Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng viên ngậm dưới lưỡi aslem 1mg

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI






LÊ THANH MINH


XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
CHẤT LƢỢNG VIÊN NGẬM DƢỚI
LƢỠI ASLEM 1 mg


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



HÀ NỘI - 2014


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LÊ THANH MINH



XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
CHẤT LƢỢNG VIÊN NGẬM DƢỚI
LƢỠI ASLEM 1 mg


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
Nơi thực hiện:
Phòng Phân tích, kiểm nghiệm và TĐSH –
Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia


HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập tại trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, em đã
đƣợc các thầy, các cô luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi
nhất để em học tập trau dồi kiến thức. Trong thời gian làm khóa luận tốt
nghiệp, em đã có cơ hội vận dụng kiến thức cũng nhƣ đƣợc mở rộng vốn hiểu
biết của mình để áp dụng cho công việc tƣơng lai.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.
TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, ngƣời đã cống hiến hết mình vì sự nghiệp giáo
dục, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và hƣớng dẫn em trong suốt quá trình nghiên
cứu, hoàn thành khóa luận.
Em xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu
đã cung cấp chất chuẩn, chế phẩm để em có thể thực hiện đề tài.
Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học
Dƣợc Hà Nội, các thầy cô, anh chị Phòng kiểm nghiệm, phân tích và tƣơng
đƣơng sinh học – Viện Công nghệ dƣợc phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi để em thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những ngƣời luôn động
viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực
hiện đề tài.
Hà nội, ngày tháng năm
Sinh viên

Lê Thanh Minh



MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ASLEM 3
1.1.1. Hoạt chất Glycyl funtumin 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt chất Glycyl funtumin 4

1.1.3. Các phƣơng pháp định lƣợng Glycyl funtumin 6
1.2. VÀI NÉT VỀ VIÊN NGẬM DƢỚI LƢỠI 9
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 10
1.3.1. Nguyên tắc và phân loại 10
1.3.2. Các thông số đặc trƣng 10
1.3.3. Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 15
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 15
2.1.2. Dung môi, hóa chất 15
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, máy móc 15
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16

2.2.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem
bằng HPLC 16
2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi
Aslem 16
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.3.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem
bằng HPLC 17
2.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn kĩ thuật và phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng
viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 18
2.3.3. Tính toán và xử lý số liệu 20
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 22
3.1. CHUẨN BỊ MẪU 22
3.1.1. Mẫu chuẩn 22
3.1.2. Mẫu thử 22
3.2. LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 23
3.2.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu 23
3.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký 23

3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 25
3.3.1. Độ phù hợp của hệ thống 25
3.3.2. Độ chọn lọc 25
3.3.3. Độ tuyến tính 27
3.3.4. Độ chính xác 29
3.3.5. Độ đúng 32

3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VIÊN
NGẬM DƢỚI LƢỠI ASLEM 1 mg 34
3.4.1. Tính chất 34
3.4.2. Định tính 34
3.4.3. Độ đồng đều khối lƣợng 35
3.4.4. Độ rã. 36
3.4.5. Độ đồng đều hàm lƣợng 36
3.4.6. Định lƣợng 37
BÀN LUẬN 39
KẾT LUẬN 42
ĐỀ XUẤT 43

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C
Nồng độ
DĐVN IV
Dƣợc điển Việt Nam IV
GF
Glycyl funtumin
GF.HCl
Glycyl funtumin hydroclorid
HLTB
Hàm lƣợng trung bình
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
KLTB
Khối lƣợng trung bình
MeOH
Methanol
MS
Khối phổ (Mass spectrometry)
PA
Hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (Pure Analysis)
r
Hệ số tƣơng quan
RSD
Độ lệch chuẩn tƣơng đối
S
Diện tích pic
SKĐ
Sắc ký đồ

STT
Số thứ tự
t
R

Thời gian lƣu
tt/tt
Thể tích/thể tích
UV
Tử ngoại (Ultraviolet)






DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Nội dung
Trang
3.1
Kết quả độ phù hợp hệ thống sắc ký.
25
3.2
Pha dãy chuẩn chạy độ tuyến tính.
27
3.3
Kết qủa khảo sát độ tuyến tính của GF.HCl.
28
3.4

Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp.
30
3.5
Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơng
pháp.
31
3.6
Kết quả thẩm định độ đúng của phƣơng pháp.
33
3.7
Kết quả đánh giá độ đồng đều khối lƣợng.
35
3.8
Kết quả đánh giá độ đồng đều hàm lƣợng.
37
3.9
Kết quả định lƣợng GF.HCl trong viên Aslem.
38









DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Nội dung

Trang
3.1
Phổ hấp thụ UV của GF.HCl.
24
3.2
Kết quả khảo sát đánh giá độ chọn lọc.
26
3.3
Sắc ký đồ khảo sát độ tuyến tính.
28
3.4
Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích
và nồng độ GF.HCl.
29
3.5
Sắc ký đồ định tính.
34






1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tổ chức Y tế Thế giới đã dự báo về mô hình bệnh tật trong thế kỷ 21,
các bệnh không lây nhiễm trong đó có ung thƣ sẽ trở thành nhóm bệnh chủ
yếu đe dọa đến sức khỏe con ngƣời, chiếm 54% nguyên nhân gây tử vong. Ở
Việt Nam, theo nhận định của Bộ Y tế, các bệnh ung thƣ, tim mạch, tâm thần

đang có nguy cơ tăng lên giống với các nƣớc công nghiệp phát triển. Theo số
liệu thống kê qua ghi nhận ung thƣ tại Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và
một số tỉnh, ƣớc tính mỗi năm ở nƣớc ta có khoảng 150.000 bệnh nhân ung
thƣ mới mắc và 75.000 ngƣời chết vì ung thƣ, con số này có xu hƣớng ngày
càng gia tăng [26]. Chính vì thế xu hƣớng nghiên cứu và sản xuất các thuốc
điều trị và điều trị bổ trợ dành cho bệnh nhân ung thƣ đang ngày càng phát
triển.
Aslem (glycyl funtumin hydroclorid) là một thuốc kích thích miễn dịch
[11] đƣợc nghiên cứu bởi Phó giáo sƣ Đào Kim Chi, Giáo sƣ Đặng Hanh
Phức và cộng sự trong hơn 30 năm. Năm 2002, chế phẩm thuốc tiêm Aslem
ra đời tại Trung tâm Khoa học công nghệ Dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội (Số đăng ký: VD-0105-06) và đƣợc chuyển giao cho công ty cổ phần
Dƣợc phẩm Vĩnh Phúc sản xuất – là sản phẩm thuốc tiêm miễn dịch đầu tiên
đƣợc sản xuất tại Việt Nam. Aslem có tác dụng tăng cƣờng miễn dịch dùng để
điều trị bổ trợ ung thƣ đƣờng tiêu hóa (gan, dạ dày, đại trực tràng, tụy), ung
thƣ phổi và ung thƣ vú. Kết hợp hiệp đồng với kháng sinh nhằm mục đích
ngăn ngừa nhiễm trùng trƣớc và sau phẫu thuật [12]. Các nghiên cứu lâm
sàng về tác dụng của Aslem đã đƣợc thực hiện và cho kết quả hết sức khả
quan [1], [20], [22], [25].
Để đáp ứng yêu cầu điều trị ngày một tăng cao, Phó giáo sƣ Đào Kim
Chi và nhóm nghiên cứu tại trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã nghiên cứu bào
2

chế thử nghiệm chế phẩm Aslem dƣới dạng viên ngậm dƣới lƣỡi (glycyl
funtumin hydroclorid 1mg).
Hiện nay, tiêu chuẩn cơ sở để định lƣợng nguyên liệu GF.HCl và dung
dịch tiêm Aslem vẫn áp dụng phƣơng pháp đo quang bằng cách tạo cặp ion
với heliantin [15]. Năm 2009, các tác giả [2] đã xây dựng thành công phƣơng
pháp định lƣợng GF.HCl bằng HPLC. HPLC là một phƣơng pháp vừa có khả
năng tách, định tính, định lƣợng đồng thời trong cùng một lần phân tích với

độ chọn lọc, độ đúng, độ chính xác cao và đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến
hiện nay.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra chất lƣợng và hoàn thiện hồ sơ
đăng ký thuốc cho viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg”
với 2 mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng Glycyl
funtumin hydroclorid trong viên ngậm dưới lưỡi Aslem bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC).
2. Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng viên ngậm dưới lưỡi
Aslem (glycyl funtumin hydroclorid 1mg).







3

O
N
C
O
H
C
H
2
NH
2

.
HCl
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ASLEM
1.1.1. Hoạt chất Glycyl funtumin
1.1.1.1. Công thức cấu tạo







Hình 1.1- Công thức cấu tạo của Glycyl Funtumin Hydroclorid [11], [12]
Công thức phân tử: C
23
H
38
O
2
N
2
.HCl
Trọng lƣợng phân tử: 410,5 Da
Tên khoa học: N- (aminoethanoyl)- 3- preganan- 20- on hydroclorid [12].
1.1.1.2. Tính chất hóa lý
Glycyl Funtumin bản chất là một aminoacyl steroid, đƣợc tổng hợp dƣới
dạng muối với HCl hoặc HBr.
- Tính chất vật lý:
+ Bột kết tinh màu trắng, vị hơi đắng và chát nhẹ.

+ Bị phân hủy ở nhiệt độ 220-230°C.
+ Dễ tan trong nƣớc nóng và methanol, tan trong cloroform, khó tan trong
nƣớc nguội.
+ Năng suất quay cực: dung dịch 0,5% trong MeOH ở 25°C có [α]
D
= 88-
98°.
- Tính chất hóa học:
4

+ GF có tính chất hóa học của một amin, tham gia phản ứng tạo muối với
các acid nhƣ HCl, HBr (dạng dƣợc dụng là GF. HCl); tham gia các phản
ứng alkyl hóa và dễ bị oxy hóa.
+ GF có bản chất là một phân tử amid nên dễ bị thủy phân khi đun nóng.
+ Có tính chất hóa học của một ceton, tham gia phản ứng cộng hợp vào
nhóm carbonyl, phản ứng oxy hóa khử nhóm carbonyl… [12].
1.1.1.3. Tác dụng dược lý
Các nghiên cứu ban đầu cho thấy: thuốc có tác dụng kích thích miễn
dịch dịch thể [11] và qua trung gian tế bào theo cơ chế hoạt hóa chức năng
thực bào của đại thực bào và tăng chuyển dạng lympho bào. Ngoài ra, nó còn
có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng và chống nhiễm khuẩn ở mô hình
in vitro và mô hình thực nghiệm gây viêm phúc mạc bởi trực khuẩn mủ xanh
kháng kháng sinh [12].
1.1.1.4. Chỉ định
Aslem đƣợc chỉ định kết hợp với phẫu thuật, hóa trị liệu và xạ trị để điều
trị bổ trợ ung thƣ đƣờng tiêu hóa (gan, dạ dày, đại trực tràng, tụy), ung thƣ
phổi và ung thƣ vú. Kết hợp hiệp đồng với kháng sinh nhằm mục đích ngăn
ngừa nhiễm trùng trƣớc và sau phẫu thuật [12].
1.1.1.5. Tác dụng không mong muốn
Ở liều điều trị, chƣa có báo cáo nào về tác dụng phụ nguy hiểm. Một số

biểu hiện nhƣ: mẩn ngứa, mề đay, nôn, buồn nôn, táo bón có xảy ra nhƣng rất
hiếm gặp [12].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt chất Glycyl funtumin
1.1.2.1. Trên thế giới
Từ năm 1958, Funtumin lần đầu tiên đã đƣợc Janot, Khương Hữu Quý
và Goutarel chiết xuất, phân lập từ lá cây Funtumia lactifolia-staff
Apocynaceae, một loài cây có ở miền Đông châu Phi.
5

Năm 1965, tại Viện nghiên cứu hóa học các hợp chất tự nhiên ở Gif-Sur-
Yvette (Cộng hòa Pháp), Giáo sư Nguyễn Đăng Tâm đã dùng Funtumin để
bán tổng hợp một dãy các aminoacyl steroid, trong đó có Glycyl funtumin đã
đƣợc chứng minh là chất có tác dụng kích thích miễn dịch mạnh, vì thế nó đã
đƣợc lựa chọn để bào chế tiếp thành một chế phẩm thuốc ở dạng muối
hydrobromid và có tên là LH1. Sau đó, do thiếu nguồn nguyên liệu nên quá
trình bán tổng hợp Glycyl funtumin bị hạn chế và dừng lại [3], [12], [19],
[22].
1.1.2.2. Ở Việt Nam
Năm 1973, chế phẩm LH1 đã đƣợc Giáo sư Tôn Thất Tùng sử dụng
trong điều trị bổ trợ cho bệnh nhân ung thƣ gan tiên phát tại bệnh viện Việt
Đức, mở ra triển vọng to lớn trong việc sử dụng dƣợc phẩm này để điều trị
những bệnh có liên quan đến sự suy giảm hệ thống miễn dịch.
Nhận thấy tiềm năng quý báu và với mong muốn tạo ra một loại dƣợc
phẩm chất lƣợng tốt đáp ứng nhu cầu chữa bệnh của ngƣời dân trong nƣớc,
các nhà khoa học Việt Nam đã nỗ lực không mệt mỏi và hiện tại đã thu đƣợc
những kết quả rất đáng khích lệ:
Năm 1977, Giáo sư Đặng Hanh Phức và cộng sự đã bán tổng hợp đƣợc
GF.HCl, đặt tên là Aslem và đƣợc sản xuất dƣới dạng thuốc tiêm ở quy mô
phòng thí nghiệm để tiến hành những thử nghiệm lâm sàng bƣớc đầu trong
điều trị ung thƣ gan, ung thƣ phổi, nhiễm khuẩn ngoại khoa kết hợp với kháng

sinh và trong nhiễm khuẩn virus khác ở các bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức,
Viện Lao và Bệnh Phổi, bệnh viện Hữu Nghị Việt Xô.
Năm 1982, nhờ tổng hợp thành công Funtumin tại khoa Hóa trƣờng Đại
học Tổng hợp Leiden (Hà Lan), Phó giáo sư Đào Kim Chi và cộng sự đã tổng
hợp thành công GF.HCl từ pregnenolon qua trung gian phtalimid tại Labo
6

Tổng hợp thuốc của trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội do tổ chức NUFFIC tài trợ
[12], [22].
Sau gần 50 năm nghiên cứu và phát triển, năm 2002, chế phẩm thuốc
tiêm miễn dịch Aslem (Glycyl Funtumin Hydroclorid 0,3mg) đã ra đời. Chế
phẩm hiện do công ty cổ phần Dƣợc phẩm Vĩnh Phúc sản xuất (Số đăng ký:
VD-0105-06). Hiện nay, Phó giáo sƣ Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu đang
tiếp tục nghiên cứu để cho ra đời chế phẩm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem
(Glycyl funtumin hydroclorid 1mg).
Cho đến nay đã có khá nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh tác
dụng của Aslem trong điều trị bổ trợ ung thƣ gan [1], sau phẫu thuật ung thƣ
đại tràng [20], ung thƣ dạ dày [22], ung thƣ đƣờng tiêu hóa [25]. Các nghiên
cứu về ảnh hƣởng của Aslem trên hệ thống enzyme CY-P450 ở gan động vật
thí nghiệm [3], ảnh hƣởng lên chức năng hệ tạo máu, gan thận và huyết áp
[18], nghiên cứu thăm dò tác dụng sinh học [21] đều cho kết quả hết sức khả
quan. Các nghiên cứu về dƣợc động học của Aslem cũng đã đƣợc tiến hành
trên động vật thí nghiệm và ngƣời tình nguyện [13], [16], [19], [23].
1.1.3. Các phƣơng pháp định lƣợng Glycyl funtumin
1.1.3.1. Các phương pháp định lượng trong huyết tương
1.1.3.1.1. Phương pháp LC-MS
Phạm Nhƣ Quỳnh [23] sử dụng LC- MS để khảo sát dƣợc động học của
GF trong huyết tƣơng chó. Phƣơng pháp đã định lƣợng đƣợc GF ở khoảng
nồng độ 0,01 – 0,2 μg/ml.
- Các điều kiện để sử dụng LC-MS cho định lƣợng GF gồm:

Chiết GF từ huyết tƣơng bằng cloroform; Pha tĩnh: cột Hypersil BDS
Cyano (5μm, 150 × 4,6 mm); Pha động: hỗn hợp MeOH – H
2
O (6:4) –
dung dịch acid formic 0,2% (tt/tt); Tốc độ dòng: 1ml/phút; Thể tích bơm
mẫu: 10 μl.
7

- Chế độ chạy:
MS Fullscan-ESI+ (150 – 650); Nhiệt độ ống mao quản: 550°C; Điện thế
ion hóa: 2kV; Điện thế chóp nón: 80 kV.

1.1.3.1.2. Phương pháp LC-MS/MS
Các nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp LC-MS/MS để định lƣợng GF
trong huyết tƣơng đã có độ chọn lọc và độ nhạy cao hơn so với phƣơng pháp
LC-MS. Tạ Mạnh Hùng và Lê Thị Thu Huyền định lƣợng GF trong huyết
tƣơng chó với khoảng nồng độ 0,5-53,3 ng/ml [16], [17], [19]. Nguyễn Thị
Quỳnh Chi định lƣợng GF trong huyết tƣơng ngƣời tình nguyện với khoảng
nồng độ 0,1-20 ng/ml [13].
Các điều kiện để sử dụng LC-MS/MS cho định lƣợng GF gồm:
Điều kiện khối phổ:
Kiểu phổ khối: MS/MS, nguồn ion hóa HESI (+), bộ phận phân tích khối
Triple Quadrupole; Chuẩn nội (IS): Salbutamol; Số khối của ion mẹ: GF:
m/z = 375, IS: m/z = 240; Thế phân mảnh GF: 32V; IS: 18V; Số khối của
mảnh ion con: GF: m/z = 121; IS: m/z = 148.
Điều kiện sắc ký:
- Nhiệt độ cột 50°C; Thể tích tiêm mẫu: 25 μl.
Cột sắc ký, pha động và tốc độ dòng có thể dùng 1 trong 2 điều kiện sau:
- Cột Luna CN, kích thƣớc 150 × 4,6 mm, 5μm; Pha động: MeOH –
dung dịch acid formic 0,5% (60:40) (tt/tt); Tốc độ dòng: chƣơng

trình gradient [16], [17], [19].
- Cột Luna C18, kích thƣớc 75 × 4,6 mm; 2,7μm; Pha động: MeOH
– dung dịch acid formic 0,5% (80:20) (tt/tt); Tốc độ dòng: 0,5
ml/phút [13].

8

1.1.3.2. Các phương pháp định lượng trong nguyên liệu và chế phẩm
Định lƣợng GF.HCl trong chế phẩm không đòi hỏi phƣơng pháp có độ
nhạy cao cỡ ng/ml nhƣ đối với định lƣợng trong huyết tƣơng.
1.1.3.2.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS
Phương pháp tạo màu với ninhydrin
Nguyên tắc: GF.HCl có khả năng tạo phức màu xanh tím không bền với
ninhydrin. Hợp chất màu có tác dụng với cadimi clorua sẽ cho một phức màu
hồng bền, phức này hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 510 nm.
Phương pháp tạo cặp ion với heliantin
Nguyên tắc: GF.HCl là một base hữu cơ có khả năng tạo cặp với acid
hữu cơ mang màu (heliantin). Cặp ion này đƣợc chiết bằng dung môi hữu cơ
cloroform rồi đem đo quang.
Cực đại hấp thụ của cặp ion này ở khoảng 425 – 426 nm.
Phƣơng pháp tạo cặp ion có độ lặp lại cao hơn và đòi hỏi dụng cụ, thuốc
thử, thao tác đơn giản hơn nên phƣơng pháp này đƣợc chọn để đƣa vào tiêu
chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu GF.HCl và dung dịch tiêm Aslem [15].
Phƣơng pháp chiết đo quang thực hiện qua nhiều giai đoạn, đòi hỏi nhiều
thời gian và phải tiếp xúc với dung môi độc hại (cloroform).
1.1.3.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự đã xây dựng và thẩm định
phƣơng pháp HPLC định lƣợng GF.HCl với khoảng nồng độ 0,05-0,25
mg/ml. Phƣơng pháp có độ chính xác cao với khả năng thu hồi > 97% và độ
chụm ≤ 0,12%.

Điều kiện sắc ký gồm:
Cột sắc ký: RP 18 (150 × 4,6 mm; 5 μm); Pha động: Methanol – dung
dịch kali dihydrophosphat 20 mM pH 7,0 (80 : 20), trộn đều, lọc qua
9

màng lọc có đƣờng kính lỗ lọc 0,45 μm; Bƣớc sóng : 204 nm; Lƣu lƣợng
dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 20 μl [2].
Phƣơng pháp định lƣợng GF.HCl có độ chính xác cao, đơn giản, thời
gian phân tích nhanh (khoảng 7 phút) và khoảng nồng độ tuyến tính phù hợp
cho việc định lƣợng trong chế phẩm.

1.2. VÀI NÉT VỀ VIÊN NGẬM DƢỚI LƢỠI
Định nghĩa: Viên đặt dƣới lƣỡi (Sublingual tablet) là chế phẩm dạng rắn,
đơn liều đƣợc đặt dƣới lƣỡi để cho tác dụng toàn thân. Viên đƣợc bào chế
bằng cách nén hỗn hợp của bột hoặc hạt thành viên có hình dạng phù hợp với
mục đích sử dụng [28].
Miệng không phải là nơi hấp thu thức ăn nhƣng tại đây có một màng
lƣới mao mạch khá phong phú, đặt biệt là 2 bên má và dƣới lƣỡi, rất thuận
tiện cho việc hấp thu thuốc. Dƣợc chất sau khi hòa tan trong nƣớc bọt (có pH
khoảng 6,5) đƣợc hấp thu qua màng niêm mạc mỏng ở dƣới lƣỡi và đi về tĩnh
mạch cảnh nghĩa là đƣợc đƣa thẳng vào vòng tuần hoàn (vào tĩnh mạch cảnh
rồi về tim), tác dụng do đó xuất hiện nhanh, lại không qua gan nên tránh đƣợc
sự phá hủy của men chuyển hóa thuốc ở gan vì vậy sinh khả dụng của thuốc
đƣợc nâng cao so với đƣờng uống. pH của nƣớc bọt là 6,5 là một lợi thế vì ít
ảnh hƣởng đến độ bền vững của các thuốc nhạy cảm với môi trƣờng kiềm
hoặc acid. Đây là một đƣờng đƣa thuốc thuận tiện, dễ thực hiện, và an toàn
[4].
Để dƣợc chất đƣợc hấp thu nhanh, viên đặt dƣới lƣỡi phải rã rất nhanh
(trong vòng 1 – 2 phút) và dƣợc chất phải là loại dễ tan.
Để tránh gây cảm giác cộm dƣới lƣỡi khi đặt và làm cho viên rã nhanh,

viên đặt dƣới lƣỡi thƣờng đƣợc chế với khối lƣợng nhỏ (<150 mg) và mỏng.
10

Do vậy dƣợc chất phải là loại dùng ở liều thấp (1-15 mg), không kích ứng
niêm mạc và ở dạng bột rất mịn [8].

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Nguyên tắc và phân loại
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid
Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các
chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng
dƣới áp suất cao.
Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân, chất lỏng
đƣợc bao trên bề mặt một chất rắn, hoặc là chất mang rắn đã đƣợc biến đổi
bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
Tùy thuộc vào bản chất các pha, cơ chế tách mà ngƣời ta phân làm nhiều
loại sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion,
sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó, sắc
ký lỏng phân bố đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay [5], [9], [10], [14].
1.3.2. Các thông số đặc trƣng
1.3.2.1. Thời gian lưu t
R

Thời gian lƣu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
tan đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại.
Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là
xác định. Vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lƣu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thƣớc, độ xốp, cấu trúc của hạt nhồi.
- Bản chất, thành phần, tốc độ pha động.
- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.
11

- Trong một số tƣờng hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất
tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hƣởng đến các cân bằng động trong
quá trình sắc ký [9], [14].
1.3.2.2. Hệ số phân bố K
Là đại lƣợng đặc trƣng cho sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha
tĩnh. K =





Trong đó: C
S
: là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh.
C
M
: là nồng độ mol của chất tan trong pha động.
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các
chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn
ra càng dễ dàng hơn [9], [14].
1.3.2.3. Hệ số dung lượng k’
Là đại lƣợng cho biết tỉ số khối lƣợng của chất tan phân bố vào pha tĩnh
và pha động. k’ = K





=







Trong đó: K: hệ số phân bố.
V
S
, V
M
: thể tích pha tĩnh và pha động.
t
R
, t
M
: thời gian lƣu của chất cần phân tích và chất không lƣu
giữ.
Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho k’ nằm trong khoảng 1≤ k’≤8 [5], [9], [14].
1.3.2.4. Hệ số đối xứng F
Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng:
F =



Trong đó:

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
12

a: khoảng cách từ đƣờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đƣờng cong
phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0.
Hệ số đối xứng thấp do hiện tƣợng mở rộng dải (doãng pic), nguyên nhân có
thể do quá trình khuếch tán xoáy, khuếch tán dọc, hoặc quá trình chuyển khối
không cân bằng [5], [9], [14].
1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N
Là đại lƣợng đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký:
N = 16





= 5,54







Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic.
W
1/2
: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic.
Nếu N quá nhỏ thì không có sự tách của các chất, nếu N quá lớn thì t

R

lớn, rửa giải tốn nhiều dung môi. Theo thực tế, trong phân tích hầu hết các
hỗn hợp mẫu, N nằm trong khoảng 3500 – 7500 là vừa đủ.
Nếu gọi L là chiều dài của cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết đƣợc
tính bằng công thức: H =


.
H càng nhỏ, hiệu lực cột càng cao [5], [9], [14].
1.3.2.6. Độ phân giải R
S

Để đánh giá mức độ tách của các chất trong một hệ pha, ngƣời ta dùng
đại lƣợng độ phân giải R
S
.
R
S
=









=











Trong đó:
t
RA
, t
RB
: thời gian lƣu hiệu lực của 2 pic liền kề nhau (của chất A và B).
W
A
, W
B
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
13

W
1/2A
, W
1/2B
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu R
S

> 1, giá trị tối ƣu R
S
= 1,5 [5], [9], [14].
1.3.3. Các phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:
nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phƣơng pháp định lƣợng hay đƣợc sử dụng trong sắc ký là:
- Phƣơng pháp chuẩn ngoại.
- Phƣơng pháp chuẩn nội.
- Phƣơng pháp thêm chuẩn.
- Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.
Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi xin trình bày cụ thể về phƣơng
pháp chuẩn ngoại. Đây là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu
chuản và thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện
tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu
chuẩn sẽ tính dƣợc nồng độ chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phƣơng pháp
chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm.
 Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của
mẫu thử. Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: C
X
= C
S
.





C
X

, C
S
: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn.
S
X
, S
S
: diện tích pic của chất phân tích trong SKĐ mẫu thử và mẫu chuẩn.
 Chuẩn hóa nhiều điểm: tiến hành theo các bƣớc sau:
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn
tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu đƣợc là các diện tích hoặc
chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa
diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng
khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác
14

định. Xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích
(hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định: Y = a + bC
Trong đó: Y: diện tích pic (hoặc chiều cao).
a: giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung.
b: độ dốc của đƣờng chuẩn.
C: nồng độ của chất phân tích.
Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong
khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn [5], [9], [14].

15

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1.1. Chất chuẩn
Chuẩn GF.HCl (hàm lƣợng: 99,89%, độ ẩm: 0,7%) do Viện kiểm
nghiệm thuốc trung ƣơng cung cấp.
2.1.1.2. Viên Aslem
Viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem chứa GF.HCl (hàm lƣợng ghi nhãn 1mg),
chế phấm do bộ môn Hóa sinh trƣờng Đại học Dƣợc Hà nội cung cấp. Số lô:
012014, sản xuất ngày: 15/01/2014.
2.1.2. Dung môi, hóa chất
- Methanol (MeOH) tinh khiết HPLC (Merck – Đức).
- Dikali hydrophosphat (PA), dung dịch H
3
PO
4
85% (PA) (Merck –
Đức).

- Nƣớc cất 2 lần.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, máy móc
- Hệ thống máy HPLC – detector UV – DAD Agilent Technologies 1260
Infinitive (Mỹ) với phần mềm Agilent Chemstation for LC version B.
- Máy siêu âm Sonorex super RK 106 (Đức)
- Máy ly tâm Hettich EBA 20 (Đức)
- Máy đo pH Mettler Toledo – seven easy S20 (Thụy Sĩ)
- Máy thử độ rã Erweka ZT4 (Đức)
- Tủ sấy Memmert (Đức)
- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm.
- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d=0,01 mg).
16

- Các dụng cụ khác: Bình định mức 20 ml, 50ml, pipet, ống đong, cốc có
mỏ, lọ đựng mẫu sắc kí (vial)…

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem
bằng HPLC
Theo hƣớng dẫn chung thẩm định quy trình phân tích đối với chế phẩm
định tính và định lƣợng [7], [27] chúng tôi tiến hành thẩm định phƣơng pháp
phân tích đã đƣợc lựa chọn với các chỉ tiêu:
 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
 Độ chọn lọc của phƣơng pháp.
 Tính tuyến tính và khoảng xác định.
 Độ chính xác: gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian.
 Độ đúng của phƣơng pháp.
2.2.2. Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi
Aslem
Chúng tôi dự kiến xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem

theo hƣớng dẫn DĐVN IV (Phụ lục 1.20) gồm các chỉ tiêu sau:
 Tính chất.
 Định tính.
 Độ đồng đều khối lƣợng.
 Độ rã.
 Độ đồng đều hàm lƣợng.
 Định lƣợng.