Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 156.11

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪSTREPTOMYCES 156.11
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI - 2013





BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪSTREPTOMYCES 156.11

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



Người hướng dẫn:
PGS.TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh và Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội







HÀ NỘI - 2013



LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thy gio PGS-
TS Cao Văn Thu– bộ môn Vi sinh - Sinh học, người đ tn tnh hướng dn tôi t
nhng bước đu tiên cho đến khi tôi hoàn thành kha lun này.

Tôi xin chân thành cảm ơn cc thy cô gio, cc cn bộ, k thut viên giảng dy,
công tc ti Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đi học
Dược Hà Nội, Bộ môn Ha vt liệu - khoa Ha trường Đi học Khoa học tự nhiên Hà
Nội đ gip đ tôi trong thời gian làm thực nghiệm.
Nhân dp này tôi cng xin gửi lời cảm ơn đến Ban gim hiệu cng toàn th các
thy cô gio trường Đi học Dược Hà Nội đ dy d và to mọi điu kiện thun lợi cho
tôi trong thời gian tôi học tp ti trường.
Và cui cng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đnh và bn b đ động viên , gip đ
tôi trong sut thời gian thực hiện kha lun.
Do hn chế v thời gian, điu kiện trang thiết b và phương tiện nghiên cứu,
kha lun này còn c nhiu thiếu st . Tôi rt mong nhn được sự gp  ca cc thy
cô, bn b đ kha lun được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 5năm 2013.
Sinh viên
Ngô Nguyễn Quỳnh Anh



MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đi cương v khng sinh 2
1.1.1.Lch sử nghiên cứu khng sinh 2
1.1.2. Đnh nghĩa khng sinh 2
1.1.3. Phân loi khng sinh 2
1.1.4. Cơ chế tc dụng ca khng sinh 3
1.1.5. Ứng dụng ca khng sinh 4
1.1.6. Sơ đồ tổng qut lên men sản xut kháng sinh 4

1.1.7. Khng sinh chng ung thư 4
1.1.8. Khi niệm v tính khng khng sinh 5
1.2.Đi cương v x khuẩn 5
1.2.1. X khuẩnvà sự hnh thành cht khng sinh t x khuẩn 6
1.2.2. Đặc đim ca x khuẩn chi Streptomyces 6
1.2.3.Phương php phân loi x khuẩn thuộc chi Streptomyces 7
1.3.Tuyn chọn, cải to và bảo quản ging x khuẩn 8
1.3.1.Chọn chng c HTKS cao bằng phép chọn lọc ngu nhiên 8
1.3.2. Đột biến cải to ging 8
1.3.3. Bảo quản ging x khuẩn 8
1.4. Lên men sinh tổng hợp khng sinh 9
1.4.1.Cc phương php lên men 10
1.4.3. Một s yếu t ảnh hưởng đến qu trnh lên men 10
1.5.Chiết tch và tinh chế khng sinh t dch lên men 10
1.5.1.Vai trò ca chiết tch và tinh chế khng sinh 11
1.5.2. Cc phương php chiết tch 11



1.6.Bước đu nghiên cứu cu trúc kháng sinh 11
1.6.1.Phổ tử ngoi - khả kiến 11
1.6.2.Phổ hồng ngoi 11
1.6.3. Phân tích khi phổ 12
1.6.4. Phổ cộng hưởng t ht nhân 12
1.7. Sàng lọc gen hot ha Streptomycesnâng cao hiệu sut sinh tổng hợp khng sinh
12
1.8. Qu trnh tiến ho ca một Dps cảm ứng c tính thm trong chi Streptomyces 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vt liệu và thiết b 14

2.1.1. Nguyên vt liệu 14
2.1.2. My mc thiết b 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.2.1.Chọn lọc, cải to ging 17
2.2.2.Lên men, chiết tch khng sinh ti ưu 17
2.2.3.Sơ bộ xc đnh một s tính cht ca khng sinh thu được 17
2.3. Phương php thực nghiệm 17
2.3.1.Nuôi cy và gi ging x khuẩn 17
2.3.2.Đnh gi hot tính khng sinh bằng phương php khuếch tn 18
2.3.3.Chọn lọc ngu nhiên 18
2.3.4. Đột biến bằng UV 19
2.3.5.Phương php đột biến ha học 20
2.3.6. Lên men chm tổng hợp khng sinh 21
2.3.7. Chiết khng sinh t dch lên men bằng dung môi hu cơ 22
2.3.8. Tch cc thành phn trong khng sinh bằng sắc k lớp mỏng 22
2.3.9.Thu khng sinh thô bằng phương php ct quay 23


2.3.10.Tinh chế khng sinh thô bằng sắc k cột 23
2.3.11. Sơ bộ xc đnh khng sinh tinh khiết thu được 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25
3.1. Kết quả sàng lọc ngu nhiên 25
3.2. Kết quả đột biến cải to ging ln 1 25
3.3. Kết quả đột biến cải to ging ln 2 26
3.4. Kết quả đột biến cải to ging ln 3 27
3.5. Kết quả chọn môi trường lên men chm 28
3.6. Kết quả chọn chng lên men 29
3.7. Kết quả chọn pH chiết 30
3.8. Kết quả sắc k lớp mỏng chọn hệ dung môi 31

3.9. Kết quả tch và tinh chế khng sinh 32
3.9.1. Kết quả sắc k cột ln 1 32
3.9.2. Kết quả sắc k cột ln 2 35
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nng chảy, đo phổ ca khng sinh tinh khiết 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40















DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ISP International Streptomyces Project
(Chương trnh Streptomyces quc tế)
B. subtilis Bacillus subtilis
P. mirabilis Proteus mirabilis
KS Kháng sinh
HTKS Hot tính khng sinh
MT Môi trường

MT2dt Môi trường dch th 2
ATCC American type culture collection
(Trung tâm gi ging quc gia M)
ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
VSV Vi sinh vt
MC Mu chứng
SLNN Sàng lọc ngu nhiên
ĐB1 Đột biến ln 1
ĐB2 Đột biến ln 2
ĐBHH Đột biến ha học
Gr(+) Gram dương
Gr(-) Gram âm
DMHC Dung môi hu cơ





DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Cc khng sinh tự nhiên và ứng dụng ca chng
Bảng 2: Cc vi khuẩn kim đnh.
Bảng 3: Cc môi trường nuôi cy x khuẩn.
Bảng 4: Cc môi trường nuôi cy VSV kim đnh.
Bảng 5: Các dung môi đ sử dụng.
Bảng 6: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngu nhiên.
Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến ln 1.
Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến ln 2.
Bảng 9: Kết quả thử HTKS đột biến ln 3.

Bảng 10: Kết quả chọn môi trường lên men chm.
Bảng 11: Kết quả chọn chng lên men.
Bảng 12: Kết quả chọn pH chiết.
Bảng 13: Kết quả chọn hệ dung môi chy sắc k(VSV kim đnh P. mirabilis).
Bảng 14: Kết quả chy sắc k cột ln 1.
Bảng 15: Kết quả sắc k lớp mỏng cc phân đon 1, 2, 3 (VSV kim đnh P. mirabilis).
Bảng 16: Kết quả chy sắc k cột ln 2 – nhóm 2.
Bảng 17: Kết quả sắc k lớp mỏng sau chy cột nhóm 2 (VSV kim đnh P. mirabilis).
Bảng 18: Kết quả chy sắc k cột ln 2 – nhóm 3.
Bảng 19: Kết quả sắc k lớp mỏng sau chy cột nhm 3.
Bảng 20: Kết quả IR.








DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hnh 1.1: Khng sinh được pht hiện qua cc năm.
Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế tc dụng ca cc họ khng sinh chính.
Hình 1.3: Sơ đồ tổng qut lên men sản xut khng sinh.
Hình 1.4: Hnh ảnh v VSV khng khng sinh.
Hình 1.5: Phân loi bộ Actinomycetales.
Hình 1.6: Cu trc khuẩn ty x khuẩn.
Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng pht trin ca x khuẩn.
Hình 1.8: Bản đồ v trí DPS trong s 17 nhiễm sắc th Streptomycetales.
Hnh 3.9: Kết quả chọn chng lên men chm tt nht

Hnh 3.10: Biu đồ kết quả chọn pH chiết với dung môi n - butanol.
Hình 3.11: Sắc k cột ln 1
Hình 3.12: Sắc k cột ln 2 - nhóm 2.
Hnh 3.13: Sắc k cột ln 2 - nhóm 3.
Hình P.14: Khuẩn lc x khuẩn sau 5 - 6 ngày.
Hình P.15: Đĩa cy zigzag sau 5 – 6 ngày.
Hình P.16: Kết quả thử HTKS đột biến ln 1 bằng phương php khi thch
(VSV kim đnh P. mirabilis).
Hình P.17: Hnh ảnh sau lên men chm tổng hợp khng sinh chng
Streptomyces156.11
Hình P.18: Kết quả thử hot tính khng sinh dch lên men sau lên men chm bằng
phương php giếng thch (VSV kim đnh P. mirabilis)
Hình P.19: Kết quả hiện hnh vi sinh vt (VSV kim đnh P. mirabilis).
Hình P.20: Phổ UV ca khng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp.
Hình P.21: Phổ IR ca khng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp.
Hình P.22: Phổ MS ca khng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp.





1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nhiệt đới nng ẩm với nn kinh tế đang pht trin, nằm trong
khu vực c tỷ lệ bệnh nhiễm trùng cao nên nước ta c nhu cu sử dụng khng sinh rt lớn.
Do nhiu nguyên nhân, tnh trng khng thuc ca vi sinh vt gây bệnh ngày càng diễn
biến phức tp và đang là mi lo ngi ca cả x hội, chng ta đ và đang phải đi mặt với
“kỉ nguyên hu khng sinh”. Tuy nhiên, hu hết cc khng sinh trên th trường dược phẩm

trong nước vn còn được nhp ngoi dưới dng nguyên liệu, bn thành phẩm hay thành
phẩm. Chính v vy, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xut khng sinh nước ta
là: một mặt cải tiến cc cht khng sinh c và pht trin công nghệ sản xut khng sinh,
mặt khc phải thc đẩy việc tm ra khng sinh mới. Đây là yêu cu tt yếu và cp thiết
trong công cuộc bảo vệ và chăm sc sức khỏe nhân dân.
Trong cc phương php sản xut khng sinh, bên cnh tổng hợp và bn tổng
hợp, phương php phân lp khng sinh t x khuẩn vn là con đường quan trọng đ tm
được cc chng c khả năng sinh tổng hợp khng sinh và t đ pht hiện hot cht mới.
Trong tổng s cc khng sinh đ được tm thy do x khuẩn tổng hợp th c tới 55% là t
Streptomyces. Bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đi học Dược Hà Nội đ nghiên cứu và
bước đu c kết quả với chi x khuẩn Streptomyces. Chính v vy, chng tôi lựa chọn đ
tài: “Gp phn nghiên cứu lên men tổng hợp khng sinh nhờStreptomyces156.11” làm
lun văn tt nghiệp với cc mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu cải to ging nâng cao năng sut sinh tổng hợp kháng sinh.
2. Lựa chọn môi trường và biến chng thích hợp cho quá trình lên men.
3. Tách chiết và tinh chế đ thu được kháng sinh tinh khiết.
4. Sơ bộ xc đnh cu trúc kháng sinh.




2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh

Cht khng sinh (antibiotic) trước đây gọi là cht khng khuẩn (antimicrobic) - là
thuc được con người dng ch yếu đ cha cc bệnh nhiễm khuẩn [21]. Cho đến nửa

sau thế kỷ XIX người ta đ xc đnh được vi sinh vt là nguyên nhân gây ra hàng lot
cc bệnh này. Do đ liệu php ho học nhằm vào vi sinh vt gây bệnh trở thành liệu
php điu tr chính.
Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Flemming đ tnh cờ pht hiện
hiện tượng nm mọc trên đĩa và quanh tảng nm đ là nhng vòng diệt khuẩn. Năm
1929, ông công b penicillin trước công chng.Năm 1938, Howara Walter Florey và
Ernst Boris Chaen đ chiết xut được penicillin.Năm 1942, penicillin được p dụng
vào điu tr.Ngay sau đ, penicillin đ trở thành một khng sinh nổi tiếng v đ cứu
sng hàng triệu chiến binh trong chiến tranh thế giới II.T nhng năm 1940 đến cui
nhng năm 1960, nhiu khng sinh mới được tìm ra và thời kỳ này được coi là một giai
đon vàng son ca việc nghiên cứu khng sinh. Năm 1944, streptomycin được pht
hiện t vi khuẩn đt Streptomyces griseus[21].Sau đ đến chloramphenicol,
tetracycline, các kháng sinh nhóm macrolid và glycopeptides được tm ra (tham
khảo phụ lục – hình 1.1). Việc cải tiến trong tng lớp khng sinh tiếp tục thu được
nhiu khng sinh phổ rộng hơn, hot tính khng vi sinh vt cao hơn, như cc khng
sinh họ β – lactam Cng với việc tm ra nhng khng sinh mới, công nghệ lên men
sản xut khng sinh cng ra đời và dn hoàn thiện. Con đường tổng hợp và bn tổng
hợp cng dn pht trin.
Việc pht hiện và pht trin khng sinh ca thế kỷ XX đ làm giảm đng k tỷ lệ tử
vong do nhiễm khuẩn. Song t nhng năm 1980, nhng khng sinh mới được pht hiện
và đưa vào điu tr giảm hẳn do chi phí qu lớn. Đồng thời, vi sinh vt nhanh khng
thuc và tc độ đ li nhanh hơn tc độ tm ra thuc mới ca con người. V vy, việc

3

p dụng cc k thut sinh học phân tử, k thut dung hợp tế bào, ti to gen là rt
quan trọng đ gip con người tm ra cc chng c HTKS cao và pht hiện cc loi
khng sinh mới [10].
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh

Theo quan niệm truyn thng, khng sinh là nhng sản phẩm đặc biệt nhn được
t vi sinh vt hay cc nguồn tự nhiên khc c hot tính sinh học cao, c tc dụng km
hm hoặc tiêu diệt một cch chọn lọc lên một nhm vi sinh vt xc đnh (vi khuẩn,
nm, nguyên sinh động vt, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thp [3, 5].
Hiện nay, khng sinh được đnh nghĩa là nhng cht c nguồn gc vi sinh vt,
được bn tổng hợp hoặc tổng hợp ha học. Với liu thp c tc dụng km hm hoặc
tiêu diệt VSV gây bệnh [1]
1.1.3. Phân loại kháng sinh

Khng sinh c th phân loi theo nhiu cch, theo nguồn gc, theo cu trc ho học,
theo cơ chế tc dụng, theo đích tc dụng
Phân loi khng sinh theo cu trc ha học thường chia ra làm cc nhm chính sau đây
[1]:
1. Cc khng sinh c cu trc β-lactam (penicillin, cephalosporin)
2. Cc khng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)
3. Cc khng sinh c cu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)
4. Cc khng sinh c cu trc 4 vòng (tetracyclin)
5. Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)
6. Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)
7. Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)
8. Cc khng sinh nhm antracyclin chng ung thư (daunorubicin)
9. Cc khng sinh nhm actinomycin chng ung thư (actinomycin D).
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh


4

Khng sinh c một hay nhiu đích tc dụng trong tế bào vi sinh vt mn cảm, tuy
nhiên c th khi qut thành 5 nhm khng sinh theo đích tc dụng chính (tham khảo
phụ lục – hình 1.2) [1].

1. Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn:β -lactam, vancomycin, bacitracin
2. Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: amphotericin, polymicin
3. Ức chế tổng hợp acid nucleic: quinolon, rifampicin
4. Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: chloramphenicol,
tetracyclin, macrolid
5. Ức chế chuyển hóa: co-trimoxazol.
1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh
 Trong lĩnh vực y học:
- Khng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến đ điu tr và phòng các bệnh
nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điu tr ung thư, chng nm.
 Lĩnh vực khác:
- Trong chăn nuôi: Khng sinh cng được dùng đ điu tr bệnh do vi sinh vt gây
ra trên động vt. Ví dụ: Griseoviridin dung điu tr bệnh viêm phổi cp, viêm vú
ca trâu bò
- Trong trồng trọt: Kháng sinh có th diệt nm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây
trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin [3], [12]
1.1.6. Sơ đồ tổng quát quy trình lên men sản xuất kháng sinh
Cc bước cơ bản trong quá trình lên men t x khuẩn được th hiện ở hình 1.3 phn
phụ lục. [3], [4], [8].
1.1.7. Kháng sinh chống ung thư

Ở sinh vt bc cao, mi tế bào có chức năng nht đnh được thực hiện trong mi tương
tác/liên hệ với các tế bào khác. Khi gặp điu kiện bt thường, tế bào mt liên hệ với các
tế bào xung quanh và phân chia không ngng to thành cu trúc khi u hay ung thư.
Ung thư được điu tr bằng một trong ba liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp cùng

5

phu thut đ loi bỏ khi u, chiếu x đ phá huỷ chọn lọc các tế bào ung thư hoặc hoá
tr. Nhiu cht hoá học dùng trong hoá tr liệu ung thư là sản phẩm bc hai mà vi sinh

vt sinh ra do đ được gọi là kháng sinh chng/ khng ung thư. Một s nhóm kháng
sinh đ được dng trong điu tr ung thư là anthracycline, actinomycin, bleomycin và
đt được nhng kết quả khả quan.[16], [23]
1.1.8. Khái niệm về tính kháng kháng sinh

Kháng thuc là hiện tượng vi sinh vt mt đi tính nhy cảm ban đu ca nó trong một
thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng ca kháng sinh hay hóa tr liệu [22].

Hình 1.4: Vi khuẩn kháng kháng sinh
Có 2 kiu kháng thuc: kháng thuc tự nhiên và kháng thuc mới nhn. Kháng thuc
tự nhiên là đặc trưng ca tng nòi sinh vt nht đnh đi với một s kháng sinh nht
đnh nào đ. Khng thuc mới nhn có th do thay đổi tính thm thành tế bào, do các
enzyme vô hiệu ha khng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hot ha cc con đường
trao đổi cht thay thế khác mà hot cht không tác dụng. [5]
1.2. Đại cương về xạ khuẩn

1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

X khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn tht (Eubacteria)có cu to dng sợi
phân nhánh. Chúng phân b rộng ri và đa dng trong đ đa s sinh trưởng hiếu khí và
to khuẩn ty phân nhnh tương tự như nm. Tên x khuẩn bắt nguồn t tiếng Hy Lp

6

“actys” (tia) và “mykes” (nm).Đa s x khuẩn có nguồn gc t đt. Trong mi gam
đt nói chung có tới hàng triệu x khuẩn [5].
Streptomyces là chng phổ biến, chiếm tới 95% các chng phân lp được.X khuẩn có
th được phân lp t nước ngọt nhưng mt độ hiện diện thp hơn. Cc ging phổ biến
là Actinoplanes, Micromonospora Nhiu ging x khuẩn đ được phân lp t nước
bin và trm tích bin bao gồm Streptomyces, Mocrobispora [22]

X khuẩn tổng hợp được nhiu cht có giá tr, đặc biệt là kháng sinh.Chúng sản sinh
một lượng lớn cht kháng sinh với nhng cu trúc hóa học đa dng. [3]
Kháng sinh là sản phẩm cui cùng ca quá trình chuyn hóa, được tích ly bên trong tế
bào (nội bào) hay phng thích ra ngoài môi trường (ngoi bào).Các chng x khuẩn
cùng loài có th sản sinh các kháng sinh khác nhau, mặt khác, các chng thuộc các loài
khác nhau có th sản xut cùng một loi kháng sinh. Bảng 1 phn phụ lục đưa ra một
s kháng sinh do x khuẩn tổng hợp và ứng dụng ca chúng.[13]
Tp hợp một nhóm x khuẩn phát trin riêng rẽ to thành khuẩn lc.Khuẩn lc x
khuẩn thường có dng thô ráp, dng phn, không trong sut, có các nếp gp toả ra theo
hình phóng x, đồng tâm hay chia thuỳ. Với hệ sợi phát trin, phân nhánh mnh và đa
s không c vch ngăn (chỉ tr cung bào tử khi hình thành bào tử). Kích thước và
khi lượng hệ sợi thường không ổn đnh và phụ thuộc vào điu kiện sinh lý và nuôi cy
(khoảng t 0,3µm đến 2-3µm).Đ hiu rõ hiu sự
đa dng ca x khuẩn, hình 1.5 phn
phụ lục giới thiệu phân loi bộ Actinomycetales.
[5]
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces
Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomytaceae, bộ Actinomycetales.
Trong tổng s cc khng sinh đ được tìm thy do x khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là
t Streptomyces[8].
Dưới đây là cc đặc đim thường thy ở x khuẩn Streptomyces:
Đặc điểm hình thái:Streptomyces phát trin thành dng sợi, sợi nhỏ, dài. Mng lưới
phân nhánh ca th sợi thường phát trin ở cả b mặt cơ cht rắn (to thành hệ sợi khí

7

sinh) ln bên trong to thành hệ sợi cơ cht.Hệ sợi chia làm 2 loi là khuẩn ty cơ cht
và khuẩn ty khí sinh [5].

Hình 1.6: Cấu trúc khuẩn ty của xạ khuẩn

cp – tế bào chất; cm – màng tế bào chất; cw – thành tế bào; me – mezoxom; se – vách
ngăn; ri – riboxom; re – chất dự trữ
Đặc điểm cấu tạo: Cu to ca Streptomyces chia làm ba phn: thành tế bào, màng tế
bào cht, tế bào cht. Trong đ thành tế bào x khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I,
có chứa L – diaminopimelic acid ( L –ADP ) và glycin.
Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là VSV d dưng và hô hp hiếu khí. Nhiệt độ phát
trin t 20-40°C (thích hợp là 26-32°C), pH thích hợp là 6,8-7,5. Nguồn hydratcacbon
như tinh bột, glucose Nguồn nitơ như mui nitrat, amoni
Sắc t to thành t Streptomyces được chia thành bn loi: sắc t hòa tan, sắc t ca
khuẩn ty cơ cht, sắc t ca khuẩn ty khí sinh (màu sắc ca b mặt khuẩn lc), sắc t
melanoid.
1.2.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces

- Qua đặc điểm hình thái: khóa phân loi ISP được sử dụng làm bảng phân loi
chính đ phân loi các x khuẩn thuộc chi Streptomyces dựa trên cc đặc đim: màu
khuẩn lc, màu khuẩn ty cơ cht, hình dng chui bào tử và b mặt bào tử, khả năng
to sắc t melanoid, sắc t hòa tan, khả năng tiêu thụ các nguồn đường. [5]
- Bằng sinh học phân tử: tách chiết ADN; phản ứng PCR, giải trình tự 16S rADN và
phân tích cây chng loi phát sinh. [8]

8

1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên
Các vi sinh vt c sự biến d tự nhiên theo tn s khc nhau trong ng ging thun
khiết, c c th c hot tính khng sinh tăng lên 20 - 40 % so với nhng c th khc.
Chọn ly c th c hot tính cao nht trong ng ging đ nghiên cứu tiếp.[3]
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên cc c th c HTKS cao chỉ đ nghiên cứu ban
đu, n không c gi tr p dụng vào sản xut. Đ thu được nhng chng c khả năng
siêu tổng hợp khng sinh, người ta p dụng cc phương php đột biến nhân to.[3],

[15]
1.3.2. Đột biến cải tạo giống
Cc tc nhân gây đột biến c th được chia làm 3 nhm:
- Tc nhân ha học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO
2
), hydroxylamin,
dimethylsulphat…
- Tc nhân vt l: Ánh sng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tc nhân vt l
hay được dng nht là nh sng tử ngoi (UV).
- Tc nhân sinh học: Tc nhân sinh học biến đổi gen.
Cc tc nhân vt l và ha học với liu lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hu
hết cc vi sinh vt. Nhng c th nào còn sng st sẽ c sự đột biến gen, làm thay đổi
các tính trng dn đến hoặc làm mt khả năng to khng sinh (đột biến âm) hoặc làm
tăng hiệu sut sinh tổng hợp khng sinh lên nhiu ln (đột biến dương) [8, 15]
Đặc biệt, hiệu quả ca đột biến UV chu tc động ca cc nhân t: khoảng thời
gian gia lc chiếu x và ln sao chép tiếp theo ca ADN, mức độ tổn thương ADN,
hot tính enzyme sửa cha trong tế bào x khuẩn [15]
Đ to ra cc chng c hiệu sut sinh tổng hợp khng sinh cao phải tiến hành đột biến
bc thang, kết hợp cc phương php di truyn phân tử như ti tổ hợp đnh hướng cc
gen, k thut tch dòng gen, k thut to và dung hợp tế bào trn.[3]
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn

9

Bảo quản gi ging VSV là công việc cn thiết do cc ging rt dễ b thoi ha, nhm
ln, mt mt nếu không được lưu gi một cch khoa học [3].
Thông thường, c th sử dụng 4 phương php sau đ bảo quản cc chng VSV: cy
chuyn (bảo quản trong lọ hoặc ng môi trường ở 2°C, đnh kỳ cy chuyn sang môi
trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với gi mang và làm khô ở nhiệt độ phòng),
đông khô (phân tn tế bào VSV trong MT cht bảo quản rồi đông lnh, làm khô mu

đông lnh), đông lnh (huyn dch tế bào trong cht bảo quản được đông lnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thp) [8]
Đ gi ging x khuẩn trong phòng thí nghiệm, cch đơn giản nht là nuôi cy x
khuẩn trên môi trường thch nghiêng thích hợp, ct ng thch nghiêng trong t lnh ở
2°C và đnh kỳ 3 – 6 thng cy li 1 ln [3].
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Lên men là qu trnh trao đổi cht sinh học được tiến hành do hot động ca vi sinh vt
nhờ sự xc tc ca cc enzyme với mục đích cung cp năng lượng và cc hợp cht
trung gian cho chúng [3].
Khng sinh là sản phẩm trao đổi bc hai, được to thành gn vào lc kết thc qu
trình sinh trưởng cavi sinh vt, thường vào gn hoặc vào chính pha cân bằng.

Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn.
1.4.1. Các phương pháp lên men

10

- Phương pháp lên men bề mặt: MT dng trong phương php này ở th rắn hay
th lỏng ty loài VSV. VSV hp thu dinh dưng t MT và sử dụng oxi không khí đ hô
hp trên b mặt MT. Phương php này tuy c ưu đim là thao tc đơn giản, không đòi
hỏi thiết b qu tân tiến nhưng li c nhược đim là tn mặt bằng, hiệu sut sử dụng
môi trường thp, kh tự động ha. Do đ, ngày nay chỉ sử dụng phương php lên men
b mặt trong chọn ging và gi ging.[3]
- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, pht trin cả 3
chiu nên khắc phục được tt cả cc nhược đim k trên ca lên men b mặt nhưng đòi
hỏi đu tư trang thiết b ban đu lớn. [3], [7]
1.4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
-pH môi trường: ảnh hưởng đến qu trnh lên men c th do tc dụng trực tiếp
ca cc ion H

+
hay OH
-
đến tính cht keo ca tế bào, hot lực ca enzyme hoặc là tác
dụng gin tiếp.
- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nht thời sẽ ph v trao đổi cht
trong tế bào. V thế, phải cung cp oxy sao cho tc độ hòa tan oxy bằng tc độ sử dụng
oxy ca VSV. Đi với nhiu VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tc độ sinh trưởng, rt
ngắn pha tiếm pht. Bên cnh đ, nhu cu oxy ca VSV trong cc giai đon sinh
trưởng cng không ging nhau: trong thời kỳ đu, sinh khi còn ít tc độ hòa tan oxy
lớn nên thông khí mnh là tt.[3]
Như vy, trong sản xut, cn nghiên cứu cụ th ảnh hưởng ca cc yếu t tới
qu trnh lên men đ c th ti ưu ha qu trnh này nhằm to điu kiện thun lợi nht
cho sinh tổng hợp cht mong mun.[3], [7]
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đây là giai đon c vai trò rt quan trọng bởi v sản phẩm thu được sau qu trnh lên
men thường không bn vng, hàm lượng khng sinh trong dch lên men thường
thp.[3], [12]

11

1.5.2. Các phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng
-Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ không đồng tan:chuyn khng sinh
cn tch (đang hòa tan trong dch lọc) sang pha dung môi hu cơ.
- Tinh chế sản phẩm với mục đích thu lấy KS tinh khiết. Phương pháp sắc ký:
+ Sắc k lớp mỏng: Là phương php tch cc cht trong hn hợp dựa trên khả
năng b hp phụ (là ch yếu) khc nhau ca chng trên cc b mặt một cht rắn (cht
hp phụ). Cht hp phụ ở đây được trng đu thành một lớp mỏng trên gi đ.Đi
lượng đặc trưng cho mức độ di chuyn ca cc cht phân tích là hệ s R

f
.
+ Sắc k lỏng trên cột: Là phương php tch xc đnh cc cht dựa trên sự phân
b khc nhau ca cc cht gia hai pha: pha tĩnh là cht lỏng bao bọc to thành tm
phim màng mỏng trên b mặt một cht rắn (gọi là cht mang c c ht nhỏ) được nhồi
vào cột, pha động là dung môi thm qua toàn bộ b mặt pha tĩnh [13], [20]
1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1. Phổ tử ngoại - khả kiến
Cc bức x UV-VIS c năng lượng kh lớn nên c khả năng làm thay đổi mức năng
lượng ca cc electron t trng thi cơ bản lên trng thi kích thích. Gia cu trc ha
học ca phân tử cht cn nghiên cứu với quang phổ hp thụ c mi quan hệ chặt chẽ
(Ví dụ: Nhng phân tử nào càng c nhiu liên kết đôi th sự hp thụ càng chuyn v
bước sng dài hơn, đặc biệt là cc hệ liên hợp). Cc phân tử c đặc đim: ni đôi liên
hợp, nhân thơm, d t N, S, O c khả năng hp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS.
1.6.2. Phổ hồng ngoại
Năng lượng ca bức x hồng ngoi không đ lớn đ làm thay đổi trng thi năng
lượng ca electron mà chỉ đ đ thay đổi trng thi dao động ca phân tử [2].
Phổ IR được sử dụng đ pht hiện cc nhm chức đặc biệt trong phân tử.Mi bước
sng hp phụ cực đi trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhm chức.
1.6.3. Phân tích khối phổ

12

Khi phổ là k thut đo trực tiếp tỷ s khi lượng và điện tích ca ion (m/z) được to
thành trong pha khí t phân tử hoặc nguyên tử ca mu. Dng chm điện tử c năng
lượng trung bnh (50-100eV) đ bắn ph phân tử hu cơ ở chân không cao (10
-
6
mmHg). Trong qu trnh đ cht hu cơ b ion ha và b ph v thành mảnh. Các tín
hiệu thu được tương ứng với cc ion sẽ th hiện bằng một s vch (pic) c cường độ

khc nhau tp hợp thành một khi phổ đồ [6].
Dựa vào khi phổ có th đnh tính (khi lượng phân tử, nhn dng các cht) xc đnh
cu trc và đnh lượng các cht [2].
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng t ht nhân hiện nay là k thut ưu việt và triệt đ nht trong phân
tích, biện giải toàn bộ phổ [13]
Phổ cộng hưởng t ht nhân là sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do sự phụ
thuộc cường độ tín hiệu theo t trường H hay tn s µ ca t trường biến thiên. Biện
giải phổ phụ thuộc các yếu t sau: độ chuyn dch hóa học (v trí tín hiệu cộng hưởng),
tương tc spin – spin và độ dch chuyn dưới tín hiệu.
1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh. [24]
Sự biu hiện ca cc cụm gen chuyn ha thứ cp trong Streptomycetes được điu
khin bởi gen hot ha. Tăng s lượng bản sao làm tăng sản xut khng sinh hoặc kích
hot cc cụm gen câm. Đặc tính này đ được sử dụng cho cc nhân bản ca abaA,
afsQ1/Q2, afsR t Streptomycescoelicolor và afsR2from Streptomyces lividans làm
tăng sinh tổng hợp KS. Đ to ra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064
(NRRL3585) thư viện gen ca 2.400 cosmids (kích thước trung bnh là 33 kb, ~ 10
gen) trong Escherichia coli và sau đ chuyn cc bản sao trực tiếp đến S. lividans đ
kim tra khả năng sinh khng sinh. Ngoài ra, đưa pUZ8002 plasmid vào vi khuẩn E.
coli XL1-Blue MR đ sản xut dòng XLUZ. pUZ8002 huy động oriT-plasmid c hiệu
quả t E. coli. XLUZ như cc my ch nhân bản đ xây dựng cc thư viện gen S.

13

clavuligerus. Sử dụng pJTU2554 tích hợp (attP φC31) cos oriT vector làm vector nhân
bản. Cc dòng vô tính ca thư viện di truyn c th được huy động vào S. lividans trực
tiếp, mà không c một bước chuyn đổi DNA bổ sung.Cc chng vi khuẩn E. coli c
chứa cc clavuligerus cosmids S. được nuôi cy. Trong đ, tm thy exconjugants 4%

đ được kích hot bởi cc dòng vô tính cosmid giới thiệu. Tt cả 105 cosmids li được
đưa vào S. lividans bằng cch tiếp hợp, và xc nhn rằng sản xut khng sinh là do
cosmids mà không phải do đột biến tự pht.
1.8. Quá trình tiến hoá của một protein nhị nguyên (Dps) cảm ứng có tính thấm
trong chi Streptomyces. [25]
Protein nh nguyên(Dps) c mặt ở hu hết trong hệ gen vi khuẩn, và hiện ti người ta
đnh gi cao sự phản ứng đa dng ca chng khi b kích thích. Nghiên cứu trước đây
chỉ ra rằng nhm protein này to thành cc dodecamer (th nh thp) và cu trc bc 4
c chức năng quan trọng.
Hơn na, tỷ lệ Dps trong toàn bộ hệ gen c th thay đổi, thm chí ở cc loài c
mi quan hệ chặt chẽ, song chi tiết này vn chưa được lí giải thoả đng.Hình 1.8 phn
phụ lục đưa ra bản đồ v trí Dps trong s 17 nhiễm sắc th Streptomycetales
. Chúng tôi
xây dựng li lch sử tiến ho c th nht ca Dps trong hệ gen Streptomyces. Thông
thường cc vi khuẩn m ho cho nhiu hơn một gen Dps. Sự thay đổi v s lượng ca
Dps c th do lặp đon, mt đon hay thêm đon. Nghiên cứu cho rằng bộ gen ca

S. coelicolor m ho cho 3 Dps bao gồm một Dps không đuôi. Thí nghiệm invivo cho
thy một Dps kém pht trin hơn hai Dps còn li, không dễ nhn ra oligomerise. Các
vng khởi động (promoter) biu hiện gen nhân đôi Dps cho thy cặp gen paralogous là
khc biệt, sự tương quan này chỉ ra sự xut hiện ca cc vng khởi động sigB. Cui
cng, chng tôi tm ra một nhm mới ca Dps và đi diện ca cc protein này trong S.
coelicolor với cu trc bc 4 dodecamer tính ổn đnh cao.


14

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: chng Streptomyces 156.11do Bộ môn Vi sinh – Sinh học
trường Đi học Dược Hà Nội phân lp t mu đt trồng trọt ti min Bắc.
 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cp, được trnh
bày ở bảng 2.
Bảng 2: Các vi khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gr(+)
Vi khuẩn Gr(-)
Bacillus subtilis ATCC 6633
Proteus mirabilis BV 108
 Môi trường
-Cc môi trường nuôi cy x khuẩn: thành phn cc MT được trnh bày ở bảng 3.
- Các MT lên men (MTdt): C thành phn tương ứng MT nuôi cy x khuẩn nhưng
loi bỏ thch.
- Cc MT nuôi cy VSV kim đnh: thành phn cc MT được trnh bày ở bảng 4.
Chú ý: Cc MT nuôi cy x khuẩn, MT lên men và MT nuôi cy VSV kim đnh đu
được tiệt trng ở 118 – 120°C trong 30 phút
Bảng 3: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phn
Đơn v
MT1
MT2
MT5
Tinh bột
g
2
2
2,4
Glucose
g

1
Cao tht
g


0,3
Pepton
g


0,3
KNO
3

g
0,1


KCl
g

0,05

NaNO
3

g

0,2

15

CaCO
3

g


0,4
FeSO
4
.7H
2
O
g
0,01


K
2
HPO
4

g
0,05
0,1

MgSO

4
.7H
2
O
g
0,05
0,05

NaCl
g
0,05


Thch
g
1,8
2
2
Nước
ml
100
100
100
pH
6,8 – 7,2
Bảng 4: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phn
NaCl
Cao tht
Pepton

Thch
pH
%
%
%
%
MT canh thang
0,5
0,3
0,5
0
7,0 – 7,4
MT thch thường
0,5
0,3
0,5
1,8
 Dung môi: Bảng 5 giới thiệu cc dung môi sử dụng trong nghiên cứu.
Bảng 5: Các dung môi đã sử dụng
Dung môi
Khi lượng riêng (g/ml)
Nhiệt độ sôi (°C)
Aceton
0,79
56
Acetonitril
0,782 – 0,783
80 – 82
n – butanol
0,81

116 – 118
Butylacetat
0,880 – 0,885
117 – 118
Cloroform
1,470 – 1,480
60 – 62
Diclorometan
1,32
40
Ethanol
0,789 – 0,791
78,3
Ethylacetat
0,889 – 0,901
70,4
NH
4
OH 25%
0,880

Methanol
0,791 – 0,793
64,5