã được sử dụng để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces trong họ Streptomytaceae. Khóa phân loại dựa trên các đặc điểm:
- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn: Màu sắc KTCC, màu sắc KTKS, hình
dạng chuỗi bào tử, đặc điểm bề mặt, kích thước và hình dạng bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả năng
sử dụng nguồn hydratcarbon [9], [20], [2].
1.3. Cải tạo giống và bảo quản giống vi sinh vật

1.3.1. Cải tạo giống vi sinh vật
 Mục đích:
Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có
hoạt tính rất thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất
đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu
điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm:
6


- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên
men, tạo ít bọt hơn.
- Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn.
- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết, nhóm chức mới
[8],[9].
 Các phương pháp cải tạo giống:
 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên:
Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 20-30% những cá thể khác. Cần phải
chọn lấy cá thể có hoạt tính kháng sinh cao nhất trong ống giống nghiên cứu tiếp.
Việc chọn lọc này chỉ để tiến hành nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng
vào sản xuất [13].
 Đột biến nhân tạo
Các tác nhân gây đột biến mạnh như tia UV, tia X hay tác nhân hóa học như
HNO
2
, ethylenimin, dimethylsulfat, nitrosoguanidin, cho tác dụng với liều lượng
và thời gian thích hợp sẽ giết chết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự
đột biến gen, làm thay đổi tính trạng dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh
(đột biến âm tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần

(đột biến dương tính).
Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vi sinh vật
có kích thước nhỏ (0,5-3,0µm) thì có có thể xuyên thấu tới vùng nhân. Vì vậy, ánh
sáng UV được dùng phổ biến trong cải tạo giống. Liều lượng chiếu được đặc trưng
bởi 3 yếu tố: thời gian chiếu, khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử. Liều lượng
chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng lớn và cuối cùng đạt đến giới hạn nhất
định. Thông thường đột biến dương sẽ xuất hiện ở liều lượng chiếu có độ sống sót
7


từ 0,1-1,0%, còn đột biến âm sẽ xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn.
Để tạo ra biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành
đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định
hướng gen, kĩ thuật tách dòng gen, tạo và dung hợp tế bào trần.
1.3.2. Bảo quản giống vi sinh vật
 Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao và ổn định các đặc tính di
truyền, không bị nhiễm các vi sinh vật lạ.
 Các phương pháp bảo quản:
- Bảo quản lạnh: bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 2
0
C, định kỳ 3-6
tháng cấy chuyền. Tuy nhiên, cách này khiến chủng có nguy cơ bị thay đổi đặc
tính di truyền.
- Làm khô: trộn tế bào VSV với giá mang (đất, cát, gelatin) và làm khô ở nhiệt
độ phòng.
- Đông khô: phân tán tế bào VSV trong môi trường chất bảo quản rồi đông lạnh,
làm khô mẫu đông lạnh bằng thăng hoa. Cách này tuy phức tạp nhưng đảm bảo
được các đặc tính di truyền.
- Đông lạnh: huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thấp (từ -78

0
C đến -20
0
C). Cách này đơn giản và hiệu quả,
nhưng cần có phương tiện để duy trì nhiệt độ thấp.
Trong phòng thí nghiệm thường nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch
nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2
0
C và định kì 3-6 tháng cấy
chuyền [8],[2],[10],[15].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của
8


VSV nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất
trung gian cho chúng.
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp, được tạo thành lúc gần kết thúc quá
trình sinh trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng [8],[13],[19].
1.4.2. Các phương pháp lên men
Có 2 phương pháp lên men:
 Lên men bề mặt:
Là quá trình VSV được nuôi cấy trên bề mặt rắn, bán rắn, lỏng. VSV hấp thu
các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề
mặt môi trường. Vì vậy yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng, lớn và
không quá sâu (5-10cm).
- Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị
ban đầu thấp.
- Nhược điểm: hiệu suất sử dụng thường thấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự động

hóa, tốn nhân công.
 Lên men chìm:
Là phương pháp VSV được nuôi cấy trong các bình lên men bình phản ứng
sinh học, trong điều kiện sinh lý tối thích, VSV phát triển cả 3 chiều.
- Ưu điểm: dễ cơ giới, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện
tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
- Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, không thể xử lý cục bộ, cán bộ
cần chuyên môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường [2],[10],[13].
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh
 Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
9


- Phương pháp tạo phức kết tủa.
- Phương pháp trao đổi ion.
- Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, ).
 Chiết xuất:
- Là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình
chuyển chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai
pha lỏng (1 pha là nước, 1 pha là dung môi hữu cơ không đồng tan với
nước).
- Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào
nhau.
- Kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch nên ta có thể sử dụng chiết
lỏng - lỏng theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng. Kháng sinh nội bào tồn
tại trong tế bào nên tiến hành chiết rắn lỏng.
 Tinh chế:
- Phương pháp sắc ký: là một quy trình trong đó các chất tan được tách riêng
ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học của các chất này

trong hệ thống hai hay nhiều pha.
- Nguyên lý tách: mẫu phân tích được hòa tan trong pha động, sau đó được
đưa lên pha tĩnh 1 cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Các chất tan của
mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau tùy thuộc sự tương tác
giữa pha tĩnh, pha động, chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành
phần sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ.
- Một số phương pháp sắc ký thường dùng:
 Sắc ký lớp mỏng: là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả
năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn
(chất hấp phụ). Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf
10


R
f
=
dm
v
d
d
trong đó: d
v
: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết.
d
dm
: Khoảng cách dung môi chạy.
Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt động của chất hấp thụ, tính chất
của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất
chấm.
 Sắc ký cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác

nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo thành
tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nhồi
vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. Quá trình
rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục một lượng mới của pha động
[1],[2],[3],[8],[17].
1.6. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp xác định cấu trúc của kháng sinh.
1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR)
- Là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thu bức xạ hồng
ngoại của một chất vào số sóng hoặc bước sóng bức xạ.
- Vùng hồng ngoại tương ứng trạng thái dao động trong phân tử. Dao động ưu
tiên nhất là dao động giữa những nguyên tử kế cận. Phổ hấp thụ IR cho thông tin về
cấu trúc phân tử. Biện giải phổ IR: sắp xếp các đỉnh hấp thụ theo chiều giảm dần
của số sóng, sau đó căn cứ vào cấu trúc dự kiến của một chất xác định các đỉnh hấp
thụ tương ứng với kiểu dao động của nhóm chức [9],[15],[6].
1.6.2. Phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS)
- Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng
hay số sóng là phổ tử ngoại.
- Vùng UV-VIS bao gồm tia cực tím và ánh sáng khả kiến. Do cấu trúc phân
tử quyết định mức năng lượng của điện tử và chuyển dịch điện tử xảy ra với sóng
11


ánh sáng vùng này, do vậy phương pháp này được áp dụng để định danh các chất.
[3], [7].
1.6.3. Phổ khối lượng (MS)
- Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ bằng
cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số
khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc
nguyên tử của mẫu.
- Dựa trên phổ thu được ta xác định được khối lượng phân tử và góp phần

nhận dạng cấu trúc hóa học của hợp chất [2],[15], [18].
1.7. Một số nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces.
1.7.1. Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn Streptomyces gilvigriseus:
Chủng Streptomyces MUSC 26T được phân lập từ mẫu đất rừng ngập mặn
tại Tanjung Lumpur, Malaysia. Hình thái xạ khuẩn được quan sát trên bề mặt môi
trường ISP7 thấy được là Gram dương, khuẩn ty khí sinh màu vàng. Vách tế bào
được xác định là có chứa acid LL-diaminopimelic, ngoài ra còn xác định có lipid,
các loại đường (galactose, glucose, mannose…). Các đặc điểm khác cho thấy chủng
này có một loạt các đặc điểm giống với các loài thuộc chi Streptomyces:
Streptomyces qinglanensis 172205T (96,5%), Streptomyces sodiiphilus YIM
80305T (96,6%), Streptomyces rimosus ATCC 10970T (96,4%). Tiến hành giải
trình tự gen kết luận rằng chủng này đại diện cho một loài mới, đặt tên là
Streptomyces gilvigriseus [25].
1.7.2. Phương pháp tiếp cận mới để tăng hiệu suất tổng hợp kháng sinh trên chủng
Streptomyces albus:
Nghiên cứu trên chủng Streptomyces albus sinh kháng sinh Salinomycin mà
trước đây chủng này được nuôi cấy để sản xuất trên quy mô công nghiệp. Người ta
đã chứng minh được hiệu quả của việc dùng các đột biến kháng thuốc để cải thiện
hiệu suất sản xuất Salinomycin với tỷ lệ cao (7-12%). Sau đó, tiếp tục chứng minh
12


thành công việc cải thiện hiệu suất Salinomycin bằng việc dùng đột biến ba tác
nhân. Các Streptomycin đã được chứng minh là có một điểm đột biến trong gen
rpsL (mã hóa protein ribosome S12). Tương tự như vậy, các đột biến Rifampin có
đột biến ở gen rpoB (mã hóa cho tiểu đơn vị RNA polymerase β). Tăng năng suất
của Salinomycin trong giống đột biến Streptomycin (có chứa các đột biến K88R
trong protein S12) có thể là kết quả của một cơ chế tổng hợp protein bất thường.
Ribosome đột biến K88R được đặc trưng bởi sự tăng 70S (ổn định trong nồng độ
thấp Mg

2+
). Kết luận rằng khả năng tổng hợp protein bất thường này trong giống đột
biến Streptomyces là kết quả của việc gia tăng sự ổn định của phức hợp 70S, tác
động trực tiếp đến việc tăng cường sản xuất Salinomycin [26]
1.7.3 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 -
Streptomyces microflavus.
Tiến hành nghiên cứu trên chủng Streptomyces 15.29: theo phân loại ISP
nhận thấy Streptomyces 15.29 có các đặc trưng giống với Streptomyces sinensis
(92,86%). Tiến hành giải trình tự gen 16S rARN ứng dụng PCR fingerprinting sử
dụng mồi MST1 cho thấy hệ gen của Streptomyces 15.29 hoàn toàn trùng khớp với
gen của Streptomyces microflavus. Do đó, kết luận tên khoa học của Streptomyces
15.29 là Streptomyces microflavus. Qua cải tạo giống, hiệu suất sinh tổng hợp KS
của Streptomyces 15.29 được nâng cao rõ rệt, chọn được biến chủng Streptomyces
15.29.21.23 (từ đột biến UV) để lên men chìm. Tiến hành lên men chìm trên máy
lắc và trong bình lên men 5 lít và 500 lít, nhận thấy lên men trong máy lắc cho kết
quả tốt hơn. Khảo sát các dung môi và pH thích hợp để chiết kháng sinh từ dịch lên
men, nhận thấy dung môi Ethylacetat ở pH = 5 cho kết quả tốt nhất. Tiến hành tách
KS bằng SKLM và sắc ký cột cho thấy bột kháng sinh thô có ít nhất 4 thành phần.
Tiến hành tinh chế các thành phần chính thu được hiệu suất là 66% [20].



13


CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Giống xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 đã được
phân lập và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà

Nội cung cấp và lưu giữ.
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định
VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội
cung cấp (bảng 2.1):
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định
Loại vi khuẩn
Tên VSV kiểm định
Tên viết tắt
Vi khuẩn Gram dương (+)

Bacillus cereus ATCC 6633
B. cereus
Bacillus subtilis ATCC 10241
B. subtilis
Bacillus pumilus ATCC 10241
B. pumilus
Sarcina lutea ATCC 9341
S. lutea
Staphyllococus aureus ATCC 1128
S. aureus
Vi khuẩn Gram âm (-)
Escherichia coli ATCC 25922
E. coli
Proteus mirabilis BV108
P. mirabilis
Shigella flexneri DT 112
S. flexneri
Salmonella typhi DT 220
S. typhi
Pseudomonas aeruginosa VM 201

P. aeruginosa

2.1.3. Các loại môi trường nuôi cấy
 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần các môi trường sử dụng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 2.2:
14


Bảng 2.2. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml).
Thành phần
MT1
MT2
MT5
MT6
MT7
Tinh bột
2
2
2,4
2

Glucose



1

Saccarose

3
Bột đậu tương



1,5

Bột ngô


2

0,1
Pepton


0,3

0,3
Cao thịt


0,3

0,5
KNO
3
0,1

KCl

0,05



NaNO
3

0,2



CaCO
3


0,4
0,2

FeSO
4
,7H
2
O
0,01

K
2
HPO
4
0,05
0,1



MgSO
4
,7H
2
O
0,05
0,05



NaCl
0,05


0,1

Cao nấm men

0,5
Thạch
1,8
2
2
2
2
Nước
100
100
100
100
100
pH
7,0 - 7,2
6,8- 7,2
7,0 - 7,2
7,0 - 7,2
7,0 - 7,2

Với môi trường lên men dịch thể (MTdt) sử dụng để lên men chìm thì các thành
phần tương tự như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (bảng 2.3):


15

Bảng 2.3. Môi trƣờng nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần
NaCl (g)
Pepton (g)
Cao thịt (g)
Thạch (g)
Nước
(ml)
pH
MT canh thang
0,5
0,5
0,3
0
100
7,0 -7,5
MT thạch thường
0,5
0,5
0,3
1,6-1,8
100


 Các môi trường xác định hình thái xạ khuẩn theo ISP (ký hiệu môi trường
ISP2 - ISP3):
Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl
2

.4H
2
O 0,1g; FeSO
4
.7H
2
O 0,1g;
ZnSO
4
.7H
2
O 0,1g; nước cất vđ 100ml; pH = 7,0 – 7,2.
ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt 10,0g; glucose 4,0g; thạch 20,0g; nước
cất vđ 1000ml; pH=7,3.
ISP3: Yến mạch 20,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 18,0g; nước cất vđ
1000ml; pH=7,2.
Lƣu ý: Các môi trường đều được tiệt trùng ở điều kiện 118-120
0
C/20 phút, 1amt.
2.1.4. Dụng cụ, hóa chất
 Các dung môi sử dụng (bảng 2.4):
Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng và một số đặc tính của nó
Dung môi
Khối lƣợng riêng (g/ml)
Nhiệt độ sôi (
0
C)
Methanol
0,791-0,793
64,5

Ethylacetat
0,889- 0,901
77,1
Ethanol
0,789-0,791
78,3
Chloroform
1,470-1,480
60-62
n- Butanol
0,81
116- 118
Aceton
0,790
56
16


Triethylamin
0,726-0,728
89,5
Amoniac 25%
0,880
37,7
Diethyformamid
0,946-0,950
153
Butylacetat
0,880- 0,885
117- 118

Acetonitril
0,782-0,783
80-82
Dicloromethan
1,33
39,6

 Vật liệu cho chạy sắc ký:
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60F254 Mreck.
- Dung môi chạy sắc ký (bảng 2.4).
- Bình chạy sắc ký.
- Cột chạy sắc ký đường kính 1cm, dài 50cm.
- Hạt Silicagel 60 Mreck (0,040- 0,063mm).
- Ống mao quản có kích thước phù hợp.
 Máy móc, thiết bị, dụng cụ:
- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48.
- Nồi hấp vô trùng Hyrayama model HL 3030.
- Tủ sấy Sanyo Clean Bench, tủ lạnh, tủ lạnh sâu.
- Tủ ấm Memmert, Binder 30
o
C – 37
o
C.
- Cân kỹ thuật, cân phân tích.
- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 LF.
- Máy cất quay BuchiR220, bơm chân không Waterbath B490.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt. Máy quét phổ UV.
- Máy đo phổ IR, MS (Khoa Hóa - Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên)
- Thước kẹp Palmer, bình chiết, bình nón, ồng đong, đèn cồn, pipet, ống nghiệm,
đĩa Petri…

17


2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184.225
- Nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 trên MT ISP2 và ISP3.
- Quan sát và đánh giá hình thái của Streptomyces 184.225 bằng kính hiển vi
điện tử.
2.2.2. Chọn lọc và cải tạo giống
- Xác định MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 184.225.
- Chọn 2 chủng vi khuẩn (1 vi khuẩn G (+) và 1 vi khuẩn G (-)) để làm VSV
kiểm định cho các nghiên cứu về sau.
- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất.
- Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng
hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc.
- Đột biến bằng tác nhân hóa học để tiếp tục nâng cao khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc.
2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh
- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất.
- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được từ những lần
cải tạo giống, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo
kháng sinh mạnh nhất.
- Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch lọc kháng sinh.
- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất.
- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất.
- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ.
2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được
- Xác định nhiệt độ nóng chảy.