Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 119.112

B Y T
TRƯNG ĐI HC DƯC H NI



LÊ THỊ NGC HIỆP

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN
MENTNG HP KHNG SINH
TỪSTREPTOMYCES 119.112

KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S



H NI-2013

B Y T
TRƯNG ĐI HC DƯC H NI



LÊ THỊ NGC HIỆP


GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TNG HP KHNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 119.112

KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S

Ngưi hưng dn:
Ths. Võ Thị Thu Thủy
Nơi thc hin:
B môn Vi sinh& Sinh hc
Trưng Đại hc Dưc H Ni


H NI-2013



LI CẢM ƠN
Tôi xin gi li cm ơn sâu sc nhất đn cô gio Ths. Võ Thị Thu Thủy ngưi đ
tn tnh hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi hon thin kha lun ny.
Tôi xin chân thnh cm ơn cc thy cô giáo, cc cn b, k thut viên ging dy,
công tc ti B môn Vi sinh - Sinh hc , B môn Công nghip dưc trưng Đi hc
Dưc H Ni , B môn Ha vt liu - khoa Ha trưng Đi hc Khoa hc tự nhiên H
Ni đ gip đ tôi trong thi gian lm thực nghim.
Nhân dịp ny tôi cng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng ton th cc
thy cô gio trưng Đi hc Dưc H Ni đ dy d v to mi điu kin thun li cho
tôi trong thi gian tôi hc tp ti trưng.
V cui cng l li cm ơn tôi gi ti gia đnh v bn b đ đng viên , gip đ
tôi trong sut thi gian thực hin kha lun.
Do thi gian lm thực nghim cng như kin thc của bn thân c hn , khóa
lun ny cn c nhiu thiu st . Tôi rất mong nhn đưc sự gp  của cc thy cô , bn
b đ kha lun đưc hon thin hơn.
Tôi xin chân thnh cm ơn!
H Ni, ngày 10, tháng 5, năm 2013.
Sinh viên

LÊ THỊ NGỌC HIỆP

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TNG QUAN 2
1.1. Đi cương v khng sinh 2
1.1.1. Định nghĩa khng sinh 2
1.1.2. Phân loi khng sinh 2
1.1.3. Cơ ch tc dụng của khng sinh 3
1.2.Đi cương v x khuẩn 3
1.2.1. Đặc đim hnh thi của x khuẩn 4
1.2.2. Đặc đim của x khuẩn chi Streptomyces 5
1.3. Sơ đồ tổng qut sinh tổng hp khng sinh……………………………………….…6
1.4.Tuyn chn, ci to v bo qun ging x khuẩn 6
1.4.1. Mục đích 7
1.4.2. Chn chủng c HTKS cao bằng sng lc ngu nhiên 7
1.4.3. Đt bin ci to ging…. 7
1.4.4. Bo qun ging x khuẩn …………………………………………………… 8
1.5. Lên men sinh tổng hp khng sinh 8
1.5.1. Cc phương php lên men 9
1.5.2. Mt s yu t nh hưởng đn qu trnh lên men 10
1.6. Chit tch v tinh ch khng sinh t dịch lên men 10
1.6.1. Vai tr của chit tch v tinh ch khng sinh 10
1.6.2. Cc phương php chit tch 11
1.7.Bưc đu nghiên cu cấu trc khng sinh 12
1.7.1. Phổ t ngoi - kh kin 12
1.7.2. Phổ hồng ngoi 12
1.7.3. Khi phổ 13

1.8. Mt s nghiên cu liên quan…………………………………………………… 13
1.8.1. So sánh glucose và glycerol làm nguồn carbon cho sn xuất ε-poly- L-Lysin
tStreptomyces sp. M-Z18………………………………………………………… 13
1.8.2. Tinh ch i lực Phosphoprotein xc định các protein tham gia vào S-
adenosyl-L-methionine lm tăng cưng sn xuất khng sinh trong
Streptomycescoelicolor………………………………………………………………
14
1.8.3. Xc định định hot tính sinh hc của mt nhm gồm 51 macrolide bằng cch
kích hot enzyme tổng hp polyketide trong Streptomyces ambofaciens……… 14

CHƯƠNG 2: ĐI TƯNG V PHƯƠNG PHP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vt liu v thit bị 16
2.1.1. Nguyên vt liu 16
2.1.2. My mc thit bị 18
2.2. Ni dung nghiên cu 18
2.2.1. Chn lc, ci to ging 18
2.2.2. Lên men, chit tch khng sinh ti ưu 18
2.2.3. Sơ b xc định mt s tính chất của khng sinh thu đưc 19
2.3. Phương php thực nghim 19
2.3.1. Nuôi cấy v gi ging x khuẩn 19
2.3.2. Đnh gi hot tính khng sinh bằng phương php khuch tn 19
2.3.3. Chn lc ngu nhiên 20
2.3.4. Đt bin ……………………… 21
2.3.5. Lên men chm tổng hp khng sinh 22
2.3.6. Chit khng sinh t dịch lên men bằng dung môi hu cơ 23
2.3.7. Tch cc thnh phn trong khng sinh bằng sc k lp mỏng 23
2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phương php cất quay 24
2.3.9. Tinh ch khng sinh thô bằng sc k ct 24
2.3.10. Phương php xc định khng sinh tinh khit thu đưc 25

CHƯƠNG 3: KT QUẢ THỰC NGHIỆM V NHN XÉT 26
3.1. Kt qu sng lc ngu nhiên 26
3.2. Kt qu đt bin ci to ging ln 1 27
3.3. Kt qu đt bin ci to ging ln 2 27
3.4. Kt qu đt bin ha hc bằng HNO
2
28
3.5. Kt qu chn môi trưng lên men chm 29
3.6. Kt qu chn chủng lên men 30
3.7. Kt qu chn dung môi v pH chit 30
3.8. Kt qu sc k lp mỏng chn h dung môi 31
3.9. Kt qu sc kí ct………………… 32
3.9.1. Kt qu sc k ct ln 1 32
3.9.2. Kt qu sc k ct ln 2 34
3.9.3. Kt qu sc k ct ln 3 36
3.10. Kt qu đo nhit đ nng chy, đo phổ của khng sinh tinh khit 39

KT LUN V KIN NGHỊ 41




DANH MỤC CC KÝ HIỆU, CC CHỮ VIT TẮT

ISP International Streptomyces Project
(Chương trnh Streptomyces quc t)
ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
ATCC 6633 Trung tâm gi ging Hoa Kỳ
BV 108 Bnh vin 108

B.subtilis Bacillussubtilis ATCC 6633
ĐB1 Đt bin ln 1
ĐB2 Đt bin ln 2
ĐBHH Đt bin ha hc
G(+) Gram dương
G(-) Gram âm
HTKS Hot tính khng sinh
MC Mu chng
MT Môi trưng
MT1dt Môi trưng dịch th 1
MT2dt Môi trưng dịch th 2
MT6dt Môi trưng dịch th 6
P. mirabilis Proteus mirabilis BV 108
SLNN Sng lc ngu nhiên
VSV Vi sinh vt


DANH MỤC CC BẢNG

Bng 1: Cc vi khuẩn kim định
Bng 2: Cc MT nuôi cấy x khuẩn
Bng 3: Cc MT nuôi cấy VSV kim định
Bng 4: Cc dung môi đ s dụng
Bng 5: Kt qu th HTKS sng hc ngu nhiên
Bng 6: Kt qu th HTKS đt bin ln 1
Bng 7: Kt qu th HTKS đt bin ln 2
Bng 8: Kt qu th HTKS đt bin ha hc
Bng 9: Kt qu chn môi trưng lên men chm
Bng 10: Kt qu chn chủng lên men
Bng 11: Kt qu chn dung môi v pH chit

Bng 12: Kt qu SKLM chn h dung môi
Bng 13: Kt qu th HTKS cc phân đon sau chy sc k ln 1
Bng 14: Kt qu SKLM sau chy ct ln 1
Bng 15: Kt qu th HTKS cc phân đon sau chy sc k ln 2
Bng 16: Kt qu SKLM cc phân đon sau chy ct ln 2
Bng 17: Kt qu th HTKS nhm 2 sau chy ct
Bng 18: Kt qu SKLM nhm 2 sau chy ct
Bng 19: Kt qu th HTKS nhm 3 sau chy ct
Bng 20: Kt qu SKLM nhm 3 sau chy ct
Bng 21: Kt qu IR






DANH MỤC CC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hnh 1: Sơ đồ cơ ch tc dụng của cc h khng sinh chính
Hnh 2: Sơ b phân loi x khuẩn
Hnh 3: Cc khuẩn ty ở x khuẩn
Hnh 4: Sơ đồ tổng qut lên men sn xuất khng sinh
Hnh 5: Đưng cong sinh trưởng pht trin x khuẩn
Hnh 6: Pic sc k ct ln 1
Hnh 7: Pic sc k ct ln 2
Hnh 8: Pic sc k ct ln 3 nhm 2
Hnh 9: Pic sc k ct ln 3 nhm 3
Hnh PL1: X khuẩn giai đon pht trin 5-6 ngày
Hnh PL2: Kt qu đt bin bằng nh sng UV
Hnh PL3: Th HTKS bằng phương php khi thch(P. mirabilis)

Hnh PL4: Th HTKS bằng phương php ging thch (B. subtilis)
Hnh PL5: Th HTKS bằng phương php khoanh giấy lc(B. subtilis)
Hình PL6: Kt qu chn MT lên men chìm
Hnh PL7: Kt qu chn chủng lên men
Hnh PL8: Kt qu SKLM sau chy ct ln 1
Hnh PL9: Kt qu chy sc k ct
Hnh PL10: Kt qu đo phổ UV của khng sinh
Hnh PL11: Kt qu đo phổ IR của khng sinh
Hnh PL12: Kt qu đo phổ khi của khng sinh

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vic khm ph v pht trin cc khng sinh đ to ra cc th lực v khí hu hiu
gip con ngưi chng li vi khuẩn. Phm vi điu trị của khng sinh hin nay không chỉ
dng li ở cc bnh nhiễm khuẩn, m khng sinh cn đưc dng ngy mt nhiu đ
điu trị ung thư.
Tuy nhiên, vic nghiên cu pht trin khng sinh mi đang c xu hưng gim
theo thi gian. Trong khi đ, mô hnh cc bnh nhiễm khuẩn ngy cng đa dng, vic
s dụng khng sinh ngy mt trn lan, tnh hnh khng khng sinh ngy cng gia tăng
v đang l mi lo ngi ton cu.
Hin trng đ đang l ting chuông cnh bo, con ngưi sẽ thua trong cuc
chin chng vi khuẩn. V vy, đẩy mnh nghiên cu, sn xuất cc khng sinh c hiu
qu điu trị cao, đc tính thấp v ít bị khng thuc l mt yêu cu tất yu v cấp thit
trong công cuc bo v v chăm sc sc khỏe ngưi dân.
Trong tất c cc khng sinh đưc bit đn hin nay th c khong 55% c nguồn
gc t x khuẩn v 60% trong s đ thuc chi Streptomyces. Đ l cơ sở đ cc nh
khoa hc nưc ta hin nay tp trung nghiên cu vo chi x khuẩn ny.
Chính v vy, em chn đ ti: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hp kháng
sinh từ Streptomyces 119.112” lm kha lun tt nghip. Chủng Streptomyces 119.112

do B môn Vi sinh – Sinh hc trưng đi hc Dưc H Ni phân lp v cung cấp. Kha
lun mong mun đt đưc cc mục tiêu sau đây:
- Nâng cao hiu suất sinh tổng hp khng sinh t chủng Streptomyces
119.112bằng sng lc ngu nhiên v đt bin ci to ging.
- Lựa chn môi trưng v bin chủng thích hp cho qu trnh lên men.
- Chit tch v tinh ch khng sinh thu đưc.
- Tng bưc xc định đnh gi tính chất vt l v cấu trc ha hc của khng
sinh do chủng Streptomyces 119.112.


2

CHƯƠNG I: TNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Khng sinh l nhng sn phẩm đặc bit nhn đưc t vi sinh vt hay cc nguồn
tự nhiên khc c hot tính sinh hc cao, c tc dụng km hm hoặc tiêu dit mt cch
chn lc lên mt nhm vi sinh vt xc định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh đng vt, …)
hay t bo ung thư ở nồng đ thấp. [9], [15]
Cn phân bit mt s chất cng do vi sinh vt to ra nhưng không đưc gi l
khng sinh (rưu ethylic, cc acid hu cơ, …) v chng tc dụng lên vi sinh vt khc
không mang tính chn lc v ở nồng đ cao.[9], [15]
1.1.2. Phân loại kháng sinh
C nhiu cch phân loi khng sinh: theo nguồn gc, theo tính nhy cm của vi
khuẩn vi khng sinh, theo cơ ch tc dụng, theo cấu trc ha hc… Phân loi khng
sinh theo cấu trc ha hc l khoa hc nhất v n gip cho ngưi nghiên cu nhanh
chng định hưng đưc cc đặc đim của chất khng sinh mi pht hin khi bit đưc
cấu trc ha hc của n, trnh lng phí thi gian đ nghiên cu v cc đặc đim khc.
[9], [16]
Phân loi khng sinh theo cấu trc ha hc thưng chia ra cc nhm chất sau

đây:
 Cc khng sinh c cấu trc β-lactam (penicillin, cephalosporin)
 Cc khng sinh cha nhân thơm (chloramphenicol)
 Cc khng sinh c cấu trc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)
 Cc khng sinh c cấu trc 4 vng (tetracyclin)
 Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)
 Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)
 Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)
 Cc khng sinh nhm antracyclin chng ung thư (daunorubicin)

3

 Cc khng sinh nhm actinomycin chng ung thư (dactinomycin D).

1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ ch tc dụng lên vi sinh vt gây bnh của mi chất khng sinh thưng mang
đặc đim riêng, ty thuc vo bn chất của khng sinh đ.[16]
Hnh 1 gii thiu sơ đồ cơ ch tc dụng của cc h khng sinh chính.

Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính

 Ức ch qu trnh tổng hp vch TB vi khuẩn:
-lactam, nhóm Glycopeptid.

 Tc đng lên tổng hp protein của vi khuẩn: tetracycline, aminoglycosid (lên
tiu đơn vị 30S), cloramphenicol, macrolid, lincosamid (50S).
 Ức ch qu trnh tổng hp acid nhân: nhm quinolon, rifampicin.
 Thay đổi tính thấm của mng: polymicin (colistin).
 Khng chuyn ha: acid folic, sulfamid, trimethoprim.
1.2. Đại cương về xạ khuẩn

X khuẩn (Actinomycetes) thuc nhm vi khuẩn tht (Eubacteria) phân b rng ri
trong tự nhiên, l cc vi khuẩn Gram dương, pht trin dng si phân nhnh c tỷ l
G+C>55%. Trong mi gam đất ni chung thưng c cha hng triu x khuẩn. Đi đa
s cc x khuẩn l cc vi sinh vt hiu khí, hoi sinh, c cấu to si dng phân nhnh.

4

Do c th sinh tổng hp đưc nhiu sn phẩm trao đổi chất quan trng nên cc x
khuẩn đưc cc nh khoa hc quan tâm nghiên cu rất nhiu.[5], [6], [10], [15]
Trong s hơn 16,000 khng sinh hin đ đưc bit trên th gii th khng 55% là do
x khuẩn to ra. X khuẩn cn đưc s dụng đ sn xuất nhiu loi enzyme (amylase,
celllulase, protease…), cng như cc hp chất khc.
Mt s đặc đim của x khuẩn:
 Đưng kính khuẩn ty xấp xỉ khong 0,2-0,1
m đn 2-3 .
 Mu sc khuẩn ty rất phong ph: trng, vng, đỏ, lục, tím…
 Thnh t bo x khuẩn dy khong 7,5-10nm, không có cellulose, kitin.
 Đa s khuẩn ty không c vch ngăn.
 Phân chia t bo theo kiu phân bo vô tính.
 Bt mu nhm vi khuẩn Gr(+) khi nhum Gram.
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
X khuẩn thuc nhm cc vi khuẩn tht nhưng pht trin thnh dng si, h si của
x khuẩn chia thnh khuẩn ty cơ chất v khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lc x khuẩn kh đặc
bit: không trơn ưt như vi khuẩn, nấm men m thưng c dng thô rp, dng phấn,
không trong sut, c cc np gấp tỏa ra theo hnh phng x. [5], [6], [10], [15]

5


Hình 2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces
Cc loi x khuẩn thuc Streptomyces c kh năng to ra nhiu khng sinh c
cấu trc phc tp. Trong tổng s cc khng sinh đ đưc tm thấy do x khuẩn tổng hp
th c ti 60% l t Streptomyces. [15]
 Đặc điểm hình thái: h si của x khuẩn gồm c khuẩn ty cơ chất v khuẩn ty
khí sinh:
• Khuẩn ty cơ chất: mc sâu vo môi trưng nuôi cấy, không phân ct trong sut
qu trnh pht trin, b mặt nhẵn hoặc sn si, c th tit ra môi trưng mt s loi sc
t, c sc t tan trong nưc, c sc t chỉ tan trong dung môi hu cơ.
• Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất pht trin di ra trong không khí. Sau
mt thi gian pht trin trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hin cc chui bo t.
• Chui bo t (si bo t) c rất nhiu hnh dng khc nhau: thẳng, sng, mc
câu, xon… Chui bo t phân ct to thnh cc bo t trn, l cơ quan sinh sn chủ
Actinomycetes
VSV giống xạ khuẩn
Actinomycetales
Actinoplanaceae
Streptomycetaceae
Actinomycetaceae
…
Streptomyces
Streptoverticulum
Themostreptomyces
…

6

yu của x khuẩn. B mặt bo t c th c dng trơn nhẵn (sm), x x da cc (wa), c
gai (sp) hoặc c tc (ha).

Hình 3: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn

 Đặc điểm sinh lý: Streptomyces l sinh vt dị dưng, c tính oxi ha cao. Đ
pht trin, chng phân gii cc hydratcarbon lm nguồn cung cấp vt chất v năng
lưng, đồng thi thủy phân cc hp chất như gelatin, casein, tinh bt, kh nitrat thnh
nitrit. Streptomyces l loi x khuẩn hô hấp hiu khí. Nhit đ ti ưu của chng l 25-
30°C, pH ti ưu thưng l 6,8-7,5.
 Khả năng tạo sắc tố: Sc t to thnh t Streptomyces đưc chia lm 4 loi: sc
t ha tan, sc t của khuẩn ty cơ chất, sc t của khuẩn ty khí sinh,sc t melanoid.
1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

7


Hình 4: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh

1.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.4.1. Mục đích
Ging truyn ủ trong phng thí nghim
Bnh nhân ging trong phng thí nghim
Bnh nhân ging trên thit bị nhân ging
Bnh lên men to khng sinh
Dịch lên men
Dịch lc
Sinh khi
Sinh khi thô
Dịch chit sinh khi
Sn phẩm tinh ch
Dịch chit khng sinh
Dịch chit đm đặc

Sn phẩm tinh ch
Sn phẩm đ kim nghim
Sn phẩm đưc đng gi

8

Cc VSV thun chủng đưc phân lp t cc nguồn tự nhiên (bn, đất, nưc, mô
thực vt…) thưng c HTKS không cao, hiu suất sinh tổng hp thấp. Do đ, đ thu
đưc cc chủng c HTKS cao đưa vo sn xuất đi hỏi phi ci to, chn ging bằng
cc phương php khc nhau v nghiên cu điu kin nuôi cấy, bo qun thích hp. [9],
[13]
1.4.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngu nhiên
Cc vi sinh vt c sự bin dị tự nhiên theo tn s khc nhau trong ng ging
thun khit, c c th c hot tính khng sinh tăng lên 10-30 % so vi nhng c th
khc. Cn phi chn lấy c th c hot tính cao nhất trong ng ging đ nghiên cu
tip.[9]
Trong thực t, chn lc tự nhiên cc c th c HTKS cao chỉ đ nghiên cu ban
đu, n không c gi trị p dụng vo sn xuất. Đ thu đưc nhng chủng c kh năng
siêu tổng hp khng sinh, ngưi ta p dụng cc phương php đt bin nhân to.
1.4.3. Đột biến cải tạo giống
 Phương php đt bin nhân to kt hp vi sng lc l phương php ci to
ging hiu qu.
 Cc tc nhân gây đt bin c th đưc chia lm 3 nhm:
• Tc nhân ha hc: ethylenimin, acid nitrơ (HNO
2
), hydroxylamin,
dimethylsulphat…
• Tc nhân vt l: Ánh sng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tc nhân vt l
hay đưc dng nhất l nh sng t ngoi (UV). Kh năng đt bin cn phụ thuc vo
khong cch chiu, thi gian chiu, cưng đ bc x.

• Tc nhân sinh hc: Transposon, Bacteriophage Mu, …
 Cc tc nhân vt l v ha hc vi liu lưng v thi gian thích hp sẽ git cht
hu ht cc vi sinh vt. Nhng c th no cn sng st sẽ c sự đt bin gen, lm thay
đổi cc tính trng dn đn hoặc lm mất kh năng to khng sinh (đt bin âm) hoặc
lm tăng hiu suất sinh tổng hp khng sinh lên nhiu ln (đt bin dương).

9

 Đ to ra cc chủng c hiu suất sinh tổng hp khng sinh cao phi tin hnh đt
bin bc thang, kt hp cc phương php di truyn phân t như ti tổ hp định hưng
cc gen, k thut tch dng gen, k thut to v dung hp t bo trn. [9], [11]
1.4.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
Bo qun gi ging VSV l công vic cn thit do cc ging dễ bị thoi ha,
nhm ln, mất mt nu không đưc lưu gi mt cch khoa hc. Mục đích cụ th l: gi
ging VSV c tỷ l sng st cao, cc đặc tính di truyn không bị bin đổi v không bị
tp nhiễm bởi cc vi sinh vt l.
Thông thưng, c th s dụng 4 phương php sau đ bo qun cc chủng VSV:
cấy chuyn (bo qun trong l hoặc ng môi trưng, định kỳ cấy chuyn sang môi
trưng mi), lm khô (trn t bo VSV vi gi mang v lm khô ở nhit đ phng),
đông khô (phân tn t bo VSV trong MT chất bo qun rồi đông lnh, lm khô mu
đông lnh), đông lnh (huyn dịch t bo trong chất bo qun đưc đông lnh nhanh v
bo qun ở nhit đ thấp).
Đ gi ging x khuẩn trong phng thí nghim, cch đơn gin nhất l nuôi cấy
x khuẩn trên môi trưng thch nghiêng thích hp, cất ng thch nghiêng trong tủ lnh
2°C v định kỳ 3-6 thng cấy li 1 ln. [9], [13]
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Lên men l qu trnh trao đổi chất sinh hc đưc tin hnh do hot đng của vi
sinh vt nh sự xc tc của cc enzyme vi mục đích cung cấp năng lưng v cc hp
chất trung gian cho chng.

Khng sinh l mt trong nhng sn phẩm của qu trnh lên men x khuẩn. Cụ th
hơn, khng sinh l sn phẩm trao đổi bâc hai, đưc to thnh gn vo lc kt thc qu
trnh sinh trưởng của x khuẩn, thưng vo gn hoặc vo chính pha cân bằng. [9]

10


Hình 5: Đưng cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn
1.5.1. Các phương pháp lên men
Có 2 phương php lên men chính:
 Lên men b mặt: Trong phương php ny, vi sinh vt đưc nuôi cấy trên b mặt
cơ chất rn, bn rn hoặc lỏng.
• Ưu đim: Thao tc đơn gin, dễ thực hin, dễ x l cục b, không đi hỏi thit bị
phc tp.
• Nhưc đim: Kh cơ gii ha, tự đng ha, khó vô trùng, tn din tích, tn nhân
công, hiu suất s dụng môi trưng thấp.
 Lên men chìm : Vi sinh vt (hiu khí&kị khí) đưc nuôi cấy trong môi trưng
lỏng.
• Ưu đim: Dễ cơ gii ha, tự đng ha, dễ kim sot ton b qui trnh, tn ít din
tích, chi phí nhân lực thấp, hiu suất qu trnh lên men cao.
• Nhưc đim: Đu tư trang thit bị k thut ban đu ln.
• Cc phương php lên men chm: Lên men mẻ, lên men c bổ sung, lên men bn
liên tục, lên men liên tục.

11

- Lên men mẻ (lên men c chu kỳ): VSV đưc nuôi c định trong bnh lên men
vi 1 th tích MT xc định. VSV pht trin theo giai đon v to ra sn phẩm. Kt thc
qu trnh, ngưi ta thu lấy sn phẩm.
- Lên men c bổ sung: trong qu trnh nuôi cấy c bổ sung thêm môi trưng

dinh dưng đ lm cho mt đ t bo trong bnh tăng lên. Do đ, nâng sao hiu qu s
dụng bnh lên men.
- Lên men liên tục: Thit bị đưc cấu to đặc bit sao cho khi VSV đ pht
trin đn mt giai đon thích hp th sẽ lấy đi mt th tích dịch lên men v đồng thi bổ
sung thêm MT mi vo bnh.
- Lên men bn liên tục: trong qu trnh lên men, vic bổ sung thêm MT dinh
dưng v rt bt dịch lên men không đưc thực hin liên tục m định kỳ sau nhng
khong thi gian nhất định. [4], [9]
1.5.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
 pH môi trường: nh hưởng đn qu trnh lên men c th do tc dụng trực tip
của cc ion H
+
hay OH
-
đn tính chất keo của t bo, hot lực của enzyme hoặc l tc
dụng gin tip.
 Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiu oxy nhất thi sẽ ph v trao đổi chất trong
t bo. V th, phi cung cấp oxy sao cho tc đ ha tan oxy bằng tc đ s dụng oxy
của VSV. Đi vi nhiu VSV, sự thông khí sẽ lm tăng tc đ sinh trưởng, rt ngn pha
tim pht. Bên cnh đ, nhu cu oxy của VSV trong cc giai đon sinh trưởng cng
không ging nhau: trong thi kỳ đu, sinh khi cn ít tc đ ha tan oxy ln nên thông
khí tương đi mnh l tt.
 Như vy, trong sn xuất, cn nghiên cu cụ th nh hưởng của cc yu t ti qu
trnh lên men đ c th ti ưu ha qu trnh ny nhằm to điu kin thun li nhất cho
sinh tổng hp chất mong mun. [13]
1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.6.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

12

Đây l giai đon c vai tr rất quan trng bởi v sn phẩm thu đưc sau qu trnh
lên men thưng không bn vng, hm lưng khng sinh trong dịch lên men thưng
thấp. Do đ, cn tch riêng khng sinh khỏi cc tp chất khc v tinh ch sn phẩm đt
đưc cc tiêu chuẩn cn thit theo quy định dng điu trị. Công đon tinh ch sẽ gp
phn quyt định gi thnh của sn phẩm. [9]
1.6.2. Các phương pháp chiết tách
 Khng sinh l nhng sn phẩm trao đổi chất th cấp . Ty theo đặc tính của loi
m KS đưc tit v o môi trưng nuôi cấy hay gi li trong TB . Đ thu lấy cc chất c
đ tinh khit cao cn tm phương php chit tch thích hp.
 Mt s phương php chit tch thưng dng:
• Phương php chit bằng dung môi hu cơ.
• Cc phương php sc k (sc k trao đổi ion, sc k ra gii trên ct…).
• Phương php to phc kt tủa, chưng cất, thăng hoa.
 Chit xuất:
Chit xuất l phương php tch mt hoặc mt s chất ra khỏi hn hp. Đ l qu
trnh phân b cc chất gia hai pha không trn ln vo nhau: mt pha lỏng v mt pha
rn (cân bằng lỏng- rn) hoặc gia hai pha lỏng (cân bằng lỏng- lỏng, thưng mt pha
l nưc).
 Phương php sc k:
• L mt nhm cc phương php ha l dng đ tch cc chất riêng rẽ t mt hn
hp nhiu thnh phn. Nguyên l tch chung l mu phân tích đưc ha tan trong mt
pha đng, đưc cho qua pha tĩnh mt cch liên tục v không ha ln vi n. Pha tĩnh
đưc c định trên ct hay trên b mặt chất rn. Cc chất tan l thnh phn của mu sẽ di
chuyn qua pha tĩnh vi tc đ khc nhau phụ thuc tương tc gia pha tĩnh, pha đng
v chất tan. Nh tc đ di chuyn khc nhau cc thnh phn của mu sẽ đưc tch riêng
bit thnh di trên sc đồ, lm cơ sở cho phân tích định tính hay định lưng.

13

• Cơ ch của sự chia tch c th l cơ ch hấp phụ, phân b, trao đổi ion, sng lc

phân t hay sự phi hp đồng thi của nhiu cơ ch ty thuc vo tính chất của chất
lm pha tĩnh v dung môi lm pha đng.
• Cc phương php sc k thưng dng trong nghiên cu sinh tổng hp KS:
- Sc k lp mỏng: Pha tĩnh l chất hấp phụ, đưc c định trên bn mỏng. Pha
đng l mt h dung môi đơn hoặc đa thnh phn đưc pha theo tỷ l. Pha đng di
chuyn qua bn mỏng nh lực mao dn hoặc tc đng của trng lực.
- Sc k ct: Pha tĩnh đưc gi trên ct, pha đng đi qua pha tĩnh nh p suất
hoặc trng lực. Qu trnh ra gii đưc thực hin bằng cch thêm liên tục lưng mi
của pha đng. Dng ct thủy tinh hoặc ct bằng kim loi c KT 50×1(cm). Bên trong
ct c cha chất hấp phụ ở dng ht nhỏ, thưng l silicagel, nhôm oxyd, tinh bt…l
pha tĩnh đ đưc chuẩn ha đ đm bo kích thưc chuẩn. Dung môi s dụng l dung
môi trơ hoặc dung môi c đ phân cực thích hp l pha đng(ethyl acetat, n-hexan,
aceton, methanol…) hoặc hn hp gia chng. [1], [3], [15]
1.7. Bưc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.7.1. Phổ tử ngoại - khả kiến
 Đưng cong biu diễn sự phụ thuc đ hấp thụ bc x UV vo bưc sng hay
s sng l phổ t ngoi.
 Cc bc x UV-VIS c năng lưng kh ln nên c kh năng lm thay đổi mc
năng lưng của cc electron t trng thi cơ bn lên trng thi kích thích. Gia cấu trc
ha hc của phân t chất cn nghiên cu vi quang phổ hấp thụ c mi quan h chặt
chẽ (Ví dụ: Nhng phân t no cng c nhiu liên kt đôi th sự hấp thụ cng chuyn v
bưc sng di hơn, đặc bit l cc h liên hp). Cc phân t c đặc đim: ni đôi liên
hp, nhân thơm, dị t N, S, O c kh năng hấp thụ năng lưng nh sng UV-VIS. [1],
[2], [8]
1.7.2. Phổ hồng ngoại

14

 Phổ hồng ngoi l phương php đo sự hấp thụ bc x hồng ngoi (IR) khi n đi
qua mt lp chất cn th ở cc s sng khc nhau.

 Năng lưng của bc x hồng ngoi không đủ ln đ lm thay đổi trng thi năng
lưng của electron m chỉ đủ đ thay đổi trng thi dao đng của phân t. Phổ IR đưc
s dụng đ pht hin cc nhm chc đặc bit trong phân t. Mi bưc sng hấp phụ
cực đi trên phổ IR sẽ đặc trưng cho mt nhm chc. [1], [2], [8]

1.7.3. Khối phổ (MS: mass spectrometry)
Dng chm đin t c năng lưng trung bnh đ bn ph phân t hu cơ ở chân
không. Khi cc phân t ở trng thi khí va chm ti mt dng electron c năng lưng
cao th sẽ tch ra mt hoặc hai ion v trở thnh ion co đin tích +1 (chim tỉ l ln) v
+2. Loi ion ny đưc gi l ion gc hay ion phân t. Nu cc ion phân t tip tục va
chm vi dng electron c năng lưng ln hơn th chng sẽ v thnh nhiu mnh ion,
thnh cc ion gc hay cc phân t trung ha khc nhau. Cc ion c khi lưng m v
đin tích e. Tỷ s m/e gi l s khi z. Ngưi ta ghi li phổ khi dưi dng vch hay
bng. [8]
1.8. Một số nghiên cứu liên quan

1.8.1.
So sánh glucose và glycerol làm nguồn carbon cho sản xuất ε-poly- L-
Lysin từ Streptomyces sp. M-Z18
Glucose đưc s dụng rng ri trong sn xuất cc ε-poly-L-lysine(ε-PL). Tuy
nhiên, glycerol l mt nguồn carbon mi cho qu trnh sn xuất ε-PL trong nhng năm
gn đây. Trong nghiên cu ny, Glycerol vưt tri so vi đưng glucose cho sn
xuấtε-PL theo phương php lên men hng lot chủngStreptomyces sp. M-Z18 trên
glycerol đưc so snh vi glucose trong sut qu trnh lên men đ chỉ ra sự khc bit.
Hot đng của cc enzyme quan trng cho thấy aspartate kinase (ASPK) v ε-PL
synthetase (Pls) trong môi trưng glycerollaf cao hơn so vi đưng glucose, v đặc bit
l hot đng của Plscos th tăng lên 2,3 đn 3,6 ln tương ng ti thi đim 24 v 36

15

gi. Hơn na, phân tích thông lưng chuyn ha đ chng minh rằng mt thông lưng
cao hơn 25% c nguồn gc t glycetol đưc hưng vo tổng hp ε-PL hơn so vi
đưng glucose. Kt qu l, cơ ch của glycerol tt hơn so vi đưng glucose đưc xc
định: cc hot đng của ASPK v Pls trong glycerol cao hơn so vi glucose, v kt qu
l nguồn carbon trực tip vo tổng hp ε-PL tăng lên. Nghiên cu ny cung cấp mt ti
liu tham kho đ thay th glycerol glucose thông thưng như nguồn carbon đ sn
xuất ε-PL. [17]
1.8.2. Tinh chế ái lc Phosphoprotein xác định các protein tham gia vào S-
adenosyl-L-methionine làm tăng cưng sản xuất kháng sinh trong Streptomyces
coelicolor
Streptomyces l chi ln sn xuất thuc khng sinh hu ích c nguồn gc tự
nhiên. Cc sn phẩm chuyn ha trong Streptomyces thưng bin dng kh rõ rng, do
đ rất kh đ pht trin mt phương php chung đ thc đẩy vic sn xuất cc sn phẩm
chuyn ha ở hu ht cc chủng Streptomyces. Vic nâng cao sn phẩm chuyn ha của
nhiu Streptomyces bởi S-adenosylmethionine (SAM) trong cc nghiên cu trưc đ
cho thấy sự tồn ti của mt tc đng điu ha SAM (SAM regulatory effect). Trong
nghiên cu ny đ sng lc 9 protein bằng cch s dụng cc ct lc phosphoprotein t
Streptomyces coelicolor. Trong s đ, gen (SCO5477, SCO5113, SCO4647, SCO4885
v SCO1793) cho năm protein bị gin đon bởi đt bin chn. Cc sn phẩm
undecylprodigiosin v actinorhodin đ đưc thay đổi trong tất c cc đt bin. SAM
lm tăng cưng sn xuất actinorhodin đ bị mất bởi tất c cc đt bin tr đt bin
SCO4885,lm gim sn xuất cc actinorhodin v undecylprodigiosin kho x l SAM
(SAM). Nghiên cu ny chng minh rằng lc i lực phosphoprotein c th đưc s
dụng như mt phương php sng lc đ xc định cc protein liên quan đn dấu hiu
SAM. [18]
1.8.3. Xác định định hoạt tính sinh học của một nhóm gồm 51 macrolide bằng
cách kích hoạt enzyme tổng hợp polyketide trong Streptomyces

16

Ambofaciens
Nhu cu tm kim cc thuc mi đ chng li bnh nhiễm trng, ung thư v
nhng bnh nguy him đe da đn tính mng con ngưi luôn l rất ln. Gn đây, nhng
phương php nghiên cu tip cn di truyn rất pht trin, thc đẩy sự đổi mi trong vic
tm kim cc thuc c nguồn gc tự nhiên. Phân tích b gen của S. ambofaciens
ATCC23877 pht hin thấy nhiu cụm gen sinh tổng hp cc chất chuyn ha bc 2,
bao gồm mt cụm gen sinh tổng hp polyketide typ I (Polyketide synthetase- PKS).
PKS bao gồm 25 gen (9 gen trong s đ m ha PKSs), dung lưng khong 150 kb. Đ
l mt trong nhng gen sinh tổng hp polyketid ln nhất đưc mô t cho đn nay.
Nhng sn phẩm chuyn ha của cụm gen ny chưa đưc bit rõ, phân tích qu trnh
phiên m cho thấy n không biu hin trong điu kin pht trin ở phng thí nghim.
Biu hin của mt gen nhất định trong cụm m ha mt protein, tương tự như liên kt
ATP của LuxR trong mt nhm protein ln (LAL), kích hot biu hin cc gen sinh
tổng hp. Điu ny dn đn vic xc định đưc 4 trong 51 macrolid, đưc đặt tên l
Stambomycin A-D như l sn phẩm chuyn ha của cụm gen. Cấu trc của cc hp
chất ny bao gồm mt s tính năng sinh tổng hp th vị, như sp xp cc đơn vị mở
rng bất thưng trong chui polyketid v hydroxyl ha cc chui polyketid đang pht
trin đ cung cấp nhm hydroxyl cấu thnh macrolid. Stambomycin c th chng li sự
gia tăng nhanh của cc t bo ung thư ở ngưi. Cơ sở d liu tm kim xc định cc gen
điu chỉnh m ha LAL trong nhiu cụm gen sinh tổng hp bí ẩn của b gen x khuẩn,
cho thấy biu hin hot ha cc con đưng chuyn ha riêng bit đi din cho cch tip
cn mi cc sn phẩm c hot tính sinh hc t tự nhiên. [19]