Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 168.27

NGUYỄN THỊ KIM VUI

GÓP PHẦN
STREPTOMYCES 168.27





- 2013



BỘ Y TẾ




NGUYỄN THỊ KIM VUI



GÓP PHẦN
STREPTOMYCES 168.27

: ThS. Nguyễn Liên Hương
:




- 2013


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành tại bộ môn Vi sinh & Sinh học, trường Đại
học Dược Hà Nội.
, động viên và giúp đỡ
từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện khóa luận này.
-
-
.
.
.
.
!
5 năm 2013.
Sinh viên
NGUYỄN THỊ KIM VUI

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh 2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2
1.1.3. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh 2
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh 3
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn(Actinomycetes) 3
1.2.1. Đại cương về xạ khuẩn 3
1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 4
1.3. Sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. 5
1.3.1. Sự hình thành các chất kháng sinh ở xạ khuẩn 5
1.3.2. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 5
1.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 6
1.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 7
1.4.1. Mục đích 7
1.4.2. Sàng lọc ngẫu nhiên 7
1.4.3. Đột biến cải tạo giống 8
1.4.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 9
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9
1.5.1. Khái niệm lên men 9
1.5.2. Các phương pháp lên men 10
1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10
1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 11
1.6.1. Chiết xuất 11
1.6.2. Tách, tinh chế sản phẩm: 11
1.7. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12
1.7.1. Phổ tử ngoại 12
1.7.2. Phổ hồng ngoại 13

1.7.3. Khối phổ (MS) 13
1.8. Các nghiên cứu liên quan: 13
1.8.1. Điều chỉnh sinh tổng hợp daunorubicin từ S.peucetius –phản hồi và dự tính kiểm soát phiên
mã 13
1.8.2. Sự xuất hiện và sinh tổng hợp C-demethylactinomycin (C-DMA) từ S.chrysomallus và
S.parvulus sinh actinomycin 14
1.8.3. Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của actinomycete phân lập từ chất lắng ở biển 15
CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 16


2.1.1. Nguyên vật liệu 16
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ 17
2.2. Nội dung nghiên cứu 18
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm 18
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 18
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 18
2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên 20
2.3.4. Đột biến 20
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21
2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 22
2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 22
2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 23
2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 24
2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 24
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 24
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 25
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 25
3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 26
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 27

3.4. Kết quả đột biến hóa học 28
3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30
3.6. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt của kháng sinh trong dịch lọc 31
3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết 32
3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 33
3.9. Kết quả sắc ký cột 34
3.9.1. Chạy cột sắc ký lần 1 34
3.9.2. Chạy cột sắc ký lần 2 36
3.9.3. Chạy cột sắc ký lần 3 39
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42


Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

ADN Acid 2’- deoxyribonucleic
B.subtilis Bacillus subtilis
CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên
CKS Chất kháng sinh
DMHC Dung môi hữu cơ
D
(mm) Đường kính vòng vô khuẩn
ĐB Đột biến
Gr(-) Gram âm
Gr(+) Gram dương
HTKS Hoạt tính kháng sinh
IR Hồng ngoại- Infrared
KH Khoa học
KS Kháng sinh
MC Mẫu chứng

MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
P.mirabilis Proteus mirabilis
s Độ lệch thực nghiệm hiệu chỉnh
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
TĐC Trao đổi chất
V Thể tích
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
UV Tử ngoại- Ultraviolet


Danh mục các bảng

Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên chủng
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1
Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2
Bảng3. 7: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học
Bảng 3.8: Kết quả chọn môi trường lên men
Bảng 3.9: Kết quả chọn biến chủng lên men chìm tốt nhất
Bảng 3.10: Kết quả thử độ bền của dịch lọc ở các pH khác nhau
Bảng 3.11: Kết quả thử độ bền nhiệt của kháng sinh
Bảng 3.12: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (P.mirabilis)
Bảng 3.13: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký
Bảng 3.14: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1
Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột (P.mirabilis)
Bảng 3.16: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2- nhóm 1 (2-8)

Bảng 3.17: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột phân nhóm 1.1
(P.mirabilis)
Bảng 3.18: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2- nhóm 3 (15-18)
Bảng 3.19: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột phân nhóm 3.2
(P.mirabilis)
Bảng 3.20: Kết quả SKLM sau chạy cột lần 3 (P.mirabilis)



Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn.
Hình 1.2: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh
Hình 1.3: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn
Hình 3.4: Pic sắc ký cột lần 1
Hình 3.5: Pic sắc ký cột lần 2 (nhóm 1)
Hình 3.6: Pic sắc ký cột lần 2 (nhóm 3)


1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cách đây hơn 70 năm, Penicillin – kháng sinh đầu tiên ra đời có khả năng
tiêu diệt vi khuẩn mạnh mẽ đã mở ra một tương lai lạc quan cho nhiều bệnh nhân
nhiễm khuẩn. Nhưng đến nay cuộc chiến giữa kháng sinh và vi khuẩn vẫn tiếp diễn,
nhiều loại vi khuẩn tưởng đã bị tiêu diệt từ lâu với kháng sinh chuyên trị nhưng giờ
đây vẫn còn hiện diện và đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh. Điều hết sức đáng
sợ trong những năm vừa qua là song song với việc phát hiện thêm các chủng vi
khuẩn siêu kháng thuốc thì tốc độ tìm ra các loại kháng sinh mới lại không hề theo

kịp tốc độ phát triển của các loại vi khuẩn.
Với sự gia tăng số lượng các ca tử vong do vi khuẩn kháng thuốc và mối đe
dọa của các loại “siêu vi khuẩn” có khả năng kháng lại hầu như mọi loại kháng sinh
là một trong những vấn đề gây lo ngại và trở thành mối quan tâm nghiên cứu của
những nhà khoa học. Phương pháp chủ yếu để tìm ra kháng sinh hiện nay vẫn là
phương pháp sinh học- các kháng sinh mới có thể được tổng hợp rất phong phú từ
vi khuẩn, xạ khuẩn hoặc nấm.
Đặc biệt nước ta với môi trường tự nhiên rất đa dạng là điều kiện thuận lợi
cho sự sinh sôi phát triển của hệ vi sinh trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó chi xạ khuẩn Streptomyces với khả năng
tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm nhất. Chính vì thế chúng tôi
lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
168.27” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau:
- Nghiên cứu cải tạo nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của
chủng Streptomyces 168.27.
- Nghiên cứu điều kiện lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh từ dịch lọc,
dịch lên men tối thích để thu kháng sinh tinh khiết.
- Sơ bộ xác định một số đặc tính của kháng sinh đã thu được.

2

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là tất cả những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có
tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như
cả với các tế bào ung thư) ở nồng độ thấp mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu
lên người, động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung [6, 18].
1.1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Có 5 kiểu chủ yếu [3,

18] :
• Ức chế tổng hợp vách tế bào VK làm VK bị tiêu diệt. Một số kháng sinh
như: β- lactamase, vancomycin, bacitracin, fosfomycin tác dụng theo cơ chế này.
• Tác động lên quá trình tổng hợp protein của VK:
– Gắn vào tiểu đơn vị 30S có tác dụng kìm khuẩn: Cloramphenicol,
tetracyclin, macrolid và lincosamid.
– Gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom làm tiêu diệt VK: Các
aminoglycosid, spectinomycin.
• Ức chế tổng hợp acid nucleic từ quá trình sao chép và phiên mã:
Actinomycin, antracyclin, rifampicin.
• Thay đổi tính thấm của màng: Polymycin, amphotericin.
• Kháng chuyển hóa: Co– trimoxazol (gồm sulfamethoxazol và
trimethoprim).
1.1.3. Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh
Những yêu cầu của y học đối với một kháng sinh là [6]:
• Kháng sinh phải không độc hoặc rất ít độc đối với cơ thể.
• Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh và mạnh đối với VSV gây bệnh.
• Dễ hòa tan trong nước và bền vững khi bảo quản lâu dài.
3

• Hoạt tính kháng khuẩn không bị giảm khi tiếp xúc với dịch cơ thể.
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh
• Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm
khuẩn, nhiễm nấm và một số bệnh ung thư [3].
• Trong lĩnh vực khác:
– Trong chăn nuôi: Kháng sinh để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin
điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như
chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng
trứng ở gà, vịt [6, 10].
– Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để xử lý hạt, đất trồng, kích

thích hạt nảy mầm và tiêu diệt nấm, các VK gây bệnh cho cây trồng (Validamycin
dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả) [6].
–
: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis
tạo ra) [6].
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn(Actinomycetes)
1.2.1. Đại cƣơng về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, phát triển dạng sợi phân nhánh
có tỷ lệ G+C>55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ
khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh. Do có thể sinh
tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được rất
nhiều các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu [10, 11]



4

1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh
có cấu trúc phức tạp [4]. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ
khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces [7].
• Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn
ty khí sinh, chuỗi bào tử [7, 9].
Đặc điểm hình thái xạ khuẩn được thể hiện ở hình 1.1

`Hình 1.1: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
• Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao.
Nguồn carbon thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều hợp chất hữu cơ khác.
Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là

muối nitrat, muối amoni…[6, 8]
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng
là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.
• Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4
loại:sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố
melanoid [9, 10].



5

1.3. Sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn.
1.3.1. Sự hình thành các chất kháng sinh ở xạ khuẩn
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Tuy nhiên, hầu
hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình
thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng. Mặc dù
CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình
sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định [12].
+ CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi
phản ứng enzym.
+ CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau.
+ CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ
cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
+ Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS
có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ
thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp
CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và
cofactor [12].
1.3.2. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh
Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn

được thể hiện trong hình 1.2 [6, 8].

6


1.2
1.3.3. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
Nhiệt độ: đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 -30
0
C, nhưng nhiệt
độ tối thích cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 25 – 28
0
C
[10, 12] .
Giống truyền ủ trong phòng thí
nghiệm
Bình nhân giống trong phòng thí
nghiệm
Bình nhân giống trên thiết bị nhân
giống
Bình lên men tạo kháng sinh
Dịch lên men
Dịch lọc
Sinh khối
Sinh khối thô
Dịch chiết sinh
khối
Sản phẩm tinh
chế
Dịch chiết

kháng sinh
Dịch chiết đậm
đặc
Sản phẩm tinh
chế
Sản phẩm đã kiểm
nghiệm
Sản phẩm được đóng
gói
7

pH môi trường: pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến
hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường. pH thích hợp cho sinh
tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axít đều ức chế quá trình tổng hợp
CKS [10,13].
Độ thông khí: Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các
VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của
quá trình nuôi cấy) [10, 12].
Tuổi giống: Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men,
mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Tuổi giống thích
hợp nhất là 36-72h. Lượng giống cấy truyền khoảng từ 2 - 10% [10, 12].
1.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.4.1. Mục đích
Các xạ khuẩn mới phân lập từ thiên nhiên thường có HTKS không cao, hiệu
suất sinh tổng hợp thấp. Do đó, để đáp ứng yêu cầu của nhà sản xuất công nghiệp
cần cải tạo giống VSV với mục đích khác nhau [17]:
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên
men, tạo ít bọt hơn…
- Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn.

- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết mới, nhóm chức
mới.
1.4.2. Sàng lọc ngẫu nhiên
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30 % so với những cá thể
khác. Tuy nhiên trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao để
nghiên cứu ban đầu, chưa có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng
có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến
nhân tạo [6, 17].
8

1.4.3. Đột biến cải tạo giống
Các loại đột biến: Đột biến điểm, đột biến đa điểm, đột biến trượt khung[16].
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm [7, 16]:
Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO
2
), hydroxylamin,
dimethylsulphat…
Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tác nhân vật
lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Ánh sáng tử ngoại gây đột biến
theo cơ chế: tác dụng lên acid nucleic mạnh nhất ở bước sóng 260 nm, gây hiện
tượng dime hóa Timin. Ở đây hai Timin đứng gần nhau liên kết cộng hóa trị với
nhau ở C4-C5, hậu quả dẫn đến sao chép bị sai lệch do ADN polymerase dễ lắp 1
nucleotid không chính xác vào vị trí bên. Do tác dụng của ánh sáng UV, trên sợi
ADN đồng thời cũng xuất hiện một dime Pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-
4. Ở đây C6 của Pyrimidin 5’ (Timin hoặc Cystorin) được liên kết với C4 của
Pyrimidin 3’ (thường là Cystorin). Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu gây
đột biến của ánh sáng UV. Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu,
thời gian chiếu, cường độ bức xạ.
Ánh sáng thường: sau khi đột biến bằng UV, nếu đem chiếu ánh sáng

thường thì có khoảng 50-80 % tế bào được phục hồi do tác dụng của enzym
photolyase. Hiện tượng này gọi là quang phục hoạt [16].
Tác nhân sinh học: Tác nhân transposon, phage M
4
,
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết
chết hầu hết các vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen,
làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến
âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến
dương). Cần chọn lọc ra những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu
tiếp [7].
9

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành
đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định
hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần [6, 7].
1.4.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không
bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ [17].
Hiện nay có nhiều phương pháp để bảo quản các chủng VSV như: cấy
chuyền, làm khô, đông khô, ổn định trong đất…
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi
cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong
tủ lạnh và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [13, 17].
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.5.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình phân giải hydratcarbon được tiến hành do hoạt động
của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và
các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng [15].
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc

quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha dừng [15].
Đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn nối
tiếp: pha lag, pha log, pha dừng và pha suy tàn, được thể hiện ở hình 1.3 [6, 7].

Hình 1.3: Đƣờng cong sinh trƣởng phát triển của xạ khuẩn
P
ha lag
P
ha log
Ph
a dừng

Ln(x)
10

1.5.2. Các phƣơng pháp lên men
Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn
hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không
khí để hô hấp trên bề mặt MT. Vì vậy yêu cầu của lên men bề mặt là bề mặt môi
trường phải rộng và lớp môi trường không quá sâu (2-10cm), trong quá trình lên
men cần quạt để tăng độ thoáng khí đồng thời phải giữ độ ẩm môi trường khoảng
60% (có trường hợp 90-100%) để tránh khô bề mặt môi trường [6, 7, 8].
Ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ
giống.
Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3
chiều. Chính vì thế mà sản phẩm thu được với hiệu suất cao trong môi trường dịch
thể. Với ư
. Tuy nhiên n
: đ , không thể xử lý cục bộ nếu hỏng đợt
lên men sẽ gây thất thu, tốn kém rất lớn [6, 7, 8].

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:
+ Lên men mẻ (lên men chu kỳ)
+ Lên men có bổ sung
+ Lên men liên tục
+ Lên men bán liên tục
1.5.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men
pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp
của các ion H
+
hay OH
-
đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là
tác dụng gián tiếp [8, 15].
Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử
dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí hợp lý sẽ làm tăng tốc độ sinh
trưởng, rút ngắn pha tiếm phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai
11

đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ
hòa tan oxy lớn nên thông khí tương đối mạnh là tốt [8, 15].
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi
nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [8].
1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng cần tách riêng kháng sinh khỏi các
tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định
dùng điều trị. Do vậy cần lựa chọn các kỹ thuật chiết tách, tinh chế thích hợp để thu
được sản phẩm có độ tinh khiết cao và hoạt lực kháng sinh mạnh [14].
1.6.1. Chiết xuất

Chiết xuất là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác (thường
dùng dung môi đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất hỗn hợp
cần nghiên cứu [6].
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào
nhau [6].
Khi chiết bằng dung môi hữu cơ thì dung môi phải thỏa mãn các yêu cầu sau
[6]:
- Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, ít độc, khó cháy.
- Có tính chọn lọc cao, hòa tan tốt hoạt chất, ít hòa tan tạp chất.
- Dễ cất thu hồi.
1.6.2. Tách, tinh chế sản phẩm:
Tách và tinh chế sản phẩm với mục đích thu lấy chất tinh khiết.
Sắc ký: Là phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn
hợp. Sự tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau trong
hệ hai pha không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động [14].
Phương pháp tách hay dùng trong nghiên cứu tổng hợp kháng sinh là sắc ký
lớp mỏng. Sắc ký lớp mỏng là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp
12

phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ). Pha
tĩnh trong bản mỏng sắc ký rất đa dạng gồm: chất hấp phụ, chất trao đổi ion, chất
rây phân tử và các dung môi khác nhau trên chất mang [1, 14].
Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số R
f
[1]: R
f
=
Trong đó:
o a là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm của vết.
o b là khoảng cách dung môi chạy.

o R
f
có giá trị từ 0 đến 1.
Kết quả đo R
f
phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cách tiến hành, tính chất hoạt
độ của chất hấp phụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường
chạy sắc ký, lượng chất chấm.
Tinh chế là quá trình tạo ra sản phẩm kháng sinh tinh khiết, phục vụ cho các
nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp hay dùng để tinh chế kháng sinh là sắc ký cột.
Trong phương pháp này, một cột chứa chất nhồi dùng làm pha tĩnh. Chất nhồi cột
có thể là Silicagel, Nhôm oxyd, Sephadex Đó đều là các chất đã chuẩn hóa để
đảm bào kích thước chuẩn. Dung môi trong phương pháp này là pha động. Dựa vào
kết quả thăm dò tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng để lựa chọn
hệ dung môi chạy sắc ký lỏng trên cột cho thích hợp [1].
1.7. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.7.1. Phổ tử ngoại
Các ánh sáng UV có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi mức
năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa cấu
trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ
chặt chẽ. Các phân tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả
năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV [2, 20].


13

1.7.2. Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái
năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử. Phổ
IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước sóng

hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức [1, 20].
1.7.3. Khối phổ (MS)
Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu
cơ ở chân không cao (10
-6
mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị
phá vỡ thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng
một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ. Nó cung
cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc
và định lượng các chất [20].
1.8. Các nghiên cứu liên quan:
1.8.1. Điều chỉnh sinh tổng hợp daunorubicin từ S.peucetius –phản hồi và dự
tính kiểm soát phiên mã
Streptomyces là nhóm vi khuẩn đất quan trọng, sản xuất ra các hợp chất có
tác dụng sinh học như kháng sinh. Daunorubicin là tác nhân chữa một số bệnh ung
thư, là chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất từ S.peucetius. Do tầm quan trọng
của daunorubicin trong điều trị ung thư, sự hiểu biết về cơ chế phân tử của việc sinh
tổng hợp ra nó sẽ góp phần tìm hiểu di truyền học của dãy để có hiệu suất cao hơn.
Thêm nữa, sự hiểu biết này có thể được áp dụng để thiết kế các kháng sinh lai có
thế được thực hiện invivo nhờ chuyển các gene từ loài Streptomyces này sang loài
khác [22].
Sinh tổng hợp của daunorubicin ở S.peucetius được hoàn thành bởi chức
năng của 30 gene mã hóa enzym theo một kiểu phối hợp chuỗi. Ngoài những enzym
trên, 3 chất điều chỉnh phiên mã DnrO, DnrN và Dnrl điều chỉnh quá trình nhiều
14

bước này bằng cách tạo ra một mạch điều chỉnh đường vòng đoán trước thông suốt,
có thể hoàn toàn kiểm soát các gene mã hóa enzym. Vì daunorubicin là thuốc có

khả năng xen giữa ADN, việc duy trì nồng độ thuốc tối ưu trong nội bào là việc
then chốt để ngăn ngừa sự tự gây độc. Khi bắt đầu của sinh tổng hợp daunorubicin
cũng là lúc hoạt hóa cơ chế feedback được thực hiện bởi chất chuyển hóa. Khi nồng
độ trong nội bào vượt quá mức, daunorubicin xen giữa vào chuỗi DNA và ngăn cản
sự gắn của các nhân tố phiên mã. Sự kiềm chế feedback này được giảm bớt bởi một
nhóm các gene tự kháng, điều này đồng thời làm nồng độ daunorubicin cao trong
nội bào thoát ra. Bài báo này thảo luận chức năng cơ chế của mỗi nhân tố phiên mã
và sự tác động lẫn nhau của chúng trong việc bắt đầu và duy trì sinh tổng hợp
daunorubicin ở S.peucetius [22]
1.8.2. Sự xuất hiện và sinh tổng hợp C-demethylactinomycin (C-DMA) từ
S.chrysomallus và S.parvulus sinh actinomycin
Streptomyces chrysomallus và Streptomyces parvulus sản xuất C-DMA mới
bên cạnh actinomycin thông thường của nó khi được cung cấp 3-hydroxyanthranilic
acid (3-HA) [19].
Trong trường hợp C-DMA thiếu 1 nhóm methyl, sự ngưng tụ được đặc thù
hướng phần 3-HA vào phía α của chất mang màu phenoxiazino. Ngạc nhiên là, C-
DMA (0,8%) cũng được tìm thấy trong hỗn hợp actinomycin của môi trường
streptomyces không được bổ sung sau thời gian cấy dài, điều đó chỉ ra sự hiện diện
tự nhiên của 3-HA. Khi cung cấp 3-hydroxykynurenine (3-HK) cũng tạo ra C-
DMA, chứng tỏ rằng 3-HK là nguồn của 3-HA [19].
Phân tích các chất chuyển hóa tryptophan trong nội bào của streptomyces, sử
dụng 5-(3)H-tryptophan là chất phóng xạ đánh dấu, phát hiện ra sự hình thành 4-
MHA, nhưng không có 3-HA. Điều đó cho thấy rằng 3-HK nội bào phần lớn được
chuyển hóa thành 3-hydroxy-4-methylkynurenine (4-MHK), tiền chất trực tiếp của
4-MHA. Mặc dù vậy, lượng nhỏ 3-HK có được từ con đường tạo ra 4-MHA có thể
đã được chuyển hóa thành 3-HA trong suốt quá trình nuôi cấy của streptomyces, từ
đó tạo ra C-DMA tự nhiên [19].
15

1.8.3. Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của actinomycete phân lập từ chất

lắng ở biển.
Trong nghiên cứu này, ADN được phân lập và vùng ITS của 16s rARN được
khuếch đại bởi phản ứng chuỗi polymerase, sử dụng 2 prime vi khuẩn quốc tế:
1492R (5'-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3') cùng với Eubac27F (5'-
AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'). Sản phẩm khuếch đại được làm tinh khiết
bởi bộ kít mini TIANgel, gắn với vector đơn MD18-T (TaKaRa), và vận chuyển tới
các tế bào khả biến của E.coli DH5α. Mảnh gene 16S rRNA được tạo chuỗi nhờ
primer chuyển tiếp M13F (-47) và primer đảo ngược M13R (-48). Việc tìm kiếm
các chuỗi tương đồng (thuật toán BLAST) được tìm thấy trái ngược với cơ sở dữ
liệu chuỗi nucleotid không dư thừa đang tồn tại, do đó, được đặt tên là Streptomyces
sp SU, Streptomyces rubralavandulae dòng SU1, Streptomyces cacaoi dòng SU2,
Streptomyces cavourensis dòng SU3, Streptomyces avidinii dòng SU4,
Streptomyces globisporus dòng SU5, Streptomyces variabilis dòng SU6,
Streptomyces coelicolor dòng SU7. Trong 8 chất phân lập, actinomycete
Streptomyces avidinii dòng SU4 được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn [21].
Kết quả: Dịch chiết thô của actinomycet phân lập ức chế dòng tế bào Hep-2
và VERO với giá trị IC
50
lần lượt là 64,5 và 250 µg. Giá trị đó rất gần với tiêu chí
gây độc tế bào của các dịch chiết thô, được thiết lập bởi Viện Ung thư quốc gia Hoa
Kỳ (NCI) là IC
50
< 30 µg/ml. Phân tích sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) cho thấy
chất có hoạt tính có thể là 1,2-benzenedicarboxylic acid, bis(2-methylpropyl) ester
(12,17%), isooctyl phthalate (15,29%) với thời gian lưu tương ứng là 15,642 và
21,612 [21].
Kết luận: Nghiên cứu chứng minh rõ ràng rằng chất lắng từ biển có
actinomycet với chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học có thể cung cấp chất liệu
sinh học chất lượng cao cho chương trình sinh hóa chống ung thư. Những kết quả
này giúp chúng ta kết luận rằng tiềm năng của việc sử dụng các chất chuyển hóa và

hệ gen sau tiến gần tới việc phân lập nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học và việc áp
dụng vào thương mại là chuyện không còn xa nữa [21].
16

CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
• Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 168.27 do Bộ môn Vi sinh – Sinh
học trường Đại học Dược Hà Nội phân lập đã qua sàng lọc và cải tạo giống trước đó
1 năm. Lấy chủng ĐB1.13 tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
• Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp.
Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633
Vi khuẩn Gram(-): Proteus mirabilis BV 108
• Môi trường
Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: thành phần các MT được trình bày ở
bảng 1 (pH môi trường: 6,8 – 7,2).
Các MT lên men (MTdt): thành phần MT như ở bảng 2.1 nhưng loại bỏ
thạch.
Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: thành phần MT được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần
Đơn vị
MT1
MT2
MT5
Tinh bột
g
2
2
2,4

Glucose
g


1
Cao thịt
g


0,3
Pepton
g


0,3
KNO3
g
0,1


KCl
g

0,05

NaNO3
g

0,2

CaCO3
g


0,4
FeSO4.7H2O
g
0,01


K2HPO4
g
0,05
0,1

MgSO4.7H2O
g
0,05
0,05

NaCl
g
0,05


Thạch
g
1,8
2
2

Nước
ml
100
100
100
17

Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm
định đều được tiệt trùng bằng nhiệt ẩm ở 121°C trong 30 phút.
Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần
NaCl
Cao thịt
Pepton
Thạch
pH
[%]
[%]
[%]
[%]
MT canh thang
0,5
0,3
0,5
0
7,0-7,4
MT thạch thường
0,5
0,3
0,5

1,8

• Dung môi: Bảng 2.3 trình bày các dung môi đã được sử dụng.
Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng
Dung môi
Khối lượng riêng (g/ml)
Nhiệt độ sôi (°C)
Aceton
0,79
56
Acetonitril
0,782-0,783
80-82
n-Butanol
0,81
116-118
Butylacetat
0,880-0,885
117-118
Chloroform
1,470-1,480
60-62
Dicloromethan
1,32
40
Dimethylformamid
0,95
153
Ethanol
0,789-0,791

78,3
Ethylacetat
0,889-0,901
70,4
NH4OH 25%
0,880

Methanol
0,791-0,793
64,5
Triethylamin
0,726-0,728
90
n-Hexan
0,6548
69

• Vật liệu chạy sắc ký
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck
- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 4 ở trên
- Bình chạy sắc ký, cột sắc ký (đường kính 1 cm, dài 50cm), Silicagel 60
F254 hạt có đường kính 0,06-0,2mm
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V (ánh sáng UV (λ=254nm)).