Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 155.16

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VƢƠNG THỊ THẮM

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
Streptomyces 155.16.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ




HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VƢƠNG THỊ THẮM

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
Streptomyces 155.16.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn
1. ThS Lê Thị Thu Hương
2. TS Bùi Quang Phúc
Nơi thực hiện
1. Bộ môn Vi sinh – Sinh học
2. Viện sốt rét – kí sinh trùng trung
ương.

HÀ NỘI - 2013
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Lê Thị Thu Hƣơng, TS Bùi
Quang Phúc đã trực tiếp hƣớng dẫn, ân cần chỉ bảo tôi thực hiện và hoàn thành
khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang
giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, viện sốt rét – kí sinh trùng trung
ƣơng, khoa Hóa – trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học đã tạo điều kiện,
giúp đỡ trong thời gian tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng các thầy cô giáo trong trƣờng
Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại
trƣờng.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, quan tâm, giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian qua.
Do điều kiện hạn hẹp về thời gian, về phƣơng tiện nghiên cứu và trình độ bản
thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận
đƣợc các ý kiến đóng góp từ thầy cô và bạn bè để khóa luận đƣợc hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20/05/2013
Sinh viên
Vƣơng Thị Thắm




MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN…….………………………………………………….2

1.1.Đại cƣơng về kháng sinh.……………………………………………………….2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh ……….………………………………….2
1.1.2. Đặc tính của kháng sinh … 2
1.1.3. Phân loại kháng sinh ……………………………………………….2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh…………………………………… 3
1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh…………………………………… 3
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn………………………………………………… …….4
1.2.1. Đặc điểm chung của xạ khuẩn …………………………… ……4
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptpmyces …………………… …….5
1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ
khuẩn ……………………………………………………………………… 6
1.3.Tuyển chọn, cải tạo giống và bảo quản giống xạ khuẩn…………………… …7
1.3.1. Mục đích …………………………………………………………7
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép sàng lọc ngẫu nhiên …………7
1.3.3. Đột biến cải tạo giống …………………………………… … 7
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………………… … 8
1.4.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ………………………………… …… 8
1.4.1. Đại cƣơng …… …………………………… ………………… 8
1.4.2. Các phƣơng pháp lên men ………………………………… …… 9
1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ………………………… 10
1.5.1. Lọc và chiết xuất………………………………………………… 10
1.5.2. Tách và tinh chế ……………………………………………… 10
1.6.Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ………………………………….11
1.6.1. Phổ tử ngoại - khả kiến……………………………… … ……….11
1.6.2. Phổ hồng ngoại ……………………………………………… 11
1.6.3. Phổ khối… ……………………………………………………… 11
1.7.Một số nghiên cứu về Streptomyces và sự sinh tổng hợp kháng sinh… 11
1.7.1. Phân loại, lên men, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của kháng
sinh Sparsomycin- đƣợc sản xuất bởi Streptomyces sp.AZ-NIOFD1 ……11
1.7.2. Phân lập, định tên và tối ƣu hóa quá trình sản xuất kháng sinh từ xạ

khuẩn Streptomyces phân lập từ đất vùng Wady El Natron- Ai Cập ……12
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ……………………………………………… 14
2.1.1. Chủng xạ khuẩn… ……………………………………………… 14
2.1.2. Chủng vi sinh vật kiểm định ………………………………….14
2.1.3. Môi trƣờng ……………………………………………………… 14
2.1.4. Dung môi ……………………………………………………… 15
2.1.5. Vật liệu chạy sắc ký: …………………………………………16
2.1.6. Máy móc thiết bị ……………………………………………… 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………… 17
2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống …………………………………………17
2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích ………………………… 17
2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu đƣợc ……17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………………………………… 18
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn trong ống nghiệm… ……………18
2.3.2. Phƣơng pháp sàng lọc ngẫu nhiên ………………………………… 18
2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp khuếch tán … 18
2.3.4. Đột biến bằng ánh sáng UV…… …………………………… … 19
2.3.4. Phƣơng pháp đột biến hóa học ………………………………….20
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ………………………… 21
2.3.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ……21
2.3.7. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng…… 22
2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phƣơng pháp cất quay …………… …23
2.3.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ………………………… 23
2.3.10. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu đƣợc……………………23
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT ………………… 24
3.1.Nghiên cứu cải tạo giống và lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………….24
3.1.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ………………………………….24
3.1.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ………………………… 25
3.1.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ………………………… 26

3.1.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 ………………………… 27
3.1.5. Kết quả chọn môi trƣờng lên men chìm ………………………… 28
3.1.6 Kết quả chọn chủng lên men ………………………………….28
3.2. Chiết tách, tinh chế kháng sinh. …………………………………………29
3.2.1. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi… ………………… 29
3.2.2. Kết quả tinh chế kháng sinh bằng SK cột…… ……………………29
3.3 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết … ………34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………… 36
KẾT LUẬN ………………………………………………………………………36
ĐỀ XUẤT ………………………………………………………………………37










DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ATCC American Type Culture Collection
ADN Acid 2’-deoxyribonucleic
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
CFU Colony Forming Unit
DM Dung môi
ĐB Đột biến
ĐBHH Đột biến hóa học
HTKS Hoạt tính kháng sinh
IR Infrared ( hồng ngoại )

ISP International Streptomyces Project
KS Kháng sinh
MS Mass Spectroscopy
MT Môi trƣờng
MTdt Môi trƣờng dịch thể
MW Moleculer Weight
NMR Nuclear magnetic resonance
rRNA ribosome Ribonucleic Acid
SK Sắc kí
SKLM Sắc kí lớp mỏng
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
T
0
n/c
Nhiệt độ nóng chảy
UV Ultra violet ( tử ngoại)
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên
Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 1
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 2
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 3

Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trƣờng lên men chìm
Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men
Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký
Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 1 .
Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 1)
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 2)
Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 3
Bảng 3.12: Kết quả dự đoán từ phổ MS
Bảng 3.13 : Kết quả IR












DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ PHỤ LỤC
Hình 1.1 : Sơ đồ phân loại xạ khuẩn.
Hình 1.2 : Các loại khuẩn ti ở xạ khuẩn.
Hình P1: Kết quả thử HTKS các biến chủng sau ĐBHH bằng phƣơng pháp khối
thạch (VSV kiểm định : S. flexneri).
Hình P2: Kết quả thử HTKS của dịch lên men bằng phƣơng pháp giếng thạch
(VSV kiểm định : S. flexneri).
Hình P3: Kết quả thử HTKS các phân đoạn chạy sắc ký cột lần 1 bằng phƣơng
pháp khoanh giấy lọc.

Phụ lục 1 : Phổ UV- VIS của kháng sinh.
Phụ lục 2: Phổ IR của kháng sinh.
Phụ lục 3: Phổ MS của kháng sinh.










.


- 1 -

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bước sang thế kỷ 21, con người vẫn tiếp tục phải đối mặt với nguy cơ tử vong
cao đến từ các bệnh nhiễm khuẩn. Việc kiểm soát các bệnh này vấp phải những tác
động bất lợi do tình trạng kháng kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt ở các quốc
gia đang phát triển. Nhu cầu về việc tìm ra loại thuốc kháng sinh mới với phổ tác
dụng rộng, độ an toàn cao, có thể làm giảm chi phí y tế, vẫn luôn là mối quan tâm
của cả cộng đồng. Tuy nhiên việc nghiên cứu này đang bị bỏ ngỏ, thậm chí bởi cả
các hãng dược phẩm lớn do vấn đề về kinh phí. Do đó đặt ra yêu cầu tìm ra loại
kháng sinh mới tận dụng các nguồn lực sẵn có để chi phí sản suất là thấp nhất.
Thực tế, có khoảng trên 80% số kháng sinh đang sử dụng được sinh tổng hợp từ xạ
khuẩn, trong đó 55% do chi Streptomyces tạo ra; 50% trong số 20 000 chất chuyển
hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học được sản xuất từ xạ khuẩn có nguồn gốc từ đất.

Trong đó được phân lập dễ nhất từ đất là chi xạ khuẩn Streptomyces.
Từ những nghiên cứu ban đầu cho thấy, chủng xạ khuẩn Streptomyces 155.16
do bộ môn Vi sinh – Sinh học – trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp, cho kháng
sinh có hoạt tính mạnh, ổn định, có nhiều tiềm năng trong thực tế, nên chúng tôi lựa
chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
155.16”. Khóa luận mong muốn đạt những mục tiêu sau đây:
1. Nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh thông qua chọn lọc cải
tạo giống.
2. Xác định được các điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh với hiệu suất
cao, chi phí thấp.
3. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh thu được.



- 2 -

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh.
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các
nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt
một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh
động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.[9]
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp, chỉ được sinh tổng hợp mạnh ở giai
đoạn phát triển sau của sinh trưởng VSV.[13]
Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi là
kháng sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật
khác không mang tính chọn lọc và ở nồng độ cao.[9]
1.1.2. Đặc tính của kháng sinh:
Kháng sinh có thể do các VSV tiết ra môi trường xung quanh, như: penicillin,

streptomycin, tetracyclin…hoặc được tích lũy trong tế bào VSV và được giải phóng
khi tế bào bị phá vỡ, như : gramycidin…
Các kháng sinh có cấu trúc hóa học đa dạng, do đó các tính chất lý, hóa học
cũng khác nhau: độ tan trong các dung môi, độ bền nhiệt, độ bền trong các môi
trường có pH khác nhau.
Tính chọn lọc của các kháng sinh khác nhau lên các VSV là khác nhau, có
kháng sinh phổ rộng ( tác dụng trên cả VK Gram(+) và VK Gram (-) ), có kháng
sinh phổ hẹp ( chỉ tác động trên VK Gram (+) hoặc Gram (-)).
Kháng sinh được tích lũy cực đại khi các VSV được phát triển trong các điều
kiện môi trường tối ưu. Vì vậy để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cần
tạo điều kiện phát triển thích hợp nhất cho VSV.
1.1.3. Phân loại kháng sinh:
- 3 -

Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của
vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại
kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất, bao gồm:[8,9,14]
- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)
- Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)
- Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)
- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)
- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)
- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)
- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)
- Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin)
- Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (actinomycin D).
- Các kháng sinh khác ( rifampicin)[8]
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh:
Cơ chế tác dụng của kháng sinh là một quá trình phức tạp, bắt đầu bằng sự
tương tác của các phân tử kháng sinh với các vị trí đích trên các tế bào VSV mẫn

cảm. Từ đó làm thay đổi các chức năng tế bào quan trọng, ức chế sự phát triển của
tế bào VSV, thông qua việc:
- Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn.
- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn
- Ức chế tổng hợp acid nucleic.
- Thay đổi tính thấm của màng tế bào.
- Kháng chuyển hóa ( ức chế tổng hợp acid folic).
- Ức chế trao đổi chất hô hấp.[7,13,14]
1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh:[9]
 Trong y học: kháng sinh được sử dụng để dự phòng và điều trị các bệnh
nhiễm trùng, các bệnh nấm trên da, tóc, niêm mạc(nystatin, amphotericin );
dùng để điều trị ung thư (actinomycin D, doxorubicin…)
- 4 -

 Trong nông nghiệp: với các đặc tính: tác dụng nhanh, dễ phân hủy, tính đặc
hiệu cao, kháng sinh đang được nhiều nước trên thế giới sử dụng để bảo vệ cây
trồng khỏi các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra.
Hiện có khoảng 30 chất kháng sinh đã được sử dụng trong nông nghiệp, như
: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa;
griseofulvin chống bệnh rỉ sắt ở lúa mỳ do Botrytis gây ra…
 Trong chăn nuôi: kháng sinh được sử dụng để tăng trọng, tăng sản lượng
trứng của đàn gia súc, gia cầm : Five- Terravit. Egg: Oxytetracillin + các loại
vitamin.
 Trong công nghiệp thực phẩm: dùng kháng sinh để tiêu diệt VSV trong thực
phẩm, làm tăng thời gian bảo quản thực phẩm : subtilin (do Bacillus subtilis tạo
ra)…
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn:
1.2.1. Đặc điểm chung của xạ khuẩn.
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), là các vi
khuẩn Gram (+), có tỷ lệ G+C >55%. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu

khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh.[4,5,13]
Xạ khuẩn phân bố rất rộng trong tự nhiên, trong đất, nước, rác, bùn, phân
chuồng…, trong 1gam đất có khoảng 29 000 – 2 400 000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9
– 45% tổng số VSV.[7]
Xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi, hệ sợi được chia thành khuẩn ty cơ chất
và khuẩn ty khí sinh. Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành
khuẩn lạc xạ khuẩn. [13]
 Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà
thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra
theo hình phóng xạ.
 Khuẩn ty xạ khuẩn thường không có vách ngăn với màu sắc hết sức phong
phú: da cam, đen đỏ, nâu, trắng, vàng, xám …
- 5 -

Xạ khuẩn sinh sản nhờ các bào tử : chuỗi bào tử ( họ Streptomycetaceae ),
bào tử di động ( họ Actinoplanaceae), bào tử hình cầu do phân cắt hệ sợi đã già ( họ
Actinomycetaceae).[13]
Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như: Kháng sinh, enzym,
vitamin…có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hoặc được tiết ra
môi trường.
Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo sơ đồ dưới đây.

Hình 1.1 : Sơ đồ phân loại xạ khuẩn.
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces
Streptomyces là một chi thuộc bộ Actinomycetale. Streptomyces có mặt trong
đất, nước và bào tử của chúng còn được tìm thấy trong không khí.[22,23]
Các xạ khuẩn thuộc chi này có khả năng sản xuất nhiều chất chuyển hóa thứ
cấp có hoạt tính sinh học như chống nấm, chống virus, chống tăng huyết áp, ức chế
miễn dịch và đặc biệt là kháng sinh [17]. Có khoảng 55% kháng sinh được sản xuất
từ Streptomyces.[18]

- Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn
ty khí sinh:
Actinomycetes
VSV giống xạ khuẩn
Actinomycetales
Actinoplanaceae
Streptomycetaceae
Actinomycetaceae
…
Streptomyces
Streptoverticulum
Themostreptomyces
…
- 6 -

+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong
suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số
loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí.
+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn.

Hình 1.2 : Các loại khuẩn ti ở xạ khuẩn.
- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao.
Năng lượng được tạo ra bằng cách phân giải các hydratcarbon, đồng thời thủy phân
các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của chúng là
25-30°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5.
- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:
sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố
melanoid.[5,6,22]

1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ
khuẩn.
- Nhiệt độ : nhiệt độ tối thích cho sự sinh tổng hợp kháng sinh là từ 18 – 28
0
C.[27]
- pH môi trường : thường là trung tính, môi trường quá acid hay kiềm đều ức chế
tổng hợp kháng sinh.[13]
- Thông khí : xạ khuẩn là VSV hiếu khí, yêu cầu có độ thông khí cao.[9,10]
- 7 -

- Thành phần dinh dưỡng trong môi trường lên men:
+ Nguồn C : thích hợp nhất là tinh bột, ngoài ra có thể tùy chủng xạ khuẩn để
thay thế bằng các đường như : glucose, fructose, maltose…[24]
+ Nguồn N : thường yêu cầu cả Nito hữu cơ và Nito vô cơ (các muối amoni).
+ Nguồn phosphate : có ý nghĩa quan trọng đối với quá trình sinh trưởng của xạ
khuẩn cũng như hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. Nếu thiếu phosphate, xạ khuẩn
sinh trưởng kém, hiệu suất lên men thấp. Nếu thừa phosphate sẽ kéo dài pha sinh
trưởng, rút ngắn pha tổng hợp kháng sinh.[24,27]
+ Nguyên tố vi lượng : cần chú ý tới khả năng tạo phức của một số kháng sinh
với các nguyên tố vi lượng trong môi trường nếu quá thừa.[9]
1.3. Tuyển chọn, cải tạo giống và bảo quản giống xạ khuẩn.
1.3.1. Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên, thường chỉ sản
xuất ra một lượng nhỏ các chất kháng sinh với HTKS thấp. Do đó, để thu được các
chủng có HTKS cao, đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các
phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích
hợp.[9,24]
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép sàng lọc ngẫu nhiên
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30 % so với những cá thể

khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu
tiếp. [9]
Tuy nhiên, trong thực tế, để thu được những chủng có khả năng siêu tổng
hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.
1.3.3. Đột biến cải tạo giống
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:[9,24]
- Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO
2
), hydroxylamin,
dimethylsulphat…
- 8 -

- Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia γ, chùm hạt α. Tác nhân vật lý hay
được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào
khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ.
- Tác nhân sinh học: Transposon (Tn) hoặc Bacteriophage Mu.[13]
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết
chết hầu hết các vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen,
làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất hoặc giảm khả năng tạo kháng
sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh (đột biến
dương).
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến
hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp gây đột biến[9].
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
Mục đích: để giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền
không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng
VSV: bảo quản trong tủ lạnh, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới; làm khô
(trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng); đông khô (phân tán
tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh); đông

lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở
nhiệt độ thấp).
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi
cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong
tủ lạnh và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần[9,11].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1. Đại cƣơng
Lên men là quá trình phân giải hydrocarbon trong điều kiện thích hợp (hiếu
khí hay kị khí) và kháng sinh là một trong những sản phẩm quan trọng của quá
trình lên men sử dụng xạ khuẩn. Cụ thể hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất
- 9 -

bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn,
thường vào gần hoặc chính pha cân bằng.[9,13]
Quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh là quá trình lên men hiếu khí.
1.4.2. Các phƣơng pháp lên men
- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn
hay thể lỏng. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp
trên bề mặt MT. [9]
Ưu điểm: thao tác đơn giản, không đòi hỏi thiết bị tân tiến.
Nhược điểm : tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động
hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống
và giữ giống.
- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3
chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng
đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn. [3,9]
Có 4 kiểu lên men chìm như sau:[3,21]
+ Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi trong bình lên men với
1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc
quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.

+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường
dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả
sử dụng bình lên men.
+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát
triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men, đồng thời
bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình.
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh
dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những
khoảng thời gian nhất định.
- 10 -

1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Kết thúc quá trình lên men, KS có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch
lên men cùng với nhiều chất phụ, tạp chất. Do đó cần thực hiện chiết tách, tinh chế
để thu được kháng sinh đạt tiêu chuẩn cần thiết theo tiêu chuẩn điều trị.
1.5.1. Lọc và chiết xuất:
Tùy thuộc vào loại kháng sinh là nội bào hay ngoại bào để có phương pháp
lọc và chiết xuất thích hợp:
- KS ngoại bào được thu từ dịch lọc hay dịch lên men bằng kỹ thuật chiết
lỏng – lỏng. Thực tế, thường dùng cân bằng nước – dung môi hữu cơ không đồng
tan với nước để chiết kháng sinh.
- KS nội bào được thu từ sinh khối, thường bằng phương pháp chiết rút sử
dụng dung môi hữu cơ.[7]
1.5.2. Tách và tinh chế:
- Mục đích : để tách riêng từng chất trong một hỗn hợp.
Phương pháp sắc kí thường được sử dụng để tách và tinh chế kháng sinh. Ngoài
ra, phương pháp kết tinh cho phép thu được kháng sinh có độ tinh khiết cao.
- Các phương pháp sắc ký:
+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên
khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn

(chất hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số R
f
. Các
chất sau khi tách ra sẽ tạo ra các vết khác nhau trên bản mỏng sắc kí. Các vết này
có thể được phát hiện nhờ màu sắc của các chất hoặc được hiện hình bằng chất tạo
màu thích hợp hay hiện hình nhờ VSV (như các chất kháng sinh)
+ Sắc ký lỏng phân bố : Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự
phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo
thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ
hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha
tĩnh.[1]
- 11 -

1.6. Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1. Phổ tử ngoại - khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi
mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa
cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối
quan hệ chặt chẽ (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự hấp
thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử có
đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng
lượng ánh sáng UV-VIS.[1]
1.6.2. Phổ hồng ngoại
Các nhóm nguyên tử trong phân tử chất hấp thụ năng lượng từ các bức xạ
hồng ngoại làm thay đổi trạng thái dao động của phân tử, đồng thời tạo nên một dải
hấp phụ trên phổ IR. Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt
trong phân tử. Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một
nhóm chức.[1,2]
1.6.3. Phổ khối:

Phổ khối là tập hợp các tín hiệu tương ứng với các ion- được thể hiện dưới
dạng các pic có cường độ khác nhau. Các tín hiệu này thu được khi các ion được
tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối của
máy khối phổ. Phổ khối cho phép xác định chính xác khối lượng các ion, phân tử;
xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu; hoặc dùng trong phân tích định
lượng.[1]
1.7. Một số nghiên cứu về Streptomyces và sự sinh tổng hợp kháng sinh
1.7.1. Phân loại, lên men, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của kháng
sinh Sparsomycin- đƣợc sản xuất bởi Streptomyces sp.AZ-NIOFD1.[16]
Năm chủng xạ khuẩn được phân lập từ nước sông Nile - Ai Cập, được sàng lọc
trên môi trường nitrate- tinh bột ở 30
0
C trong 5 ngày, từ đó chọn ra chủng có khả
năng sản xuất chất kháng sinh có phổ rộng - Streptomyces sp AZ-NIOFD1. Xạ
khuẩn được phân loại theo ISP. Tiến hành cô lập gen, khuếch đại, giải trình tự của
- 12 -

gen 16S - rRNA. Sử dụng chương trình BLAST đánh giá sự tương tự về ADN. Lên
men trong bình 250ml chứa 75 ml môi trường lên men, lắc trên máy lắc ở 30
0
C, tốc
độ 200 vòng/phút trong 5 ngày. Dịch lọc thu được sau khi ly tâm dịch lên men, loại
bỏ sinh khối, được điều chỉnh về pH = 7, sử dụng dung môi n- butanol để chiết tách
kháng sinh với tỷ lệ V dịch lọc : V dung môi = 1 : 1. Pha dung môi hữu cơ được
gộp lại và cất quay đến khô ở T
0
< 50
0
C. Kháng sinh thô được tinh chế bằng sắc ký
lớp mỏng với hệ dung môi chloroform : methanol (24:1) và sắc ký cột với hệ dung

môi chloroform : methanol (8:2), lấy 50 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5 ml. Nhận thấy
từ phân đoạn 20- 30 cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất. Cấu trúc kháng sinh tinh
chế được, được xác định nhờ phổ IR, UV, MS, NMR.
Kết quả : xạ khuẩn đã phân lập có các đặc điểm tương tự tới 99% với
Streptomyces violaceusniger. Kháng sinh thu được tan trong aceton, methanol,
chloroform, ethanol, DMSO; nhưng không tan trong benzen, n-hexan. Kháng sinh
có T
o
n/c
= 205
0
C, MW = 361,3, công thức phân tử : C
13
H
21
N
3
O
6
S
2
, có phổ tác dụng
trên cả vi khuẩn Gr (+), Gr(-), một số vi nấm và sinh vật đơn bào khác.
1.7.2. Phân lập, định tên và tối ƣu hóa quá trình sản xuất kháng sinh từ xạ
khuẩn Streptomyces phân lập từ đất vùng Wady El Natron- Ai Cập.[20]
Các chủng xạ khuẩn dùng trong nghiên cứu phân lập từ đất mặn và đất kiềm
vùng Wady El Natron- Ai Cập, được phát triển trên môi trường tinh bột - nitrat có
bổ xung nystatin ở 28
0
C trong 5 ngày. 55 xạ khuẩn phân lập được, chia làm 4 nhóm

theo màu sắc : xám 50%, trắng 20%, xanh 28%, đỏ 2%. Sử dụng khóa phân loại
theo ISP, xác định được tên của 4 loại xạ khuẩn sinh kháng sinh có hoạt tính cao,
bao gồm : Streptomyces coelicolor, Streptomyces flaveous, Streptomyces plicatus,
Streptomyces griseo yamaguchi. Thử hoạt tính của kháng sinh sinh tổng hợp bởi
các xạ khuẩn này trên vi khuẩn Gram(+), Gram(-), nấm. Chọn môi trường thích
hợp cho sự sinh tổng hợp kháng sinh : xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường
khác nhau như: thạch nền có tinh bột- nitrat, thạch nền có glycerol - asparagin,
thạch nền có tinh bột - muối vô cơ, thạch nền có cao thịt cá, thạch nền có yến mạch,
thạch nền có cao nấm men. Sau đó thử hoạt tính kháng sinh được sinh tổng hợp
- 13 -

trên các môi trường này. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng
sinh bởi xạ khuẩn phân lập được.Các yếu tố được nghiên cứu là: nguồn C, nguồn
nito, phosphat, các nguyên tố vi lượng : Zn, Fe, Mn ,các yếu tố như thời gian sinh
trưởng, pH ban đầu, sự thông khí. Kết quả được đo lường dựa trên sự phát triển của
xạ khuẩn- đo trọng lượng sinh khối, định lượng kháng sinh sinh ra.
Kết quả : nguồn C tốt nhất là tinh bột, nguồn N tốt nhất là từ KNO
3
, Ca(NO
3
)
2
,
(NH
4
)
2
SO
4
, nguồn P : sử dụng HPO

4
2-
là tốt nhất. pH cũng ảnh hưởng đến sự sinh
tổng hợp kháng sinh, pH thích hợp xác định được theo nghiên cứu là 7,6. Thời gian
nuôi cấy: Streptomyces plicatus sinh kháng sinh tối đa sau 3 ngày nuôi cấy. Nồng
độ oxi cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.


















- 14 -

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Chủng xạ khuẩn:
Chủng Streptomyces 155.16 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học

Dược Hà Nội cung cấp.
2.1.2. Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp:
- Chủng Gram (+): Bacillus pumilus ATCC 10241. (BP)
- Chủng Gram (-) : Shighella flexneri DT 112 (Shi)
2.1.3. Môi trƣờng
Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: thành phần các MT được trình bày ở
bảng 2.1.
Các MT lên men (MTdt): Có thành phần tương ứng MT nuôi cấy xạ khuẩn
nhưng loại bỏ thạch.
Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: thành phần các MT được trình bày ở
bảng 2.2.
Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định
đều được tiệt trùng ở 118-120°C trong 30 phút.

Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần
NaCl (%)
Cao thịt
(%)
Pepton
(%)
Thạch
(%)
pH
MT canh thang
0,5
0,3
0,5
0

7,0-7,4
MT thạch thường
0,5
0,3
0,5
1,8





- 15 -

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Thành phần
Đơn
vị
MT1
MT2
MT3
MT4
MT5
MT6
MT7
Tinh bột
g
2
2

2,4
2

Lactose
g


3




Glucose
g



2
1


Saccarose
g

3
Cao ngô
g


0,5
0,5



Bột đậu tương
g





1,5

Cao thịt
g




0,3

0,3
Pepton
g

0,3

0,5
KNO
3

g
0,1






KCl
g

0,05





NaNO
3

g

0,2





NH
4
NO
3

g


0,2
0,2



CaCO
3

g


0,3
0,4
0,4

0,2

(NH
4
)
2
SO
4

g





0,2

FeSO
4
.7H
2
O
g
0,01

K
2
HPO
4

g
0,05
0,1
0,1
0,05



MgSO
4
.7H
2
O
g
0,05
0,05
0,25
0,15



NaCl
g
0,05

0,1
0,5
Cao nấm men
g





0,5

Thạch
g
1,8
2
2
2
2
2
1,8
Nước
ml
100
100
100
100
100

100
100
pH
6,8-7,2

2.1.4. Dung môi .
Dung môi được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm dung môi dùng để chiết,
dung môi dùng trong sắc kí, dung môi dùng trong các phương pháp phân tích phổ.



- 16 -

Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng trong nghiên cứu.

Dung môi
Khối lượng
riêng (g/ml)
Nhiệt độ sôi
(°C)
Aceton
0,79
56
Acetonitril
0,782-0,783
80-82
n-Butanol
0,81
116-118
Butylacetat

0,880-0,885
117-118
Cloroform
1,470-1,480
60-62
Diclorometan
1,32
40
Dimethylformamid
0,95
153
Ethanol
0,789-0,791
78,3
Ethylacetat
0,889-0,901
70,4
NH
4
OH 25%
0,880

Methanol
0,791-0,793
64,5
Triethylamin
0,726-0,728
90
n-Hexan
0,6548

69

2.1.5. Vật liệu chạy sắc ký:
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck.
- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 2.3 ở trên
- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1mm
2.1.6. Máy móc thiết bị
- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba
60W, điện thế 220V.
- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf
- Tủ ấm Memmert, Binder
- Tủ lạnh Toshiba.
- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48
- Tủ sấy SL shellab
- Lò vi sóng Whirlpool
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030