Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 183 224

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN ĐÌNH TÚ
NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP
KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES
183.224
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI - 2014



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


ĐOÀN ĐÌNH TÚ

NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP
KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES
183.224

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: ThS. Lê Thị Thu Hương
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học
Trường Đại Học Dược Hà Nội



HÀ NỘI - 2014



LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo ThS. Lê Thị Thu
Hương, người đã tận tình giúp đỡ tôi từ những bước đầu tiên cho tới khi tôi
hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ
thuật viên đang giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học, Bộ môn
Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời
gian làm thực nghiệm.
Nhân dịp này tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban Giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn,
khóa luận này còn có nhiều sai sót. Tôi rất mong được sự góp ý của các thầy
cô, các bạn để khóa luận hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.


Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2014

Sinh viên
ĐOÀN ĐÌNH TÚ






MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh 2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh 2
1.1.3. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 4
1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh 4
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 5
1.2.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 5
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 6
1.2.3. Phân loại xạ khuẩn 7
1.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 8
1.4. Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn 8
1.4.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 8
1.4.2. Đột biến cải tạo giống 8
1.4.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 9
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9
1.6. Chiết tách và tinh chế sản phẩm 10
1.7. Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh 11
1.7.1. Phổ hồng ngoại 11
1.7.2. Phổ tử ngoại 12

1.7.3. Phổ khối 12
1.8. Một số nghiên cứu liên quan 12
1.8.1. Quy tắc sinh tổng hợp kháng sinh thiopeptid Cyclothiazomycin
bằng cách phiên mã chuỗi SHJG8833 của Streptomyces hygroscopicus
5008. 12



1.8.2. Sự kích hoạt và bất hoạt các chất chuyển hóa thứ cấp ở
Streptomyces albus và Streptomyces lividans sau khi chuyển đổi với
cosmids có chứa các cụn gen thienamycin từ Streptomyces cattleya……13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ: 18
2.2. Nội dung nghiên cứu: 19
2.3. Phương pháp thực nghiệm: 19
2.3.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn: 19
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống: 19
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán: 20
2.3.4. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 21
2.3.5. Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc
ngẫu nhiên 21
2.3.6. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 21
2.3.7. Phương pháp lên men mẻ 23
2.3.8. Phương pháp xác đinh độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh
trong dịch lên men 23
2.3.9. phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ 23
2.3.10. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 24

2.3.11. phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 25
2.3.12. Phương pháp xác định kháng sinh tinh khiết thu được 25
2.3.13. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP 25
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 28
3.1. Kết quả thử hoạt tính của Streptomyces 183.224 khi phân lập 28
3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp và VSV kiểm định 28
3.3. Nghiên cứu định tên khoa học của Streptomyces 183.224 29


3.4. Kết quả quá trình chọn lọc ngẫu nhiên 30
3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 31
3.6. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 32
3.7. Kết quả lên mem sinh tổng hợp kháng sinh 33
3.8. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của
kháng sinh trong dịch lọc 34
3.9. Kết quả chọn dung môi chiết xuất kháng sinh 35
3.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 37
3.11. Kết quả sắc ký cột 38
3.12. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và sơ bộ xác định các nhóm chức
đặc trưng của kháng sinh thu được 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
1. Kết luận Error! Bookmark not defined.
2. Kiến nghị 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid 2’-deoxyribonucleic

CW Thành tế bào – Cell wall
DMHC Dung môi hữu cơ
ĐB Đột biến
Gr Gram
IR Hồng ngoại – Infrared
ISP International Streptomyces project
KS Kháng sinh
L-DAP L-diaminopimelat
MTdt Môi trường dịch thể
MTth Môi trường thích hợp
TB Tế bào
TĐC

Trao đổi chất
VSV Vi sinh vật
UV Tử ngoại – Ultraviolet
B. cereus Bacillus cereus
S. flexneri Shigella flexneri
Gr(+) Gram dương
Gr(-) Gram âm
SK Sắc ký




DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học
Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật kiểm định
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.224 trên 6
vi khuẩn khi phân lập
Bảng 3.2: Hoạt tính KS của Streptomyces 183.224 trên 7 môi trường
Bảng 3.3: Các đặc điểm phân loại của Streptomyces 183.224 và Streptomyces
albidus theo ISP
Bảng 3.4: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 183.224
Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 1
Bảng 3.6: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 2
Bảng 3.7: Kết quả chọn môi trường lên men
Bảng 3.8: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt
Bảng 3.9:
Ả
nh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày
Bảng 3.10:
Ả
nh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh
Bảng 3.11: Kết quả thử dịch chiết kháng sinh bằng 5 DMHC
Bảng 3.12: Chiết kháng sinh bằng ethylacetat ở pH 7, chiết lặp 3 lần
Bảng 3.13: Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
Bảng 3.14: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1
Bảng 3.15: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 3-15.
Bảng 3.16: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2.
Bảng 3.17: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 1-10.





DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Hình P1: Hình dạng chuỗi bào tử Streptomyces 183.224
Hình P2: Hình dạng bề mặt bào tử Streptomyces 183.224
Hình P3: Thử hoạt tính KS các biến chủng sau CLNN bằng phương pháp khối
thạch (VSV kiểm định B. cereus)
Hình P4: Thử hoạt tính KS các phân đoạn sau chạy cột lần 1 bằng phương
pháp khoanh giấy lọc (VSV kiểm định B. cereus)
Hình P5: Lên men chìm xác định biến chủng để lên men tốt nhất
Hình P6: Kết quả đo Phổ UV-VIS






1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhà vi khuẩn học người Anh Alexander-Flemming và Howara Walter
Florey, Ernst Boris Chaen đã mở ra kỷ nguyên mới cho ngành y học – công
nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng trong điều trị bệnh nhờ phát minh ra
penicillin. Nhưng hiện nay do tình trạng lạm dụng kháng sinh và nhiều
nguyên nhân khác đã dẫn tới nguy cơ vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng.
Do đó, đi kèm với các biện pháp sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý thì việc
nghiên cứu sản xuất ra kháng sinh mới có nhiều đặc tính ưu việt thực sự rất
cần thiết.
Cùng với việc tạo ra kháng sinh bằng con đường tổng hợp và bán tổng
hợp thì việc tìm ra kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật vẫn giữ một vị trí vô
cùng quan trọng. Chi Streptomyces gồm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc, đặc tính kháng khuẩn. Một số loài
còn có khả năng kháng tế bào ung thư và HIV. Bởi vậy mà hiện nay, ở Việt

Nam đang phân lập và nghiên cứu rất rộng rãi. Sản xuất kháng sinh có nguồn
gốc vi sinh vật đặc biệt phù hợp với định hướng phát triển công nghiệp dược
nước ta.
Do vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng
sinh nhờ Streptomyces 183.224” với mục tiêu:
- Phân loại, định tên khoa học của Streptomyces 183.224 theo ISP.
- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất.
- Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.


2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh.
Định nghĩa hẹp truyền thống: Kháng sinh là những hợp chất hóa học do
sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn
lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa,
virus…) hay cả tế bào ung thư, ở nồng độ thấp. [6]
Định nghĩa rộng: Kháng sinh phải bao hàm cả các chất tổng hợp bằng
phương pháp hóa học có tác dụng diệt khuẩn như các dẫn chất quinolon
(pefloxacin, norfloxacin…). [7]
1.1.2. Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách khác nhau để phân loại các kháng sinh: phân loại theo
nguồn gốc (kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, kháng sinh bán tổng hợp), theo
phổ tác dụng (phổ rộng hay hẹp), theo cơ chế tác dụng (ức chế tổng hợp vách
tế bào, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nucleic,
thay đổi tính thấm màng tế bào, ức chế tổng hợp acid folic), theo cấu trúc hóa

học…
Song cách phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất
vì nó giúp cho các nhà nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc
điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được công thức hóa học của
nó.
Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học (bảng 1.1).
Bảng 1.1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học [10]
Phân loại Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể
1. Kháng sinh có Aminoglycosid Streptomycin,
3

chứa đường trong
phân tử
Neomycin
Orthosomycin Everninomycin
N-glycosid Streptothrinin
C-glycosid Vancomycin
Glycolipid Moenomycin
2. Kháng sinh chứa
vòng lacton lớn
(macrocyclic
lacton)
KS macrolid Erythromycin
KS polyen Candicidin, Nystatin
Asamycin Rifamycin
Macrotetrolid Tetralactin
3. Quinon và kháng
sinh cùng họ
Anthracyclin Adriamycin
Naphthoquinon Actinortidin

Benzoquinon Mitomycin
Các tetracyclin
Tetracyclin,
Terramycin
4. Các kháng sinh
aminoacid và
peptid
Dẫn xuất aminoacid Cycloserin
KS β-lactam
Penicillin
,Cephalosporin
KS peptid Bacitracin, Polymycin
Chromopeptid Actinomycin
Depsipeptid Valinomycin
5. Kháng sinh dị
vòng chứa N

Các KS nucleotid Polyoxin
6.

Kháng sinh dị
vòng chứa O
Các KS polyether Monensin
7. Các kháng sinh
nhân thơm
Dẫn xuất benzen Chloramphenicol
Các ether thơm Novobiocin
4

1.1.3. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh [6]

Cô, tinh chế

Kiểm nghiệm

Đóng gói

Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh
 Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh dùng điều trị các bệnh do vi khuẩn,
vi nấm gây ra. Đặc biệt, một số kháng sinh còn được dùng trong hóa trị liệu
ung thư. [14]
Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm
Nhân giống quy mô thí nghiệm
Nhân giống trong thiết bị nhân giống
Lên men tổng hợp kháng sinh
Dịch lên men

Dịch lọc
Sinh khối
Dịch chiết sinh khối
Dịch chiết
Sản phẩm tinh chế
Sản phẩm đã được kiểm
Sản phẩm đóng gói
Lọc, ly tâm
Chiết bằng dung môi hữu cơ
Dùng cột trao đổi ion…
5

 Ngoài lĩnh vực y học: Kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh
vực khác.
 Trong chăn nuôi: Kháng sinh được dùng để điều trị các bệnh cho
động vật (griseoviridin trị bệnh viêm phổi cấp, viêm vú trâu, bò. Metimyxin
hoặc chloramphenicol dùng điều trị các bệnh do Brucella gây ra…). Kháng
sinh được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm
chi phí thức ăn, kích thích tăng sản lượng trứng ở gà, vịt. [6]
 Trong trồng trọt: Để xử lý hạt, đất trồng. ngâm hạt giống trong
dung dịch kháng sinh trước khi gieo để kích thích hạt nảy mầm và tiêu diệt
nấm và các vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng (validamycin, blastixidin,
kasugamycin). [6]
 Kháng sinh dùng trong công nghiệp thực phẩm: Thực phẩm đóng
hộp dùng chất kháng sinh để bảo quản giúp giảm thời gian khử trùng bằng
nhiệt, nhiệt độ khử trùng giảm xuống làm cho chất lượng sản phẩm tốt hơn,
các vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi (subtilin, nisin). [6]
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân
bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, phân chuồng, rác,

bùn, thậm chí ở cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển
được. Theo Waksman trong 1g đất có khoảng 29.000 -2.400.000 xạ khuẩn,
chiếm 9-45% tống số VSV.
Xạ khuẩn là các vi khuẩn Gr(+), có tỷ lệ G + C > 55% trong ADN, hiếu
khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh.
Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan
trọng như kháng sinh, vitamin, acid hữu cơ, các enzym… nên được các nhà
khoa học nghiên cứu rất nhiều. [7]
1.2.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn
6

Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, còn khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh
hay yếu, thậm chí không phát triển tùy từng chi, từng loài.
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi từ 0,3-1,0 µm đến 2-3 µm. Đa
số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc
khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú, có thể gặp các màu da cam, đen, đỏ, lục
lam, nâu, trắng, vàng, xám… Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào môi trường một
số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có loại phụ thuộc vào pH, có loại chỉ
tan trong DMHC. Trong môi trường đặc hiệu, có loại xạ khuẩn có thể tạo ra
sắc tố melanoid sẫm đen.
Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí
thành các khuẩn ty khí sinh. Người ta gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ
cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp bắt đầu phát triển từ các bào tử nảy
mầm.
Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ.
Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ
hay dạng màng dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, đường tròn
đồng tâm…
Đối với các xạ khuẩn thuộc họ Streptomycetaceae sau một thời gian

phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Các chuỗi
bào tử có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như: thẳng,
uốn cong, móc câu - đơn hoặc kép, và xoắn lò xo. Bào tử trần của họ xạ
khuẩn này có hình dạng: hình cầu, hình bầu dục, hình trụ… Bề mặt bào tử có
thể là nhẵn, sần xùi da cóc, có gai hoặc có tóc. [7]
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gr(+), có một số đặc
điểm khác biệt sau:
7

Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày khoảng 10-20 nm, có
chức năng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ TB. Căn cứ vào thành
phần hóa học thành TB xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm: CW1, CW2, CW3,
CW4. Các xạ khuẩn chi Streptomyces được xếp vào nhóm CW1, thành tế bào
có chứa L-DAP và glycin. [7]
Màng TB chất của xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10 nm, có cấu trúc và chức
năng như vi khuẩn nói chung.
Mezosom nằm ở phía trong của TB chất, có hình phiến, hình bọng hay
hình ống. Mezosom làm tăng diện tích tiếp xúc của màng TB chất và qua đó
làm tăng hoạt tính enzym, tăng vận chuyển điện tử…
Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt
phosphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Sudan III), các hạt polysacharid
(bắt màu với dung dịch Lugol). [12]
1.2.3. Phân loại xạ khuẩn
Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà khoa học nghiên
cứu phát triển để phân loại xạ khuẩn, phải kể đến khóa phân loại của
Waksman, khóa phân loại của Krassilnhikov (Nga), khóa phân loại của
Gauze… Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn (Actinomycetes) thành bộ
Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn. Bộ Actinomycetales chia thành
các họ: Actinoplanaceae, Actinomycetaceae, Streptomycetaceae,

Micromonosporaceae, Nocardiaceae…
Khóa phân loại Streptomyces thuộc Chương trình Streptomyces quốc tế
(ISP) do Shirling và Gotlieb đề xuất (1970) được sử dụng rộng rãi để phân
loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae. Trong
khóa phân loại này, các đặc trưng phân loại được sử dụng bao gồm: Màu sắc
khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng
chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, khả năng tiêu thụ các nguồn carbon. [7]
8

1.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh
Để phân lập VSV sinh KS người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất
khác nhau: Đất ở ruộng, đất ở quanh rễ cây, đất nền ở chuồng gia súc, gia
cầm, bùn, nước ở sông hồ… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những
VSV sinh KS mà ta mong muốn bằng các phương pháp đặc trưng và trên các
môi trường chọn lọc (MT1, MT2 đối với xạ khuẩn). [6]
Các phương pháp phân lập xạ khuẩn:
 Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch.
 Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa VSV kiểm
định.
 Phương pháp làm giàu đất bằng VSV kiểm định.
 Phương pháp thêm KS vào trong môi trường phân lập.
 Phương pháp sử dụng các VSV đột biến có cường độ hô hấp thấp làm
VSV kiểm định (phân lập KS chống ung thư).
1.4. Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn
VSV tổng hợp KS phân lập được từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt
tính thấp. Vì vậy để thu được các chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh
đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác
nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp.
1.4.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10

-10
– 10
-5
trong
ống giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau. Trong đó có biến
chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20-30% những cá thể khác. Cần phải
chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [6]
1.4.2. Đột biến cải tạo giống
Các tác nhân đột biến bao gồm:
9

 Các tác nhân hóa học: Acid nitrơ (HNO
2
), ethylenimin
(CH
2
NHCH
2
), dimethylsulfat ((CH
3
)
2
SO
4
), hydroxylamin (H
3
NO)…
 Các tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion
hóa khác. Khả năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào cường độ
bức xạ, khoảng các chiếu và thời gian chiếu.

 Các tác nhân sinh học: Các yếu tố di truyền vận động Transposable
Genetic Elements. [17]
Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao
phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp với các phương pháp di truyền
phân tử như tái tổ hợp định hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật
tạo và dung hợp TB trần.
Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến, phần lớn các VSV
chết. Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng
hợp KS tăng (đột biến dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm).
Cần chọn lọc ra những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu
tiếp. [6]
1.4.3. Bảo quản giống xạ khuẩn
Việc cải tạo thành công chủng VSV sẽ không có ý nghĩa nếu chủng
giống không được bảo quản tốt để có thể sống sót và duy trì các tính trạng thu
được. Do đó việc bảo quản giống VSV là việc có ý nghĩa hết sức quan trọng.
[18]
Các phương pháp bảo quản giống VSV có thể kể đến như: bảo quản
lạnh, làm khô, đông khô, đông lạnh. [19]
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Có 2 phương pháp lên men chính:
 Lên men bề mặt: Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy
trên bề mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng.
10

 Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không
đòi hỏi thiết bị phức tạp.
 Nhược điểm: Khó cơ giới hóa, tự động hóa, khó vô trùng, tốn diện
tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng môi trường thấp. [6]
 Lên men chìm: VSV (hiếu khí hoặc kỵ khí) được nuôi cấy trong môi
trường lỏng.

 Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy
trình, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
 Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn. [10]
 Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung,
lên men bán liên tục, lên men liên tục. [14]
1.6. Chiết tách và tinh chế sản phẩm
 Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Tùy theo đặc
trưng của loài mà KS được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong TB.
Để thu được các chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách
thích hợp.
 Một số phương pháp chiết tách thường dùng: [1]
 Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
 Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên
cột…).
 Phương pháp tạo phức kết tủa.
 Chiết xuất:
Chiết xuất là phương pháp tách một hay một số chất ra khỏi hỗn hợp. Đó
là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha
lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng-rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng
lỏng-lỏng, thường một pha là nước). [6]
 Phương pháp sắc ký:
11

 Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng
rẽ từ một hỗn hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích
được hòa tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và
không hòa lẫn vào nó. Pha tĩnh được cố định trên cột hay bề mặt chất rắn. Các
chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác
nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di
chuyển khác nhau mà các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành

dải trên sắc ký đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng. [8]
 Cơ chế của chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion,
sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào
tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
 Các phương pháp sắc ký hay được sử dụng trong tinh chế KS:
 Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản
mỏng. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được pha theo tỷ
lệ. Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác dụng của
trọng lực. [16]
 Sắc ký rửa giải trên cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động di
chuyển qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực. Quá trình rửa giải được thực
hiện bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động. [9]
1.7. Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh
1.7.1. Phổ hồng ngoại
 Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR)
khi nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau.
 Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và
thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối
tương quan giữa nhóm nguyên tử và giải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có
mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có
12

các dải phổ hấp thụ đặc trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng
IR. [4]
1.7.2. Phổ tử ngoại
 Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước
sóng hay số sóng là phổ tử ngoại. [5]
 Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện
tử của phân tử. Các điện tử ở trạng thái cơ bản E
0

chuyển sang trạng thái kích
thích E
1
, E
2
. Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron
trong liên kết đơn, liên kết đôi, hệ thống thơm…, hay cặp electron tự do
không tham gia liên kết của O, N, các halogen. [1]
 Phổ khối :

 Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và
điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên
tử của mẫu. Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn
phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10
-6
mmHg). Trong quá trình đó chất
hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng
với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp
thành một khối phổ đồ.
 Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các
chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất. [1]
1.8. Một số nghiên cứu liên quan
1.8.1. Quy tắc sinh tổng hợp kháng sinh thiopeptid Cyclothiazomycin bằng
cách phiên mã chuỗi SHJG8833 của Streptomyces hygroscopicus 5008.[25]
Cyclothiazomycin là một kháng sinh thiopeptid, thường là các dẫn xuất
phức tạp của các peptide ribosomally. Một nhóm gen có chứa 12 khung được
đọc mở trùng với cụm gen mã hóa cyclothiazomycin từ Streptomyces
hygroscpicus 10-22 đã được phát hiện trong trình tự bộ gen của Streptomyces
13

hygroscpicus 5008. Gen SHJG8833 và SHJG8837 của cụm gen SHJG8838
được dự đoán sẽ mã hóa các protein điều hòa từ những chủng khác nhau.
Điểm khởi đầu của phiên mã SHJG8833 nằm ở một thymidine 54
nucleotid của codon khởi đầu. Nếu gen GHJG8833 bất hoạt thì
cyclothiazomycin sẽ không được tổng hợp, và tổng hợp cyclothiazomycin có
thể được phục hồi khi kích hoạt SHJG8833 bằng dòng điện đột biến. Phân
tích gen chỉ ra rằng SHJG8833 quy định một tập hợp liên tiếp gồm 7 gen từ
SHJG8826 đến SHJG8832. Phân tích cũng chỉ ra rằng khi sao chép 7 gen có
thể tạo thành 2 cụm gen, SHJG8826-27 và SHJG8828-32. Phân tích ca gel đã
chứng minh miền ADN của SHJG8833 liên kết điểm khởi đầu của SHJG8826
với SHJG8828 và một chuỗi trong SHJG8826 và SHJG8829. Những kết quả
này chỉ ra rằng SHJG8833 là một gen điều phối sinh tổng hợp
cyclothiazomycin bằng cách kích hoạt các gen cấu trúc trong cụm clt.
1.8.2. Sự kích hoạt và bất hoạt các chất chuyển hóa thứ cấp ở Streptomyces
albus và Streptomyces lividans sau khi chuyển đổi với cosmids có chứa các
cụn gen thienamycin từ Streptomyces cattleya.[21]
Sự kích hoạt và bất hoạt trong sản suất kháng sinh đã đạt được ở
Streptomyces albus J1074 và Streptomyces lividans TK21 sau khi có cụm gen
thienamycin của S. cattleya. Sự thay đổi mạnh mẽ về hình thái và sự trao đổi
chất có liên quan đến sự hoạt hóa của nhiều chất chuyển hóa thứ cấp và bất
hoạt của các chất khác, đã được tìm thấy ở các chủng tái tổ hợp chứa cụm
thienamycin so với chủng trước đó.
Với S. albus, sắc ký lỏng hiệu năng cao và cấu trúc NMR đã phát hiện
ra bốn hợp chất có hoạt tính: các kháng sinh paulomycins A, B và
paulomenols A và B. Bốn hợp chất được tạo thành là các chất dễ bay hơi
được phát hiện bằng sắc ký khí và phổ khối và là cơ sở để so sánh với
pyrazines; bao gồm tetramethylpyrazin, một hợp chất có nhiều ứng dụng quan
14

trọng trong lâm sàng chừa từng được sản xuất bởi Streptomyces. Ngoài ra,

việc này cho thấy tiềm năng của S .albus để sản xuất ra nhiều chất chuyển hóa
thứ cấp khác từ thực vật, bao gồm các hợp chất trong y học như dihydro-β-
agarofuran và trong ngành công nghiệp nước hoa như β-patchoulena.
Đối với S. lividans, sản xuất actinorhodins đã được kích hoạt mạnh mẽ
trong các chủng tái tổ hợp trong khi undecylprodigiosins đã giảm đáng kể.
Việc kích hoạt các chất chuyển hóa trong các chủng Streptomyces có thể tìm
ra các thuốc mới.













15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: Chủng xạ khuẩn Streptomyces 183.224 được phân
lập từ mẫu đất Quận 9, Thành phố Hồ Chí Minh tại bộ môn Vi Sinh-Sinh Học
trường Đại học Dược Hà Nội.
 Giống VSV kiểm định: Các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi
Sinh-Sinh Học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp. (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật kiểm định
Vi khuẩn Gr(+) Vi khuẩn Gr(-)
Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus pumilus ATCC 10241 Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201
Sarcina lutea ATCC 9341 Salmonella typhi DT 220
Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri DT 112
 Môi trường: Gồm các môi trường kiểm định, môi trường nuôi cấy xạ
khuẩn, môi trường ISP.
 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: (bảng 2.1)
Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần

MT
NaCl (%)
Cao thịt
(%)
Pepton
(%)
Thạch
(%)
pH
Canh thang 0,5 0,3 0,5 0
7,0-7,4
Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8
Nước cất vđ 100 100 100 100
 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: (bảng 2.3)
16

Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

MT


Thành phần (g)
MT1

MT2

MT3 MT4

MT5 MT6

MT7

Tinh bột 2 2 2,4 2
Lactose
Glucose 2 1
Cao ngô 0,5 0,5
Saccarose 3
Bột đậu tương 1,5
Cao thịt 0,3 0,3
Pepton 0,3 0,5
KNO
3
0,1
KCl 0,05
NaNO
3
0,2
NH

4
NO
3
0,2 0,2
CaCO
3
0,3 0,4 0,4 0,2
(NH
4
)
2
SO
4
0,2
K
2
HPO
4
0,05 0,1 0,1 0,05
MgSO
4
.7H
2
O 0,05 0,05 0,25 0,15
NaCl 0,05 0,1 0,5
Cao nấm men 0,5
Thạch 1,8 2 2 2 2 2 1,8
Nước máy vđ (ml) 100 100 100 100 100 100 100
pH 6,8-7,2