Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 180 245

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGÔ THỊ MINH TÂM

NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪ STREPTOMYCES 180.245

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI – 2013




BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGÔ THỊ MINH TÂM


NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪ STREPTOMYCES 180.245

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn :
PGS.TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện :
Bộ môn Vi sinh – sinh học

HÀ NỘI – 2013



Lời cảm ơn
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Cao Văn Thu –
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các cán bộ , kỹ thuật viên
đang giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp
dược, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, khoa Hóa trường Đại học Quốc gia
Hà Nội, Viện hóa học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, thư viện
Khoa học kỹ thuật đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể
các thầy, cô giáo, cán bộ công nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội
đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá
trình học tập, nghiên cứu tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do những hạn chế về thời gian, phương tiện và trình độ của bản thân,
chắc chắn khóa luận này còn có nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được
những ý kiến đóng góp của các thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn
thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội ngày18 tháng 5 năm 2013
Sinh viên




Ngô Thị Minh Tâm



MỤC LỤC

BỘ Y TẾ 1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 1
NGÔ THỊ MINH TÂM 1
NGHIÊN CỨU LÊN MEN 1
TỔNG HỢP KHÁNG SINH 1
TỪ STREPTOMYCES 180.245 1
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 1
HÀ NỘI – 2013 1
BỘ Y TẾ 2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 2
NGÔ THỊ MINH TÂM 2
NGHIÊN CỨU LÊN MEN 2
TỔNG HỢP KHÁNG SINH 2
TỪ STREPTOMYCES 180.245 2
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 2
HÀ NỘI – 2013 2
Lời cảm ơn 3

I. TỔNG QUAN 2
1.1 Đại cương về kháng sinh 2
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2 Phân loại kháng sinh 2
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3
1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 3
1.1.5 Giới thiệu về tính kháng kháng sinh 4
1.2 Đại cương về xạ khuẩn 4
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: 5
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 6
1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 7
1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 8
1.4.1 Mục đích 8
1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên 8
1.4.3 Đột biến cải tạo giống 9
1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn [9,14 ] 9
1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 10
1.5.1 Khái niệm lên men ái khí 10
1.5.2 Các phương pháp lên men 11
1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11
1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 12


1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 12
1.6.2 Các phương pháp chiết tách [1, 3, 9] 12
1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 13
1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến 13
1.7.2 Phổ hồng ngoại 13
1.7.3 Khối phổ MS 13
1.8 Sử dụng tương tác giữa các loài để sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp

trong xạ khuẩn 14
1.9 Hoạt tính kháng khuẩn invitro của xạ khuẩn biển chống lại
Staphylococcus aureus đa kháng thuốc 14
1.10 Sàng lọc, phân lập, phân loại và lên men sản xuất kháng sinh từ
Streptomyces xinghaiensis có hoạt tính chống lại các chủng kháng linezolid 15
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 15
2.1.1 Nguyên vật liệu 15
2.1.2 Máy móc thiết bị 19
2.2 Nội dung nghiên cứu 19
2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 180.245 19
2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống 20
2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 20
2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 20
2.3 Phương pháp thực nghiệm 20
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20
2.3.2 Phân loại xạ khuẩn theo ISP 20
2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch
tán 21
2.3.4 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 22
2.3.5 Sàng lọc ngẫu nhiên 22
2.3.6 Đột biến 23
2.3.7 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 24
2.3.8 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 25
2.3.9 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 25
2.3.10 Xác định độ bền của dịch chiết kháng sinh với ánh sáng 26
2.3.11 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 26
2.2.12 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 27
2.3.13 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 27
2.3.14 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 27
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 28

3.1 Xác định tên khoa học của Streptomyces 180.245 28
3.2 Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 28
3.3 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 29


3.4 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 30
3.5 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 31
Tiếp tục đem chủng 8.27 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng
cách 60 cm, thời gian 5 phút. Tỷ lệ sống sót là 0,22%. Mang 33 biến chủng
thu được thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Kết quả chính như sau : 31
3.6 Kết quả đột biến hóa học 31
3.7 Kết quả chọn môi trường lên men chìm 32
3.8 Kết quả chọn chủng lên men 33
3.9 Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt 33
3.10 Kết quả chọn dung môi và pH chiết 34
3.11 Kết quả thử độ bền của dịch chiết kháng sinh trong DM với ánh
sáng 35
3.12 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 35
3.13 Kết quả sắc ký cột lần 1 35
3.14 Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi lần 2 : 36
3.15 Kết quả sắc kí cột lần 2 37
3.16 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 37
3.16.1 Nhiệt độ nóng chảy 180,5ºC. 37
3.16.3 Phổ hồng ngoại 38
3.16.4 Phổ khối : 38
VI. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
KẾT LUẬN 40
KIẾN NGHỊ : 41
Bảng phụ lục 1 : Một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ISP International Streptomyces Project
(Chương trình Streptomyces quốc tế)
B.subtilis Bacillus subtilis
P. mirabilis Proteus mirabilis
S.olivoverticillatus Streptomyces olivoverticillatus
MDRSA Multi drug resistance Staphylococus aureus
HTKS Hoạt tính kháng sinh
MIC Minimum inhibitory concerntration
( nồng độ ức chế tối thiểu )
MT Môi trường
MTidt Môi trường i dịch thể
DM Dung môi
ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
VSV Vi sinh vật

MC Mẫu chứng
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
UV1 Đột biến UV lần 1
UV2 Đột biến UV lần 2
HH Đột biến hóa học
vđ vừa đủ
đvC đơn vị carbon







DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định 15
Bảng 2: Các dung môi sử dụng 17
Bảng 3: Các đặc điểm của Streptomyces 180.245 vàS. olivoverticillatus theo ISP 28
Bảng 4: HTKS của Streptomyces 180.245 trên MT1,MT2, MT3, MT7 30
Bảng 5: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 30
Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến UV lần 1 30
Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến UV lần 2 31
Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học 31
Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men chìm 32
Bảng 10: Kết quả chọn chủng lên men 32
Bảng 11: Kết quả thử độ bền pH 33
Bảng 12: Kết quả thử độ bền nhiệt 33
Bảng 13: Kết quả chọn dung môi và pH chiết 34
Bảng 14: Kết quả thử độ bền của dịch chiết với ánh sáng phòng 34

Bảng 15: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký lần 1 35
Bảng 16: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 35
Bảng 17: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký lần 2 36
Bảng 18: Kết quả chạy sắc ký lần 2 36
Bảng phụ lục 1 : Một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra
Bảng phụ lục 2 : Thành phần các hệ dung môi sử dụng









DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của một số họ kháng sinh chính 3
Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn 5
Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 5
Hình 4: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn 6
Hình 5: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh 7
Hình 6: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn 10
Hình 7:Phổ UV - VIS 37
Hình 8: Dự đoán thành phần phân tử dựa vào phổ khối 38
Hình 9: Dự đoán cấu trúc phân tử dựa theo kết qủa MS ( trích ) 38
Hình phụ lục 1 : Hình ảnh hiển vi chuỗi bào tử
Hình phụ lục 2: Hình ảnh hiển vi bề mặt bào tử
Hình phụ lục 3 : Nuôi cấy xạ khuẩn bề mặt
Hình phụ lục 4 : Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

Hình phụ lục 5 : Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc
Hình phụ lục 6 : Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch
Hình phụ lục 7 : Hiện hình VSV vết sắc kí lớp mỏng
Hình phụ lục 8: Sắc kí cột tinh chế kháng sinh
Hình phụ lục 9: Một số cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn
Hình phụ lục 10: Phổ IR
Hình phụ lục 11 : Phổ khối





1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển về vi sinh vật học , với bước ngoặt lịch sử là phát minh về penicilin đã
mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất kháng sinh và
ứng dụng kháng sinh vào điều trị cho con ngườ i. Từ khi ra đời đến nay, kháng sinh
luôn thể hiện được vai trò quan trọng trong y học, trở thành công cụ đắc lực trong
phòng và chữa bệnh. Vì vậy, nhu cầu có các kháng sinh có hiệu quả cao, ít bị kháng
và độc tính thấp là tất yếu đối với nền y tế của các quốc gia trong đó có Việt Nam
chúng ta – một nước đang phát triển có tỉ lệ bệnh nhiễm trùng cũng như tỉ lệ kháng
kháng sinh cao.
Môi trường khí hậu đa dạng ở nước ta là điều kiện thuận lợi cho nhiều loại vi
sinh vật phát triển, trong số đó là xạ khuẩn. Rất nhiều xạ khuẩn, đặc biệt là xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và nhiều hoạt chất có
giá trị trong y học khác. Với thực trạng nước ta hiện nay, hầu hết kháng sinh trên thị
trường là nhập khẩu (dạng thành phẩm hoặc bán thành phẩm ), ngành công nghiệp
sản xuất kháng sinh chưa phát triển, đây là một hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các

thuốc mới, kháng sinh mới đưa vào sản xuất và điều trị. Do đó, chúng tôi đã lựa
chọn đề tài “ Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces
180.245 ” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau :
- Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 180.245,
- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh,
- Xác định các điều kiện tối thích để lên men, chiết tách kháng sinh,
- Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được .






2


I. TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1 Định nghĩa kháng sinh
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn
khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn
lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh,…) hay tế
bào ung thư ở nồng độ thấp [10,16] Cần phân biệt một số chất cũng do VSV tạo ra
nhưng không được gọi là kháng sinh (ethanol, các acid hữu cơ,…) vì chúng tác
dụng lên VSV khác không chọn lọc và ở nồng độ cao.[16]
1.1.2 Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của
vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng ,…[10,17] Phân loại kháng sinh theo
cấu trúc hóa học rất quan trọng vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định
hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc

hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác. [7]
Sau đây là một số nhóm kháng sinh phân loại theo cấu trúc hoá học : [7,10]
- Các kháng sinh β-lactam ( các penicillin, cephalosporin)
- Các kháng sinh cloramphenicol ( cloramphenicol, )
- Các kháng sinh aminoglycosid (streptomycin, gentamicin,…)
- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin , minocyclin…)
- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…)
- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…)
- Các kháng sinh lincosamid ( clindamycin , lincomycin ,…)
- Các kháng sinh ansamycin ( rifamycin, rifampicin )
- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…)
- Các kháng sinh nhóm antracyclin (daunorubicin)
- Các kháng sinh nhóm actinomycin (dactinomycin D).
- Các kháng sinh nhóm quinolon ( ciprofloxacin , ofloxacin ,…)
3

- Các kháng sinh sulfonamid (sulfamethoxazol )
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các
phân tử đích của tế bào VSV, làm biến đổi các phản ứng đó[10,17].
Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau ở vi khuẩn. Có 6
kiểu chủ yếu [17]:
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào,
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất,
- Tác dụng lên sự tổng hợp AND,
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein,
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp,
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.

Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính
1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh
4

Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực khác như :
- Trong chăn nuôi: dùng kháng sinh trong thú y để chữa bệnh cho động vật:
Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được
sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn,
tăng sản lượng trứng ở gà, vịt. [11]
- Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus
gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizoctonia solani gây bệnh
khô vằn hại lúa .[11]
- Trong công nghiệp thực phẩm: bảo quản thực phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt
VSV trong thực phẩm: Subtilin (do B.subtilis tạo ra) [11]
1.1.5 Giới thiệu về tính kháng kháng sinh
Kháng thuốc là hiện tượng VSV mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong
một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu.[10,16]
Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới
nhận[16,17]. Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi VSV nhất định đối với
một số kháng sinh nhất định nào đó. Kháng thuốc mới nhận (tham khảo Hình phụ
lục 9) có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các enzyme vô hiệu hóa kháng
sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế
khác mà hoạt chất không tác dụng.[16]
1.2 Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C trên 55%. Trong
mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn
là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do có thể sinh tổng
hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà

khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.[5,6,12,16,19]
5

Trong số hơn 16,000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng
55-60 % là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại
enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.[12,16]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
- Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi.
Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ
khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không
trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[16]

Hình 2 : Khuẩn lạc xạ khuẩn
- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3
μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết
sức phong phú: da cam, đen đỏ, nâu, trắng, vàng, xám…[19]
6



Hình 3 : Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có
cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng
hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces.[10,16] (Tham khảo Bảng phụ lục 1 )
- Đặc điểm hình thái:
Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh :
+ Khuẩn ty cơ chất : mọc sâu vào MT nuôi cấy, không phân cắt trong suốt
quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra MT một số loại sắc tố,

có loại tan trong nước, có loại chỉ tan trong DM hữu cơ.[19]
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí.
+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) khuẩn ty khí sinh sau một thời gian phát triển
trên đỉnh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có rất nhiều hình dạng khác
nhau: thẳng, uốn cong, móc câu, xoắn; phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ
quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn, xù xì
da cóc, có gai hoặc có tóc .[5,16,19]

Actinomycetes
VSV giống xạ khuẩn Actinomycetales
Actinoplanaceae Streptomycetaceae Actinomycetaceae
…
Streptomyces Streptoverticulum Themostreptomyces
…
7


`Hình 4 : Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn
- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao.
Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và
năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử
nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích
của chúng là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[16,19]
- Khả năng tạo sắc tố:
Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố
của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.[19]
1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm
Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm

Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống
Bình lên men tạo kháng sinh
Dịch lên men
Dịch lọc Sinh khối
Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh
8


Hình 5: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [13]
1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.4.1 Mục đích
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước,
mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp[14]. Do
đó, để thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn
giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản
thích hợp.[10,14]
1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên
9

Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể có HTKS tăng lên 20-30 % so với những cá thể khác. Cần phải chọn
cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [16]
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có
khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến
nhân tạo.[11,16]
1.4.3 Đột biến cải tạo giống
Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến : [11,13,16]
- Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO
2

), dimethylsulphat,
hydroxylamin ,…
- Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia α hay β. Tác nhân vật lý hay được
dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng
cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ.
- Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon,…
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết
chết hầu hết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm
thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất, làm giảm khả năng tạo kháng sinh
(đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh mẽ (đột
biến dương). [13,14]
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành
đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định
hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.[14]
1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn [9,14 ]
Bảo quản giữ giống VSV rất cần thiết với mục đích cụ thể là: giữ giống VSV
có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm
bởi các VSV lạ. [9,14]
Thông thường, có 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:[14]
10

- Bảo quản trong lọ hoặc ống MT trong tủ lạnh, định kỳ cấy chuyền sang
ống (hoặc lọ) MT mới.
- Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng)
- Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh,
làm khô mẫu đông lạnh)
- Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh
và bảo quản ở nhiệt độ thấp).
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi
cấy xạ khuẩn trên MT thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh

2
o
C và định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần.
1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.5.1 Khái niệm lên men ái khí
Lên men ái khí là các quá trình phân giải, chuyển hóa hydratcarbon trong
điều kiện ái khí. Hiểu theo nghĩa rộng, lên men ái khí bao gồm tất cả những quá
trình lên men chuyển hóa các nguồn carbon sinh tổng hợp các sản phẩm sơ cấp và
thứ cấp, trong đó có lên men sản xuất các kháng sinh, một số vitamin…, là những
sản phẩm có ứng dụng quan trọng trong Y Dược học. [16]
Tất cả các quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh là các quá trình lên
men ái khí. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết
thúc quá trình sinh trưởng của VSV, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng.
[11,16]

11

Hình 6 : Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn[11,16]
1.5.2 Các phương pháp lên men
- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn
hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không
khí để hô hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn
giản, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng,
hiệu suất sử dụng không gian thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng
phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[4,11]
- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3
chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng
đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.
Có 4 kiểu lên men chìm như sau:[4]
+ Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên

men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm.
Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.
+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm MT dinh
dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng cao hiệu quả sử
dụng bình lên men.
+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát
triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng
thời bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình.
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh
dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những
khoảng thời gian nhất định.
1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
- pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực
tiếp của các ion H
+
hay OH
-
đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc
là tác dụng gián tiếp.[14]
12

- Nhiệt độ: Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng mà còn
ảnh hưởng đến kiểu sinh sản, hình thái, trao đổi chất và nhu cầu dinh dưỡng của
VSV. Ở nhiệt độ thấp VSV không phát triển được, ở nhiệt độ cao VSV bị chết do
biến tính protein và kể cả ARN [16]. Thiết bị lên men cần có bộ phận trao đổi nhiệt
hữu hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tối thích cho VSV.[11]
- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy tương thích tốc
độ sử dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh
trưởng, rút ngắn pha tiềm tàng. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai

đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ
hòa tan oxy lớn nên thông khí khá mạnh là tốt.[11,14]
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để tìm các điều kiện tối thích tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh
tổng hợp chất mong muốn.
1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá
trình lên men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men
thường thấp. Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế
sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị. Công đoạn
tinh chế sẽ quyết định tới giá thành của sản phẩm.[11]
1.6.2 Các phương pháp chiết tách [1, 3, 9]
- Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp lọc ( thường
dùng giấy lọc hoặc bông), sinh khối được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chui qua
do chênh lệch áp suất trên và dưới lớp lọc.[9]
- Ly tâm: là phương pháp tách các chất có khối lượng riêng khác nhau,
thường là tách pha rắn khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm.[9]
- Chiết bằng DM hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách (đang hòa tan trong
dịch lọc) sang pha DM hữu cơ.[9]
13

- Các phương pháp sắc ký:[1,3]
+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên
khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một rắn hấp
phụ. Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại lượng
đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số R
f
.
+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự

phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo
thành màng phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt
nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là DM thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi
mức năng lượng của các điện tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa
cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối
quan hệ chặt chẽ (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự hấp
thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử có
đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng
lượng ánh sáng UV-VIS.[1,2,8,18]

1.7.2 Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái năng
lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử. [1,18]
Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử.
Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.[1,2,8]
1.7.3 Khối phổ MS
Khối phổ ( MS – mass spectrometry) là kĩ thuật đo trực tiếp tỉ số khối lượng
và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử
của mẫu. Các ion tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
14

phân tích khối. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng các pic có
cường độ khác nhau tập hợp thành phổ khối.[1,18]
Phổ khối cung cấp thông tin định tính về khối lượng phân tử, nhận dạng các
chất, xác định cấu trúc và định lượng các chất.[1,2]
1.8 Sử dụng tương tác giữa các loài để sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp trong
xạ khuẩn

Xạ khuẩn từ lâu đã là nguồn đáng kể sinh tổng hợp các hoạt chất cho điều trị.
Các nghiên cứu gần đây về trình tự gen và phiên mã đã chỉ ra rằng các xạ khuẩn
chịu trách nhiệm cho khoảng một nửa số thuốc kháng sinh được sử dụng trên lâm
sàng, chứa một lượng lớn các tập hợp gen, có tiềm năng sản xuất ra nhiều chất mới .
Tuy nhiên, rất nhiều cụm gen không được biểu hiện trong điều kiện nuôi cấy
thông thường. Có một nguyên nhân của thực tế này nằm ở phương pháp nghiên cứu
xạ khuẩn thường dùng: xạ khuẩn được nuôi cấy trong MT giàu dinh dưỡng nhưng
không bắt chước các điều kiện phức tạp trong đó các xạ khuẩn phát triển. Phương
pháp mới dựa trên điều kiện nuôi đa loài cung cấp một cách mới để điều tra các sản
phẩm của các cụm gen. Gần đây nhóm nghiên cứu đã thực hiện ghép cặp giữa các
loài thử nghiệm tương tác để khai thác chất chuyển hóa thứ cấp mới và nghiên cứu
sinh học cơ bản của tương tác liên xạ khuẩn. Các phương pháp sinh học và hóa học
cũng được mô tả chi tiết trong nghiên cứu . [22]
1.9 Hoạt tính kháng khuẩn invitro của xạ khuẩn biển chống lại Staphylococcus
aureus đa kháng thuốc
Năm mươi mốt chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất muối ven biển vùng
Kothapattanam, Ongole, bang Andhra Pradesh.[21]
Sàng lọc ban đầu được thực hiện bằng phương pháp cấy vạch vuông góc với
MDRSA. Các chất có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ các xạ khuẩn bằng DM.
Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết và dịch lọc được xác định bằng phương pháp
Kirby-Bauer. MIC của dịch chiết ethylacetate xác định bằng phương pháp khuếch
tán. Các xạ khuẩn mạnh được xác định bằng khóa Nonomura, Shirling - Gottlieb
năm 1996 với hướng dẫn Bergey. Kết quả trong số năm mươi mốt chủng được phân
15

lập sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, xạ khuẩn SRB25 đã thể hiện hiệu quả chống lại
MDRSA. Các dịch chiết ethylacetate thể hiện sự ức chế cao đối với VSV kiểm định.
Thử nghiệm thực hiện với các dịch chiết ethylacetate chống MDRSA và tìm được
MIC là 1000 µg /ml.
Điều tra cho thấy các xạ khuẩn biển từ MT chảo muối có thể có thể sản xuất

các chất mới chống lại VSV kháng thuốc. [21]
1.10 Sàng lọc, phân lập, phân loại và lên men sản xuất kháng sinh từ
Streptomyces xinghaiensis có hoạt tính chống lại các chủng kháng linezolid
Tình trạng kháng linezolid đang xuất hiện ở các bệnh viện. Trong nghiên cứu
đang thực hiện, đã có 3 loại xạ khuẩn phân lập từ đất có tiềm năng trong sản xuất
kháng sinh chống lại các trường hợp kháng linezolid, trong đó mẫu nuôi cấy mang
mã số RK46 được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn. Sau các thử nghiệm hóa sinh, vi sinh
và phân tích trình tự gen 16S rDNA, mẫu xạ khuẩn này được xác định là một dòng
Streptomyces xinghaiensis, sản xuất ra kháng sinh có hiệu quả trên 5 chủng VSV
kháng linezolid trên lâm sàng. Quá trình sản xuất kháng sinh được thử nghiệm trên
11 MT khác nhau, trong đó có MT có bổ sung calcium carbonate, họạt tính tối đa
ghi nhận được sau 72 h. Thành phần có HTKS được chiết bằng DM ethylacetat và
tinh khiết hóa bằng các phương pháp sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng và sắc kí lỏng hiệu
năng cao. Hoạt chất tinh khiết có thời gian rửa giải 6,8 phút và được phân tích 1H,
13C cộng hưởng từ hạt nhân và MS. So sánh với các chất kháng sinh tự nhiên đã
biết cho thấy đây là kháng sinh reductiomycin, hợp chất này thể hiện hoạt tính trên
5 mẫu VSV kháng linezolid và trên Mycobacterium tuberculosis, đồng thời thể hiện
hoạt tính chống ung thư nhẹ. [20]
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1 Nguyên vật liệu
 Môi trường
 Các MT thạch nuôi cấy xạ khuẩn bề mặt :
16

MT1 : MT2:
Tinh bột 2 g Tinh bột 2 g
KNO
3
0,1 g KCl 0,05 g

K
2
HPO
4
0,05 g K
2
HPO
4
0,1 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,05 g MgSO
4
.7H
2
O 0,05 g
NaCl 0,05 g NaNO
3
0,2 g
FeSO
4
.7H2O 0,01 g FeSO
4
.7H2O 0,01 g
Thạch 1,8 g Thạch 2 g

MT3 MT4
Lactose 3 g Glucose 2 g

Cao ngô 0,5 g Cao ngô 0,5 g
NH
4
NO
3
0,2 g NH
4
NO
3
0,2 g
CaCO
3
0,3 g CaCO
3
0,4 g
K
2
HPO
4
0,1 g K
2
HPO
4
0,05 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,15g MgSO
4

.7H
2
O 0,25 g
Thạch 2 g Thạch 2 g

MT5 MT6
Tinh bột 2,4 g Tinh bột 2 g
Glucose 1 g Bột đậu tương 1,5 g
Cao thịt 0,3 g (NH
4
)
2
SO
4
0,2 g
Pepton 0,3 g NaCl 0,1 g
CaCO
3
0,4 g CaCO
3
0,2 g
Thạch 2g Cao nấm men 0,5 g
Thạch 2 g
MT7
Saccarose 3g
Cao thịt 0,3 g
Pepton 0,5 g
NaCl 0,5 g
Thạch 1,8 g
Cân các thành phần , thêm nước vừa đủ 100 ml ( pH 6,8 – 7 )

 Các MT dịch thể (MTdt): thành phần tương ứng các MT nuôi cấy bề mặt
nhưng không có thạch.
Bảng 1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định