Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng cefuroxim trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

B ộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
• • • •
NGUYỄN THỊ LAN
NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CEFUROXIM TRONG HUYÉT TƯƠNG BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHÓA 2002
% 'X ^ W 'Y
Người hướng dẫn: PGS. TS. TRẦN TỬ
TS. PHÙNG THỊ VINH "
Nơi thực hiện: TRƯNG TÂM ĐÁNH GIÁ TƯƠNG
ĐƯƠNG SINH HỌC - VIỆN KIÉM NGHIỆM THUỐC TRƯNG ƯƠNG
Thời gian thực hiện: 03/2007 - 05/2007
HÀ NỘI 05 / 2007
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các thầy
cô và toàn thể cán bộ, nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Đe hoàn thành luận văn này tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Tử An đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin tỏ lòng biêt ơn chân thành tới ban giám đốc Viện kiểm nghiệm
thuốc trung ương, TS. Phùng Thị Vinh - Giám đốc trung tâm đánh giá tương
đương sinh học Viện kiểm nghiệm thuốc và toàn thể cán bộ nhân viên trung
tâm đã tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài để hoàn thành luận văn này.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình, toàn thể bạn
bè động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2007

Nguyễn Thị Lan
ĐẶT VẤN Đ Ê 1
PHẦN 1: TỎNG QUAN 3
1.1: ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFUROXIM

3
1.1.1: Cấu trúc hóa h ọc 3
1.1.2: Tính chất vật lý 3
1.1.3: Tác dụng dược lý 3
1.1.4: Dược động học 4
1.2: YÊU CẦU CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG
HUYẾT TƯƠNG 5
1.2.1: Yêu cầu chung 5
1.2.2: Các chỉ tiêu cần thẩm định
5
1.2.3: Các phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc 8
trong huyết tương 8
1.3: ĐỊNH LƯỢNG CEFUROXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG
HPLC 11
1.3.1: Chương trình H PLC 11
1.3.2: Nhận xét và lựa chọn: 15
PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 16
2.1: NGUYÊN - VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN c ứ u

16
2.1.1: Nguyên liệu, hóa chất, dung m ôi 16
2.1.2: Dụng cụ thiết bị 16
2.1.3: Đối tượng nghiên cứu trong xây dựng và thấm định phương pháp
phân tích 17
2.2: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

17
2.2.1: Nghiên cứu, xây dựng qui trình kỹ thuật

17
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích 19
2.3. BÀN LUẬN 30
PHẦN 3: KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 32
3.1. KẾT LUẬN 32
3.2. ĐỀ XUẤT 33
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG, s ơ ĐỒ
Sơ đồ 1: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn

9
Sơ đồ 2: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

10
Sơ đồ 3: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp tạo tủa

11
Bảng 1: Chương trình HPLC định lượng cefuroxim acetyl trong huyết
tương 14
Bảng 2: Sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội và nồng độ
Cefuroxim chuẩn pha trong huyết tương
24
Bảng 3: Ket quả xác định giới hạn định lượng dưới

26
Bảng 4: Ket quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày

27
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày

28
Bảng 6 : Kết quả khảo sát độ ổn định của Cefuroxim trong huyết tương
29
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng

20
Hình 2: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có chuẩn nội Acetanilid
.
21
Hình 3: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn nội và chuẩn
Cefuroxim (nồng độ 5 Ị4,g/mL) 21
Hình 4: sắc ký đồ huyết tương trước khi uống thuốc

22
Hình 5: sắc ký đồ huyết tương người sau khi uống viên Haginat 250 mg
1,5 giờ

22
Hình 6. Thông tin của pic Cefuroxim của mẫu chuẩn tự tạo pha trong
huyết tương 23
Hình 7: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của tỷ lệ diện tích pic
chuẩn/chuẩn nội theo nồng độ Cefuroxim chuẩn pha trong huyết
tương 25
BẢNG VIỂT TẮT
ACE Acetanilid

CFX Cefuroxim
HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sac ký lỏng
hiệu năng cao
LLOQ Giới hạn định lượng dưới
MeCN Acetonitril
MeOH Methanol
RSD Độ lệch chuẩn tương đối
SD Độ lệch chuẩn
SKD Sinh khả dụng
TB Trung bình
TĐSH Tương đương sinh học
ĐẶT VẤN ĐÈ
Song song với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và ngành công
nghệ dược phẩm, lĩnh vực phân tích phục vụ cho công tác đảm bảo chất lượng
thuốc cũng không ngừng lớn mạnh. Nhu cầu về nghiên cứu sinh khả dụng
(SKD), tương đương sinh học (TĐSH) cũng như tương đương điều trị ở Việt
Nam ngày một tăng thêm. Ket quả đánh giá SKD và TĐSH giúp các nhà sản
xuất lựa chọn được công thức, kỹ thuật bào chế tối ưu tạo ra các sản phẩm
thuốc chất lượng tốt, giúp các bác sỹ có thêm cơ sở để chọn thuốc thay thế
hay hiệu chỉnh liều dùng cho phù hợp với từng bệnh nhân.
Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH, một
trong những nội dung quan trọng là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử
lý mẫu và phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học ( máu, huyết tương,
nước tiểu, ). Qúa trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều
khó khăn do khi thuốc sau khi vào cơ thể thường bị chuyển hóa tạo thành
nhiều dẫn chất khác nhau, hơn nữa nồng độ thuốc trong các dịch sinh học
thường rất thấp, môi trường dịch sinh học phức tạp. Chính vì vậy, phương
pháp phân tích phải được thẩm định rất chặt chẽ theo những qui định riêng để
đảm bảo kết quả thực nghiệm đúng và chính xác.
Hiện nay ở Việt Nam chưa có văn bản chính thức đánh giá tác dụng

sinh học đối với các chế phẩm sản xuất trong nước, trong hồ sơ đăng ký thuốc
chưa có yêu cầu cung cấp kết quả nghiên cứu về TĐSH. Để ngành dược Việt
Nam phát triển và hội nhập với các nước trên thế giới việc triển khai nghiên
cứu TĐSH của thuốc có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tế quản lý thuốc ở
nước ta hiện nay nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và khả năng cạnh tranh.
Trước nhu cầu đó chúng tôi lựa chọn đề tài:
1
“ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng cefuroxim trong
huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”
Đe tài nhằm giải quyết các mục tiêu:
❖ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng cefuroxim
trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
♦> ứng dụng được phương pháp đã xây dựng để định lượng
cefuroxim trong huyết tương người phục vụ cho nghiên cứu dược động
học và đánh giá tương đương sinh học của chế phấm.
Chúng tôi hy vọng rằng kết quả nghiên cứu này sẽ có giá trị thực
tiễn cao, góp phần vào việc thúc đẩy ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao
để định lượng các chất trong dịch sinh học nhằm phục vụ cho đánh giá
tương đương sinh học của thuốc.
2
PHẦN 1: TỎNG QUAN
1.1: Đại cương về cefuroxim
1.1.1: Cấu trúc hóa học
H jC
J ,
(lRS)-l-Acetoxyethyl(6R,7R)-3- carbamoyloxymethyl-7-
[(Z)-2-furan-2-yl-2-methoxyiminoacetylamino]-8-oxo-5-
thia-l-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylat
1.1.2: Tỉnh chất vật lỷ [10][18][19]
Bột màu trắng hoặc gần như trắng, tan trong nước, không tan trong

ethanol. Rất ít tan trong benzen, cloroform.
[<4 ° =+60“
pKa (trong nước) = 2.5
1.1.3: Tác dụng dược lý [3] [8]
Cefiiroxim là kháng sinh bán tổng hợp phổ rộng, thuộc nhóm
cephalosporin, thuốc tiêm là dạng muối natri và thuốc uống là dạng acetyl
este. Cefuroxim acetyl là tiền chất của cefuroxim, chất này có rất ít hoạt tính
kháng khuẩn khi chưa bị thủy phân thành cefuroxim trong cơ thể sau khi được
hấp thu. Cefuroxim có hoạt tính kháng khuẩn hữu hiệu và rất đặc trưng chống
nhiều tác nhân gây bệnh thông thường, kể cả chủng tiết beta - lactamase của
cả vi khuan Gram dương và Gram âm.
3
1.1.4: Dược động học [3][11 ]
Sau khi uống, cefuroxim acetyl được hấp thu qua đường tiêu hóa và
nhanh chóng bị thủy phân ở niêm mạc ruột và trong máu để giải phóng
cefuroxim vào hệ tuần hoàn, gốc acetyl được chuyển hóa thành acetaldehyd
và acid acetic. Thuốc được hấp thu tốt nhất trong bữa ăn. Nồng độ đỉnh của
cefuroxim trong huyết tương thay đổi tùy theo dạng viên hay dạng hỗn dịch.
Nồng độ đỉnh trong huyết tương của hỗn dịch uống đạt 71% nồng độ đỉnh
trong huyết tương của thuốc viên. Diện tích dưới đường cong (AUC) của hỗn
dịch uống đạt 91% AƯC của thuốc viên. Do đó thuốc viên và hỗn dịch uống
cefuroxim acetyl không thể thay thế nhau theo tương quan mg/mg. Ở người
trưởng thành khi uống cefuroxim dạng viên nén 125mg, 250mg, 500 mg, lg
ngay sau khi ăn thì đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 2 - 3 giờ lần lượt
là 2,1; 4,7; 7; 13,6 |ug/mL. Sau 6 giờ giảm xuống còn 0,3; 0,7; 2,2; 3,4 |ig/mL.
Muối natri được dùng theo đường tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch, ở người
khỏe mạnh khi tiêm bắp liều 500mg, 750mg, lg thì sau 1 5 -6 0 phút nồng độ
đỉnh trong huyết tương đạt lần ỉượt 20,8 - 25,7; 26 - 34,9; 32 - 40|ug/mL. Khi
tiêm tĩnh mạch liều 500mg, lg nồng độ đỉnh trong huyết tương lần lượt là 2,1
và 3,6 |Lig/mL sau 4 giờ. Khi tiêm tĩnh mạch liều 750mg nồng độ đỉnh trong

huyết tương đạt 24|ig/mL sau 1 giờ tiêm và đạt 3,5|.Lg/mL sau 4 giờ tiêm.
Có từ 33-50% cefuroxim trong hệ tuần hoàn liên kết với protein huyết
tương. Cefuroxim phân bố rộng khắp cơ thể kể cả dịch màng phổi, đờm,
xương, hoạt dịch và thủy dịch. Thể tích phân bố biểu kiến ở người lớn khỏe
mạnh nằm trong khoảng từ 9,3-15,8 lít/l,73m2.
Cefuroxim đi qua hàng rào máu não khi màng não bị viêm. Thuốc qua
nhau thai và có bài tiết qua sữa mẹ.
ở người trưởng thành nửa đời thuốc trong huyết tương từ 1,2-1,6 giờ và
kéo dài ở trẻ sơ sinh và người suy thận. Cefuroxim không bị chuyển hóa và
4
được thải trừ ở dạng không biến đổi, khoảng 50% qua lọc cầu thận và 50%
qua bài tiết ở ống thận. Thuốc đạt nồng độ cao trong nước tiểu.
Sau khi tiêm, hầu hết liều sử dụng thải trừ trong vòng 24 giờ. Probenecid
ức chế thải trừ cefiiroxim qua ống thận làm nồng độ trong huyết tương tăng
cao và kéo dài hơn. Cefuroxim chỉ thải trừ qua mật với lượng rất nhỏ.
Nồng độ cefuroxim giảm khi bị thẩm tách.
1.2: Yêu cầu của phương pháp định lượng thuốc trong huyết tương [4]
[7] [20]
1.2.1: Yêu cầu chung
Đe đánh giá sinh khả dụng của thuốc, cần xác định được nồng độ của
thuốc trong máu sau khi uống. Do đó phương pháp lựa chọn phải được thẩm
định và đánh giá về tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện
và giới hạn định lượng đối với từng hoạt chất do nồng độ của thuốc trong
huyết tương thường rất thấp cỡ ng/mL hoặc |ig/mL.
1.2.2: Các chỉ tiêu cần thẩm định
Đánh giá phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu qui định của Dược điến
áp dụng cho các phép phân tích trong dịch sinh học. Những chỉ tiêu bao gồm:
❖ Tính đặc hiệu của phương pháp
♦> Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Độ đúng, độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày

❖ Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
❖ Độ ổn định của mẫu phân tích
> Tính đặc hiệu của phương pháp:
Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng đánh giá chất cần phân tích
khi có mặt các chất khác có thể là tạp chất, hoặc các thành phần cản trở khác.
Phương pháp phân tích có khả năng nhận diện chất cần phân tích và không bị
nhầm lẫn bởi các chất khác.
5
Trong phân tích dịch sinh học, phương pháp phải chứng minh được chất
xác định là dược chất hay chất chuyển hóa có tác dụng. Phân tích mẫu không
bị ảnh hưởng bởi các chất nội sinh và chất chuyển hóa liên quan.
Bằng thực nghiệm, điều chỉnh và lựa chọn các điều kiện xử lý mẫu, định
lượng sao cho pic của cefuroxim trên sắc đồ thu được phải nằm riêng rẽ, tách
riêng với các pic tạp khác có trong mẫu huyết tương .
Báo cáo kết quả phải bao gồm cả sắc kí đồ của mẫu trắng (dịch sinh học),
mẫu chất chuẩn pha trong dịch sinh học và mẫu thử thu được sau khi dùng
thuốc.
'r Đường chuẩn và khoảng tuyến tỉnh:
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của phương pháp đo
(diện tích hay chiều cao pic trong sắc ký, mật độ quang trong quang phổ )
với nồng độ của chất phân tích trong dịch sinh học. Mối quan hệ này phải
được đánh giá bằng phương trình hồi qui, thu được bằng phương pháp phân
tích hồi qui ( phương pháp bình phương nhỏ nhất).
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một
đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Trong khoảng này, phép phân tích phải
thỏa mãn các yêu cầu về độ đúng và độ chính xác theo qui định.
Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một
mẫu sinh học. Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ nồng độ của các mẫu
cần phân tích. Không xác định nồng độ mẫu thử dựa trên điểm ngoại suy của
khoảng tuyến tính. Nồng độ thấp nhất là giới hạn định lượng, thông thường

phải bằng 1/20- 1/10 giá trị c max. Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường
chuẩn phải tuyến tính và có hệ số tuyến tính R2 > 0,98.
Đường chuấn phải đáp ứng các điều kiện sau:
S Độ lệnỊ). so với giá trị thực của các nồng độ phải <15%, trừ điểm X
gần LLOQ được chấp nhận < 20%
6
s Có ít nhất 4/6 điểm chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả
LLOQ và nồng độ cao nhất.
> Độ đúng:
Gía trị đánh giá sự phù hợp của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu
đã biết. Điều đó có thể được biểu thị bằng hệ số thu hồi, thường cho phép
trong khoảng 85-115%, nhưng có thể chấp nhận 80-120% đối với điểm gần
giới hạn định lượng.
Độ đúng cũng cần xác định ít nhất ở 2 khoảng nồng độ thấp nhất và cao
nhất.
> Độ chỉnh xác
Đánh giá mức độ phân tán của các phép thử song song. Độ chính xác
được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng độ của mẫu cần kiểm tra,
một nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của phương pháp định lượng (LOQ),
một nồng độ gần với điểm giới hạn trên của đường chuẩn và một nồng độ ở
gần điểm giữa đường chuẩn. Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5
mẫu.
Độ chính xác có thể được biểu thị là độ lệch chuẩn tương đối (RSD)
trong ngày và giữa các ngày, được xác định trên mẫu đối chứng. RSD khoảng
15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%.
'r Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):
Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được với độ đúng
và độ chính xác cho phép.
Mầu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là
LLOQ nếu thỏa mãn:

s Đáp ứng ở LLOQ ít nhất phải bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng
s Pic của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm tách riêng và có
thể tái lập với độ chính xác từ 8 0 - 120 %.
7
> Độ ổn định của mẫu thử
Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá
trong lúc lấy mẫu, xử lý và bảo quản.
Trong thấm định phương pháp phân tích cần xác định các loại độ on định sau
- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc bao gồm: độ ổn
định ở điều kiện nhiệt độ phòng, độ ổn định ở điều kiện bảo quản dài ngày, độ
ổn định của dung dịch pha loãng (nếu cần).
- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:
+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông - rã đông
+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng
+ Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh trong khoảng thời gian dự định
1.2.3: Các phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc
trong huyết tương (6)
Có 3 phương pháp xử lý mẫu hay được sử dụng với các mẫu dịch sinh
học: tủa protein với dung môi hữu cơ hoặc acid, chiết lỏng - lỏng và chiết pha
rắn, tùy thuộc vào điều kiện của từng phòng thí nghiệm và đặc điểm của chất
phân tích để lựa chọn phương pháp phù họp.
’> Phương pháp chiết pha rắn (rắn-lỏng): Đây là một kỹ thuật
chiết xuất theo cơ chế liên kết - rửa giải hoặc hấp phụ - giải hấp. Lựa chọn cột
(chất liên kết) thích hợp, dung môi rửa giải, dung môi loại tạp phù hợp để áp
dụng vào qui trình chiết, phương pháp này ít được dùng phần lớn do giá
thành, nhưng mức độ tinh khiết của dịch chiết cao.
Mau thử (1- 2mL)
Cột chiết thích hợp
8
\

Loại tạp băng dung môi thích hợp
ị
Làm khô (hút chân không 5 phút)
Rửa giải bằng dung môi thích hợp
ị
Bốc hơi dịch rửa giải
( Nhiệt độ/ khí trơ)
ị
Hòa tan cắn / pha động, lọc, tiêm sắc ký
Sơ đồ 1: Các bước xử lỷ mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn
> Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng:
Chiết lỏng - lỏng trong phân tích dịch sinh học thường dùng một dung
môi ít tan trong nước để chiết chất phân tích từ mẫu huyết tương. Kỹ thuật này
tuy phải dùng nhiều dung môi nhưng gía thành thấp nên được dùng nhiều ở
nước ta.
Mầu thử ( 1 -2 mL)
Dung môi chiết thích họp ( 2 -5 lần thể tích mẫu)
r r
Chiêt (lăc cơ học, thời gian, nhiệt độ)
ị
9
Hòa tan cắn trong pha động, lọc, tiêm sắc ký
Sơ đồ2:Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng
đây là phương pháp đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, thời
gian chiết nhanh nên được chọn để xử lý mẫu trong giai đoạn thăm dò
phương pháp phân tích. Các tác nhân gây tủa protien thường được sử
dụng trong quá trình xử lý mẫu bao gồm: acid, dung môi hữu cơ hoặc
muối:
> Tủa bằng acid: Đơn giản, phù hợp với các dược chất bền
trong môi trường acid, dễ tan trong nước, khó chiết bằng dung môi hữu

cơ. Tác nhân gây tủa thường được sử dụng là acid tricloracetic,
trifloracetic, acid percloric với nồng độ thông thường khoảng 5 - 10%.
'> Tủa bằng dung môi hữu cơ: Khảo sát với 2 loại dung môi:
methanol, acetonitril với các tỷ lệ khác nhau.
> Tủa bằng muối: amoni sulfat khan
> Phương pháp loại protein: Khảo sát tỷ lệ các chất tạo tủa,
Mầu thử
(lmL)
Acid percloric 1/10
0,25 ml
Methanol/ acetonitril
5 ml
Amoni sulfat
0,25 g
10
Ly tâm Ly tâm
Ly tâm
Lọc dịch nối Lọc dịch nối
Ỷ
Sắc ký
Sắc ký
> ■y
Sơ đô 3: Các bước xử lỷ mâu băng phương pháp tạo tủa
1.3: Định lượng cefuroxim trong huyết tương bằng HPLC
1.3.1: Chương trình HPLC (9) (6) (4)
Đe định lượng các chất trong dịch sinh học (huyết tương, mô, nước tiểu),
thường sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý ( điện di mao quản, sắc ký
khí, sắc ký lỏng, ). Đối với một số hoạt chất có tác dụng dược lý đặc hiệu có
thể định lượng bằng phương pháp vi sinh ( một số chất kháng sinh/kháng
khuẩn) hoặc phương pháp miễn dịch đặc hiệu. So với các phương pháp vi

sinh, miễn dịch; phương pháp phân tích hóa lý có phạm vi ứng dụng rộng hơn
và thường cho kết quả ổn định và dễ triển khai hơn. Trong các phương pháp
phân tích hóa lý, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được sử dụng
trong nghiên cứu SKD và TĐSH. Các phương pháp thường được lựa chọn
giới thiệu: sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tử ngoại, huỳnh quang, điện
hóa, khối phổ. Tuy nhiên việc ứng dụng các phuơng pháp này còn tùy thuộc
vào trang thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm Việt Nam. Phương pháp
HPLC dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái
lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào
nhau: pha tĩnh và pha động. Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích
được tiêm vào cột sắc ký, chúng sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh
11
tùy thuộc bản chất hạt nhồi và chất cần phân tích. Khi bơm dung môi pha
động qua cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ di
chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi
đi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được chuyển qua bộ phận xử
lý kết quả . Sau đây là một số chương trình HPLC định lượng cefuroxim trong
huyết tương.
12
STT Côt
•
Pha động
Toe do
•
dòng
(ml/phút)
Giới han
•
ĐL
Thời

gian lưu
(phút)
Detector
UV(nm)
Chuẩn nôi
•
1(16)
LC-18DB 150x4.6 mm,
5|im
Acetonitril 10% trong hệ
đệm phosphat(pH=3)
2
0.25pig/mL
12
280
2(15) BeckmanUltrasphere ODS
150x4.6 mm, 5|im
MeCN:đệm phosphat 50mM
10:90
1.5
500ng/mL
6,3
280 Cephaloridin
3(15)
ChromSpher Cl 8 100x3
mm, 5|j.m
Me0H:KH2P0 467mM 15:85 0,4 700ng/mL 7,7 275 Cephalexin
4(15)
Novapak c 18 MeCNracid acetic băng
:nước 6:1:93 (pH=4)

1 5,4 254
5(15) Hypersil C l8 250x2.1 mm,
5|um
MeCN:đệm pH=4,3(acetat
25mM và triethylamin
15mM điều chỉnh) 7,5:92,5
0,35 5,9
6(15)
Lichrosorb RP-18
150x4.7mm, 5|im
MeOH:Tetrabutylamonium
20mM và KH2P04 23:77
1 lnmol/L 13 254 Cephalexin
13
7(15)
5Bondapak C18 300x3.9
mm
MeCN: amoniacetat 1 OmM
10:90
1,5
270
8(15)
Alltech C18 250x4.6 mm,
10|Lim
MeOH:muôi acetatlOmM
30:70
1,5
10 254 cefsulodin
9(15) Bondapak C18
MeCN: Đệm acetat pH=5,2

15:85
1 100-
1 OOOng/
mL
6,8 254
cefoperazon
10(18) Ultrasphere C18 150x4.6
mm, 5|im
MeCN:Amoni acetat lOmM
10:90
1,5
270
Bảng 1: Chương trình HPLC định lượng cefuroxim acetyl trong huyết tương
14
1.3.2: Nhận xét và lựa chọn:
• • •
Mục tiêu của đề tài là xây dựng qui trình định lượng cefuroxim trong
huyết tương người bằng phương pháp HPLC nên các chỉ tiêu được ưu tiên lựa
chọn là:
❖ Môi trường thử: Máu người.
❖ Detector: Lựa chọn detector ƯV, áp dụng khi phân tích các
chất có giới hạn định lượng cỡ Ịig/m L phù hợp với trường hợp cefuroxim.
❖ Giới hạn định lượng: Càng nhỏ càng tốt vì nồng độ thuốc
trong dịch thường rất thấp, lượng mẫu thử ít (l-2mL).
♦> Thời gian lưu: càng ngắn càng tốt.
♦> Pha động: yêu cầu hóa chất phải thông dụng dễ pha, thích
hợp với pha tĩnh.
❖ Cột: Ưu tiên sử dụng cột pha đảo, thích họp với phòng thí
nghiệm ở nước ta.
15

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1: NGUYÊN - VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN c ứ u
2.1.1: Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
> Chất chuẩn và nội chuẩn (IS):
+ Cefuroxim (CFX) - Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương; hàm
lượng: 95,15 (tính theo khan), độ ẩm: 2,51%, SKS: 0105175, bảo quản 5°c
tránh ánh sáng.
+Acetanilid (ACE) - Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương; chất chuẩn
làm việc, hàm lượng 100%.
> Dung môi, hóa chất
Hóa chất, dung môi đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA) dùng
trong chiết tách và chạy sắc ký.
s Methanol, acetonitril loại chạy sắc ký
s Acid percloric, acid phosphoric
s Kali dihydrophosphat
s Acetanilid
> Huyết tương dùng trong nghiên cứu: huyết tương trắng mua của
Viện huyết học và truyền máu trung ương. Chọn các lô huyết tương không có
nhiều pic lạ rải rác trong khoảng thời gian 4- 10 phút.
2.1.2: Dụng cụ thiết bị
Tất cả dụng cụ thiết bị đều được chuẩn hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005
và GLP bao gồm:
> Thiết bị phân tích: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Merck - Hitachi D -
7000: Bơm L - 7100 kiểu gradient áp suất thấp; Detector Diod Array L -
7455; Buồng ổn nhiệt cột L - 7350; bơm mẫu bằng tay; Phần mềm điều khiển
16
và xử lý kết quả Merck — Hitachi Model D - 7000 Chromatography Data
station software vertỉon 4:1.
> Máy ly tâm lạnh Sartorius sigma 2 - 16K
> Cân phân tích sartorius (d = 0,1 mg; e = 0,1 mg)

> Máy lắc tự tạo tốc độ 60 vòng / phút
> Lắc xoáy Minishaker MS 1
> Micropipet 1-lOjLiL, 10-100jnL, lOO-lOOOf^L
> Các loại dụng cụ thủy tinh có độ chính xác thích hợp
2.1.3: Đối tượng nghiên cứu trong xây dựng và thẩm định phương
pháp phân tích
*t* Mầu trắng: Huyết tương trắng - Viện huyết học và truyền máu
trung ương.
❖ Mầu chuẩn hay mẫu thử tự tạo: Hòa tan CFX chuẩn trong huyết
tương trắng với các nồng độ thích hợp.
♦> Mầu thử: Huyết tương của người tình nguyện sau khi uống CFX
chứng hoặc thử.
2.2: KÉT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1: Nghiên cứu, xây dựng qui trình kỹ thuật
Xây dựng quỉ trình xử lý mẫu huyết tương
Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lý
mẫu, chiết tách CFX từ huyết tương trên các mẫu chuẩn CFX hòa tan trong
pha động; mẫu huyết tương trắng và các mẫu chuẩn CFX hòa tan trong huyết
tương trắng có nồng độ xấp xỉ Cmax, bằng các phương pháp như:
+ Tủa protein với các tác nhân gây tủa có thể là acid ( percloric,
tricloracetic, trifluoracetic), hoặc dung môi (MeOH, MeCN).
> Tủ bảo quản mâu ở nhiệt độ -40°c, Sanyo MDF - 236
+ Tủa protein kết hợp với chiết loại tạp bằng chiết lỏng
17
♦t* Xác định điều kiện sắc kỷ
Tiến hành sắc ký trên hệ thống sắc ký HPLC Merck - Hitachi (D-7000
Interface, L- 7100 pump, L-7455 Detector Diod array) với các điều kiện sắc
ký khác nhau:
s Cột phân tích: Khảo sát trên ba loại cột pha đảo C18 hoặc C8
của các hãng khác nhau: Merck (Lichrospher 250 X 4,6mm, 5p.m),

Inertsil (ODS 2 150 X 4,6mm, 5|im) và Alltech (Altima 250 X 4,6mm,
5Ị^m.
s Nhiệt độ cột: thay đổi từ nhiệt độ phòng đến 50°c.
s Pha động: Khảo sát trên các pha động là dung dịch đệm acetat,
đệm phosphat có thành phần, tỷ lệ và pH khác nhau.
s Thể tích tiêm mẫu: Từ 20 - IOOịiL.
s Lựa chọn chất thích họp làm chất chuẩn nội.
Sau khi tham khảo các phương pháp định lượng trong huyết tương bằng
phương pháp HPLC đã được công bố, dựa vào công thức phân tử, tính chất lý
hóa học cũng như điều kiện thí nghiệm ở nước ta để tiến hành xây dựng qui
trình định lượng trong huyết tương bằng HPLC.
Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được qui trình xử lý mẫu
và điều kiện sắc ký đáp ứng yêu cầu của phép phân tích có khả năng tách
riêng được pic của CFX và nội chuẩn khỏi các pic tạp có trong mẫu huyết
tương như sau:
❖ Qui trình xử lỷ mẫu
Khảo sát trên 3 kỹ thuật xử lý mẫu trong các phương pháp phân tích dịch
sinh học, kỹ thuật tủa protein là phương pháp đơn giản nhất, thời gian chiết
nhanh hơn nên được chọn để xử lý mẫu .
Tiến hành: Lấy 1,0 mL huyết tương ( mẫu trắng/chuẩn/thử) cho vào ống
ly tâm. Thêm 50|J.L dung dịch chuẩn nội Acetanilid 250|ig/mL; 0,25mL dung
18
dịch HCIO4 (1/10) lắc xoáy 2000 vòng/phút trong 2 phút, ly tâm
5000vòng/phút X ìophút. Lấy dịch nổi, lọc qua giấy lọc 0,45 Ịim. Dịch lọc thu
được dùng để tiêm sắc ký.
❖ Điều kiện sắc ký
Hệ thống HPLC, cột: Rp 18, 250 mm X 4 mm, kích thước hạt
nhồi 5|am.
s Nhiệt độ cột: 40°c.
s Pha động: hỗn hợp Acetonitril : Methanol: Đệm phosphat pH 3

(10 : 22 : 68).
s Tốc độ dòng: 1 mL /phút.
s Thể tích tiêm: 20ịiL.
s Detector u v X = 275nm.
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích
*1* Mầu chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan chất chuẩn gốc Cefuroxim trong MeOH
để thu được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng lOOOịig CFX/mL
MeOH. Dung dịch chuẩn gốc có thể bảo quản trong tủ lạnh, dùng trong vòng
1 tháng.
+ Dung dịch chuẩn làm việc
Dung dịch A: Lấy 0,5mL dung dịch chuẩn, bốc hơi dung môi (40°c,
khí N2). Hòa tan cắn trong 5mL huyết tương trắng (100|ig/mL).
Dung dịch B: Lấy lmL dung dịch A, thêm huyết tương trắng vừa đủ
5mL (20|ig/mL).
Dung dịch C: Lấy 0,5mL dung dịch B, thêm huyết tương trắng vừa đủ
5mL (lO^ig/mL).
♦> Mầu trắng: Huyết tương trắng không chứa CFX.
<♦ Mau thử: Huyết tương người tình nguyện sau khi uống CFX.
19