Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 20 112

m
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHAN THỊ THANH THẢO
GÓP PHẦN NGHIÊN cứu LÊN MEN
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 20.112
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
Thời gian thực hiện
PGS.TS. CAO VĂN THU
BỘ MÔN VI SINH - SINH HỌC
2-5/2006
HÀ NỘI, 5/2006

-
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và cảm ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm cfn
đến PGS.TS Cao Văn Thu - người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện
khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên
trong bộ môn Vi sinh - Sinh học, phòng thí nghiệm trung tâm, Thạc sĩ
Nguyễn Đình Luyện - Bộ môn Công nghiệp dược, PGS.TS Nguyễn Quang
Đạt - Bộ môn Hoá hữu cơ, đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực
nghiệm. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy giáo, cô
giáo các bộ môn, các phòng ban trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập tại trường.
Với thời gian thực nghiệm có hạn và trong quá trình thực nghiệm không

tránh khỏi những thiếu sót nên khoá luận này chắc chắn còn nhiều hạn chế .
Rất mong được sự góp ý của các thầy cô giáo và bạn bè để khoá luận hoàn
thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn
Hà Nội ngày 19 tháng 5 năm 2005
Sinh viên
Phan Thi Thanh Thảo
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN

,

,

2
1.1. Vài nét về kháng sinh


2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
2
1.1.3. Phân loại kháng sinh
2
1.1.4. úíig dụng kháng sinh 3
1.1.5. Sơ đồ mô tả qui trình sản xuất kháng sinh
4
1.2. Đại cương về xa khuẩn

4
1.2.1. Xạ khuẩn 4
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 5
1.2.3. Phân loại Streptomyces

.

6
1.3. Cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh

Jỉ
1.3.1. Mục đích cải tạo giống 7
1.3.2. Các phưcmg pháp cải tạo giống 7
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 8
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8
1.4.1. Lên men bề mặt 8
1.4.2. Lên men chìm 9
1.5. Chiết tách, tinh chế sản phẩm sau lên men 10
1.5.1, Tách sinh khối từ dịch lên men 10
1.5.2. Tách chất kháng sinh từ sinh khối 10
1.5.3 Chiết kháng sinh từ dịch lọc 10
1.5.4. Tách các thành phần kháng sinh và tinh chế kháng sinh.
.
11
1.6. Nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh
.


12
1.7. Một số nghiên cứu gần đây về kháng sinh

13
1.7.1. Phân lập một kháng sinh mới, Alaremycin, có cấu trúc
giống với 5-Aminolevulinic acid từ Streptomyces sp. A012304

13
1.7.2 Phenoxymethylpenicillin được chèn giữa các hydrotalcit là thuốc
ức chế vi khuẩn 14
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 15
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Các phương pháp thực nghiệm 17
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 23
2.2.1. Sàng lọc chủng đã được cất giữ của xạ khuẩn Streptomyces 20.112 23
2.2.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 23
2.2.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 26
2.2.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29
2.2.5. Kết quả chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
31
2.2.6. Kết quả sắc ký lớp mỏng
32
2.2.7. Kết quả thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không

33
2.2.8. Kết quả sắc ký cột 34
2.2.9. Kết quả thu kháng sinh tinh chế bằng cất quay chân không

36
2.2.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy bột tinh chế

38
2.2.11. Kết quả xác định một số nhóm chức của kháng sinh bằng quang
phổ hồng ngoại 39
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT

41
3.1. Kết luận 41
3.2. Đề xuất 41
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
HTKS Hoạt tính kháng sinh
KS Kháng sinh
MT
Môi trường
MTdd
Môi trường dung dịch
Gr(+)
Gram dưoỉng
Gr(-) Gram âm
VK
Vi khuẩn
vsv
Vi sinh vật
D(mm)
Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
s
Độ lệch thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh
B.pumilus
Bacillus pumilus
p. mirabilis
Proteus mirabilis

ĐẬT VẤN ĐỂ
Hiện nay, khoa học nghiên cứu các chất kháng sinh vẫn đang là vấn đề
nổi bật, thu hút sự chú ý quan tâm của nhiều nhà khoa học thuộc các lĩnh vực
khác nhau trên thế giới. Nhờ sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại và
sự hỗ trợ của các ngành khoa học khác, việc nghiên cứu các chất kháng sinh
đã đạt được những thành tựu rực rỡ, hàng năm có vài trăm chất được phát
hiện. Tuy hiện nay có nhiều chất kháng sinh được phát hiện nhưng chỉ có
không quá 1% có giá trị thực tiễn trong y học. Hơn nữa do việc sử dụng
không hợp lý chất kháng sinh trong y học cũng như trong chăn nuôi làm ngày
càng có nhiều chất kháng sinh không còn tác dụng. Do vậy việc tìm kiếm các
chất kháng sinh mới là cẩn thiết và vô cùng quan trọng. Trong số các vi sinh
vật sinh chất kháng sinh, xạ khuẩn là nhóm tiềm năng lớn, khoảng 8000 chất
kháng sinh hiện biết trên thế giới có 80% là do xạ khuẩn sinh ra. Nhiều kháng
sinh có nguồn gốc xạ khuẩn có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng làm kìm
hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng của nhiều loại vi sinh vật khác nhau.
Trong những năm gần đây, bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học
Dược Hà Nội đã tiến hành phân lập một số chủng Streptomyces có trong đất
Việt Nam, góp phần vào các nghiên cứu ban đầu tìm ra kháng sinh mới. Qua
quá trình thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn khóa luận: "Góp phần nghiên cứu
lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 20.112" với những
mục tiêu:
- Nghiên cứu cải tạo giống quy mô phòng thí nghiệm để nâng cao năng
suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Bước đầu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh quy mô phòng
thí nghiệm.
- Bước đầu nghiên cứu tinh chế kháng sinh và xác định một số nhóm
chức trong cấu trúc kháng sinh bằng phổ hồng ngoại( IR).
PHẦNl
TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về kháng sinh

1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [5],
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay từ
các nguồn tự nhiên khác, có hoạt tính sinh học cao, ở nồng độ thấp có tác
dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác
định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật )•
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh [9].
Người có công lớn nhất trong việc khám phá ra thế giới các chất kháng
sinh, đặt nền móng cơ bản cho nghiên cứu chất kháng sinh là bác sĩ người
Anh Alexander Fleming (1881-1955). Năm 1928, Fleming phát hiện nấm sợi
Penicilium notatum khi phát triển có thể ức chế mạnh, thậm chí làm tan cả
khuẩn lạc của vi khuẩn Staphylococcus aureus. Năm 1940, B.E.Chain,
H.W.Florey tiến hành chiết xuất thành công chế phẩm kháng sinh đầu tiên đặt
tên penicilin, mở ra một kỷ nguyên mới, kỷ nguyên kháng sinh chính thức ra
đời. Sau penicilin nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới tiến hành nghiên cứu
tìm kiếm kháng sinh từ vsv.
Đến nay, số lượng chất kháng sinh hiện biết là hơn 8000 chất và mỗi
năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh được phát hiện.
I.13. Phân loại kháng sinh {6\
Có nhiều cách phân loại kháng sinh, thông thường phân loại theo cấu tạo
hoá học gồm có các nhóm sau:
1. Kháng sinh p-lactam
2. Kháng sinh Aminoglycosid
3. Kháng sinh Tetracyclin
4. Kháng sinh Chloramphenicol và dẫn chất
5. Kháng sinh Macrolid
6. Kháng sinh Lincosamid
7. Kháng sinh Polypeptid
8. Kháng sinh Quinolon
9. Các chất kháng sinh khác: Rifamycin, kháng sinh chống nấm, kháng
sinh chống ung thư.

1.1.4. ứng dụng kháng sinh [5].
❖ ứig dụng kháng sinh trong lĩnh vực y học:
Việc ứng dụng kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm trùng có ý nghĩa
thực tiễn y học lớn. Ngày nay, do việc sử dụng rộng rãi kháng sinh làm tỷ lệ
kháng kháng sinh tăng cao nên việc cải tạo các kháng sinh có sẵn và tìm kiếm,
sản xuất kháng sinh mới là rất cần thiết.
❖ ứig dụng kháng sinh ngoài lĩnh y học
- Kháng sinh dùng trong chăn nuôi: Kháng sinh được các bác sỹ thú y
dùng để điều tri các bệnh do v sv gây ra cho động vật. Ví dụ: dùng
griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú ở trâu bò, Ngoài ra KS còn
được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc. Ví dụ: các chế phẩm
Biovit, Tetravit.
- Kháng sinh dùng trong trồng trọt: Kháng sinh được dùng để tiêu diệt
v s v gây bệnh cho cây trồng. Ví dụ: những kháng sinh thưòmg dùng là
griseofulvin, kasugamycin
- Kháng sinh dùng trong công nghiệp thực phẩm: Một số kháng sinh là
chất bảo quản lý tưởng thực phẩm tươi và đóng hộp. Ví dụ: subtilin, nisin hay
được dùng trong bảo quản thực phẩm
1.1.5. Sơ đồ mô tả qui trình sản xuất kháng sinh[5].
1.2. Đại cương về xạ khuẩn [3], [4], [7], [9].
1.2.1. Xạ khuẩn.
♦♦♦ Đặc điểm chung của xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi
trong tự nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gr(+), hiếu khí, hoại sinh, có
cấu tạo dạng scfi phân nhánh. Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất
và khuẩn ty khí sinh. Xạ khuẩn có khả năng tạo nhiều sản phẩm trao đổi chất
quan trọng như : kháng sinh, ezym, một số vitamin và acid hữu cơ Tuy
nhiên một số ít xạ khuẩn gây bệnh cho người.
❖ Đặc điểm hình thái xạ khuẩn:
- Đường kính khuẩn ty khoảng 0,2)Lim-3|am,
- Màu sắc của khuẩn ty rất phong phú: trắng, vàng, đỏ, tím, nâu, xám,

- Thành tế bào xạ khuẩn dày khoảng 10nm-20nm,
- Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính.
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces
Streptomyces là giống xạ khuẩn được Waksman và Henri đặt tên năm
1943. Chúng có vị trí tiến hóa cao trong số các giống thuộc vi khuẩn Gr(+), có
khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh phát triển, phân nhánh.
❖ Đặc điểm hình thái
- Khuẩn lạc : khuẩn lạc của xạ khuẩn rất đặc biệt, nó không trơn ướt như
vi khuẩn, nấm men mà thường thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có nếp
tỏa ra theo hình phóng xạ. Khuẩn lạc có chân vững chắc khó tách khỏi môi
trường.
- Hệ sợi xạ khuẩn có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh
+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu trong môi trường nuôi cấy. Nó có thể tiết
ra môi trường một số loại sắc tố : có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan
trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không
khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các
chuỗi bào tử.
Màu sắc của khuẩn ty hết sức phong phú : màu trắng, vàng, đỏ, lục, xám.
- Xạ khuẩn sinh sản vô tính bằng bào tử.
+ Trên đầu khuẩn ty khí sinh hình thành cuống bào tử và chuỗi bào tử.
Chuỗi bào tử có nhiều hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng hoặc
móc câu, xoắn.
+ Bào tử: hình elipsoid, lăng trụ, cầu. Đường kính khoảng l-5|im. Bề
mặt bào tử có thể nhấn, gai, tóc, xù xì như da cóc.
❖ Đặc điểm sinh lý:
- Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có nguồn cacbon thường dùng là
đường, tinh bột và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ: peptôn, cao
ngô, cao nấm men, nitơ vô cơ là nitrat, muối amoni
- Streptomyces là vi sinh vật hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu thường là 25-30® c,

pH tối ưu là 6,8-7,5.
❖ Khả năng tạo sắc tố: sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:
sắc tố hòa tan, sắc tố khuẩn ty khí sinh, sắc tố khuẩn ty cơ chất, melanoid
1.2.3. Phân loại Streptomyces.
❖ Streptomyces có nhiều khóa phân loại khác nhau như: khóa phân loại
Krasillnikow, Waksman, Gauze, Shirling và Gottlieb Vào năm 1970, tại hội
nghị vi sinh vật thế giới lần thứ 10 tổ chức tại Mexico, uỷ ban phân loại vi
khuẩn quốc tế đã thống nhất thành lập một chương trình hợp tác mô tả, bảo
quản Streptomyces gọi tắt ISP ( International Streptomyces Project). ISP cùng
phương pháp xác định xạ khuẩn của Shirling và Gottlieb làm phương pháp
chuẩn quốc tế để phân loại Streptomyces.
♦t* Những tiêu chuẩn xác định xạ khuẩn:
- Hình thái cuống bào tử,
- Bề mặt bào tử,
- Màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh,
- Khả năng tạo sắc tố melanoid,
- Khả năng tạo sắc tố hòa tan,
- Khả năng sử dụng các nguồn đường.
1.3. Cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh.
13.1. Mục đích cải tạo giống [5].
Các chủng xạ khuẩn mới phân lập từ cơ chất thiên nhiên thường có hoạt
tính thấp, đồng thời trong quá trình nuôi cấy hoạt tính có thể bị giảm dần. Vì
vậy, để thu được chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất phải cải tạo, chọn
giống bằng các biện pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích
hợp nhằm các mục đích:
- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh,
- Cải tạo đặc tính lên men, rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt
- Chỉ sinh tổng hợp một sản phẩm để dễ chiết tách, tinh chế,
- Sinh tổng hợp được sản phẩm mới.
1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống [5].

♦♦♦ Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc tự nhiên.
Các vi sinh vật biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống,
có thể có cá thể tăng hoạt tính kháng sinh so với cá thể khác. Cần phải chọn cá
thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp.
Trên thực tế, tần suất xuất hiện các cá thể dương tính khá thấp và việc
chọn lọc tự nhiên chỉ giúp cho những nghiên cứu bước đầu, chưa có giá trị áp
dụng vào sản xuất công nghiệp. Để thu được các chủng có khả năng siêu tổng
hợp kháng sinh có giá trị trong công nghiệp cần áp dụng các phương pháp đột
biến nhân tạo.
❖ Đột biến nhân tạo.
- Là đột biến sinh ra bởi các tác nhân vật lý hay hóa học. Khi sử dụng các
tác nhân này với liều lượng thích hợp có thể giết chết hầu hết vi sinh vật.
Trong số các cá thể sống sót sẽ xuất hiện sự biến đổi ở nhiễm sắc thể, làm
thay đổi tính trạng, hoặc làm giảm (mất) khả năng tạo kháng sinh (đột biến
âm tính), hoặc tăng hiệu suất tạo kháng sinh (đột biến dương tính).
- Những tác nhân hóa học: hydroxylamin, nitrozoguanidin, acid nitrơ
- Những tác nhân vật lý: tia rcmghen, tia nơron nhanh, ánh sáng tử
ngoại
Trong đó, đột biến bằng ánh sáng u v được sử dụng phổ biến trong di
truyền. Để thu được chủng có hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến
hành đột biến bậc thang, kết hợp các phưoỉng pháp di truyền phân tử.
133. Bảo quản giống xạ khuẩn [15], [18].
❖ Mục đích: để giữ giống vi sinh vật có tỷ lệ sống sót cao, ổn định được
những đặc điểm và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.
❖ Hiện nay có nhiều phương pháp để giữ giống như: giữ giống trên môi
trưcmg thạch nghiêng trong tủ lạnh, kỹ thuật dùng parafin, làm đông khô, ổn
định trong đất. Tùy theo trang thiết bị và vi sinh vật cần giữ mà chúng ta có
thể sử dụng phương pháp nào. Đối với giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí
nghiệm đơn giản nhất có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường
thạch nghiêng trong tủ lạnh.

1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [5], [11], [13], [15], [18].
Lên men sinh tổng hợp kháng sinh là quá trìnlĩmĩôi cấy v sv trong môi
trường dinh dưỡng với các điều kiện ngoại cảnh tốt nhất để vi sinh vật sinh
trưởng, phát triển mục đích để tạo được nhiều kháng sinh nhất.
Thông thường, người ta chia làm 2 kiểu lên men chính là lên men bề mặt
và lên men chìm.
1.4.1. Lên men bề mặt.
Theo phưofng pháp này, v s v được nuôi cấy trên bề mặt môi trường rắn,
đặc hay lỏng, vsv hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng
oxy không khí để hô hấp trên bề mặt môi trưòfng dinh dưỡng. Vì vậy yêu cầu
của lên men bề mặt là bề mặt lên men phải rộng và lớp dinh dưỡng không quá
sâu.
+ ư u điểm của phương pháp: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu
thấp.
+ Nhược điểm của phương pháp: đòi hỏi diện tích bề mặt lớn, hiệu suất
sử dụng môi trường thấp, khó cơ giới hóa và tự động hóa. Vì vậy phương pháp
này chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm để chọn giống.
1.42. Lên men chìm.
❖ Theo phưoỉng pháp này, v s v được nuôi cấy, phát triển ba chiều trong môi
trường lỏng thích hợp. v sv dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào
sinh dưỡng đang giai đoạn phát triển mạnh và đồng hóa vật chất cao nên giống
được nhân giống ở cấp khác nhau:
Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml)
Giống cấp 2: Nuôi trong bình nhân giống 501
Giống cấp 3: Nuôi trong thiết bị nhân giống 1-5
Tỷ lệ giống trong môi trường lên men thường từ 1-10%, có thể phải cho
thêm các chất phá bọt, các chất điều chỉnh pH, hay đệm pH nhằm đảm bảo
điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men. Hiệu quả quá trình lên men tăng khi
thời gian lên men rút ngắn.
+ ư u điểm của phưoỉng pháp lên men chìm: sử dụng tối đa môi trường

dinh dưỡng, hiệu suất sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men
cao. Thiết bị dễ cơ giới hóa và tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng, tốn ít nhân
công.
+ Nhược điểm của phương pháp: đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật
cao (chịu được áp lực cao, vô trùng tuyệt đối ), đầu tư lớn.
Với những ưu điểm nổi bật như vậy, đại đa số kháng sinh hiện nay được
sản xuất trong công nghiệp bằng phưofng pháp lên men chìm.
Quá trình lên men chìm được chia làm nhiều kiểu:
❖ Lên men gián đoạn (lên men có chu kỳ): là một quá trình đóng kín, trong
thời gian lên men không có bất cứ tác động hay bổ sung gì vào hệ ngoài việc
cung cấp oxy, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH (nếu cần), v s v phát triển qua
các giai đoạn và tạo sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta tiến hành các công
đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm. Phương pháp này được ứng dụng sản xuất
nhiều hoạt chất quan trọng như: acid amin, các chất kháng sinh.
*1* Lên men gián đoạn có bổ sung: Đây là biến tướng của phương pháp lên
men gián đoạn, khi ta bổ sung thêm môi trường mới vào dịch lên men một
cách ổn định, thay đổi hay định kỳ nhưng không lấy bớt dịch lên men ra.
❖ Lên men liên tục: Hệ thống lên men hoạt động như hệ thống mở. Trong
quá trình lên men vừa bổ sung liên tục môi trường dinh dưỡng đồng thời lấy
bớt ra khỏi hệ đồng lượng dịch lên men đã biến đổi cùng v s v có trong đó.
❖ Lên men bán liên tục; ở đây việc rút bớt dịch lên men và bổ sung thêm
môi trường dinh dưỡng không xảy ra liên tục mà theo chu kỳ định kỳ .
1.5. Chiết tách, tinh chế sản phẩm sau lên men.
Sau khi lên men, dịch lên men ngoài kháng sinh còn có nhiều tạp chất
khác là các chất vô cơ hoặc hữu cơ, là sản phẩm trao đổi chất hay là thành
phần của môi trường. Do đó việc tách chiết và tinh chế kháng sinh là rất quan
trọng.
Quá trình tách chiết và tinh chế kháng sinh thường tiến hành qua các bước:
1.5.1. Tách sinh khối từ dịch lên men [5], [11].
Để tách sinh khối từ dịch lên men thường dùng 2 phương pháp: lọc hoặc

ly tâm.
- Lọc: có thể bổ sung thêm chất trợ lọc và thực hiện dưới áp suất thường
hoặc áp suất giảm.
- Ly tâm: sử dụng khi phương pháp lọc không có hiệu quả.
1.5.2. Tách chất kháng sinh từ sinh khối [3], [9].
Rửa sinh khối nhiều lần bằng nước cất để loại bỏ các thành phần của môi
trường. Sau đó dùng các dung môi hữu cơ thích hợp để tách chiết.
1.5.3 Chiết kháng sinh từ dịch lọc [14].
Thường dùng các phương pháp: tách chiết bằng dung môi hữu cơ, tách
chiết bằng nhựa trao đổi ion, tạo phức kết tủa chất kháng sinh,
❖ Tách chiết bằng dung môi hữu cơ
Nguyên tắc của phưofng pháp: là dựa vào sự phân bố khác nhau của chất
kháng sinh giữa hai pha (dung môi chiết và dịch lọc) không đồng tan với nhau
để tách lấy kháng sinh.
Để chiết kháng sinh từ dịch lọc, người ta có thể dùng các phưcrng pháp
chiết sau: chiết đơn (chiết một lần), chiết lặp (chiết nhiều lần), chiết ngược
dòng.
1.5.4. Tách các thành phần kháng sinh và tinh chếkháng sinh [1], [10], [12], [17]
Thường sử dụng phương pháp sắc ký. sắc ký: là một nhóm các phương pháp
hóa lý dùng để tách các thành phần một hỗn hợp dựa trên sự phân chia khác nhau
của các chất khác nhau vào hai pha không hòa lẫn vào nhau là pha động và pha
tĩnh. Trong tinh chế kháng sinh ngưòi ta thường sử dụng các phưofng pháp sắc ký
như: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao.
❖ Sắc ký lớp mỏng: là sắc ký trong đó chất hấp phụ (pha tĩnh) được rải thành
lớp mỏng trên tấm kính hoặc tấm kim loại. Trong đó, quá trình chuyển động
của pha động qua lớp hấp phụ do tác dụng của lực mao quản, nhờ các quá
trình hấp phụ - giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau,
các thành phần được dịch chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với
những tốc độ khác nhau, Kết quả thu được sắc đồ trên bản mỏng.
+ ưu điểm của sắc ký lớp mỏng: có thể tách hỗn hợp phức tạp nhiều

thành phần, các loại hợp chất vô cơ và hữu cơ khác nhau, độ nhạy cao, lượng
mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật tiến hành đơn giản, thiết
bị tương đối rẻ.
❖ Sắc ký cột: là sắc ký trong đó chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha tĩnh
được nhồi trong ống hình trụ gọi là cột, nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi
liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.
+ Cột trong phòng thí nghiệm là những ống hình trụ bằng thủy tinh dài
25-70cm, đường kính từ l-5cm, đầu dưới có vòi và một khóa điều chỉnh tốc độ.
+ Hóa chất nhồi cột có thể là cellulose, gel của acid silic không hoạt
hóa, oxit nhôm, silicagel, CaCOg. Các chất dùng trong sắc ký cột phải được
tiêu chuẩn hóa để việc sử dụng được dễ dàng thuận lợi.
+ Dung môi: nói chung các hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng yà
sắc ký giấy đều có thể sử dụng cho sắc ký cột.
Vấn đề thiết kế một cột sắc ký dùng tách một hỗn hợp chất thử trước hết
người ta phải giải đáp những câu hỏi sau:
Dùng chất hấp phụ gì, kích thước cột?
Dùng dung môi rửa nào? thể tích mỗi loại, thể tích mỗi phân
đoạn, tốc độ chảy?
Trên thực tế người ta có xu hướng giải quyết những câu hỏi trên bằng
thực nghiệm, vừa đơn giản và cũng cho kết quả chắc chắn. Cách giải quyết
bằng thực nghiệm thông qua cách thăm dò sử dụng sắc ký lớp mỏng trước khi
tiến hành trên cột. Khi đã chọn được chất hấp phụ và hệ dung môi thích hợp
để đảm bảo việc tách lượng lớn nên làm thử các cột bé và tách một lượng chất
thử ít.
1.6. Nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh [1], [8], [16], [21].
Để xác định cấu trúc của một kháng sinh phải tiến hành xác định phổ
hồng ngoại, phổ khối, phổ NMR.
❖ Quang phổ hồng ngoại (IR)
- Quang phổ hồng ngoại là phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử.
Phân tử hấp thụ năng lượng của bức xạ hồng ngoại bị thay đổi dao động. Vì

vậy, phổ IR còn gọi là phổ dao động. Năng lượng bức xạ hồng ngoại không đủ
lớn để làm thay đổi trạng thái điện tử hay gây nên ion hóa hay sự phân ly và
cũng không đủ mạnh để gây nên sự phân hủy quang hóa.
Vùng bức xạ hồng ngoại sử dụng trong các máy quang phổ IR thông
thường là từ 400- 4000 cm *
Thường dùng số sóng V là đại lượng đặc trưng:
~ X(cm)
Trong phân tử khi nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay
đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR.
Như vậy có sự tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ. Người ta
có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết về một nhóm chức nào
đó. Có nhiều nhóm chức có dải hấp thụ đặc trưng. Đây là cơ sở việc phân tích
cấu trúc bằng phổ IR.
1.7. Một số nghiên cứu gần đây về kháng sinh [19], [20].
1.7.1. Phân lập một kháng sinh mới, Alaremycin, cố cấu trúc giống với
5-Aminolevulinic acid từStreptomyces sp. A012304 [19].
Một kháng sinh mới có cấu trúc giống với 5-Aminolevulinic acid (ALA),
tiền chất của quá trình sinh tổng hợp hem, được đặt tên là alaremycin, phân
lập từ môi trường nuôi cấy của một dòng xạ khuẩn được phát hiện ngẫu nhiên
trong thí nghiệm sàng lọc để tìm cấu trúc nhân tế bào trong Escherichia coli.
Dòng xạ khuẩn này được xác định thuộc chi Streptomyces dựa vào các đặc
điểm về hình thái học, sinh lý học, hoá học và di truyền học,
Tinh chế kháng sinh alaremycin: Dịch nổi được chảy qua cột Diaion HP-
20, dịch chảy qua cột có chứa kháng sinh được điều chỉnh về pH2 bằng HCl
IN, sau đó chiết với ethylacetat. Pha dung môi hữu cơ được chiết với nước ở
pH 9, pha nước tiến hành sắc ký trao đổi ion QMA. Các phân đoạn thu được,
điều chỉnh về pH2 với HCl IN, sau đó chiết với ethylacetat. Pha dung môi hữu
cơ tiến hành bốc hơi đến khô thu được bột trắng alaremycin.
Cấu trúc hoá học của alaremycin được xác định là 5- acetamido- 4 - 0 X 0 -
5-hexenoic acid thông qua phân tích phổ khối và phổ NMR.

Nghiên cứu cho thấy tác dụng kháng khuẩn của alaremycin tăng lên khi
có mặt của ALA mặc dù bản thân ALA không có tác dụng kháng khuẩn
thậm chí ở nồng độ 1000|Lig/ml với cơ chế chưa xác định.
1.7.2 Phenoxymethylpenicillin được chèn giữa các hydrotalcit là thuốc ức chế
vi khuẩn [20].
Thuốc kháng sinh giải phóng duy trì đang rất được quan tâm bỏfi tác
dụng kháng khuẩn kéo dài của nó. Một số nghiên cứu để sản xuất penicillin
giải phóng duy trì như viên nén penicillin trong khuân chất béo, viên nang
gelatin, nhưng hầu hết các sản phẩm đều không phát huy hiệu quả của thuốc.
Trong nghiên cứu này, phenoxymethylpenicillin (PMP) được cho chèn
giữa các lớp hydrotalcite tạo thành hỗn hợp hydrotalcit-phenomethylpenicillin
(HTP). Hydrotalcit (HT) thu được bằng cách trộn Mg(N03)2 vói A1(N03)3
trong nước ở pH9, ờ nhiệt độ phòng với tỷ lệ Mg(N0 )2:Al(N03)3 là 3:1. Sau
đó để kết tủa ở 375° K trong 24h trong hộp chứa, rửa với nước khử ion cho tới
khi dịch rửa có pH7. Để trong không k h í, cuối cùng thu được bột trắng HT.
Nung HT trong không khí ở 773° K trong 5h, PMP(500mg) được hoà tan trong
600ml nước cất ở nhiệt độ phòng. 300mg HT sau khi nung cho trộn với dung
dịch hòa tan PMP và hỗn hợp được khuấy dưới khí nitơ ở 310° K trong 7 ngày.
Sau khi điều chỉnh pH pha nước của hỗn hợp về 8,5 bằng dung dịch NaOH,
thu được HTP.
Nghiên cứu nhiễu xạ tia X mẫu HTP chứng minh được phân tử
phenomethylpenicillin trong HTP ổn định trong các lớp HT và giữ vững toàn
bộ tính chất hoá học. Trong thí nghiệm kháng khuẩn cũng khẳng định phân tử
PMP giải phóng từ HTP giữ nguyên tác dụng kháng khuẩn cũng như PMP
trong HTP được giải phóng từ từ theo thời gian. Trên cơ sở này nghiên cứu sản
xuất thuốc penicilin giải phóng duy trì từ hỗn hợp vô cơ - thuốc này.
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu

❖ Chủng xạ khuẩn
Qiủng xạ khuẩn Streptomyces 20.112 do bộ môn Vi sinh - Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
❖ Giống vi sinh vật kiểm định:
Do bộ môn Vi sinh- Sinh học cung cấp
Vi khuẩn Gram(-)
Vi khuẩn Gram(+)
Proteus mirabilis BV 108
Bacillus pumilus ATCC 10241
❖ Các môi trường sử dụng
- Môi trường canh thanh nuôi cấy vi khuẩn kiểm định:
NaCl 0,5%; pepton 0,5%; cao thịt 0,3%; nước cất vừa đủ lOOml
- Môi trường thạch thường:
NaCl 0,5%; pepton 0,5%; cao thịt 0,3%; thạch 1,8%; nước cất vừa đủ
lOOml
- Môi trưcỉng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 1 tiếp theo.
❖ Vật liệu dùng trong sắc ký:
- Dung môi chạy sắc ký: gồm dung môi được giới thiệu ở bảng 2
- Bản mỏng sắc ký: Silicagen 60P254, Merck.
- Bình chạy sắc ký
- Buret dài 25cm
- Hạt Silicagen 60P254, Merck sắc ký cột.
Thành phần MTl MT2 MT5
Tinh bột
2 2
Lactose
Glucose
Cao ngô
Saccrose
3

Bột đậu tưofng
1
Pepton
Cao thịt
KNO3
0,1
KCl
0,05
NaNOs
0,2
NH4NO3
CaCOj
0,2
(NH4)2S04
0,2
FeS04.7H20
0,001
K2HPO4
0,05
0,1
MgS04.7H20 0,05
0,05
NaCl
0,05
0,1
Cao nấm men
Thạch
1,8
2
2

Nước
100
100
100
pH
7,0 -7,2
6,8 -7,2
7,0 -7,2
- Các môi trường lên men chìm có thành phần tương tự như trên ngoại trừ
không có thạch là: MTldd, MT2dd, MT5dd.
Dung môi
Khối lượng riêng(g/ml)
Nhiệt độ sôi
Aceton
0,79 56°c
n-Butanol
0,81
116- 1180C
Butylacetat
0,880- 0,885
117-118°c
Dimethylformamid
0,95
153°c
Ethanol
0,789- 0,791 78,3°c
Triethylamin 0,727
90°c
*t* Máy móc, thiết bị
- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV(Ằ,= 254nm) nguồn phát Toshiba

60W, điện thế 220V
- Máy lắc Taitec Bio- Shaker BR 300 Lf
- Tủ ấm Trung quốc 30°c, 37°c
- Cân kỹ thuật PRECISA BJ 210C, cân phân tích SARTORIUS BP 210J
- Tủ sấy SHALLAB MODEL- 1350 FX
- Tủ cấy BASSAIR, tủ cấy AURA VF48
- Nồi hấp vô trùng HIRA YAMA Model HL - 3030e, nồi hấp
HICLIVE™HVE-25
- Máy cất quay chân không Buchi waterbath B480 (Phòng thí nghiệm
GMP, Trường Đại học Dược Hà Nội)
- Máy đo độ chảy ElectrothermalDigital (Bộ môn Hoá hữu cơ, Trường
Đại học Dược Hà Nội)
- Máy quang phổ hồng ngoại PERKINELMER (Phòng thí nghiệm trung
tâm, Trường Đại học Dược Hà Nội)
2.7.2. Các phương pháp thực nghiệm
❖ Phương pháp nuôi cấy và giữ giống:
Giống Streptomyces 20.112 được cấy zigzac trên ống thạch nghiêng
MTl, rồi ủ trong tủ ấm 30°c. Sau 6-10 ngày chủng phát triển tố t, cất các ống
giống trong tủ lạnh bảo quản ở 2°C- 4®c. Định kỳ 3- 6 tháng cấy
❖ Phương pháp thử hoạt lực kháng sinh:
- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vsv
kiểm định. ỈCháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường sẽ ức chế sự
phát triển của v sv kiểm định tạo vòng vô khuẩn có đường kính tỷ lệ thuận
với logarit nồng độ kháng sinh tương ứng. Tiến hành như sau:
+ Chuẩn bị giống v s v kiểm định:
VSVkiểm định được đưa vào môi trường canh thang ( đối vói vi khuẩn).
Nuôi cấy ở nhiệt độ 37°c (đối với vi khuẩn) trong 18-24h.
+ Cấy v s v kiểm định vào môi trường thạch thường:
Môi trường thạch thường được tiệt trùng ở 120°c/ 20 phút, để nguội tới
45-50°C rồi cấy giống v sv kiểm định vào theo tỷ lệ Vgiông:VMT= 1 • 40. Lắc

đều, đổ môi trường ra các đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/ 1 đĩa.
+ Đưa mẫu thử vào môi trường chứa v s v kiểm định:
Nếu mẫu thử là khối thạch chứa kháng sinh: Đặt khối thạch o = 6,0mm
lên bề mặt môi trường chứa v s v kiểm định.
Nếu mẫu thử là dung dịch(dịch lọc lên men, ): Tạo các giếng thạch
trên môi trường đã cấy v s v kiểm định o = 6,0mm rồi nhỏ mẫu thử vào, mỗi
giếng nhỏ 0,05ml
Nếu mẫu thử là dịch chiết kháng sinh trong dung môi hữu cơ: Dùng
khoanh giấy lọc o = 6,0mm đã tẩm dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử 3
lần, sấy nhẹ cho khô, sau đó đặt lên môi trường đã cấy v s v kiểm định.
+ Nuôi cấy :
Các đĩa petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°c (đối với vi
khuẩn) trong 18-24h
+ Đánh giá kết quả:
Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn (đo bằng thước kẹp Panmer có độ
chính xác 0,02mm) và xử lý theo công thức:
_ ẺA t(Đ,-Dy
D

n 11 « -1
D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm)
Dị : Đưòỉng kính vòng vô khuẩn thứ i (mm)
s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
n : Số thí nghiệm làm song song
❖ Phương pháp cải tạo giống VSV: ứig dụng phương pháp đột biến bằng ánh
sáng UV:
- Pha hỗn dịch bào tử:
Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 20.112 cho vào ống nghiệm
chứa sẵn lOml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều thu được hỗn
dịch bào tử ở độ pha loãng 10‘^(định ước). Sau đó dùng pipet vô trùng hút Iml

hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10'® làm mẫu chứng, 9ml còn lại
cho vào đĩa petri vô trùng.
- Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV:
Đĩa petri chứa 9ml hỗn dịch được đem chiếu ánh sáng u v vói khoảng
cách và thòi gian thích hợp ( khoảng cách 60cm, thời gian chiếu 5 phút), sau đó
để vào chỗ tối khoảng 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10'^.
- Cấy bào tử sau đột biến:
Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml mẫu chứng nồng độ 10'^ và
0,1 ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các nồng độ 10 '^, 10'^ cho vào các đĩa
petri có chứa MTl. Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên
bề mặt thạch. Mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa. Nuôi cấy ở 30®c trong 6 ngày.
Sau 6 ngày nuôi cấy, đếm khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công
thức:
% sống sót = = X100
No
N^: Số khuẩn lạc phát triển sau đột biến
Nq: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng
- Chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cấy lên bề mặt MTl, nuôi cấy
thêm 6 ngày rồi thử hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp khối thạch(tiến
hành song song với mẫu chứng).
Mỗi biến chủng làm 3 thí nghiệm song song.
Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% biến đổi hoat tính = = X100
Dị: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i(mm)
Dq: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng(mm).
Dựa vào kết quả thu được lựa chọn biến chủng có % đột biến cao nhất để
tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
❖ Phương pháp lên men gián đoạn:
- Tạo giống cấp 1:
Chủng Streptomyces 20.112 sau khi nuôi cấy trên ống thạch nghiêng

(MTl) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500 ml chứa lOOml
MTldd bằng lOml nước máy vô trùng, lắc trên máy lắc ờ nhiệt độ 30°c, tốc
độ quay 145 vòng/phút trong 48h.
- Lên men:
Sau 48h nhân giống, giống cấp 1 được cấy vào bình nón 500ml chứa
lOOml các môi trưcmg lên men khác nhau để chọn môi trường lên men tốt nhất
với tỷ lệ Vgiô„g: yuĩìènmsn = 1-10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 30°c,
tốc độ quay 145 vòng/ phút trong 120h.
Sau khi lên men, lọc dịch lên men thu được dịch lọc thử hoạt lực kháng
sinh của dịch lọc bằng phương pháp giếng thạch. Dựa vào kết quả đó lựa chọn
môi trường lên men tốt nhất
❖ Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ:
Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối thu được dịch lọc trong. Điều
chỉnh pH của dịch lọc về pH7 rồi chiết với dung môi n-Butanol. sử dụng
phương pháp chiết 1 lần như sau: