Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh streptomyces 15.29

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN NGUYỆT MINH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 15.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGUYỄN NGUYỆT MINH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN

TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 15.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội




HÀ NỘI – 2014




Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS
Cao Văn Thu - người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu nghiên cứu
khoa học đến khi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang giảng
dạy và công tác tại Bộ môn Vi sinh-Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược và Viện
hóa học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu cùng toàn
thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã
khuyến khích, động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và làm

khóa luận.
Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn và kiến thức của bản thân còn hạn chế
nên khóa luận này còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến
của các thầy cô và các bạn để khóa luận được chỉnh sửa và hoàn thiện hơn nữa.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2014.
Sinh viên
Nguyễn Nguyệt Minh









Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh. 2
1.1.1. Định nghĩa về kháng sinh. 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh. 2
1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh. 3
1.1.4. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh. 3
1.2. Đại cương về xạ khuẩn. 5
1.2.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces. 5
1.2.2. Khả năng hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn. 7
1.2.3. Con đường hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn. 7
1.3. Phương pháp cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn. 8

1.3.1. Mục đích 8
1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống. 8
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn. 9
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. 10
1.4.1. Bản chất của quá trình lên men 10
1.4.2. Giống vi sinh vật 10
1.4.3. Các phương pháp lên men. 10
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh 11
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh. 11
1.5.2. Chiết xuất. 11
1.5.3. Tách sản phẩm. 12
1.6. Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh 12
1.6.1. Phổ tử ngoại (UV). 12
1.6.2. Phổ hồng ngoại (IR) 13
1.6.3. Phổ khối (MS) 13
1.7. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 -
Streptomyces Microflavus. 14


1.8. Xây dựng và tối ưu hóa thống kê về môi trường nuôi cấy để nâng cao sự sản
xuất hợp chất kháng khuẩn bởi Streptomyces sp. JAJ06. 14
1.9. Phân lập và nhận diện phân tử của Streptomyces spp. với hoạt tính kháng
khuẩn từ vùng Tây Bắc của Iran. 15
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 17
2.1.1. Nguyên vật liệu 17
2.1.2. Máy móc, thiết bị. 19
2.2. Nội dung nghiên cứu. 20
2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống 20
2.2.2. Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh. 20

2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được. 20
2.3. Phương pháp thực nghiệm. 20
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21
2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên 21
2.3.4. Đột biến 22
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23
2.3.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ. 24
2.3.7. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24
2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay. 25
2.3.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 25
2.3.10. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết. 25
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh khiết thu được. 25
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 26
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 26
3.2. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1. 26
3.3. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2. 28
3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29
3.4.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất. 29


3.4.2. Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất. 30
3.5. Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ. 31
3.6. Kết quả sắc ký cột. 32
3.6.1. Sắc ký cột lần 1. 32
3.6.2. Sắc ký cột lần 2. 34
3.6.3. Sắc ký cột lần 3. 36
3.6.4. Hiệu suất quá trình tách và tinh chế kháng sinh. 37
3.7. Kết quả sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được. 37
3.7.1. Chất tinh khiết 1. 37

3.7.2. Chất tinh khiết 2. 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC















DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid 2’- deoxyribonucleic
CW Cell wall (Thành tế bào)
DM Dung môi
DMHC Dung môi hữu cơ
ĐB Đột biến
Gr Gram
Gr (+) Gram dương
Gr (-) Gram âm
HTKS Hoạt tính kháng sinh
IR Infrared (Hồng ngoại)

L-DAP L-diaminopimelat acid
MS Mass spectrometry (Phổ khối)
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
P. mirabilis Proteus mirabilis
RAPD Random amplified polymorphic DNA
(ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên)
S. aureus Staphylococcus aureus
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
TK Tinh khiết
UV Ultraviolet (Tử ngoại)
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật






DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Nội dung
Bảng 1.1
Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học
Bảng 1.2 Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp
Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định
Bảng 2.2 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.3 Các môi trường dùng trong nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.4 Các dung môi đã sử dụng
Bảng 3.1
Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 3.2
Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1
Bảng 3.3
Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2
Bảng 3.4 Kết quả chọn môi trường lên men.
Bảng 3.5
Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt
Bảng 3.6
Kết quả chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
Bảng 3.7 Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Bảng 3.8 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Bảng 3.9
Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2
Bảng 3.10
Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 2
Bảng 3.11 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 3





DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Tên hình Nội dung
Hình 1.1 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
Hình 3.1 Đồ thị kết quả thử HTKS các dạng chủng, biến chủng trong lên
men chìm
Phụ lục 1 Hình ảnh 3 bình nón chứa 3 môi trường lên men chìm lần 1
Phụ lục 2 Kết quả thử HTKS bằng phương pháp khối thạch
Phụ lục 3 Hình ảnh sắc ký cột lần 1

Phụ lục 4 Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên
Phụ lục 5 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1
Phụ lục 6 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2.

Phụ lục 7 Phổ UV của chất tinh khiết 1
Phụ lục 8 Phổ UV của chất tinh khiết 2
Phụ lục 9 Phổ IR chất tinh khiết 1


Phụ lục 10 Phổ IR chất tinh khiết 2
Phụ lục 11 Phổ khối chất tinh khiết 1
Phụ lục 12 Phổ khối chất tinh khiết 2
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, là cơ hội cho nhiều loại bệnh
phát triển, đặc biệt là nhóm bệnh do vi khuẩn gây ra. Nhưng khí hậu Việt Nam đồng
thời cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của một hệ sinh thái vô cùng đa
dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài vi sinh vật hữu ích.
Kháng sinh là hoạt chất có tác dụng sinh học rất mạnh, được tổng hợp từ vi
khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm hoặc từ một số thực vật bậc cao. Sự phát minh ra kháng
sinh là một thành tựu rực rỡ, mở ra một kỷ nguyên mới của nền y học trong điều trị
các bệnh nhiễm khuẩn. Những viên thuốc nhỏ bé đã góp phần chống lại bệnh tật do
vi khuẩn gây ra và bảo vệ sức khỏe cho con người.
Nghiên cứu để sản xuất ra kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật luôn là đề tài
hấp dẫn các nhà khoa học. Trong số hơn 15000 kháng sinh đã được biết đến hiện
nay trên thế giới thì khoảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra, trong đó chủ yếu là do chi
Streptomyces sản xuất. Đây là một chi xạ khuẩn lớn, có nhiều tiềm năng sinh tổng
hợp kháng sinh và đang được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới tập trung
nghiên cứu.

Tại Bộ môn Vi sinh-Sinh học trường đại học Dược Hà Nội, tôi chọn đề tài nghiên
cứu: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces
15.29” với các mục tiêu sau:
+ Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh.
+ Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp của chủng Streptomyces
15.29, nghiên cứu chiết xuất, tinh chế kháng sinh do Streptomyces 15.29 tạo ra.
+ Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được.

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh.
1.1.1. Định nghĩa về kháng sinh.
Thuật ngữ kháng sinh

theo quan niệm truyền thống được định nghĩa là những
chất do các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn ) tạo ra có khả năng ức chế sự
phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn khác.
Ngày nay, kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vi sinh vật mà còn được
tạo ra bằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa kháng
sinh cũng thay đổi.
Hiện nay, kháng sinh được định nghĩa như sau: Kháng sinh là những chất có
nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học. Với liều thấp có
tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh [3].
1.1.2. Phân loại kháng sinh.
Có nhiều cách để phân loại: dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng
sinh, dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh, dựa vào cấu trúc hóa học
Dựa vào cấu trúc hóa học chia kháng sinh thành các nhóm chính như bảng
1.1 [3].
Bảng 1.1: Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học

Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể
Beta lactam + Penicilin: Benzylpenicilin, Oxacilin
+ Cephalosporin: Cephalexin, Cefotaxim
+ Các betalactam khác: Carbapenem, Monobactam, Chất
ức chế betalactamase.
Aminoglycosid Streptomycin, Gentamicin
Macrolid Erythromycin, Clarithromycin
3

Lincosamid Lincomycin, Clindamycin
Phenicol Cloramphenicol, Thiamphenicol
Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin
Peptid + Glucopeptid: Vancomycin
+ Polypeptid: Polymycin
Quinolon Acid nalidixic, Ciprofloxacin
Co-trimoxazol Co-trimoxazol

1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh.
+ Trong y học: Kháng sinh lần đầu được sử dụng trong y học là penicillin vào năm
1943. Sau đó 1 loạt các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra để điều
trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo, góp phần nâng tuổi thọ con người lên.
+ Trong thú y: để điều trị các bệnh nhiễm trùng của động vật.
Ví dụ: Griseoviridin chữa bệnh viêm phổi cấp, viêm vú của trâu, bò.
Metimycin dùng điều trị các bệnh do Brucella gây ra.
+ Trong nông nghiệp: để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng.
Kháng sinh còn được dùng kích thích hạt nảy mầm.
Ví dụ: Griseofulvin dùng chống lại bệnh do Botrytis gây ra (bệnh rỉ sét ở lúa mì).
+ Trong chăn nuôi: kháng sinh được dùng bổ sung vào thức ăn nhằm kích thích tăng
trọng: Terravit, Biovit, Monenzin
+ Trong công nghiệp thực phẩm: để bảo quản thực phẩm đóng hộp [5].

1.1.4. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh.
Hình 1.1 giới thiệu sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [5].

4

Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh












Lọc, ly tâm






Cô, tinh chế


Kiểm nghiệm

Đóng gói
Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm
nghiệmnghiệm nghiệm
Nhân giống quy mô thí nghiệm
Nhân giống trong thiết bị nhân giống
Lên men tổng hợp kháng sinh
Dịch lên men
Sinh khối
Dịch chiết sinh khối
Dịch lọc
Dịch chiết
Sản phẩm tinh chế
Sản phẩm đã được kiểm nghiệm
Sản phẩm đóng gói
5

1.2. Đại cương về xạ khuẩn.
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các Gr
(+), có tỷ lệ G + C >55%.
Đại đa số xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi
phân nhánh. Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có
khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn.
Xạ khuẩn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzym (amylase, cellulase,
protease, glucoizomerase ) cũng như các hợp chất khác.
1.2.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces.
a) Đặc điểm của chi Streptomyces [6], [8].
+ Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2 µm.
+ Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi
bào tử. Ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử. Bào tử không có
khả năng di động.

+ Chuỗi bào tử có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như: thẳng,
uốn cong, móc câu-đơn hoặc kép và xoắn lò xo.
+ Bào tử trần của họ xạ khuẩn này có các hình dạng: hình cầu, hình elipsoid-bầu
dục, hình trụ
+ Bề mặt bào tử có thể là nhẵn, sần sùi da cóc, có gai hoặc có tóc.
+ Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của họ xạ khuẩn này.
+ Một số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất.
+ Hiếu khí, không nhuộm acid - cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính.
+ Thường có khả năng khử nitrat thành nitrit, phân hủy adenin, esculin, casein,
gelatin, hypoxanthin, tinh bột và L-tyrosin.
6

+ Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon.
+ Nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25-35
0
C, pH tối thích là 6,5-8,0 [6],[8].
b) Cấu tạo tế bào của chi Streptomyces [6].
Cấu tạo tế bào của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào
chất, tế bào chất.
+ Thành tế bào có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 cm.
Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào được chia vào nhóm CWI: có chứa L-
DAP (L- diaminopimelic acid) và glycin.
+ Màng tế bào chất của xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10 nm. Chúng có cấu trúc và chức
năng giống của vi khuẩn nói chung.
+ Mesosome: nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay hình
ống.
c) Phân loại chi Streptomyces [6].
+ Có khá nhiều khóa phân loại đã được các nhà khoa học nghiên cứu phát triển.
Khóa phân loại Streptomyces thuộc Chương trình Streptomyces quốc tế
(International Streptomyces Project) do Shirling và Gotlieb đề xuất (1970) đã được

sử dụng rộng rãi để để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ
Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại này, các đặc trưng phân loại được sử
dụng bao gồm:
Màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan,
hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, tiêu thụ đường arabinose, tiêu thụ đường
xylose, tiêu thụ đường inositol, tiêu thụ đường mannitol, tiêu thụ đường fructose,
tiêu thụ đường rhamnose, tiêu thụ đường saccarose, tiêu thụ đường raffinose.
7

+ Ngày nay việc áp dụng kỹ thuật xác định trình tự gen 16S rADN để phân loại xạ
khuẩn đã và đang được áp dụng, nhất là ở các phòng thí nghiệm tiên tiến.
1.2.2. Khả năng hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.
Các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có
cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng
hợp được thì có tới 60% là từ Streptomyces.
Bảng 1.2 giới thiệu một số kháng sinh do Streptomyces tổng hợp [6], [10].
Bảng 1.2: Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp
Kháng sinh Chủng sinh tổng hợp Phổ tác dụng
Actinomycin D S. antibioticus Ung thư
Adriamycin S. peuceticus Ung thư
Kanamycin S. kanamyceticus Gr(-)
Acid clavulanic S. clavuligerus Gr(+)
Amphotericin B S. nodosus Nấm
Cloramphenicol S. venezuelae Gr(+)
Nystatin S. noursei Nấm

1.2.3. Con đường hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành chất kháng sinh.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh. Một

số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn
tại trong môi trường tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành chất kháng sinh là do
sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh
là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân
bằng của chu kỳ sinh trưởng.
8

Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng
cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất
định.
+ Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một
chuỗi phản ứng enzym.
+ Chất kháng sinh được hình thành từ hai hay ba chất chuyển hóa khác nhau.
+ Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polymer hóa các chất chuyển
hóa sơ cấp. Sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất
kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng
hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu
trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp
các tiền chất, enzyme và cofactor [9].
1.3. Phương pháp cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn.
1.3.1. Mục đích
Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng VSV có khả
năng tạo chất kháng sinh mong muốn với hàm lượng đủ để thỏa mãn yêu cầu của
sản xuất công nghiệp. VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên
nhiên thường có hoạt tính rất thấp. Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao
đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau
và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp [5].
1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống.
a) Sàng lọc ngẫu nhiên

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong các ống
giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20-30 % các cá thể
khác.
9

Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu
tiếp.
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất [5].
b) Đột biến nhân tạo
Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến:
+ Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ, dimethylsulphat, hydroxylamin.
+ Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β. Tác nhân vật lý hay được
dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng
cách đột biến, thời gian và cường độ bức xạ.
+ Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết
chết hầu hết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm
thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất, làm giảm khả năng tạo kháng sinh
(đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh mẽ (đột
biến dương) [12].
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn.
Các giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất. Vì vậy việc bảo quản
giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng, không chỉ ở trung tâm giữ giống quốc gia mà
ngay ở các phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết.
Nhiệm vụ của công tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩ thuật
cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn định
và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác.
Thông thường có 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:
+ Bảo quản trong lọ hoặc ống MT trong tủ lạnh 2

0
C, định kỳ cấy chuyền sang ống
(hoặc lọ) MT mới.
+ Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng).
10

+ Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô
mẫu đông lạnh).
+ Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo
quản ở nhiệt độ thấp từ -78
0
C đến -20
0
C) [13].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh.
1.4.1. Bản chất của quá trình lên men
Lên men thực chất là phản ứng oxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác của các
enzym do VSV tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo ra các sản phẩm
trao đổi chất trong dịch lên men [5], [13].
1.4.2. Giống vi sinh vật
Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật là công cụ tác động và điều khiển lên
quá trình sinh học còn giống là khâu quan trọng đầu tiên, quyết định giá trị kinh tế
của quá trình sản xuất. Giống vi sinh vật dùng trong quá trình lên men phải là các tế
bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất
cao nhất. Do đó trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống cấp I, II, III [5], [13].
1.4.3. Các phương pháp lên men.
 Phương pháp lên men bề mặt.
a) Đặc điểm: quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường rắn, đặc hay lỏng.
VSV hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô
hấp trên bề mặt môi trường.

b) Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến
c) Nhược điểm: tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng không gian thấp, khó cơ giới hóa
tự động hóa.
d) Ứng dụng: chỉ sử dụng trong chọn giống và giữ giống trong phòng thí nghiệm
[7]
11

 Phương pháp lên men chìm.
a) Đặc điểm: VSV phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng. Phương
pháp này dùng cho cả VSV hiếu khí và kị khí. Đối với VSV kị khí trong quá trình
lên men không cần sục khí, còn VSV hiếu khí thì phải vừa khuấy trộn vừa sục khí
liên tục.
b) Ưu điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm
mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa.
c) Nhược điểm: phải có thiết bị chuyên dụng, chi phí đầu tư lớn, đòi hỏi phải làm
trong điều kiện vô trùng tuyệt đối.
d) Phân loại: Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính
+ Lên men mẻ
+ Lên men có bổ sung
+ Lên men liên tục
+ Lên men bán liên tục [7].
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh.
Đây là giai đoạn rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên
men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp.
Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất và tinh chế sản phẩm đạt được
các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị. Công đoạn tinh chế sẽ góp
phần quyết định tới giá thành của sản phẩm [5].
1.5.2. Chiết xuất.
+ Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan để tách

lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu [2], [4].
12

+ Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau
[2], [4].
+ Nếu chiết bằng dung môi hữu cơ thì dung môi cần thỏa mãn các điều kiện sau [5]
 Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc, khó cháy.
 Có tính chọn lọc cao: hòa tan tốt hoạt chất, ít hòa tan tạp chất.
 Dễ cất thu hồi.
1.5.3. Tách sản phẩm.
+ Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp
phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp đơn giản tách riêng từng chất
[2], [4].
+ Trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh, phương pháp sắc ký được sử dụng để
tách sản phẩm. Các phương pháp sắc ký thường được dùng:
 Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản mỏng (bản
kính, bản nhôm ). Pha động là một hệ dung môi đa thành phần được pha theo
tỷ lệ. Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của
trọng lực [11].
 Sắc ký cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất
hoặc trọng lực. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục lượng
mới của pha động [1].
1.6. Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh
1.6.1. Phổ tử ngoại (UV).
+ Nguyên tắc: Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng
điện tử của phân tử. Các điện tử ở trạng thái cơ bản E
0
chuyển sang trạng thái kích
thích E
1

, E
2
. Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước
sóng hay số sóng là phổ tử ngoại [4].
13

+ Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết đơn,
liên kết bội, hệ thống thơm… hay cặp electron tự do không tham gia liên kết của O,
N, S [2].
1.6.2. Phổ hồng ngoại (IR)
+ Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi
qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau.
+ Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và
thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương
quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp
thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ
đặc trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR.
+ Vùng bức xạ hồng ngoại sử dụng trong các máy quang phổ IR thông thường là
600-4000 cm
-1
[2].
1.6.3. Phổ khối (MS)
+ Phổ khối là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được
tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị
bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối
lượng của carbon
12
C) hoặc bằng Dalton (1 dalton Da bằng khối lượng của nguyên
tử hydro).
+ Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ

phân tích khối trước khi đến detector. Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị
chân không, áp suất trong hệ dao động từ 10
-3
Pa đến 10
-6
Pa. Tín hiệu tương ứng
với các ion sẽ được thể hiện bằng 1 số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại
thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng
phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất [2].
14

1.7. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 -
Streptomyces Microflavus.
Trong số các kháng sinh chúng tôi phân lập được từ cơ chất Việt Nam có
Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn có độ ổn định di truyền học tốt, có khả năng
sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng và có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực phòng
bệnh và chữa bệnh.
Kết quả phân loại theo ISP và giải trình tự gien 16rADN chúng tôi đã cơ bản
xác định được Streptomyces 15.29 có tên khoa học là Streptomyces microflavus. Cải
tạo giống qua sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến ánh sáng UV kết hợp với sàng lọc sau
đột biến đã làm tăng trưởng được hiệu suất tổng hợp kháng sinh của chủng. Biến
chủng Streptomyces 15.29.21.23 là biến chủng tốt nhất hiện nay mà chúng tôi tạo
được. Lên men chìm trên máy lắc và trong bình lên men 5 lít và 500 lít được thực
hiện và kết quả là lên men trên máy lắc cho kết quả tốt nhất, còn lên men trên bình
lên men 5 lít và 500 lít cho kết quả tương đương, tuy nhiên kém hơn lên men trên
máy lắc nhiều. Từ dịch lọc lên men kháng sinh chiết được tốt nhất bằng ethylacetat
ở pH 5,0. Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột cho thấy hỗn hợp kháng sinh có ít nhất 4
thành phần. Trong đó thành phần chính được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, cột
oxyt nhôm, YMC và cột Sephadex có hiệu suất 66%. Bước đầu xác định giá trị MIC
của kháng sinh này khá thấp: từ 0,11- 0,30 µg/ml đối với S. aureus, P. mirabilis,

S.flexneri, S.typhi [14].
1.8. Xây dựng và tối ưu hóa thống kê về môi trường nuôi cấy để nâng cao sự
sản xuất hợp chất kháng khuẩn bởi Streptomyces sp. JAJ06.
Streptomyces sp. JAJ06 là chủng sản xuất kháng sinh phụ thuộc nước biển,
trước đây được phân lập và mô tả từ ruộng muối ven biển Ấn Độ. Bài báo này báo
cáo sự thay thế nước biển bằng một công thức muối được xác định trong môi trường
sản xuất, sau đó tối ưu hóa phương tiện thống kê để đảm bảo phù hợp cũng như cải
thiện sự sản xuất kháng sinh bởi Streptomyces sp. JAJ06. Chủng xạ khuẩn này được
15

quan sát kĩ để sản xuất hợp chất kháng sinh với công thức hóa học hợp nhất của
muối natri clorua thay vì nước biển trong môi trường sản xuất .
Thí nghiệm thiết kế Plackett-Burman đã được áp dụng, và ba thành phần, tinh
bột, KBr và CaCO3, được công nhận là có ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất kháng
sinh của Streptomyces JAJ06 ở mức độ riêng rẽ. Sau đó, phương pháp bề mặt đáp
ứng với thiết kế Box-Behnken được sử dụng để tối ưu hóa các thành phần ảnh
hưởng này nhằm cải thiện việc sản xuất kháng sinh của Streptomyces sp. JAJ06.
Tổng cộng có 17 thí nghiệm đã được tiến hành với việc xây dựng một mô hình bậc
hai và một phương trình đa thức bậc hai. Mức độ tối ưu của các thành phần trung
bình thu được từ việc phân tích các mô hình và phương pháp tối ưu hóa số học. Khi
chủng JAJ06 được nuôi trong môi trường tối ưu hóa, hoạt tính kháng sinh đã tăng
lên đến 173.3 U/ml, tăng 26,8% so với ban đầu (136,7 U/ml). Nghiên cứu này tìm
ra một cách hữu hiệu để nuôi cấy Streptomyces sp. JAJ06 nhằm tăng cường sản xuất
các hợp chất kháng sinh [18].
1.9. Phân lập và nhận diện phân tử của Streptomyces spp. với hoạt tính kháng
khuẩn từ vùng Tây Bắc của Iran.
Từ 140 chủng phân lập được thu thập từ khắp miền tây bắc của Iran, 12 chủng
phân lập Streptomyces biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn cao với tác nhân vi khuẩn
được phân loại qua PCR để xác định trình tự gen 16 rDNA và phân tích mẫu ADN
đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD).

Phân tích đặc điểm hình thái, hóa sinh và trình tự gen 16S rDNA chỉ ra rằng
tất cả 12 chủng phân lập thuộc về các chi Streptomyces. Ngoài ra, sàng lọc các
chủng liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng chống lại các vi khuẩn chỉ thị
cũng như phân loại của chúng sử dụng phân tích RAPD tiết lộ rằng G614C1 và
K36C5 có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể và cao tương ứng với Streptomyces
coelicolor và Streptomyces albogriseolus.