Xây dựng phương pháp định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong chế phẩm bằng điện di mao quản

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



ĐỖ THỊ HÒA


XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI
QUANG CỦA ATENOLOL TRONG
CHẾ PHẨM BẰNG ĐIỆN DI MAO
QUẢN


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI -2014


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ HÒA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI
QUANG CỦA ATENOLOL TRONG
CHẾ PHẨM BẰNG ĐIỆN DI MAO

QUẢN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Th.S. Vũ Ngân Bình
2.
DS. Ngô Minh Thúy

Nơi thực hiện đề tài:
1. Bộ môn Hóa phân tích & Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội
2.
Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới
ThS. Vũ Ngân Bình – Bộ môn Hóa phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược
Hà Nội, DS. Ngô Minh Thúy và PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – Phòng Quản
lý khoa học – Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo,
giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo, các anh/ chị kỹ thuật viên tại Bộ
môn Hóa phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như toàn thể
anh/ chị cán bộ, công nhân viên tại Labo Hóa – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo
và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến
thức quý báu trong suốt năm năm em học tập tại trường.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè, và những người luôn theo sát

chăm lo, động viên, kích lệ em trong học tập và cuộc sống.





Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014
Sinh viên


Đỗ Thị Hòa


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL 3
1.1.1. Tính chất lý, hóa 3
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN 6
1.2.1. Khái niệm 6
1.2.2. Nguyên lý của quá trình điện di mao quản 7
1.2.3. Điện di mao quản vùng 9
1.3. VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC 10
1.3.1. Đồng phân quang học 10
1.3.2. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 10
1.3.3. Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học 12

1.4. TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE SỬ DỤNG
CYCLODEXTRIN LÀ TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG 13
1.4.1. Tổng quan về Cyclodextrin 13
1.4.2. Tách đồng phân đối quang sử dụng Cyclodextrin là tác nhân chọn lọc
đối quang 15
1.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
CỦA ATENOLOL 16
1.5.1. Nghiên cứu trong nước 16
1.5.2. Nghiên cứu trên thế giới 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19
2.1.2. Dung môi và hóa chất 19
2.1.3. Trang thiết bị 19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20
2.2.1. Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol
bằng điện di mao quản 20
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol
bằng điện di mao quản 20
2.2.3. Ứng dụng phương pháp này định lượng chế phẩm có chứa Atenolol
trên thị trường 21
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.3.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm
việc 21
2.3.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 22
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 23
2.3.4. Ứng dụng định lượng Atenolol trong các chế phẩm trên thị trường 23
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu 23
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25
3.1. KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN ĐIỆN DI 25

3.1.1. Lựa chọn cột mao quản 25
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của điện thế áp vào hai đầu mao quản. 26
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 28
3.2.1. Độ phù hợp hệ thống 28
3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính 29
3.2.3. Độ đặc hiệu 31
3.2.4. Độ lặp lại 33
3.2.5. Độ đúng 34
3.3. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM. 36
BÀN LUẬN 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BGE (Background Electrolyte) Dung dịch điện ly nền
CE (Capillary Electrophoresis) Điện di mao quản
CGE (Capillary Gel Electrophoresis) Điện di mao quản gel
CIEF (capillary isoelectric focusing)
Điện di mao quản hội tụ
đẳng điện
CITP (capillary isotachophoresis) Điện di mao quản đẳng tốc
CM-β-CD
Carboxymethyl beta
cyclodextrin
CZE (Capillary Zone Electrophoresis) Điện di mao quản vùng
DM- β-CD Dimethyl beta cyclodextrin

EOF ( Electro-osmotic flow ) Dòng điện thẩm
GC (Gas Chromatography) Sắc ký khí
HPCE (High Performance Capillary Electrophoresis)
HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao
MEKC (Micellar Electrokinetic Chromatography) Sắc ký điện động mixen
R
s
(Resolution) Độ phân giải
RSD ( Relative Standard Deviation ) Độ lệch chuẩn tương đối
SD (Standard Deviation) Độ lệch chuẩn
SĐK Số đăng ký
SFC (Supercritical fluid chromatography) Sắc ký lỏng siêu tới hạn
SKS Số kiểm soát
TLC (Thin layer chromatography) Sắc ký lớp mỏng
Tris
Tris(Hydroxymethy)
amimomethan
β-CD Beta cyclodextrin

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Tính chất của một số CD tự nhiên. 14

Bảng 2: Độ phù hợp hệ thống 28

Bảng 3: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Atenolol racemic 29

Bảng 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 30

Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu thử M1 34

Bảng 6: Kết quả xác định phần trăm tìm lại trên mẫu M1(thêm 10%) 35

Bảng 7: Kết quả xác định phần trăm tìm lại trên mẫu M1(thêm 20%) 36

Bảng 8: Kết quả định lượng mẫu M2 37




















DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1: Công thức cấu tạo của Atenolol 3

Hình 2: Sơ đồ hệ thống điện di mao quản. 7

Hình 3: Sự hình thành dòng EOF 8

Hình 4: Giá trị thực của hiệu điện thế 25

Hình 5: Giá trị thực của cường độ dòng điện: 26

Hình 6: Điện di đồ ở 3 hiệu điện thế 27

Hình 7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của S-(-)-Atenolol theo nồng độ
S-(-)-Atenolol 30

Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic của R-(+)-Atenolol theo nồng độ
R-(+)-Atenolol 31

Hình 9: Điện di đồ mẫu placebo 32

Hình 10: Điện đi đồ mẫu Atenolol racemic chuẩn 100 ppm. 32

Hình 11: Điện di đồ mẫu thử 100 ppm. 32

Hình 12: Điện di đồ mẫu M2 37

Hình 13: Vị trí tương tác liên kết hydro[22]. 39



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, trong điều trị trên lâm sàng đã sử dụng ngày càng nhiều các thuốc

có chứa hoạt chất là các dạng đồng phân quang học tinh khiết, giúp nâng cao hiệu
quả điều trị, giảm liều dùng và hạn chế được nhiều tác dụng không mong muốn so
với khi dùng thuốc có chứa hoạt chất ở dạng hỗn hợp racemic. Ví dụ như
levofloxacin (đồng phân tả tuyền của ofloxacin) có tác dụng kháng khuẩn mạnh gấp
hàng chục đến hàng trăm lần dextrofloxacin (đồng phân hữu tuyền của ofloxacin)
[4], hoặc dexchlorpheniramin maleat (đồng phân hữu tuyền của chlorpheniramin
maleat) là một thuốc kháng Histamin H
1
dùng điều trị dị ứng có tác dụng mạnh gấp
hai lần chlorpheniramin maleat (dạng racemic) với cùng liều lượng do dạng đồng
phân tả tuyền không có tác dụng, do đó cho phép giảm liều dùng chỉ còn một nửa
[3].
Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, xu hướng các bệnh về tim mạch ngày
càng tăng nhanh. Đối với nhóm thuốc tim mạch thì thời gian điều trị thường kéo
dài, do đó việc sử dụng dạng đồng phân quang học tinh khiết lại càng có ý nghĩa
quan trọng. Atenolol là dẫn chất của benzenacetamid, có tác dụng chẹn chọn lọc
trên thụ thể β
1
- adrenergic, dùng điều trị tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn
định, nhồi máu cơ tim sớm (trong vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ
tim, loạn nhịp nhanh trên thất [2]. Với một carbon bất đối trong phân tử, Atenolol là
hỗn hợp racemic của hai đồng phân đối quang: S-(-)-Atenolol và R-(+)-Atenolol.
Một số nghiên cứu đã chứng minh và chỉ ra rằng S-(-)-Atenolol đóng vai trò chính
trong chẹn β giao cảm khi dùng Atenolol dạng hỗn hợp racemic, đồng thời độc tính
cũng thấp hơn so với dạng R-(+)-Atenolol [20],[21]. Do đó việc sản xuất và sử dụng
đồng phân S-(-)-Atenolol ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Điều này đòi hỏi
phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn đồng
phân trong hỗn hợp racemic của Atenolol.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản (Capillary
Electrophoresis - CE) là phương pháp hóa lý được các nhà phân tích lựa chọn trong

lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nhiều lý do: hiệu lực tách cao, lượng
2

mẫu và hóa chất sử dụng nhỏ, thiết bị hoàn toàn tự động, cơ chế tách đơn giản và dễ
dàng trong phát triển phương pháp [16], [19], [22].
Tại Việt Nam, việc áp dụng kỹ thuật điện di mao quản trong phân tích kiểm
nghiệm vẫn còn hạn chế. Để nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc của hệ
thống kiểm nghiệm cũng như hội nhập với xu hướng phát triển của ngành Dược trên
thế giới, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng các đồng
phân đối quang của Atenolol trong chế phẩm bằng điện di mao quản” với hai
mục tiêu:
1. Thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng
điện di mao quản.
2. Ứng dụng phương pháp này định lượng chế phẩm có chứa Atenolol trên thị
trường.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL
Công thức cấu tạo
O
NH
2
O
NH
CH
3
CH

3
H
OH

R-(+)- Atenolol
NH
2
O
O
NH
CH
3
CH
3
OH
H

S-(-)-Atenolol
Hình 1: Công thức cấu tạo của Atenolol
Công thức phân tử: C
14
H
22
N
2
O
3
.
Khối lượng phân tử: 266,3.
Tên khoa học:

2-[4-[(2RS)-2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenyl]acetamid.
1.1.1. Tính chất lý, hóa
 Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, hơi tan trong nước, tan trong
ethanol, methanol, khó tan trong methylen clorid.
 Điểm chảy: 152
o
C đến 155
o
C.
 Góc quay cực (dung dịch 0,10 g Atenolol trong 10,0 ml nước) từ -0,10
o
đến
+0,10
o
.
 Cực đại hấp thụ: dung dịch trong methanol có hai cực đại hấp thụ ở 275 nm
và 282 nm. Tỉ số độ hấp thụ cực đại đo ở 275 nm và 282 nm từ 1,15 đến
1,20 [1], [3], [23].
4

1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
1.1.2.1. Tác dụng và cơ chế tác dụng
Atenolol có tác dụng chống tăng huyết áp, là dẫn chất của benzenacetamid,
thuộc nhóm chẹn chọn lọc trên thụ thể β
1
. Thuốc có tác dụng làm giảm lực co cơ và
giảm tần số tim. Atenolol không có tác dụng ổn định màng. Atenolol tan trong nước,
do đó ít thấm vào hệ thần kinh trung ương.
Ðiều trị bằng Atenolol sẽ ức chế tác dụng của catecholamin khi gắng sức và
căng thẳng tâm lý, dẫn đến làm giảm tần số tim, giảm cung lượng tim và giảm huyết

áp. Ðiều trị bằng Atenolol không làm tăng hoặc làm tăng rất ít sức cản của mạch
ngoại biên. Trong điều kiện có stress với tăng giải phóng adrenalin từ tuyến thượng
thận, Atenolol không làm mất sự co mạch sinh lý bình thường. Ở liều điều trị, tác
dụng co cơ trơn phế quản của Atenolol kém hơn so với những thuốc chẹn thụ thể
beta không chọn lọc. Tính chất này cho phép điều trị cả những người có bệnh hen
phế quản nhẹ hoặc bệnh phổi tắc nghẽn khác. Điều trị như vậy phải được kết hợp
với thuốc chủ vận thụ thể β
2
dùng theo đường hít, dưới sự giám sát chặt chẽ của
thầy thuốc chuyên khoa về hen.
Atenolol ít ảnh hưởng đến giải phóng insulin và chuyển hóa carbohydrat.
Phản ứng tim mạch đối với hạ đường huyết (như tim đập nhanh) không bị ảnh
hưởng một cách có ý nghĩa bởi Atenolol. Bởi vậy, Atenolol có thể dùng được cho
người đái tháo đường. Ở người tăng huyết áp, Atenolol làm giảm một cách có ý
nghĩa huyết áp cả ở tư thế đứng lẫn tư thế nằm. Ðể điều trị tăng huyết áp, nếu cần,
có thể kết hợp Atenolol với thuốc chống tăng huyết áp khác, chủ yếu là thuốc lợi
niệu và/hoặc thuốc giãn mạch ngoại biên [2].
Một nghiên cứu cho thấy liều 50 mg đơn đồng phân S-(-)-Atenolol làm giảm
huyết áp tâm thu, huyết áp tâm trương, nhịp tim cùng mức độ với sử dụng liều 100
mg Atenolol racemic. Trong khi đó liều 50 mg đơn đồng phân R-(+)-Atenolol
không làm thay đổi bất kì thông số nào. Như vậy đồng phân S-(-)-Atenolol là đồng
phân có hoạt tính chẹn β giao cảm và đồng phân R-(+)-Atenolol là đồng phân
không có hoạt tính [20].
5

Đồng phân R-(+)-Atenolol có thể làm tăng hoặc thậm chí gây ra những tác
dụng phụ nghiêm trọng. Đó là lý do nên thay thế Atenolol racemic bằng đơn đồng
phân S-(-)-Atenolol với liều chỉ bằng một nửa liều Atenolol racemic đang được sử
dụng để giảm tác dụng phụ [21].
1.1.2.2. Dược động học

Nồng độ tối đa trong huyết tương của thuốc đạt được trong vòng từ 2-4 giờ
sau khi uống. Sinh khả dụng của Atenolol xấp xỉ 45%, nhưng có sự khác nhau tới 3-
4 lần giữa các người bệnh. Thể tích phân bố là 0,7 lít/kg.
Atenolol chỉ được chuyển hóa một lượng nhỏ, dưới 10% của liều dùng được
bài tiết là chất chuyển hóa. Phần lớn liều thuốc dùng được bài tiết qua thận dưới
dạng không thay đổi. Thời gian bán thải của thuốc từ 6 - 9 giờ đối với người lớn có
chức năng thận bình thường. Thời gian bán thải của thuốc tăng lên đối với người có
chức năng thận giảm và không bị ảnh hưởng bởi bệnh gan. Nồng đố thuốc trong
máu thường tăng theo tuổi. Nếu Atenolol được dùng cùng với thức ăn thì sinh khả
dụng của thuốc giảm ít nhất là 20%. Tuy nhiên điều này không có ý nghĩa lâm sàng
[2].
1.1.2.3. Chỉ định
Tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu cơ tim sớm (trong
vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên thất [2].
1.1.2.4. Chống chỉ định
 Sốc tim, suy tim không bù trừ, blốc nhĩ - thất độ II và độ III, chậm nhịp tim
có biểu hiện lâm sàng.
 Không được dùng kết hợp với verapamil [2].
1.1.2.5. Dạng thuốc và hàm lượng
 Viên nén 25, 50 và 100 mg.
 Thuốc tiêm tĩnh mạch 5 mg/10 ml.
Một số chế phẩm chứa atenolol dạng racemic trên thị trường như viên nén
Tenormin 50mg và 100 mg, thuốc tiêm Tenormin 5 mg (Astra-Zeneca), Atenolol
6

Stada 50 mg (Công ty TNHH Liên doanh Stada Việt Nam), Tenocar 50 mg, Teginol
50 mg (Công ty cổ phần Dược Hậu Giang).
1.2. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN
1.2.1. Khái niệm
Sự phát triển của điện di bắt đầu trong khoảng từ năm 1930 đến năm1937 khi

Tiselius cố gắng tách protein huyết thanh gồm α, β – albumin và γ – globulin. Đó là
lần đầu tiên điện di được sử dụng cho việc tách các hợp chất có hoạt tính sinh học.
Tuy nhiên, sự phân tách không hoàn chỉnh do lượng mẫu lớn và sử dụng hiệu điện
thế thấp. Năm 1967, Hjerten thực hiện điện di protein, acid nucleic và các ion vô cơ
bằng mao quản có đường kính trong 300 µm, phát hiện bằng UV. Vào đầu những
năm 1980, Jorgenson và Lukacs công bố phát minh về một hệ thống CE đơn giản và
đã thu hút sự chú ý của rất nhiều các nhà nghiên cứu. Năm 1989, Karger tổ chức
Hội nghị quốc tế đầu tiên về điện di mao quản hiệu năng cao và trong cùng năm đó,
hệ thống CE thương mại đầu tiên đã có sẵn. Kể từ đó, số công bố về CE đã tăng lên
nhanh chóng do tính linh hoạt, đơn giản và hiệu quả cao của nó [17].
Điện di là hiện tượng di chuyển của tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán
trong chất điện giải khi có dòng điện đi qua. Cation di chuyển về phía cực âm
(catod), anion di chuyển về phía cực dương (anod). Các phần tử không tích điện
không bị hút về phía hai điện cực. Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các
chất trong mao quản silica dài 25 - 100 cm, đường kính trong 25 - 100 μm, đường
kính ngoài 300 - 400 μm. Điện thế một chiều áp vào hai đầu mao quản 10 - 30 kV
(cường độ điện trường có thể đến 500 V/cm) tạo ra quá trình chia tách, các chất
phân tích được phát hiện khi di chuyển về một đầu mao quản nhờ một detector thích
hợp [1], [6].
7


Hình 2: Sơ đồ hệ thống điện di mao quản.
1.2.2. Nguyên lý của quá trình điện di mao quản
Quá trình vận hành của CE điển hình với mao quản silica chứa dung dịch
đệm làm việc, thì nhóm silanol (SiOH) ở trên thành trong của mao quản sẽ giải
phóng ion hydrogen (H
+
) vào dung dịch đệm và bề mặt thành mao quản sẽ tích điện
âm ngay cả ở pH rất thấp. Cation hay các chất hòa tan tích điện dương một phần

trong môi trường bị hút tĩnh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên một lớp
điện kép để cân bằng điện tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao
quản gọi là thế Zeta (ξ).
Khi đặt thế trên chiều dài cột mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch
tán sẽ di chuyển về phía catod. Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo cả khối
dung dịch trong mao quản đi về catod. Sự chuyển động của khối dung dịch trong
mao quản silica dưới tác dụng của lực điện trường được gọi là dòng điện thẩm
(electroosmotic flow - EOF).
8


Hình 3: Sự hình thành dòng EOF
Mức độ ion hóa của nhóm silanol trên thành mao quản phụ thuộc chủ yếu
vào pH của dung dịch đệm làm việc, do đó trị số EOF thay đổi theo pH. Ở pH thấp,
nhóm silanol nói chung có độ ion hóa thấp và dòng EOF nhỏ. Ở pH cao hơn, nhóm
silanol bị ion hóa nhiều hơn và dòng EOF tăng.
Ngoài pH dung dịch đệm, dòng EOF sẽ thay đổi khi:
 Lực ion của dung dịch tăng lên, làm giảm thế Zeta nên dòng EOF giảm.
 Trong một số trường hợp, các dung môi hữu cơ như methanol hay
acetonitril được cho thêm vào dung dịch đệm để làm tăng độ tan của các
chất hòa tan, hằng số điện môi của dung dịch điện di giảm xuống kéo
theo sự giảm của EOF.
Detector được đặt về phía đầu catod của mao quản. Dòng EOF thường lớn
hơn linh độ điện di. Do vậy, ngay cả anion cũng bị đẩy về phía catod và detector.
Khi sử dụng đệm phosphat pH 7,0 ở mao quản không có lớp bao, thông thường
trình tự xuất hiện các chất tan trong điện di đồ là các cation, các chất trung tính và
các anion.
Hiện nay, có 5 loại điện di mao quản chủ yếu:
 Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) còn gọi là
điện di dung dịch tự do hay điện di mao quản dòng tự do.

 Sắc ký mixen điện động, còn gọi là sắc ký điện động mixen (micellar
electrokinetic chromatography - MEKC).
 Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE).
9

 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF)
 Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP) [1], [6].
1.2.3. Điện di mao quản vùng
Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác
nhau về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch thử.
Linh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất
định của phương pháp. Chúng được tối ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành phần
của đệm, pH và lực ion.
Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách
các tiểu phân tích điện.
Linh độ điện di của ion (
EP
), được biễu diễn bằng phương trình:

EP
= q/(6πηr) (1)
Trong đó q là điện tích của ion,  là độ nhớt dung dịch và r là bán kính của
ion hydrat hóa.
Từ mối liên hệ này suy ra, chất phân tích kích thước nhỏ, điện tích lớn có
linh độ lớn. Chất phân tích kích thước lớn, điện tích nhỏ có linh độ thấp.
Tốc độ di chuyển (
EP
), tính bằng cm/s, được biểu thị bằng phương trình:
v
EP

=μ
EP
( V / L ) (2)
Trong đó 
ep
là linh độ điện di, V là điện thế đặt và L là chiều dài (cm) tổng
cộng của mao quản.
Tốc độ của EOF (
EO
), tính bằng cm/s, được biểu diễn bằng phương trình:

EO
= μ
EO
(V / L) (3)
Trong đó 
EO
là linh độ dòng EOF.
Thời gian di chuyển (t
m
), tính bằng giây, là thời gian cần thiết cho chất tan di
chuyển trên toàn bộ chiều dài hiệu dụng (l) của mao quản (từ đầu vào đến detector),
t
m
được biểu thị bằng hệ thức sau:
t
m
= l / E(μ
EP
+ μ

EO
)= l L / V(μ
EP
+ μ
EO
) (4)
Trong đó E là cường độ điện trường (E = V/L)
10

Hiệu lực của hệ thống điện di có thể liên quan đến linh độ, dòng EOF và
được biểu thị bằng số đĩa lý thuyết (N), được tính bằng phương trình:
N = (μ
EP
+ μ
EO
) E l /2D (5)
Trong đó D là hệ số khuếch tán của chất hòa tan và các ký hiệu khác được
định nghĩa như trên.
Độ phân giải (R
s
) của hai chất hòa tan được rửa giải kế tiếp nhau, có thể xác
định bằng phương trình:


=0,18
(


−


)
/

+




(6)
Trong đó μ
EP1
và μ
EP2
là linh độ của hai chất hòa tan, 

là linh độ trung
bình của hai chất tan và các ký hiệu khác được định nghĩa như trên.
1.3. VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC
1.3.1. Đồng phân quang học
Đồng phân là những hợp chất khác nhau có cùng một công thức phân tử.
Đồng phân quang học là đồng phân có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân
cực theo các góc nhau.
Dạng đồng phân quang học đơn giản nhất xuất hiện trong trường hợp khi
hợp chất có thể tồn tại dưới hai dạng đồng phân lập thể có cấu tạo không chồng khít
lên nhau được. Hầu hết các tính chất lý học thông thường của hai đồng phân đối
quang là giống nhau, trừ khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo những
góc bằng nhau nhưng ngược chiều. Xác định cấu hình tuyệt đối của đồng phân đối
quang theo quy định của hệ thống của Cahn-Ingold-Prelog. Nếu đồng phân quay
mặt phẳng ánh sáng phân cực sang bên phải thì nó được gọi là đồng phân quay phải
R (tiếng La tinh: rectus (phải)). Nếu đồng phân quang học đó quay mặt phẳng ánh

sáng sang bên trái thì nó được gọi là đồng phân quay trái S (tiếng Latinh: siniter
(trái)).
Hỗn hợp racemic có chứa số phân tử bằng nhau của mỗi dạng đối quang, do
đó độ quay cực tổng cộng bằng không [5], [9], [15].
1.3.2. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang
1.3.2.1. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang gián tiếp
11

Phương pháp này dựa trên một phản ứng hóa học giữa hai đồng phân đối
quang với một hợp chất bất đối tạo thành hỗn hợp hai đồng phân lập thể nhưng
không đối quang trước khi được phân tách bằng điện di. Được thể hiện như sơ đồ:
(R,S)-C + (S)-D [(R)-C-(S)-D] + [(S)-C-(S)-D]
Trong đó:
C: Hỗn hợp racemic cần phân tích
D: Thuốc thử bất đối
R-, S- tương ứng là đồng phân quay phải và đồng phân quay trái.
Hỗn hợp thu được có thể được tách bằng GC và HPLC. Về nguyên tắc,có thể
dùng CE để phân tích hỗn hợp trên, sử dụng dung dịch điện ly nền không chọn lọc
đối quang, bởi các thành phần trong hỗn hợp có tính chất lý hóa khác nhau.Tuy
nhiên phương pháp này rất khó áp dụng trong CE. So với phương pháp phân tách
trực tiếp thì phương pháp gián tiếp này có một số nhược điểm sau đây:
 Tốn thời gian xử lí mẫu.
 Cần có các nhóm hoạt động hóa học trong cấu trúc như nitơ, hydroxyl,
carboxylic.
 Phải sử dụng thuốc thử bất đối rất tinh khiết vì sự có thêm một chất đối
quang sẽ tạo ra thêm hai đồng phân lập thể không đối quang nữa và gây
khó khăn cho quá trình phân tích.
 Hai đồng phân trong hỗn hợp racemic cần phân tích phải phản ứng với
cùng mức độ và tốc độ.
 Đáp ứng của detector với hai dẫn xuất tạo thành phải tương đương nhau.

 Điều kiện phản ứng phải thích hợp để tránh sự chuyển dạng lập thể của
thuốc thử bất đối, đồng phân quang học của chất phân tích và dẫn xuất
đồng phân lập thể không đối quang.
Thông thường, không phải dễ dàng để giải quyết tất cả các vấn đề trong quá
trình thực nghiệm như mô tả ở trên. Tuy nhiên, phương pháp gián tiếp có thể được
áp dụng trong những trường hợp mà phương pháp trực tiếp không thể áp dụng được
hoặc khi cần tăng độ nhạy. Phương pháp gián tiếp trong CE chủ yếu được áp dụng
12

cho phân tách đồng phân quang học của acid amin. Tuy nhiên cũng đã có những
nghiên cứu áp dụng phương pháp này với dược chất [12].
1.3.2.2. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang trực tiếp
Phương pháp tách trực tiếp được áp dụng thành công trong CE cho việc tách
đồng phân đối quang của một số nhóm hợp chất, chủ yếu là dược phẩm. Tác nhân
chọn lọc đối quang hoặc có thể được thêm vào dung dịch điện ly nền hoặc được gắn
lên thành mao quản, hoặc được cố định hay gắn lên các hệ gel để tạo một môi
trường chọn lọc đối quang mà tương tác với hai đồng phân đối quang trong suốt quá
trình điện di dựa trên sự hình thành phức đồng phân lập thể không đối quang tạm
thời. Các phức tạm thời di chuyển về phía detector với vận tốc khác nhau chỉ khi
chúng có hằng số bền khác nhau. Các tương tác tương đối yếu tham gia vào quá
trình hình thành đồng phân lập thể không đối quang gồm liên kết hydro, tương tác
kỵ nước, liên kết π-π, lưỡng cực - lưỡng cực. Độ tinh khiết quang học của tác nhân
chọn lọc đối quang trong phương pháp tách trực tiếp không phải là một yếu tố quan
trọng như trong phương pháp tách gián tiếp; trên thực tế, các tạp chất chỉ ảnh hưởng
đến độ phân giải và đã được chỉ ra rằng kết quả tương đối tốt có thể thu được bằng
cách sử dụng tác nhân chọn lọc đối quang có chứa tới 10% đồng phân đối quang
còn lại. Cơ chế phân tách đồng phân đối quang bao gồm tạo phức lồng, tạo mixen
và tương tác ái lực. Cơ chế tạo phức lồng đã được áp dụng rộng rãi nhằm nâng cao
độ chọn lọc trong phân tách một số hợp chất bao gồm: đồng phân hình học, đồng
phân lập thể và đồng phân đối quang. Đến nay ba nhóm chính để tạo phức lồng

được sử dụng trong CE gồm các cyclodextrins (CDs), ether vòng được
tetracarboxylat hóa và kháng sinh [9], [12].
1.3.3. Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học
Hầu hết các thuốc là hợp chất đối quang và mỗi đồng phân thể hiện tác dụng
dược lý và độc tính riêng biệt. Do đó, phân tách đồng phân đối quang là cần thiết
trong phân tích dược phẩm để có được những đồng phân an toàn và có tác dụng
mong muốn. Cho đến nay phương pháp phân tích được sử dụng cho việc tách đồng
phân đối quang bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lớp mỏng
13

(TLC), sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC), và điện di mao quản(CE).
Ứng dụng của sắc ký khí chủ yếu giới hạn trong các hợp chất dễ bay hơi. Phương
pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích các thuốc đối quang là HPLC. CE là
một kỹ thuật bổ sung cho HPLC, đặc biệt đối với việc phân tích hợp chất phân cực
và tích điện [9]. Ưu điểm của CE gồm: hiệu lực tách cao, lượng mẫu và hóa chất sử
dụng nhỏ, thiết bị hoàn toàn tự động, cơ chế tách đơn giản và dễ dàng trong phát
triển phương pháp [9], [19]. Việc tách đồng phân đối quang bằng CE có thể được
thực hiện bằng phương pháp gián tiếp hoặc trực tiếp. Các phương pháp trực tiếp
thuận lợi hơn các phương pháp gián tiếp do sự đơn giản và tính sẵn có của một loạt
các tác nhân chọn lọc đối quang như cyclodextrins (CDs), ether vòng được
tetracarboxylat hóa và kháng sinh tạo phức lồng với các đồng phân đối quang.
Trong số đó, CD là tác nhân chọn lọc đối quang được sử dụng phổ biến nhất. Ngoài
các CD tự nhiên, các dẫn xuất CD khác nhau đã được thương mại hóa và chúng
mang lại độ chọn lọc cao trong tách đồng phân đối quang. Bên cạnh cơ chế tạo phức
lồng, các cơ chế khác dùng để tách đồng phân đối quang gồm trao đổi phối tử,
tương tác ái lực (ví dụ: việc sử dụng protein, kháng sinh là tác nhân chọn lọc đối
quang), và tương tác mixen (ví dụ: sử dụng các bề mặt tự nhiên hay tổng hợp là tác
nhân chọn lọc đối quang)[17].
CE hiện đang là mộtphương pháp được thiết lập để phân tích dược phẩm và
được khuyến khích ở một số Dược điển. Ví dụ, Dược điển Anh (BP) đề xuất việc

xác định erythropoietin và levocabastin hydrochlorid bởi MEKC, trong khi Dược
điển Mỹ (USP) đã có một chương chung về CE từ năm 2002 [19].
1.4. TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE SỬ DỤNG
CYCLODEXTRIN LÀ TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG
1.4.1. Tổng quan về Cyclodextrin
Cyclodextrin (CD) là oligosaccharid mạch vòng, gồm các đơn vị glucose liên
kết với nhau bằng liên kết α-(1,4)-glucosid và được tạo ra từ phản ứng thủy phân
tinh bột bằng enzym. Mặc dù trong thực tế, CD hình thành từ 6 lên đến 12 đơn vị
14

glucose đã được phân lập, tuy nhiên chỉ CD có 6,7,8 đơn vị glucose (tương ứng với
α, β, γ-CD) là hiện đang được sử dụng trong hóa phân tích.
Hình dạng của CD tương tự như một hình nón cụt rỗng với một khoang
tương đối kỵ nước, có thể lưu giữ chất phân tích và mặt ngoài thân nước do sự có
mặt của các nhóm hydroxyl (vị trí 2, 3 và 6 của glucopyranose). Vành rộng hơn có
chứa các nhóm hydroxyl thứ cấp đối quang, trong khi vành hẹp hơn chứa nhóm
hydroxyl sơ cấp không đối quang. Tính chất vật lý của các CD tự nhiên khá khác
nhau, ví dụ như về chiều rộng của khoang, độ tan, trọng lượng phân tử…, tuy nhiên
chúng có cùng độ sâu (Bảng 1).
Bảng 1: Tính chất của một số CD tự nhiên.
Tính chất
Loại CD
α β γ
Số đơn vị glucose
6 7 8
Trọng lượng phân tử
972 1135 1297
Đường kính trong (nm)
0,57 0,78 0,95
Độ sâu (nm)

0,78 0,78 0,78
Độ tan (g/100ml H
2
O)
14,5 1,85 23,2
pK
a

12,33 12,20 12,08

Các nhóm hydroxyl có mặt trên vành của CD có thể dễ dàng được thay thế
bởi các phản ứng hóa học để có được các dẫn xuất CD với các mức độ thế khác
nhau, các thành phần CD biến đổi phụ thuộc vào một số thông số như điều kiện
phản ứng, loại và tỷ lệ thuốc thử…Một số lượng lớn các dẫn xuất của CD hiện đang
được sử dụng trong CE để phân tích đồng phân đối quang như dẫn xuất methyl,
hydroxyethyl, hydroxypropyl, acetyl hóa không tích điện và các dẫn xuất
methylamino, sulphobutylether, carboxymethyl, sulfat, photphat hóa tích điện. Các
dẫn xuất của CD có thể biểu hiện tính chất rất khác so với những CD tự nhiên, có
thể được sử dụng dễ dàng để cải thiện độ chọn lọc trong tách đồng phân đối quang,
ví dụ như tăng độ tan, tăng khả năng tạo ra các liên kết thứ cấp khác nhau, tiềm
15

năng trong phân tích những hợp chất không tích điện, mức độ kị nước khác nhau
của hốc kị nước. Ví dụ, so sánh β - CD và DM- β- CD, có thể thấy rằng sự có mặt
của các nhóm methoxy làm tăng hoặc độ sâu hoặc độ tan của tác nhân chọn lọc đối
quang. Nhóm thế tích điện hoặc không tích điện thay thế cho nhóm hydroxyl trên
cấu trúc CD có thể rất có ích cho tối ưu phương pháp CE. Trong thực tế, đồng phân
không tích điện có thể được chuyển đến detector như chất phân tích tích điện do sự
hình thành phức lồng với dẫn xuất của CD có nhóm thế tích điện. Hơn nữa sự
chuyển động của tác nhân chọn lọc đối quang theo hướng ngược lại với chất phân

tích là điều kiện lý tưởng để đạt được độ phân giải tốt vì làm tăng sự khác biệt về
linh độ giữa chất phân tích tự do và chất phân tích trong phức lồng [9], [10], [13].
1.4.2. Tách đồng phân đối quang sử dụng Cyclodextrin là tác nhân chọn lọc
đối quang
Nhiều dẫn xuất CD đã được phát triển để tăng khả năng hòa tan trong nước
và để thay đổi hình dạng khoang. Tách đồng phân đối quang bằng CZE với CD là
tác nhân chọn lọc đối quang lần đầu tiên được giới thiệu bởi Fanali và là kỹ thuật
thành công nhất trong số các kỹ thuật để tách đồng phân đối quang của CE; số
lượng các bài báo mô tả kỹ thuật này gia tăng đáng kể [19].
Trong cơ chế tạo phức lồng, hợp chất lồng khít vào khoang CD với toàn bộ
phân tử hoặc với phần kỵ nước của phân tử; do đó, loại CD có vai trò rất quan trọng
trong quá trình tách. Tương tác kỵ nước với mình khoang kỵ nước không đủ để cho
phép tách các đồng phân đối quang, liên kết yếu giữa các nhóm nhóm thế với trung
tâm bất đối của chất phân tích và các nhóm hydroxyl thứ cấp và / hoặc sơ cấp của
CD đóng vai trò trong nhận dạng đối quang [9], [12], [19].
CD là một hợp chất trung hòa về điện và do đó chúng di chuyển với tốc độ
của dòng EOF trong CZE. Khi một chất tan tích điện được lồng vào khoang của
CD, phức lồng tạo thành có điện tích giống với chất tan tự do nhưng khối lượng
phân tử tăng lên, và do đó linh độ điện di thấp hơn so với chất tan tự do. Trong tách
đồng phân đối quang, các đồng phân có linh độ điện di đồng nhất và các đồng phân
trong phức lồng có thể có linh độ tương tự nhau. Vì vậy, nguyên tắc của CZE sử
16

dụng CD là tác nhân chọn lọc đối quang (CD - CZE) để tách đồng phân đối quang
là sự khác biệt giữa các hằng số bền của phức lồng tạo ra giữa các đồng phân đối
quang với CD. Đồng phân tạo phức lồng bền hơn thì có linh độ hiệu dụng thấp hơn.
Linh độ hiệu dụng là linh độ trung bình hoặc biểu kiến của chất tan trong điều kiện
thử nghiệm, nhưng trong hầu hết các trường hợp, chúng ta sử dụng đơn giản là linh
độ [19].
Phân tách đồng phân đối quang có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: loại

và nồng độ CD, pH, thành phần của BGE, nhiệt độ mao quản, hiệu điện thế…[13]
1.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
CỦA ATENOLOL
1.5.1. Nghiên cứu trong nước
 Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Thu Hiền,
Nguyễn Thị Kiều Anh [8], đã tách và định lượng đồng phân đối quang của
Atenolol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sử dụng:
 Cột: Chirex 3022 ((S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(α-
naphtyl)ethylamin) (4,0 x 250 mm; 5 μm).
 Pha động: n-hexan : 1,2 dicloromethan : methanol : acid trifluoroacetic =
57,5 : 35 : 7,5 : 0,2 (tt/tt/tt/tt).
 Bước sóng phát hiện : 229 nm.
 Thể tích tiêm mẫu: 20 μL.
 Nồng độ chất phân tích: 0,05 mg/ml (racemic)
 Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.
 Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân
Bình, Nguyễn Thị Kiều Anh (2013) [7], đã khảo sát và lựa chọn để đưa ra
điều kiện điện di bằng CE như sau:
 Cột mao quản silica nung chảy: chiều dài tổng 58,5 cm (chiều dài hiệu
dụng 50 cm), đường kính trong 75 μm.
 Dung dịch điện ly nền: Tris 50 mM, CM-β-CD 8 mM, pH 4,0.
 Nhiệt độ: 20
0
C.
17

 Hiệu điện thế: 16 kV
 Chế độ tiêm mẫu: 50 mbar x 3s.
 Bước sóng phát hiện: 194 nm
 Nồng độ chất phân tích: 100 ppm (kl/tt) Atenolol racemic.

Nghiên cứu này mới sơ bộ tách, định tính các đồng phân. Chúng tôi sẽ tiếp
tục nghiên cứu phát triển, hoàn thiện phương pháp để ứng dụng vào định lượng các
đồng phân quang học của Atenolol.
1.5.2. Nghiên cứu trên thế giới
Một số nghiên cứu định lượng đồng phân quang học của Atenolol bằng
HPLC như sau:
 Nghiên cứu của Santoro M.I, Cho H.S (2000) [18], sử dụng điều kiện sắc ký
như sau:
 Cột: Chiralcel OD (250 x 4,6 mm; 10 μm).
 Pha động: Hexan - ethanol - diethylamine = 75: 25: 0,1 (tt/tt/tt).
 Tốc độ dòng: 0,7 ml/ phút.
 Bước sóng phát hiện: 276 nm.
 Nghiên cứu của Eaga M.C (2010) [11], sử dụng điều kiện sắc ký như sau:
 Cột: Chiralcel AGP (150 x 4,0 mm; 5 μm).
 Pha động: Dung dịch đệm Natri phosphat 10 mM (pH 7,0) - methanol
= 95: 5 (tt/tt).
 Tốc độ dòng: 0,9 ml/ phút.
 Bước sóng phát hiện: 225 nm.
 Khoảng nồng độ tuyến tính: 10-100 μg/ml.
CE cũng được ứng dụng trong phân tích đồng phân đối quang của Atenolol.
 Nghiên cứu của Wuhong Li, Changhai Liu, Guangguo Tan, Xinrong Zhang,
Zhenyu Zhu, Yifeng Chai [22] sau khi khảo sat và lựa chọn, đưa ra điều kiện
điện di như sau:
 Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài
hiệu dụng 40 cm, đường kính trong 50 μm.