Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 173.113

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




LÊ THỊ THU HIỀN
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 173.113

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ









HÀ NỘI – 2013




BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THU HIỀN
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 173.113

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



Giáo viên hướng dẫn: Ths.VÕ THỊ THU THỦY
Nơi thực hiện: Bộ môn VI SINH – SINH HỌC
Đại học Dược Hà Nội









HÀ NỘI – 2013




Lời cảm ơn

Tôi xin gửu lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo Ths. Võ Thị Thu Thủy –
người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành
khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang
giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội đã
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên,giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện
nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh
khỏi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để
khóa luận này có thể được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Lê Thị Thu Hiền

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN ……………………………………………………… 2
1.1 Đại cương về kháng sinh … ………………………………………………2
1.1.1 Lược sử phát triển của kháng sinh ……………….………………… 2
1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh ……………………………………2
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh …………………………………….4
1.1.4 Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất kháng sinh ……………….…… 5
1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh ………………………………….……6
1.2 Đại cương về xạ khuẩn .…………………………………………….…… 6
1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn ……………………………………… 7
1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces………………………………7
1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn …………………….….9
1.3.1 Mục đích …………………………………………………………… 9
1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng SLNN ………….……9
1.3.3 Đột biến cải tạo giống …………………………….………………….9
1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………….…………… 10
1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………………………………… 11
1.4.1 Khái niệm lên men ………………………………………………….11
1.4.2 Các phương pháp lên men ………………………………………….11
1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men …………………….12
1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ………………… 13
1.6 Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh ………………14
1.6.1 Phổ tử ngoại – khả kiến ……………………………………………14
1.6.2 Phổ hồng ngoại……… …………………………………………….14
1.6.3 Khổi phổ (MS)………………………………………………………15

1.7 Một số kết quả nghiên cứu về kháng sinh …………………………… 15
1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên
Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus …………………… 15
1.7.2 Tối ứu hóa chuyển đổi của Streptomyces sp. ATCC 39.366 sản xuất
Leptomycin bởi electroporation …………………………………….16

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… ……… 17
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị …………………………………………….17
2.1.1 Nguyên vật liệu ………………………………………………………17
2.1.2 Máy móc và thiết bị ………………………………………………….19
2.2 Nội dung nghiên cứu ………………………………………… ………….19
2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ……………………………………………… 19
2.2.2 Lên men, tách chiết kháng sinh ……………………………………… 20
2.2.3 Sơ bộ xác định tính chất kháng sinh thu được …………………………20
2.3 Phương pháp thực nghiệm …………………………………………….….20
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ……………………………………….20
2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ……… 20
2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………………………21
2.3.4 Phương pháp đột biến ………………………………………………….22
2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ……………………………………23
2.3.6 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc kí lớp mỏng …………24
2.3.7 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không ……………………… 25
2.3.8 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……………………………….25
2.3.9 Sợ bộ xác định kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……………………… 26

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT…………………….27

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………….… 27




3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ………………………….……… 27
3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ………………………….……… 28
3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 ……………………………………29
3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………… …….……….30
3.6 Kết quả chọn chủng lên men ……………………………………….… 31
3.7 Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi ……………………… …32
3.8 Kết quả sắc kí cột …………………………………………….…………32
3.9 Kết quả đo phổ của kháng sinh tinh khiết …………………………….38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1 Kết luận ………………………………………………………………….… 40
2 Kiến nghị ………………………………………………… …………………40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
S.A Staphylococcus aureus
P. mirabilis Proteus mirabilis
ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
DMHC Dung môi hữu cơ
ĐB1 Đột biến lần 1
ĐB2 Đột biến lần 2
G (-) Gram âm
G (+) Gram dương
HTKS Hoạt tính kháng sinh
IR Hồng ngoại - Infrared
KS Kháng sinh
MC Mẫu chứng
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
SKLM Sắc ký lớp mỏng
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
TB Tế bào
TĐC Trao đổi chất
UV Tử ngoại – Ultraviolet
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học 3
Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 17
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 18
Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng 18
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 27
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 28
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 28
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 29
Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men 30
Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men 31
Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 32
Bảng 3.8: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 33
Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn lần1 (hiện hình bằng P. mirabilis) 34
Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2 35
Bảng 3.11: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 2 (hiện hình bằng P. mirabilis) 36
Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3 37
Bảng 3.13: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 3 (hiện hình bằng P. mirabilis) 38
Bảng 3.14: Biện giải các nhóm chức của phổ IR 39

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood,2007) 2
Hình 1.2: Vị trí tác dụng của một số chất kháng sinh 4
Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh 6
Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 8
Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn …………………… 13
Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis………… 34
Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 2 trên P.mirabilis ………….35
Hình 3.3: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 3 trên P.mirabilis ………….36
Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
Hình P3: Phát hiện viết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV.
Hình P4: Sắc kí lớp mỏng.
Hình P5: Sắc kí cột.
Hình P6: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.
Hình P7: Phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được.
Hình P8 : Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.









ĐẶT VẤN ĐỀ
Tác dụng của kháng sinh được phát hiện năm 1928 và Penicillin được sử dụng
vào năm 1943, từ khi ra đời, kháng sinh đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sử
ngành y – dược. Nhờ có nhóm thuốc này mà con người đã dự phòng và điều trị

được các bệnh nhiệm khuẩn, nhiễm nấm ,ung thư … Không dừng lại ở đó, ngày nay
phạm vi điều trị của kháng sinh còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và
HIV/AIDS cũng cho nhiều kết quả khả quan. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh
tràn lan và không đúng cách làm cho tình trạng kháng kháng sinh xuất hiện và ngày
càng trở nên nghiêm trọng. Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới là điều cần thiết và
được cả thế giới quan tâm.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ
của nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng kháng sinh đạt
được nhiều thành tựu. Do đó, việc nghiên cứu để phát hiện ra kháng sinh mới có
nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn là đề tài thu hút các nhà khoa học
Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có
nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi
lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ
Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp. Bởi vậy, trong khóa luận này tôi
mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây:
- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
- Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất.
- Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.








Chương 1 : TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh

Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander
Fleming lần đầu tiên phát hiện ra vòng vô khuẩn kháng sinh và kháng sinh
Penicillin được dùng điều trị và thử nghiệm đầu tiên vào những năm 1940. Ngay
sau đó, penillin trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh
trong chiến tranh thế giới thứ II.
Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều KS mới được xác định
hầu hết từ các xạ khuẩn, và đó là thời kỳ “ vàng son” của hóa liệu pháp KS( Hình
1.1)

Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007)
Việc phát hiện, phát triển và sử dụng KS trong điều trị ở thế kỷ 20 đã làm
giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ những từ 1980 số kháng sinh
mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm
thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó, một hiện trang đáng báo động là ngày càng
tăng số lượng VSV gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Hiện nay, việc
kháng của VK phải được khắc phục bằng việc phát hiện ra thuốc mới.




Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc
tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện.
Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn có
cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của cloramphenicol và
cephalosporin…

1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh
 Định nghĩa
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn tự
nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách

chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật …) hay
tế bào ung thư ở nồng độ thấp. [11]
 Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại KS: Theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng…Tuy nhiên
phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì người nghiên cứu có
thể nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện
khi biết được cấu trúc hóa học của nó. [11]
 Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm cấu trúc được
trình bày trong bảng 1
Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học [11, 18]
NHÓM KS
KS cụ thể
β-lactam
Penicillin, Cephalexin…
Phenicol
Cholaramphenicol
Aminosid
Steptomycin, Tobramycin…
Macrolid
Erythromycin, Clarithromycin…
Lincosamid
Lincomycin, Lindamycin…
Tetracyclin
Tetracyclin, Doxycyclin
Peptid
Vancomycin, Polymycin…

Quinolon
Floxacin, Levofroxacin…
Cotrimoxazol
Cotrimoxazol…
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ chế tác dụng lên VSV gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc
điểm riêng, tùy thuộc bản chất của kháng sinh đó. (Hình 1.2)

Hình 1.2 : Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào VSV,
làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác
dụng lên các đích khác nhau. [18]
 Có 6 kiểu chủ yếu: [18]
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào.
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất.
- Tác dụng lên sự tổng hợp AND.
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein.
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp.
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.





1.1.4 Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh
Giới thiệu tổng quát sơ đồ tổng hợp lên men sản xuất kháng sinh trong hình
1.3. [11]

Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh


Bình nhân giống quy mô phòng thí nghiệm
Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống
Bình lên men tạo kháng sinh
Dịch lên men
Dịch lọc
Sinh khối
Sinh khối thô
Dịch chiết sinh khối
Sản phẩm tinh chế
Dịch chiết kháng sinh
Dịch chiết đậm đặc
Sản phẩm tinh chế
Sản phẩm đã kiểm nghiệm
Sản phẩm được đóng gói
Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm




1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh
Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực khác nhau [11]:
 Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh dùng để chữa các bệnh do vi khuẩn, vi
nấm gây ra. Ngày nay, một số kháng sinh còn dùng chữa bệnh trong ung thư.
 Ngoài lĩnh vực y học: kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác.
Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh dùng để chữa bệnh cho động
vật: Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn

được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức
ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt[11].
Trong trồng trọt: Kháng sinh đã được sử dụng để tiêu diệt các bệnh của cây
trồng do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.Ví dụ: Vandamycin dùng để diệt nấm
Rhidoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả [11].…
Trong công nghiệp thực phẩm: KS cũng được sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp giúp giảm thời gian khử trùng bằng
nhiệt, nhiệt độ khử trừng giảm xuống là cho chất lượng sản phẩm tốt hơn, các
vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi. Ví dụ: kháng sinh subtilin (do
Bacillus subtilis tạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis). [11].
1.2 Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomcetes) là những VK thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi
trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ
chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được.
Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo
dạng sợi phân nhánh có G + C > 55%. [4, 18]
Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như
KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất
nhiều. [7, 19]




1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ
sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ
khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô
ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. [7, 19]
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3
μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết

sức phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu, trắng … [7]

Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có
cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh được tìm thấy do xạ khuẩn tổng
hợp thì có hơn 55% là do Streptomyces.
Actinomycetes
VSV giống xạ khuẩn
Actinomycetales
Actinoplanaceae
Streptomycetaceae
Actinomycetaceae
…
Streptomyces
Streptoverticulum
Themostreptomyces
…




Bên cạnh những đặc điểm chung của xạ khuẩn, Streptomyces cũng có những
đặc điểm riêng:
 Đặc điểm hình thái:
Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ. Khuẩn
lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng
màng dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.
Hệ sợi khuẩn lạc có cả khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ
chất: Mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát

triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi. Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển
dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ
xuất hiện các chuỗi bào tử. [7] Chuỗi bảo tử (sợi bào tử ) có rất nhiều hình dạng
khác nhau : thẳng, sóng, móc câu, xoắn…chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử
trần, là sơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn,
nhẵn, xù xì da cóc, có gai hoặc có tóc. [7, 12]
 Đặc điểm sinh lý:
Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời
thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-
30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[7, 12]
 Khả năng tạo sắc tố:
Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của
khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [7, 12]
 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Có khá nhiều khóa phân loại Streptomyces: Khóa phân loại của Waksman, khóa
phân loại của Gauze,…Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình
Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gottlieb đề xuất năm 1970 đã được sử




dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Khóa phân loại
này dựa trên các đặc điểm sau:
- Màu của khuẩn lạc.
- Màu của khuẩn ty cơ chất.
- Sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan.
- Hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử.
- Khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon.

1.3
Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1 Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên ( bùn, đất, nước,
mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh
thấp . Do đó, để thu được các chủng có HTKS và hiệu suất sinh tổng hợp cao đưa
vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn lọc giống bằng các phương pháp khác nhau
và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[11,15]
1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10
-10
-10
-5
trong ống
giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau . Trong đó có biến chủng có
HTKS mạnh hơn 20-30 % những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính
cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [11,15]
1.3.3 Đột biến cải tạo giống
Trong thực tế, việc sàng ngẫu nhiện các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, nó không có giả trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có
khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến
nhân tạo.[ 11 ]
 Phương pháp: Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:
• Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO
2
), hydroxylamin,
dimethylsulphat…
• Tác nhân vật lý:
- Ánh sáng UV, tia X, tia
hay electron.

- Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Ánh
sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV
có kích thước nhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới màng nhân.
- Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian
chiếu, cường độ bức xạ.
- Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục
hoạt (photoreactivation): Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài
ánh sáng thường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được
phục hồi.
• Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu.
Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến , phần lớn các VSV ch ết.
Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS tăng
(đột biến dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm ). Cần chọn lọc ra
những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu tiếp.[ 11 ]
1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn
Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái
hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ
thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi
và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ. [14, 16]
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng
VSV:
- Cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền
sang môi trường mới),
- Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng)
- Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm
khô mẫu đông lạnh)

- Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thấp).[14, 16]




Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi
cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong
tủ lạnh 2
0
C và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[14, 16]

1.4
Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1 Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của
vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các
hợp chất trung gian cho chúng
[4,7,11]
Nuôi cấy VSV để tĩnh hoặc lắc sinh học hay trong bình lên men trong môi
trường dịch thể ( lên men chìm ) là các hệ thống đảm bảo sinh trưởng, phát triển của
VSV phát triển theo 4 pha đặc thù là pha lag ( pha tiềm tang ), pha log ( pha lũy
thừa ), pha cân bằng và pha suy tàn. Kháng sinh là sản phẩm bặc 2, tạo ra lúc kết
thúc quá trình sinh trưởng, vào pha cân bằng [11, 7]

Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn
1.4.2 Các phương pháp lên men
 Lên men bề mặt : Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy trên bề
mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng.
 Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi

hỏi thiết bị phức tạp.




 Nhược điểm: Khó cơ giới hóa , tự động hóa , khó vô trùng , tốn diện
tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng môi trường thấp.
 Lên men chìm: Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí) được nuôi cấy trong môi
trường lỏng
 Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ qui trình,
tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
 Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.
 Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung,
lên men bán liên tục, lên men liên tục.
Có 4 kiểu lên men chìm như sau:
- Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên
men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo
ra sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.[11]
- Lên men có bổ sung: Trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi
trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do
đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men. [11]
- Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã
phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch
lên men và bổ sung thêm MT mới vào bình. [11]
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT
dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà
định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định. [11]
1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực
tiếp của các ion H

+
hay OH
-
đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc
là tác dụng gián tiếp.[14,8]
Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử
dụng oxy của VSV. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh




trưởng cũng không giống nhau: Trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan
oxy lớn nên thông khí vừa phải là tốt. [14, 8]
Nhiệt độ: Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 – 30
0
C, nhưng nhiệt
độ tối ưu cho tổng hợp KS chỉ nằm trong khoảng 22 – 28
0
C. [14,8]
Tuổi giống: Việc tổng hợp KS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men và
còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Tuổi giống cấy
truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất sinh KS cao nhất thường là 36 – 72
giờ tuổi. Lượng giống cấy truyền khoảng 2 – 10%.[14,8]
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi
nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn. [14, 8]

1.5
Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

 Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Tùy theo đặc tính của
loài mà KS được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong TB . Để thu lấy các
chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách thích hợp.
 Một số phương pháp chiết tách thường dùng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
- Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên
cột…).
- Phương pháp tạo phức kết tủa.
- Phương pháp chưng cất.
- Phương pháp thăng hoa.
 Chiết xuất: Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn
hợp. Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một
pha lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng- rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng
lỏng- lỏng, thường một pha là nước).
 Phương pháp sắc ký:




- Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một
hỗn hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa
tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không
hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn. Các
chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác
nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di
chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải
trên sắc đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng.
- Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng
lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính
chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.

- Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp KS:
• Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản
mỏng. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được
pha theo tỷ lệ. Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn
hoặc tác động của trọng lực.
• Sắc ký rửa giải trên cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua
pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực. Quá trình rửa giải được thực hiện
bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động.
[11]
1.6
Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh
1.6.1 Phổ tử ngoại - khả kiến
Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng
hay số sóng là phổ tử ngoại.
Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của
phân tử. Các điện tử ở trạng thái cơ bản E
0
chuyển sang trạng thái kích thích E
1
, E
2
.
Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết đơn,
liên kết bội, hệ thống thơm…, hay cặp electron tự do không tham gia liên kết của O,
N, các halogen.

1.6.2 Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó
đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau.
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi
trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan
giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ
để nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc
trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng IR.
1.6.3. Khối phổ (MS)
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng chùm điện
tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ trong chân
không cao (10
-6
mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ
thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số
vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ. Dựa vào khối
phổ có thể định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và
định lượng các chất.
1.7 Một số kết quả nghiên cứu về kháng sinh
1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên Rapamycin
từ Streptomyces hygroscopicus.
Rapamycin được biết là có các chức năng của là một loại kháng sinh và ức chế
miễn dịch, gần đây nó cũng đã được công nhận là có khả năng làm chậm quá trình
lão hóa. Những ảnh hưởng của oxy hòa tan (DO) mức sản xuất rapamycin dạng
viên của Streptomyces hygroscopicus
đã được nghiên cứu trong nghiên cứu này.
Kết quả cho thấy một mức độ DO cao là cần thiết để tăng cường sản xuất
rapamycin. Tuy nhiên, tiền đề để có được một sự tập trung rapamycin cao bằng
cách sử dụng kiểm soát DO đã được giữ nguyên vẹn trong dạng viện của S.

hygroscopicus. Nếu mức DO cao đạt được từ sự gia tăng kích động, nó có thể phá
vỡ các hình thái của dạng viên trong các bể lên men và kết quả là giảm sản xuất
rapamycin. Các rapamycin tối đa đạt được trong nghiên cứu này là khoảng 780 mg /




L trong 5 L dịch lên men hàng loạt với kiểm soát DO hơn 30%, với việc bổ sung
oxy tinh khiết trong khí đầu vào, và tốc độ kích động giới hạn đến dưới 200 rpm.
DO mức độ cao và hình thái học của dạng bột viên cả hai đều gây bất lợi cho
việc đạt được một sản xuất rapamycin cao của S. hygroscopicus trong lên men.[18]
1.7.2 Tối ưu hóa chuyển đổi của Streptomyces sp.ATCC 39.366 sản xuất
Leptomycin bởi electroporation.
Streptomyces sp. ATCC 39.366 sản xuất các chất dẫn xuất leptomycin.
Leptomycin B, một chất ức chế mạnh và cụ thể đối với việc tạo ra các protein hạt
nhân, là sản phẩm chính, tuy nhiên, sự ra đời của DNA vào dòng này là gần như
không thể, đã cản trở tiếp tục sử dụng nó. Chúng tôi phát triển một Streptomyces
sp. ATCC 39.366 giao thức chuyển đổi với DNA bên ngoài thông qua
electroporation. Điều kiện khác nhau đã được kiểm tra, trong đó có phương pháp
điều trị của các màng tế bào làm suy yếu các đại lý, các thông số electroporation, và
nội dung DNA. Chúng tôi thấy rằng chỉ plasmid DNA được phân lập từ một chủng
đập ET12567 dẫn đến chuyển đổi thành công. Sợi nấm phát triển trong một môi
trường men-peptone-dextrose bổ sung 1% glycine ở 28 ° C trên một shaker quay
(220 rpm) được phân tán hơn so với những thí nghiệm không có bổ sung và dễ bị
electroporation. Hiệu quả chuyển đổi tối đa là 8 × 102 CFU / mg DNA plasmid
được thu thập ở một lĩnh vực thế mạnh của 13 kV / cm với một thời gian liên tục
của 13 ms (25 μF tụ điện, điện trở song song, 600 Ω) sử dụng electrocuvettes 1-
mm. Kết quả của những biến đổi của hai loài Streptomyces khác chỉ ra rằng các điều
kiện tối ưu dành cho thành lập trong nghiên cứu này có thể chỉ áp dụng cho
Streptomyces sp. ATCC 39.366. Tuy nhiên, đây là báo cáo đầu tiên chuyển đổi

thành công của Streptomyces sp. ATCC 39.366, và sẽ tạo điều kiện cho việc xây
dựng một loại trực tiếp đột biến gen trong Streptomyces sp. ATCC 39.366 để sản
xuất hàng loạt các dẫn xuất leptomycin mới. [19]