Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 183.222

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ NGUYỆT
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 183.222
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGUYỆT

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 183.222
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Ngườihướngdẫn:
PGS.TS. Cao Văn Thu
Nơithựchiện:
BộmônVisinhvàSinhhọc
TrườngĐạihọcDượcHàNội

HÀ NỘI – 201
4


LỜI CẢM ƠN

Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS
Cao Văn Thu- người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo giúp đỡ tận tình để giúp tôi hoàn
thành khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang
giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược
trường Đại học Dược Hà Nội, viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, viện hóa học- viện
hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các
thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập tại trường.
Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ
và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân
còn hạn hẹp nên không thể tránh khỏi những sai sót trong bài luận. Vì vậy, tôi rất
mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được
hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Nguyệt

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh 2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3
1.1.4. Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 3
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 3
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces 4
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 4
1.2.3. Đặc điểm sinh lý 4
1.2.4. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 5
1.3. Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 5
1.3.1. Cải tạo giống vi sinh vật 5
1.3.2. Bảo quản giống vi sinh vật 7
1.4. Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 7
1.4.1. Khái niệm lên men 7
1.4.2. Các phương pháp lên men 7
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 9
1.6. Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. 10
1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR) 10
1.6.2. Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS) 10
1.6.3. Phổ khối lượng (MS) 11
1.7. Một số nghiên cứu liên quan 11

1.7.1. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ
Streptomyces sp. 11
1.7.2. Phương pháp tiếp cận mới để cải thiện năng suất của kháng sinh: sản
xuất các chủng gây đột biến kháng kết hợp. 12
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Đối tượng nghiên cứu 13
2.1.1. Giống xạ khuẩn 13
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định 13
2.1.3. Môi trường nuôi cấy 14
2.1.4. Dụng cụ và hóa chất. 16
2.2 Phương pháp nghiên cứu 17
2.2.1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222 17
2.2.2. Chọn lọc và cải tạo giống 17
2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh 18
2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 18
2.3. Phương pháp thực nghiệm 18
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng 18
2.3.2. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP 18
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 19
2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 21
2.3.5. Phương pháp cải tạo và chọn giống 21
2.3.6. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23
2.3.7. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên
men. 23
2.3.8. Các phương pháp chiết tách kháng sinh 24
2.3.9. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 25
2.3.10. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 25
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 26
3.1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222 26

3.2. Kết quả sinh tổng hợp của kháng sinh do Streptomyces 183.222 sinh
tổng hợp trên các môi trường khác nhau. 26
3.3. Kết quả cải tạo giống. 27
3.3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên. 27
3.3.2. Kết quả đột biến 28
3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30
3.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của
kháng sinh trong dịch lọc. 32
3.6. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh. 33
3.7. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng. 34
3.8. Kết quả chạy sắc kí cột. 35
3.9. Sơ bộ xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh thu được. 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
1. Kết luận 41
2. Kiến nghị 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
PHỤ LỤC 45





DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADN Acid 2'- deoxyribonucleic
B.cereus Bacillus cereus
DM Dung môi
DMHC Dung môi hữu cơ

ĐB Đột biến
Gr(-) Gram âm
Gr(+) Gram dương
HTKS Hoạt tính kháng sinh
ISP
International Streptomyces Project ( chương
trình Streptomyces quốc tế)
KS Kháng sinh
MC Mẫu chứng
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
P.mirabilis
Proteus mirabilis
s
Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh
SKLM Sắc ký lớp mỏng
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
TB Tế bào
UV Ultra violet ( tử ngoại)
V Thể tích
VSV Vi sinh vật



DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học . 2
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định 13
Bảng 2.2. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml). 14
Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 15
Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng 16

Bảng 3.1. Các đặc điểm của Streptomyces 183.222 và Streptomyces cellulosae 26
Bảng 3.2. Kết quả thử HTKS với 10 VSV kiểm định. 27
Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 28
Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. 29
Bảng 3.5. Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. 30
Bảng 3.6. Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men. 31
Bảng 3.7. Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trên MT2dt. 31
Bảng 3.8. Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh. 32
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh . 32
Bảng 3.10. Kết quả chiết kháng sinh bằng DMHC ở các pH khác nhau. 33
Bảng 3.11. Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM 34
Bảng 3.12. Kết quả thử các phân đoạn sau chạy cột lần 1. 35
Bảng 3.13. Kết quả SKLM với các phân đoạn 2- 16 36
Bảng 3.14. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2 37
Bảng 3.15. Kết quả SKLM các phân đoạn 1- 12 38
Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3………39
Bảng 3.17. Kết quả SKLM các phân đoạn 1-8…………………………………….40






PHỤ LỤC
Hình P.1. Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Hình P.2. Đĩa Petri chứa xạ khuẩn Streptomyces 183.222 sau 6 ngày nuôi cấy.
Hình P.3. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 183.222 bằng phương
pháp khối thạch.
Hình P.4. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 183.222 bằng phương
pháp giếng thạch.

Hình P.5. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 183.222 bằng phương
pháp khoanh giấy lọc.
Hình P.6. Kết quả chạy SKLM (hệ 40:1) phân đoạn chính sau khi chạy sắc kí cột.
Hình P.7. Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces
183.222
Hình P.8. Phổ tử ngoại vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222.
Hình P.9. Phổ hồng ngoại vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222.
Hình P.10. Phổ khối lượng vết kháng sinh 1 của Streptomyces 183.222.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày 28/9/1928, A.Fleming ngẫu nhiên phát hiện ra sự ức chế phát triển
S.aureus của penicillin notatum, sau đó 10 năm, Ernst Boris Chain và Howard
Walter Florey đã cùng hợp tác với ông nghiên cứu sâu hơn phát hiện này và tới năm
1941, họ đã chiết ra được Penicillin từ chủng penicilium chrysogenium có hoạt tính
cao hơn nhiều lần và chính thức đưa nó vào sử dụng trong chiến tranh thế giới lần I
giúp hàng ngàn thương binh thoát khỏi cái chết vì những nhiễm khuẩn thông
thường. Từ đó, kháng sinh tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong y
học lâm sàng và ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh đã ra đời.[25].
Tuy nhiên, do việc sử dụng rộng rãi tràn lan và không đúng cách của kháng
sinh hiện nay nên tình hình kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trọng,
nhiều kháng sinh đã không còn tác dụng trên một số chủng gây bệnh nữa. Vì vậy,
việc tìm ra kháng sinh mới có hiệu quả cao, độc tính thấp và ít bị kháng thuốc là yêu
cầu tất yếu trong phát triển y tế.
Môi trường tự nhiên của nước ta tạo điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển
đa dạng của hệ vi sinh vật, trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh, trong số đó 55% là do chi Streptomyces sản xuất. Đồng thời,
chi này còn có nhiều vi sinh vật ngoài khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn tổng
hợp các chất khác: chất điều trị ung thư như Streptomyces antibioticus sinh tổng

hợp actinomycin D điều trị ung thư, chất kích thích tăng trưởng được sử dụng nhiều
trong chăn nuôi… Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Góp phần nghiên cứu lên men tổng
hợp kháng sinh từ Streptomyces 183.222 ” với các mục tiêu sau:
- Sơ bộ phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.222.
- Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh.
- Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế kháng
sinh.
- Sơ bộ xác định một vài đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tổng hợp được.
2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Theo Waksmann, kháng sinh được định nghĩa kinh điển: ‘Kháng sinh là
những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức
chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác”.
Theo nghĩa rộng hiện nay: Kháng sinh đại diện cho tất cả các hợp chất có
nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với
các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như cả với tế bào ung thư) ở nồng độ thấp, mà
không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con
đường cung cấp chung. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp chỉ được sinh
tổng hợp mạnh mẽ ở giai đoạn phát triển sau (pha logarit muộn, pha dừng, hoặc pha
suy tàn) của sinh trưởng VSV. [9]
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng, hay
theo phổ tác dụng…trong đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng phổ biển
nhất vì nó giúp người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của
chất kháng sinh mới phát hiện thông qua cấu trúc hóa học của nó. Các chất được
phân loại theo cấu trúc hóa học chia làm 10 nhóm theo bảng 1.1.[8], [5]

Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học.
Nhóm kháng sinh Ví dụ
β – lactam Penicillin, Cephalosporin,…
Fluoroquinolon Ciprofloxacin, Ofloxacin,…
Aminoglycosid Streptomycin, Gentamicin
Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin
Macrolid Erythromycin, Clarithromycin, …
Polypeptide Polymycin, Vancomycin,
Imidazol Metronidazol,…
Lincosamid Lincomycin, Clindamycin,
Sulphonamid Cotrimoxazol
Nhóm khác Mupirocin

3

1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Mỗi kháng sinh có đích tác dụng trong các tế bào VSV khác nhau, tuy nhiên có
thể khái quát thành 6 nhóm đích tác dụng chính:
- Tổng hợp thành tế bào: β –lactam, Vancomycin
- Màng tế bào chất: Polyen, Amphotericin,
- Tổng hợp ADN: Actinomycin, anzamycin.
- Tổng hợp protein: Aminoglycosid (ribosome), Macrolid (liên kết t-ADN)
- Trao đổi chất hô hấp: Antimycin,…
- Trao đổi chất folat: sulfamid,…
Sơ đồ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ở phụ lục P.1. [9]
1.1.4. Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh
Để phân lập VSV sinh kháng sinh người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất
khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, bùn,… Từ các mẫu trên đem phân lập
thuần khiết những VSV sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng phương pháp đặc
trưng và trên các môi trường chọn lọc.

Các phương pháp phân lập xạ khuẩn:
- Phương pháp cấy dịch chiết lên bề mặt thạch.
- Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn VSV kiểm định.
- Phương pháp làm giàu đất.
- Phương pháp thêm kháng sinh vào trong môi trường phân lập. [4],[8]
1.2.Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong
tự nhiên.
Đa số là vi khuẩn Gr (+), có tỷ lệ G+C > 55%, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo
dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty). Do đó, có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm
trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzyme, vitamin, vì vậy, chúng được
nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây hại cho người hoặc động
vật.[4], [9],[11].

4

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces
- Khuẩn lạc: khuẩn lạc xạ khuẩn Streptomyces khá đặc biệt, thường có dạng
khô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ,
dùng que cấy không di chuyển được khuẩn lạc xạ khuẩn vì khuẩn ty cơ chất bám
sâu vào trong thạch.
- Khuẩn ty xạ khuẩn: Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ
0,3- 1,0 µm đến 2-3µm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn, màu sắc
khuẩn ty rất phong phú: đỏ, cam, đen, lục cam, nâu, Khuẩn ty cơ chất có thể tiết
vào môi trường một số loại sắc tố như: sắc tố tan trong nước, sắc tố tan trong
DMHC, đặc biệt có loài tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen.
- Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài ra trong không khí thành khuẩn
ty khí sinh. Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các
chuỗi bào tử mọc đơn hay mọc vòng (thẳng, uốn cong, xoắn lò xo, ).
- Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của họ xạ khuẩn Streptomyces. Bề

mặt bào tử có thể nhẵn, sần sùi da cóc, có gai, có tóc, với các hình dạng phong phú:
hình cầu, hình ellipsoic, hình trụ…[9],[11]
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn
- Thành tế bào: có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm, có chức năng duy
trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Chi Streptomyces thuộc nhóm CW I có
chứa L-DAP (L- diaminopimelic acid) và glycin.
- Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5-10nm. Chúng có cấu trúc và chức năng
giống vi khuẩn nói chung.
- Mesosom nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay
hình ống. Mesosom làm tăng diện tích tiếp xúc của CM và qua đó làm tăng cường
hoạt tính enzyme, tăng vận chuyển điện tử…
- Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat,
các hạt polysaccarid.[9],[16].
1.2.3. Đặc điểm sinh lý
Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân
5

giải các hydrocarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy
phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, chúng có thể khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ tối ưu thường là 25-30
0
C,
pH tối thích thường từ 6,8-7,5. Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4
nhóm: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc
tố melanoid.[9]
1.2.4. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn
Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên cứu để
phân loại, trong đó phải kể đến khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của
Gauze, đặc biệt để phân loại Streptomyces có 2 phương pháp phân lọai đang được
sử dụng phổ biến: phân loại ISP và phân loại theo giải trình tự gen.

 Phân loại theo ISP
Tại hội nghị vi sinh vật thế giới lần thứ X (1970), khóa phân loại do Shirling
& Gottlieb đề xuất đã được sử dụng để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces trong họ Streptomytaceae. Khóa phân loại dựa trên các đặc điểm:
- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn: Màu sắc khuẩn ty cơ chất, màu sắc
khuẩn ty khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, đặc điểm bề mặt, kích thước và hình
dạng bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả năng
sử dụng nguồn hydratcarbon. [9], [20], [2]
 Phân loại định tên theo giải trình tự gen
Phương pháp phân loại này sử dụng phương pháp phân loại phân tử, dựa vào
việc phân tích gen 16S rADN. Trình tự nucleotid của gen hầu như không có sự trao
đổi giữa các loài, vì vậy phương pháp này có tính chính xác cao và đáng tin cậy
hơn. [14],[21], [22].
1.3.Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật
1.3.1. Cải tạo giống vi sinh vật
 Mục đích
Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có
6

hoạt tính rất thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất
đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu
điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm các mục đích khác nhau:
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên
men, tạo ít bọt hơn.
- Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn.
- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết, nhóm chức mới.
[8],[9].
 Các phương pháp cải tạo giống

 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên:
Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 20-30% những cá thể khác. Cần phải
chọn lấy cá thể có hoạt tính kháng sinh cao nhất trong ống giống nghiên cứu tiếp.
Việc chọn lọc này chỉ để tiến hành nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng
vào sản xuất .[3].
 Đột biến nhân tạo
Các tác nhân gây đột biến mạnh như tia UV, X hay tác nhân hóa học như
ethylenimin, dimethylsulfat, nitrosoguanidin, cho tác dụng với liều lượng và thời
gian thích hợp sẽ giết chết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột
biến gen, làm thay đổi tính trạng dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh
(đột biến âm tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần
(đột biến dương tính).
Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vi sinh vật
có kích thước nhỏ (0,5 -3,0µm) thì có có thể xuyên thấu tới vùng nhân. Vì vậy, ánh
sáng UV được dùng phổ biến trong cải tạo giống. Liều lượng chiếu được đặc trưng
bởi 3 yếu tố: thời gian chiếu, khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử. Liều lượng
chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng lớn và cuối cùng đạt đến giới hạn nhất
định. Thông thường đột biến dương sẽ xuất hiện ở liều lượng chiếu có độ sống sót
7

từ 0,1-1,0%, còn đột biến âm sẽ xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn.
Để tạo ra biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành
đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định
hướng gen, kĩ thuật tách dòng gen, tạo và dung hợp tế bào trần.
1.3.2. Bảo quản giống vi sinh vật
 Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không
bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bới các sinh vật lạ.
 Các phương pháp bảo quản:
- Bảo quản lạnh: bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 2

0
C, định kỳ 3-6
tháng cấy chuyền.
- Làm khô: trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng.
- Đông khô: phân tán tế bào VSV trong môi trường chất bảo quản rồi đông lạnh,
làm khô mẫu đông lạnh.
- Đông lạnh: huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và
bảo quản ở nhiệt độ thấp (từ -78
0
C đến -20
0
C).
Trong phòng thí nghiệm thường nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch
nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2
0
C và định kì 3-6 tháng cấy
chuyền. [8],[2],[10],[15].
1.4.Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh
1.4.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của
VSV nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất
trung gian cho chúng.
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành lúc gần kết thúc quá
trình sinh trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng.
1.4.2. Các phương pháp lên men
Dựa vào thành phần đồng nhất của môi trường có thể chia làm 2 phương pháp:
 Lên men bề mặt
Là quá trình VSV được nuôi cấy trên bề mặt rắn, đặc, lỏng. VSV hấp thu các
8

chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt
môi trường. Vì vậy yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng, lớn và
không quá sâu (5-10cm).
- Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị
ban đầu thấp.
- Nhược điểm: hiệu suất sử dụng trường thấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự động
hóa, tốn nhân công.
 Lên men chìm
Là phương pháp VSV được nuôi cấy trong các bình lên men bình phản ứng
sinh học, trong điều kiện sinh lý tối thích, VSV phát triển cả 3 chiều.
- Ưu điểm: dễ cơ giới, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện
tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
- Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, không thể xử lý cục bộ, cán bộ
cần chuyên môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường.
Các phương pháp lên men chìm:
- Lên men mẻ: VSV được nuôi cố định trong bình lên men với thể tích môi
trường xác định, ở điều kiện sinh lý tối thích. Trong suốt thời gian lên men,
không tác động hay bổ sung gì, ngoài cung cấp oxy, chất phá bọt, chất điều
chỉnh pH. Kết thúc quá trình, thu lấy dịch lên men chứa sản phẩm.
- Lên men bán liên tục: là lên men VSV trong điều kiện xác định, khi VSV phát
triển tạo ra nồng độ sinh khối cần thiết ta lấy bớt đi dịch lên men rồi bổ sung
thêm lượng môi trường mới bằng lượng dịch đã lấy.
- Lên men liên tục: là quá trình lên men được bổ sung liên tục môi trường dinh
dưỡng vào bình lên men, đồng thời lấy ra khỏi hệ thống cùng lượng thể tích
dịch lên men và tế bào cùng sản phẩm trao đổi chất của chúng.
- Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh
dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng cao hiệu quả
sử dụng bình lên men.[2],[8],[10],[13].

9

1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
Tùy theo đặc tính của loài mà kháng sinh đó được tiết vào môi trường nuôi cấy
(penicillin, streptomycin…) hoặc giữ lại trong tế bào (nystatin ). Vì vậy để thu lấy
hoạt chất có độ tinh khiết cao cần chọn phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp
để sản phẩm đạt chất lượng cao, độ bền lâu và giúp hạ giá thành sản phẩm.
 Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:
 Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
 Phương pháp tạo phức kết tủa.
 Phương pháp trao đổi ion.
 Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, ).
 Chiết xuất
- Là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình
chuyển chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai
pha lỏng (1 pha là nước, 1 pha là dung môi hữu cơ).
- Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào nhau.
- Kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch nên ta thường sử dụng chiết lỏng
lỏng theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng. Kháng sinh nội bào tồn tại trong
tế bào nên tiến hành chiết rắn lỏng.
 Tinh chế ( phương pháp sắc ký):
- Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp
phức tạp thành một hỗn hợp đơn giản, từ hỗn hợp đơn giản đến tách riêng từng
chất. Quá trình sắc ký trải qua 3 giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha
động chạy qua pha tĩnh và phát hiện vết cần tách.
- Nguyên lý tách: mẫu phân tích được hòa tan trong pha động, sau đó được đưa
lên pha tĩnh 1 cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Các chất tan của mẫu sẽ di
chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau tùy thuộc sự tương tác giữa pha tĩnh,
pha động, chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành phần sẽ được
tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ.
- Một số phương pháp sắc ký thường dùng:

10

 Sắc ký lớp mỏng: là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả
năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn
(chất hấp phụ). Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf
R
f
=
dm
v
d
d
trong đó: d
v
: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết.
d
dm
: Khoảng cách dung môi chạy.
Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp thụ, tính chất của
dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm.
 Sắc ký cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác
nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo hành
tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nhồi
vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. Quá trình
rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục một lượng mới của pha
động. [1],[2],[3],[8],[17].
1.6.Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh.
1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR)
- Là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thu bức xạ hồng
ngoại của một chất vào số sóng hoặc bước sóng bức xạ.

- Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi
trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan
giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ để nhận biết nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm
chức có dải hấp thụ đặc trưng, đây chính là cơ sở để phân tích cấu trúc bằng phổ
IR.[9],[15],[6].
1.6.2. Phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS)
- Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của
phân tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Đường cong biểu diễn sự
phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại.
- Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết
đơn, liên kết bội, nhân thơm,…hoặc cặp electron tự do không tham gia vào liên
11

kết của O, N, halogen. Vì vậy, dựa vào phổ hấp thụ UV ta có thể xác định các
đặc điểm về cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu. [3], [7].
1.6.3. Phổ khối lượng (MS)
- Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ bằng
cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số
khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc
nguyên tử của mẫu.
- Tiến hành:
Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử
hữu cơ ở chân không cao (10
-6
mmHg). Khi các phân tử ở trạng thái khí va chạm
với một dòng electron có năng lượng cao thì sẽ tách ra một hoặc hai ion và trở thành
ion có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) và +2. Loại ion này gọi là ion gốc hay ion phân
tử. Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn hơn
thì chúng sẽ bị vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các ion gốc hay các phân tử trung
hòa khác nhau. Khi tách ion có số khối khác nhau và xác định được xác suất có mặt

của chúng ta vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan xác suất có mặt (cường độ I) và số
khối z. Đó là phổ khối lượng.
- Dựa trên phổ thu được ta xác định được khối lượng phân tử và góp phần
nhận dạng cấu trúc hóa học của hợp chất.[2],[15], [18].
1.7. Một số nghiên cứu liên quan
1.7.1. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase từ Streptomyces
sp.
Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase gồm tetrapetalone
B (2, C
28
H
35
NO
9
), C ( 3, C
26
H
34
NO
8
), D (4,C
28
H
36
NO
10
) từ Streptomyces sp USF –
4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp tetrapetalone A. HLO (Human
Lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là những enzyme xúc tác đầu tiên tương
ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh ra một loạt các chất gây bệnh cho người

như leukotriene, lipoxin, prostaglandin. Nghiên cứu được tiến hành trên
lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean Lipoxygenase).
12

Streptomyces sp USF- 4227 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, dịch
lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 30
0
C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa giải bằng
MeOH và aceton được gộp lại và bốc hơi dưới áp suất giảm, sau đó tinh chế bằng
sắc kí cột silicagel, DM rửa giải là n- hexan(1), n-hexan: ethylacetat= 3:7(2), n-
hexan: acetone= 3:7 (3), và acetone(4).
Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn DM (1) và (2) sau đó sắc kí trao
đổi ion bằng cột Sephadex LH-20, DM rửa giải là MeOH, tinh chế phân đoạn DM
(1) thu được 10mg bột từ 7,21g MT. Tetrapetalone A có IC
50
là 190 µm.[23], [24].
1.7.2.

Phương pháp tiếp cận mới để cải thiện năng suất của kháng sinh: sản xuất
các chủng gây đột biến kháng kết hợp.
Để cải thiện việc sản xuất các kháng sinh từ Streptomyces coelicolor A3 (2)
người ta gây đột biến kháng thuốc kết hợp. Đột biến nâng cao việc sản xuất
actinorhodin được phát hiện cao hơn (5-10%) trong số các chủng kháng
streptomycin (Strr), gentamicin (Genr), hoặc rifampin (Rifr), phát triển một cách tự
nhiên trên đĩa thạch có chứa một trong ba loại thuốc . Xây dựng các đột biến gấp
đôi (Str gen và Str rif) bằng cách cho chủng kháng gentamicin hoặc rifampin vào 1
Str đột biến dẫn đến tăng thêm (1,7 -2,5 lần) sản lượng actinorhodin . Tương tự như
vậy, đột biến gấp ba (Str gen rif), nghiên cứu đã được tìm thấy có một khả năng lớn
hơn để sản xuất thuốc kháng sinh, tạo ra một đột biến có thể sản xuất cao hơn 48 lần
so với actinorhodin ban đầu. Phân tích Str đột biến cho thấy một đột biến điểm xảy

ra trong gen rpsL, mã hóa protein ribosome S12, đột biến rif đã tìm thấy có một
điểm đột biến ở gen rpoB, mã hóa tiểu đơn vị β của RNA polymerase. Các đột biến
đôi, ba được sắp xếp theo thứ bậc sự gia tăng đáng kể trong sản xuất ActII - ORF4-
một protein phiên mã quá trình cụ thể , được xác định bằng phân tích thấm
Western. Khả năng vượt trội của các đột biến ba đã được chứng minh bằng các
phân tích sinh lý trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau. Phương pháp mới này có
thể làm tăng sản xuất kháng sinh từng bước, đặc biệt hiệu quả cho bước đầu cải
thiện việc sản xuất thuốc kháng sinh từ chủng hoang dại. Các đột biến kháng kết
hợp (đột biến ba) đã chứng minh không có suy giảm đáng kể trong sự phát triển
hoặc hình thành bào tử trong điều kiện thử nghiệm. [20]
13

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Giống xạ khuẩn
Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 183.222 đã được
phân lập và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh– Sinh học Trường Đại học Dược Hà
Nội cung cấp.
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định
Vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà
Nội cung cấp (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định
Đặc trưng Tên VSV kiểm định Tên viết tắt
Vi khuẩn Gram dương (+)


Bacillus cereus ATCC 6633 B. cereus
Bacillus subtilis ATCC 10241 B. subtilis
Bacillus pumilus ATCC 10241 B. pumilus
Sarcina lutea ATCC 9341 S. lutea

Staphyllococus aureus ATCC 1128

S. aureus
Vi khuẩn Gram âm (-)
Escherichia coli ATCC 25922 E. coli
Proteus mirabilis BV108 P. mirabilis
Shigella flexneri DT 112 S. flexneri
Salmonella typhi DT 220 S. typhi
Pseudomonas aeruginosa VM 201 P. aeruginosa




14

2.1.3. Môi trường nuôi cấy
 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần các môi trường sử dụng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml).
Thành phần MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7
Tinh bột 2 2 2,4 2
Lactose 3
Glucose 2 1
Cao ngô 0,5 0,5
Saccarose 3
Bột đậu tương 1,5
Bột ngô 2 0,1
Pepton 0,3 0,3
Cao thịt 0,3 0,5
KNO

3
0,1
KCl 0,05
NaNO
3
0,2
NH
4
NO
3
0,2 0,2
CaCO
3
0,3 0,3 0,4 0,2
FeSO
4
,7H
2
O 0,01
K
2
HPO
4
0,05 0,1 0,1 0,05
MgSO
4
,7H
2
O 0,05 0,05 0,25 0,15
NaCl 0,05 0,1

Cao nấm men 0,5
Thạch 1,8 2 2 2 2 2 2
Nước 100 100 100 100 100 100 100
pH 7,0 - 7,2

6,8- 7,2

7,0 - 7,2

7,0 - 7,2

7,0 - 7,2

7,0 - 7,2

7,0 - 7,2

Với môi trường lên men dịch thể sử dụng để lên men chìm thì các thành phần
tương tự như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: bảng 2.3.
15

Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần NaCl (g)

Pepton (g)

Cao thịt (g)

Thạch (g)

Nước (ml)

pH
MT canh thang
0,5 0,5 0,3 0 100
7,0 -7,5

MT thạch
thường
0,5 0,5 0,3 1,6-1,8 100

 Các môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISP 1 đến ISP 9)
Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl
2
.4H
2
O 0,1g; FeSO
4
.7H
2
O 0,1 g;
ZnSO
4
.7H
2
O 0,1g; nước cất vđ 100ml ; pH = 7,0 – 7,2.
ISP 1: Tripton 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất vđ 1000ml; pH= 7,0 -7,2.
ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết malt 10,0g; glucose 4,0g; thạch 20,0g; nước
cất vđ 1000ml; pH=7,3.

ISP3: Yến mạch 20,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 18,0g; nước cất vđ
1000ml; pH=7,2.
ISP4: Tinh bột 10,0g; K
2
HPO
4
1,0g; MgSO
4
.7H
2
O 1,0g; NaCl 1,0g; (NH
4
)
2
SO
4
0,2g; CaCO
3
0,2 g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g nước cất vđ
1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP5: L-asparagine 1,0g; Glycerin 10,0g; K
2
HPO
4
1,0g; dung dịch muối vi lượng
1,0 ml; thạch 20,0g; nước cất vđ 1000ml; pH= 7,0-7,4.
ISP6:
Dung dịch A: Pepton 20,0g; acid citric 0,384g; FeSO
4
.7H

2
O 0,556g; NH
4
OH 25%
0,264g; Na
2
S
2
O
3
10ml; K
2
HPO
4
1g; nước cất vđ 1000ml.
ISP 6: Dung dịch A 36,0 g; cao nấm men 1,0g; thạch 15g; nước cất vđ 1000ml; pH=
7,0 – 7,2.
ISP 7: Glycerin 15,0g; L-tyrosine 0,5g; L-asparagine 1,0g; K
2
HPO
4
0,5g;
MgSO
4.
7H
2
O 0,5g; NaCl 0,5g; FeSO
4
.7H
2

O 0,01g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml;
thạch dây 20,0g; nước cất vđ 1000ml; pH= 7,2-7,4.
16

ISP 9: Các nguồn đường tiệt trùng bằng phương pháp Tyndal (A)
1.

D-Glucose 4.

D-Mannitol 7.

Raffinose
2.

Inositol 5.

D-Fructose 8.

Rhamnose
3.

D-Xylose 6.

L-Arabinose 9.

Saccarose
Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (Dung dịch B): CuSO
4
.5H
2

O 0,64g;
FeSO
4
.7H
2
O 0,11g; MnCl
2
.2H
2
O 0,79g; ZnSO
4.
7H
2
O 0,15g; nước cất vđ 1000ml.
ISP 9: (NH
4
)
2
SO
4
2,64g; KH
2
PO
4
2,38g; KH
2
PO
4
.7H
2

O 5,65g; MgSO
4
.7H
2
O 1,0g;
dung dịch B 1,0g; thạch 15,0g; nước cất vđ 1000ml; pH= 6,8-7,0.
D*ISP9: ISP9 sau khi đã tiệt trùng để nguội tới 60
o
C thì cho 1 trong các nguồn
đường A vào từng môi trường ISP9 riêng rẽ sao cho nồng độ đường trong môi
trường thường là 1%.
2.1.4. Dụng cụ và hóa chất.
 Các dung môi sử dụng: bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng
Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi (
0
C)
Methanol 0,791-0,793 64,5
Ethylacetat 0,789- 0,901 70,4
Ethanol 0,789-0,791 78,3
Chloroform 1,470-1,480 60-62
n- Butanol 0,81 116- 118
Aceton 0,790 56
Triethylamin 0,726-0,728 89,5
Amoniac 25% 0,880 37,7
Diethyformamid 0,946-0,950 153
n-Butylacetat 0,880- 0,885 117- 118
Acetonitril 0,782-0,783 80-82
Diclometan 1,33 39,6