Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ streptomyces 318

BỘ Y T Ế
TRƯ Ờ NG Đ Ạ I HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HUỆ
GÓP PHẦN NGHIÊN cứu KHÁNG SINH
l i s STREPTOMYCES 318
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1997 - 2002)
Người hướng dẫn: T.s Cao Văn Thu
Th.s V õT h ịT huT huỷ
Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược
Thời gian thực hiện: 01/02/2001 - 20/5/2002
Hà Nội, 5 - 2002
LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới;
Thầy giáo T.s Cao Văn Thu
Cô giáo Th.s Võ Thị Thu Thuỷ
Những người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận tốt
nghiệp này.
Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới tất cả các thầy cô trong
bộ môn Công nghiệp Dược và các bộ môn khác, cùng các phòng ban đã nhiệt
tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực nghiệm.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè và gia đình tôi, những người đã giúp đỡ và
động viên tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2002
Sinh viên: Nguyễn Thị Huệ
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đ ề 1
Phần 1: Tổng quan 3
1.1. Đại cương về Streptomyces
3

1.1.1. Một số đặc điểm chung của Streptomyces 3
1.1.2. Khả năng STH kháng sinh của Streptomyces

4
1.2. Cải tạo chọn giống v s v 5
1.2.1. Đại cương về cải tạo chọn giống v s v sinh kháng sinh

5
1.2.2. Tuyển chọn ngẫu nhiên 5
1.2.3. Đột biến bằng ánh sáng ư v 5
1.3. Lên men STH kháng sinh 7
1.3.1. Lên men bề m ặt 7
1.3.2. Lốn men chìm 7
1.4. Chiết tách-tinh chế 9
1.4.1. Chiết xuất 9
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng 11
1.5. Phân loại xạ khuẩn theo ISP (International Streptomyces Project)

11
1.6. Một số nghiên cứu gần đây về kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn

11
1.7. Lên men STH và chiết tách tinh chế một số kháng sinh

12
Phần 2: Thực nghiệm và kết q u ả

2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiêm

15

2.1.1. Nguyên vật liệu
15
2.1.2. Phương pháp thực nghiêm 18
2.2. Kết quả và biện luận 25
2.2.1. Phổ tác dụng của kháng sinh do chủng Streptomyces 318 tạo ra trên
MTphân lập(M T l) 25
2.2.2. Kết quả thử khả năng STH kháng sinh của chủng Streptomyces 318
trên các MT nuôi cấy khác nhau 26
2.2.3. Kết quả cải tạo, chọn giống v s v 27
2.2.4. Kết quả lên men STH kháng sinh 30
2.2.5. Kết quả chiết xuất-tinh chế 32
2.2.6. Kết quả phân loại theo ISP
34
Phần 3: Kết luận và đề xuất 36
1. Kết luận 36
2. Đề xuất 36
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
ADN
; Adenin deoxyribonucleic
BC
: Bacillus cereus
Bp
: Bacillus pumilis
Bs
: Bacillus subtỉlis
EC
: Escherichia coli
Gy
: Grey
MT : Môi trường

Pro
: Proteus mirabilis
Pseu
: Pseudomonas aeruginose
Shi
: Shigella flexneri
SL
: Sarcina liitea
sm : smooth
Sta
: Staphylococcus aureus
RF ; Rectiflexibiles
STH : Sinh tổng hçfp
Typhi
: Samonelỉa typhi
v sv : Vi sinh vật
w
; White
Y
: Yellow
ĐẶT VẤN ĐỂ
Tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật (VSV) đang là một vấn đề nan giải
của nghành Y-Dược học Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Đặc biệt Việt
Nam là một nước đang phát triển do đó tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn cao hơn các
nước khác vì vậy nhu cầu tìm ra một số kháng sinh mới có hiệu lực mạnh ngày càng
trở nên bức xúc, công nghệ sinh tổng hợp (STH) kháng sinh cũng đang tiếp tục
khẳng định vai trò quan trọng của nó với các lĩnh vực khác.
Penicillin là kháng sinh đầu tiên được tìm ra vào năm 1928 do nhà bác học
Alexander Fleming. Từ đó đến nay đã có khoảng 8000 kháng sinh được biết đến nhờ
quá trình STH của v s v trong đó xạ khuẩn chiếm một tỷ lệ cao, hoặc bán tổng hợp

và tổng hợp nhờ những thành tựu to lófn của khoa học hiện đại.
Trong ngành công nghiệp kháng sinh việc nghiên cứu cải tạo các chủng v s v
STH kháng sinh có vai trò rất quan trọng đồng thời việc nghiên cứu phát triển công
nghệ lên men STH kháng sinh cũng có ý nghĩa to lớn, đưa lại những ứng dụng thực
tế trong các lĩnh vực Y- Dược học.
Mặt khác khí hậu Việt Nam là nhiệt đói nóng ẩm nên rất thích hợp cho v s v
nói chung và xạ khuẩn nói riêng phát triển mạnh nên công việc nghiên cứu xạ khuẩn
đặc biệt là chi Streptomyces đã được tiến hành nhiều năm nay ồ Việt Nam. Công
việc này được triển khai từ lâu tại Bộ môn Công nghiệp Dược và Tổ môn Vi nấm -
Kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội. Qua nghiên cứu đã lựa chọn được nhiều
chủng có độ ổn định di truyền học tốt và tổng hợp được nhiều kháng sinh có phổ
tương đối rộng, đây là nguồn gen quý hiếm giúp cho việc tạo ra các kháng sinh đem
lại nhiều ứng dụng trong lĩnh vực phòng bệnh, chữa bệnh cho người và động vật.
Với các lý do trên chúng tôi đã chọn khoá luận có tựa đề; “ Góp phần nghiên
cứu kháng sinh từ Streptomyces 318 ” với mục tiêu:
- Nâng cao hiệu suất STH kháng sinh.
- Nghiên cứu sơ lược về chiết tách và tinh chế.
- Phân loại chủng Streptomyces 318.
Khoá luận gồm 3 nội dung chính:
* Từ chủng Streptomyces 318 phân lập lừ bùn đất Việt Nam tiến hành cải tạo
giống và lên men quy mô phòng thí nghiêm để STH kháng sinh.
* Nghiên cứu phương pháp chiết tách và tinh chế hoạt chất kháng sinh.
* Tiến hành phân loại Streptomyces 318 theo ISP
(International Streptomyces Project).
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về Streptomyces:
1.1.1. Một sô đặc điểm chung của Streptomyces:
Streptomyces là một chi thuộc lớp phụ Actỉnomycetales phân bố rất rộng rãi
trong tự nhiên như: đất, nước, bùn, cát Thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+), hô hấp
hiếu khí. Trong mỗi gam đất nói chung thường có trên 1 triệu xạ khuẩn, theo tác giả

Đỗ Thu Hà trong mỗi gam đất ở khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng có trung bình từ
4.10'’-5,5.10‘^ xạ khuẩn Streptomyces. Số lượng xạ khuẩn trong 1 gam đất ở các mẫu
đất khác nhau là khác nhau, đất giàu dinh dưỡng và có độ ẩm, độ pH thích hợp sô
lượng xạ khuẩn trong 1 gam đất sẽ cao hơn còn nếu không thoả mãn các điều kiện
trên thì số lượng xạ khuẩn sẽ giảm.
Chi Streptomyces tạo ra cả khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất. Màu sắc
của khuẩn ty hết sức phong phú có thể gặp các màu: Trắng, vàng, xám, đen, đỏ, lục,
lam, tím, nâu, xám đen hay gặp các màu trắng, vàng, xám, đen. Khuẩn ty cơ chất
có thể tiết ra môi trường (MT) một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố
chỉ tan trong dung môi hữu cơ, có những sắc tố sẽ bị mất màu khi thay đổi pH.
Khuẩn ty cơ chất phát triển một cách đồng đều tạo thành một kết cấu bền. Khuẩn ty
cơ chất đang sinh trưởng có tính chất như sụn (xốp), bề mặt nhẵn hoặc xù xì, có xu
hướng dính chặt vào môi trường. Khuẩn ty khí sinh có kích thước từ 1,0-1,4 /umvầ.
hình thành những chuỗi sinh bào tử, đây là cơ quan sinh sản có tính chất rất đặc
trưng, chuỗi sinh bào tử có cấu tạo gồm một sợi trục không có tác dụng sinh sản,
trên sợi trục có những sợi ngắn phân nhánh, những đoạn phân nhánh cuối cùng mới
có khả năng sinh bào tử. Trong một số trường hợp đặc biệt khuẩn ty khí sinh bị mất
khả năng tạo thành bào tử bởi đột biến (Erickson,1948). Theo Waksman chuỗi sinh
bào tử có thể thẳng, xoắn hoặc hình làn sóng. Bào tử được hình thành do sự kết đoạn
tức là nguyên sinh chất trong khuẩn ty co lại thành từng cụm và được bao bọc bằng
một màng đặc biệt hoặc do sợi cắt khúc tức là sự hình thành vách ngăn. Trên mỗi
nhánh có từ 10-100 bào tử, bào tử có thể là hình cầu, elip hoặc hình trụ hai đầu tròn,
đường kính của bào tử thường tương ứng với đưòfng kính của khuẩn ty, nếu bào tử
hình cầu kích thước từ 0,3-0,8 jum còn bào tử hình trụ kích thước là 0,8; 1,0 hoặc
0,7 // m. Khuẩn lạc thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp
toả ra theo hình phóng xạ.
Streptomyces là v sv có thành tế bào kiểu I có chứa L.DAP
(diaminopimelat) và glycin.
Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển là 25”C-35‘*C và pH thích
hợp là từ 6,8-7,5.

Hình dạng và kích thước bào tử có vai trò quan trọng trong định tên xạ khuẩn.
1.1.2. Khả năng STH kháng sinh của Streptomyces:
Streptomyces là một chi có khả năng tạo thành nhiều loại kháng sinh thuộc
nhiều nhóm như: Aminosid, chloramphenicol, tetracyclin, macrolid, lincosamid
- Kháng sinh nhóm aminosid:
+ Streptomycin là chất kháng sinh thứ 2 được sử dụng trong lâm sàng sau
penicillin được tổng hợp nhờ 5. griseus (Waskman, 1943).
+ Kanamycin sản xuất từ 5. kanamycetius (Umezawa, 1957).
+ Tobramycin sản xuất từ s. tenebreus
+ Neomycin sản xuất i\i s. fradiae (Waksman, Lechevalier, 1949).
+ Paromomycin sản xuất từ s. rimosus forma paromomycinus
+ Spectinomycin dihydroclorid sản xuất từS. spectabìỉis
- Kháng sinh nhóm chloramphenicol:
+ Chloramphenicol do s. venezuelae tạo ra.
- Kháng sinh nhóm tetracyclin:
+ Tetracyclin do s. aiireofaciens (1952).
+ Oxytetracyclin do s. vimosus (Finlay và cộng sự, 1950).
+ Clotetracyclin do s. aureofaciens (1947).
- Kháng sinh nhóm macrolid:
+ Erythomycin do s. erythteus
+ Oleandomycin do s. antibioticiis
+ Spiramycin do s. ambofaciens
- Kháng sinh nhóm lincosamid:
+ Lincomycin do s. lincolnensis (1962).
- Kháng sinh chống nấm:
+ Nystatin do s. noursei (1951).
+ Amphotericin B do s. nodosus
- Một số kháng sinh khác;
+ Fosfomycin (Fosfocin) chiết xuất ì\i s. fradiae (1980).
1.2. Cải tạo chọn giống VSV:

1.2.1. Đại cương về cải tạo chọn giống v s v sinh kháng sinh:
Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng v sv có khả
năng tạo chất kháng sinh mong muốn, với một hàm lượng đủ để thoả mãn yêu cầu
của sản xuất công nghiệp vì vậy việc cải tạo sàng lọc ra những chủng mới, thoả mãn
các yêu cầu của quá trình sản xuất, từ khâu chiết tách-tinh chế sản phẩm là vô cùng
quan trọng và cần thiết.
1.2.2. Tuyển chọn ngẫu nhiên:
Tuyển chọn ngẫu nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên, là tuyển chọn lấy
những biến chủng xuất hiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại
cảnh. Mục đích của tuyển chọn ngẫu nhiên là chọn ra các chủng phát triển tốt, trên
cơ sở kế thừa những đặc tính vốn có của loài bố mẹ.
1.2.3. Đột biến bằng ánh sáng u v :
Đột biến là quá trình làm thay đổi trình tự sắp xếp các base hoặc thay đổi bản
thân các base trong ADN. Sự sinh ra đột biến gọi là phát sinh đột biến. Các yếu tô gây
đột biến gọi là các tác nhân gây đột biến, đột biến có thể làm thay đổi một vài nhược
điểm của giống như xuất hiện dạng đột biến đề kháng vói các tác nhân bất lợi. Dựa vào
nguyên nhân phát sinh đột biến mà người ta chia đột biến ra làm hai loại:
❖ Đột biến tự phát là đột biến mà không có sự tham gia của các tác nhân đột
biến, một trong những nguyên nhân của đột biến tự phát có lẽ là do sự sai sót ngẫu
nhiên khi liên kết các nucleotid trong quá trình sao chép.
*x* Đột biến nhân tạo là đột biến được tạo ra bởi các tác nhân đột biến với
mục đích làm nâng cao tần xuất xuất hiện đột biến.
Có 3 loại tác nhân đột biến:
• Tác nhân vật lý như: Tia X, tia Rơngen, ánh sáng uv
• Tác nhân hoá học như: N-mustar, etylenimin, HNO2
• Tác nhân sinh học: Đột biến do hiện tượng thiếu các base nitơ hay
do tác động của các gen gây đột biến.
Ánh sáng ư v khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào v s v có
kích thước nhỏ (0,3-3,0|Lim) thì nó có thể đâm thấu tới nhân vì vậy được dùng phổ
biến trong đột biến cải tạo giống.

Cơ chế gây đột biến của ánh sáng UV; Ánh sáng u v có tác dụng trên ADN
và mạnh nhất ở bước sóng 260nm, kết quả là gây dime hoá thymin (do làm đứt các
liên kết hydro trong mạch kép ADN của tế bào VSV). ở đây thymin gần nhau được
liên kết cộng hoá trị với nhau, ở nguyên tử c số 5 và số 6. Hậu quả là sao chép bị sai
lầm vì ADN polymerase dễ lắp một nucleotid vào vị trí trên. Do tác dụng của ánh
sáng tử ngoại trên sợi ADN cũng xuất hiện một dime pyrimidin khác, gọi là quang
sản phẩm 6-4. ở đây Q của pyrimidin 5 (thymin hoặc cytozin) được liên kết với C4
của pyrimidin 3 (thưòng là cytozin). Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của
đột biến gây nên với ánh sáng u v .
* Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến;
Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 yếu tố là thời gian chiếu, khoảng
cách chiếu và độ pha loãng bào tử. Liều lượng chiếu càng cao thì số lượng đột biến
càng lớn và cuối cùng đạt đến một giới hạn nhất định. Thực nghiệm cho thấy những
đột biến dương thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót từ 0,1 -1 %,
còn đột biến âm thưòng xuất hiện ồ liều lượng chiếu cao hơn.
Ánh sáng; Hiện tượng làm mất tác dụng gây đột biến của tia u v do ánh Sííng
thưòỉng gọi là quang phục hoạt, khi hỗn dịch bào tử chiếu tia ư v để nơi có ánh sáng
thường thì độ sống sót của bào tử tăng lên so với khi để trong bóng tối.
Các yếu tố khác như: pH, nhiệt độ, thành phần MT, trạng thái sinh ]ý của
bào tử cũng ảnh hưởng đến hiệu quả chiếu ánh sáng u v .
1.3. Lên men STH kháng sinh:
Đa số các kháng sinh hiện có là sản phẩm của quá trình lên men hoặc bán
tổng hợp và tổng hợp. Vì vậy lên men STH kháng sinh là rất quan trọng và cần thiết.
Có hai kiểu lên men chính là: Lên men bề mặt và lên men chìm.
1.3.1. Lên men bề mặt:
v sv được nuôi cấy trên bề mặt MT rắn hay lỏng, v sv hấp thụ các chất dinh
dưỡng của MT và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt MT dinh dưỡng vì
vậy yêu cầu lên men bề mặt là: Bề mặt MT phải đủ rộng và lófp MT không quá sâu
(5-lOcm).
Một số ưu điểm của lên men bề mặt là: Đơn giản, dễ thực hiện và đầu tLf

trang thiết bị thấp nhưng cũng có một số nhược điểm như; Cần một mặt bằng lớn,
hiệu suất thường thấp, rất khó tự động và cơ giới hoá, chi phí nhân công cho một
đơn vị sản phẩm cao. Do bị hạn chế bởi những nhược điểm trên nên ngày nay
những phương pháp này không còn được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất
kháng sinh mà chỉ áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm.
1.3.2. Lên men chìm:
v sv được nuôi cấy trong MT lỏng và phát triển trong toàn bộ MT. Đa sô ccíc
kháng sinh ngày nay đều được sản xuất bằng phương pháp này. Giống v s v dùng
trong lên men phải là các tế bào sinh dưỡng đang ở pha luỹ thừa, tức là có sức phát
triển mạnh và khả năng đồng hoá vật chất cao. Vì vậy trước khi lên men phải tiến
hành nhân giống (giống cấp I, II, III). Tỷ lệ giống so với MT lên men thường dùng
từ 1-10%.
Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của MT: Thay
đổi pH, nồng độ của các thành phần trong MT, các sản phẩm trao đổi chất, tạo bọt
trên bề mặt MT. Để đảm bảo những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của v s v
trong quá trình lên men ngưòi ta đã đưa ra một số biện pháp như: Dùng hệ đệm để
ổn định pH, thêm các chất phá bọt
ưu điểm của lên men chìm; MT dinh dưỡng được sử dụng một cách triệt để,
hiệu suất lên men cao, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hoá và tự động hoá,
chi phí điện nước, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp, có thể
triển khai trên quy mô lớn. Do có những ưu điểm này, nên lên men chìm được lựa
chọn cho công nghiệp sản xuất kháng sinh.
Tuy vậy lên men chìm cũng có một số nhược điểm như: Đòi hỏi nhiều trang
thiết bị kỹ thuật (thiết bị chịu áp lực, điều kiện vô trùng tuyệt đối ) dãn tới đầu tư
kỹ thuật cao. Đây là một khó khăn đối với các nước nghèo.
Lên men chìm lại chia thành các phương pháp: Lên men gián đoạn, lên men
liên tục, lên men bán liên tục song trong quá trình nghiên cứu chúng tôi chọn
phương pháp lên men gián đoạn.
*Lên men gián đoạn:
Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín. Trong suốt thời

gian lên men không tác động hay bổ sung gì vào MT lên men, ngoại trừ việc cấp
oxy (dưới dạng không khí nén), dùng chất phá bọt (nếu cần), dùng đệm điều chính
pH. Để khảo sát diễn biến của qúa trình lên men người ta tiến hành phân tích mẫu
dịch lên men mới lấy để đánh giá các tham số chính.
Trong quá trình lên men v sv sẽ phát triển qua 4 giai đoạn được gọi là các
pha: Pha tiềm tàng, pha log, pha dừng và pha suy tàn.
Inx
Hìnhl: Đưòỉng biểu diễn sinh trưởng phát triển của quần thể v sv
x: sinh khối trong dịch lên men
t: thời gian lên men
Trong sản xuất việc kết thúc lên men ồ pha nào là tuỳ thuộc vào việc STH
hoạt chất bị dừng ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của vsv nhưng trong một sô
trường hợp ta có thể kết thúc quá trình lên men khi quá trình STH chưa dừng nhưng
đã chậm lại và không kinh tế nữa.
1.4. Chiết tách-tinh chế:
Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thì khâu chiết tách và tinh chế là hết
sức cần thiết và đóng một vai trò rất quan trọng, quá trình này được tiến hành sau
khi kết thúc quá trình lên men, phải tiến hành chiết tách và tinh chế do lượng kháng
sinh có trong dịch lên men ban đầu thường rất thấp (100-200fj.g/ml), mặt khác trong
quá trình lên men v sv không chỉ tạo ra kháng sinh mà còn kèm theo nhiều sản
phẩm trao đổi chất khác. Vì vậy để thu được chất kháng sinh như mong muốn với
một hàm lượng cao và tinh khiết thì phải lựa chọn được phương pháp chiết tách và
tinh chế tốt.
Tuỳ thuộc vào bản chất của chất kháng sinh do v sv tạo ra mà có sự lựa chọn
một phương pháp phù hợp: Nếu chất kháng sinh hoà tan được trong một dung môi
hữu cơ không đồng tan với nước, thì có thể tách kháng sinh đó bằng phương pháp
chiết xuất với một thể tích nhỏ dung môi, sau đó có thể cô đặc để thu được kháng
sinh thô. Nếu chất kháng sinh không hoà tan được trong dung môi hữu cơ, thì phải
tách nó ra khỏi dịch lên men bằng các phương pháp khác như: Hấp phụ, trao đổi ion
hoặc kết tủa bằng con đường hoá học. Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích

cuối cùng là thu được một sản phẩm kết tinh với độ tinh khiết cao. Trong công
nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách và tinh
chế như: Lọc, chiết, hấp phụ và sắc ký.
1.4.1. Chiết xuất:
Đây là công đoạn tiến hành sau khi kết thúc quá trình lên men. Nếu là kháng
sinh nội bào thì ta lấy sinh khối, còn nếu là kháng sinh ngoại bào thì ta lấy dịch Ịọc
sau khi lọc loại bỏ sinh khối của dịch lên men để tiến hành chiết xuất nhằm thu
được chất kháng sinh. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố của
chất kháng sinh giữa hai pha không đổng tan với nhau là dung môi chiết với dịch
lên men hay sinh khối để tách lấy riêng chất kháng sinh (có thể là một chất hay một
nhóm chất). Vói các kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch lên men người ta
ứng dụng phép chiết lỏng - lỏng với các phương pháp chiết sau;
* Chiết đơn (chiết một lần);
Dùng một thể tích dung môi xác định Vg để chiết một lần thể tích dịch lọc v^.
Hiệu suất của quá trình chiết được tính theo công thức:
1
r= 1 -
V
1 + K, 5
V
( 1)
K^; là một hệ số phân bố đặc trưng cho chất tan và một cặp dung môi xác
định.
* Chiết lặp (chiết nhiều lần):
Chia lượng dung môi cần dùng Vb làm n phần và tiến hành chiết 11 lần, mỗi
lần dùng — lượng dung môi.
n
Hiệu suất của quá trình chiết được tính theo công thức:
r = 1 -
1

n V.,
(2)
Trong chiết lặp có thể chiết gián đoạn hoặc chiết liên tục.
Ta thấy rằng chiết lập cho hiệu suất cao hofn, song chiết đơn dù có hiệu suất
thấp hơn nhưng có ưu điểm đỡ tốn dung môi, thời gian và công sức hơn.
* Chiết ngược dòng;
Nguyên tắc của phưoỉng pháp này là: Cho dung môi chiết và dịch lọc chạy ngược
chiều nhau tạo nên sự tiếp xúc giữa hai pha kèm theo sự pha trộn và di chuyển ngược
chiều nhau. Quá trình này được tiến hành liên tục và cho hiệu suất khá cao.
* Chiết kháng sinh nội bào:
Với kháng sinh nội bào thì tiến hành chiết rắn - lỏng. Nguyên tắc của phương
pháp này là dựa vào sự khuyếch tán của kháng sinh vào dung môi chiết.
1.4.2. Sắc ký lớp mỏng:
Trong nghiên cứu kháng sinh việc áp dụng các phương pháp sắc ký là rất cần
thiết nhằm thu được chất kháng sinh có độ tinh khiết cao.
Tuỳ theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký mà có thể sử dụng các phương pháp
sắc ký khác nhau. Trong nghiên cứu tinh chế các chất kháng sinh người ta hay dùng
các phương pháp sắc ký sau; sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng
cao. ớ đây chúng tôi chỉ đề cập đến phương pháp sắc ký lớp mỏng.
*1* Sắc ký lớp mỏng:
Phương pháp này được tiến hành trên một bản mỏng (thuỷ tinh hay kim loại)
đã tráng sẵn một lớp mỏng chất hấp phụ dưới dạng bột mịn. Một số chất hấp phụ
thường dùng; Silicagel loại hạt mịn, nhôm oxyd, thạch cao, cellulose, các ionid,
sephadex
ưu điểm của phương pháp này: Nhanh (15 phút-3 giờ), trang thiết bị tương
đối đơn giản, dễ kết hợp định tính với định lượng và bán định lượng, tách tốt nhiều
hỗn hợp phức tạp.
1.5. Phân loại xạ khuẩn theo ISP (International Streptomyces Project):
Phân loại là một công việc hết sức cần thiết và quan trọng. Một số căn cứ để
tiến hành phân loại theo ISP:

• Màu sắc của khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất khi trưởng thành
• Sắc tố melanoid
• Sắc tố hoà tan
• Hình dạng của chuỗi bào tử
• Đặc điểm của bề mặt bào tử
• Khả năng tiêu thụ nguồn carbon
1.6. Một sô nghiên cứu gần đây về kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn:
- Vấn đề kháng sinh ngày càng được quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà cả ở
trên thế giói đặc biệt Việt Nam là một nưóc có sự đa dạng về tài nguyên sinh học
biểu hiện qua sự phong phú của giới v s v mặt khác điều kiện khí hậu Việt Nam là
nhiệt đới nóng ẩm nên rất thích hợp cho V sv nói chung và xạ khuẩn nói riêng phát
triển mạnh. Để đi sâu nghiên cứu về vấn đề này đã có rất nhiều công trinh nghiên
cứu song chúng tôi chỉ đưa ra một số nghiên cứu mang tính chất giới thiệu:
• Nghiên cứu về sự phân bố của xạ khuẩn sinh các chất kháng sinh nhóm
polyen chống nấm trong đất của khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng của tác giả Đỗ Thu
Hà, Trưcmg đại học sư phạm, Đại học Đà Nẵng đăng trên tạp chí sinh học, số
12/2001. Nghiên cứu này đã cho thấy: Nguồn xạ khuẩn ở Việt Nam rất phong phú,
trong số các chủng xạ khuẩn phân lập được thì tỷ lệ chủng có hoạt lực kháng sinh là
khá cao (71,3%) và tỷ lệ chủng có hoạt tính kháng sinh nhóm polyen chống nấm
cũng chiếm tỷ lệ tương đối cao (15,33%) và trong số đó có nhiều chủng có khả năng
sinh các chất kháng sinh có thể có giá trị, những kháng sinh này còn ít được thông
báo trên thế giới và ở Việt Nam. Đây chính là những nguồn gen quý hiếm từ đó có
thể lựa chọn những chủng có hoạt tính kháng sinh cao, hoạt phổ rộng, ứng dụng
trong sản xuất dịch kháng sinh thô dùng trong trồng trọt và chăn nuôi.
• Nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn Streptomyces có hoạt tính cao
chống nấm gây bệnh thực vật của các tác giả: Lê Gia Hy, Phạm Kim Dung, Bùi Việt
Hà, Viện Công nghệ Sinh học đăng trên tạp chí sinh học, số 9/1997. Nghiên cứu này
đã chứng minh: Sự phân bố của các loài xạ khuẩn trong đất ở nước ta khá cao và
phong phú, tính đối kháng của chúng cũng rất đa dạng và có tỷ lệ tưoỉiig đối cao.
Qua nghiên cứu đã lựa chọn được các chủng xạ khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh

thực vật đặc biệt là nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ đồng thời đã lựa
chọn được MT và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng phân lập được.
1.7. Lên men STH và chiết tách tinh chê một sô kháng sinh;
♦> Adriamycin, 14-Hydroxydaunomycin: [15]
Là một kháng sinh mới được sản xuất từ s. peucetiiis var. caesiiis, có tác
dụng chống ung thư, adriamycin kìm hãm sự phát triển của ung thư biểu mô, có khả
năng ức chế mạnh sarcoma và ung thư tuỷ ác tính. s. peucetius var. caesius có
nguồn gốc từ s. peucetius, quá trình đột biến s. peucetius nhờ tác nhân N-nitroso-N-
methyl urethane đã tạo ra s. peucetius var. caesius. Biến chủng này có đặc điểm là
khuẩn ty khí sinh có màu sắc từ xanh dương đến xanh xám và khuẩn ty trưởng thành
sẽ cho màu đỏ thẫm.
s. peucetius STH ra daunomycin, adriamycin là một dẫn xuất của
daunomycin. Quá trình lên men STH adriamycin được tiến hành trong bình lên men
8001ÍÍ chứa 5001ít MT hoặc trong bình 801ít chứa 501ít MT. Giống sử dụng cho lên
men là giống cấp I, II, tỷ lệ giống/MT lên men là 1/10, quá trình nhân giống và lên
men đều được tiến hành trên máy lắc hoặc bình giống, nhiệt độ 28°c.
Adriamycin là kháng sinh nội bào tìm thấy chủ yếu trong sinh khối, được
chiết bằng hỗn hợp aceton ; H2SO4 0,1N vói tỷ lệ 4:1, sau đó lọc dưới áp suất giảm
(lọc chân không) để loại bã sinh khối rồi cô đặc dịch lọc, chiết bằng cloroform ở pH
3 để loại các sắc tố thân dầu, chiết lại bằng hỗn hợp cloroíorm : methanol tỷ lệ 9:1 ở
pH 8,6; bốc hơi pha hữu cơ sẽ thu được cắn, hoà tan cắn vào HCl trong methanol và
ether sẽ cho ta tủa vô định hình màu đỏ. Tinh chế adriamycin nhờ sắc ký cột với
chất nhồi là bột cellulose trong hệ đệm phosphat pH 5,4; phản hấp phụ bằng n-
butanol bão hoà trong hệ đệm phosphat pH 5,4.
Dịch phản hấp phụ sẽ được phân tích nhờ sắc ký giấy và phổ tử ngoại. Kháng
sinh được thu hồi từ dịch phản hấp phụ bằng dung dịch nước có pH 3,0 sau đó chiết lại
bằng cloroíorm ở pH 8,6; bốc hơi cloroform, tinh thể adriamycin sẽ xuất hiện khi có
mặt HCl bằng cách thêm vào một lượng tương ứng HCl trong methanol. Sau đó kết
tinh lại bằng ethanol hoặc bằng hỗn hợp methanol-propanol. Adriamycin là kháng
sinh chống ung thư có nhiều triển vọng.

<♦ Boromycin: [17]
Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polyether - macrolid được sản xuất từ
Streptomyces sp. A-3376, là kháng sinh chống HIV. Boromycin có khả năng ngăn
chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản quá trình sao chép của
phân tử HIV trong tiến trình trưởng thành.
Trong quá trình lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là
TMC-25, sau quá trình nghiên cứu đã chứng minh được TMC-25 có cấu trúc giống
hệt của boromycin, kháng sinh có chứa một nguyên tử Bo. Qúa trình lên men STH
TMC-25 được tiến hành trên máy lắc ở 27°c trong 5 ngày.
Quá trình lên men dịch lên men sẽ được lọc để loại bỏ sinh khối, dịch lọc
được chiết bằng n-butanol, dịch chiết được tinh chế bởi dung môi phân đoạn cho ta
kháng sinh ở dạng tủa thô, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel
ODS và Sephadex LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu được
TMC-25 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Cứ 24,51ít dịch lên men đã loại bỏ
sinh khối sau quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu được 24,5mg TMC-25.
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm:
2.1.1. Nguyên vật liệu:
□ Giống xạ khuẩn:
Chủng Streptomyces 578 đã qua phân lập và tuyển chọn có khả năng STH
kháng sinh cao, phổ tác dụng rộng, do phòng thí nghiệm vi sinh kháng sinh, bộ môn
Công nghiệp Dược trưòng Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
□ Chủng v sv kiểm định:
Vi khuẩn Gram (-) gồm;
- Escherichia coìi (EC) ATCC 25922 ĩ
- Proteus mirabilis (Pro) BV 108
- Pseudomonas aeruginosa (Pseu)VM 201
'~l_ ^ - Pseudomonas aeruginosa (Pseu 2) VM 2012
- Shigella flexneri (Shi) DT 112
- Salmonella typhi (Typhi) DT 220

Vi khuẩn Gram (+) gồm:
- Bacillus cereus (BC) ATCC 9946
- Bacillus pumilus (Bp) ATCC 10241
- Bacilhis subtilis (Bs) ATCC 6633
- Sarcina iutea (SL) ATCC 9341
- Staphylococcus aureus (Sta) ATCC 12228
Nấm Candida albicans, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae.
□ Các MT đã sử dụng:
* MT phân lập (MTl): Tinh bột 20,Og; NaNO., 2,0g; K2HPO4 l,Og;
MgS04.7H20 0,5g; KCl 0,5g; Thạch 18,Og; Nước vừa đủ lOOOml; pH 6,8-7,2; tiệt
trùng ở latt/30 phút.
* MT thử khả năng STH kháng sinh:
+ MT2; Tinh bột 20,Og; KNO3l,0g; K2HP04 0,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl
0,5g; FeS04.7H20 lOmg; Thạch 18,0g; Nước vừa đủ lOOOml; pH 6,8-7,2; tiệt trùng
ở latt/30 phút.
+ MT3; Lactose 30,Og; NH4NO3 2,0g; Cao ngô 5,0g; KH2PO4 l,Og;
MgS04.7H20 0,2g; Na2S04 0,5g; CaCOj 3,0g; Thạch 18,0g; Nước vừa đủ lüüüml;
pH 6,8-7,2; tiệt trùng ở latt/30 phút.
+ MT4: Glucose 20,Og; Cao ngô 5,0g; KH2PO4 0,5g; MgS04.7H20 0,5g;
CaCOj 4,0g; NH4NO3 2,0g; Thạch 18,0g; Nước vừa đủ lOOOml; pH 6,8-7,2; tiệt
trùng ở latt/30 phút.
+ MT5: Bột ngô 2,0g; Bột đậu tương l,Og; NaCl 0,lg; CaCOj 0,2g; KH2PO4
0,lg; C0CI2.7H2O 0,0002g; Thạch l,8g; Nước vừa đủ lOOml; pH 6,8-7,2; tiệt trùng ở
latt/30 phút.
+ MT6: Bột đậu tương l,5g; Tinh bột khoai tây 2,0g; (NH4)2S04 0,2g; Cao
nấm men 0,5g; CaC030,4g; C0CI2.7H2O 0,002g; Thạch l,8g; Nước vừa đủ lOOml;
pH 6,8-7,2; tiệt trùng ở latt/30 phút.
+ MT7: Saccarose 3,0g; Bột đậu tương l,Og; (NH4)2S04 0,2g; CaC03 0,2g;
NaCl 0,lg; C0CI2.7H2O 0,0002g; Thạch l,8g; Nước vừa đủ lOOml; pH 6,8-7,2; tiệt
trùng ở latt/30 phút.

* MT lên men:
+ MTV: Tinh bột 20,Og; NaNOa 2,0g; KH2PO4 l,Og; MgS04.7H20 0,5g; KCl
0,5g; Nước vừa đủ lOOOml; pH 6,8-7,2; tiệt trùng ở latt/30 phút.
+ MT2*: Tinh bột 20,Og; KNO3l,0g; KH2P04Ũ,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl
0,5g; FeS04.7H20 lOmg; Nước vừa đủ lOOOml; pH 6,8-7,2; tiệt trùng ở latt/30 phút.
* MT thạch thường: Pepton 5,0g; Cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g; Thạch 18,0g;
Nước vừa đủ lOOOml; pH 6,8-7,2; tiệt trùng ở latt/30 phút.
* MT canh thang: Pepton 5,0g; Cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g; Nước vừa đủ
lOOOml; pH 6,8-7,2; tiệt trùng ở latt/30 phút.
* MT Sabouraud: Glucose 20,Og; Pepton 10,Og; Thạch 18,0g; Nước vừa đủ
lOOOml; pH 6,0; tiệt trùng ở latt/30 phút.
* MT phân loại (các M TISP):
+ MTr(ISP2): Cao nấm men 4,0g; Dịch chiết Malt 10,Og; Glucose 4,0g;
Nước cất vừa đủ lOOOml; pH 7,3; Thạch 20,Og; tiệt trùng ở latt/30 phút.
+ MT2 (ISP4); Dung dịch I gồm; Tinh bột 10,Og; Nước cất vừa đủ 50ơml.
Dung dịch II gồm: K2HPO4 l,Og; MgS04.7H20 l,Og; NaCl l,Og; (NH4)2S04 2,0g;
CaC03 2,0g; Nước cất vừa đủ 500ml; Muối vi lưọíng l,Oml; pH 7,0-7,4.
Trộn dung dịch I vào dung dịch II, thêm 20,Og thạch, tiệt trùng ở l att/30
phút.
+ MT3 (ISP5): L-asparagine l,Og; Glycer i.a 10,0g; K2HPO4 l,Og; Nước cất
vừa đủ lOOOml; Muối vi lượng l,Oml; pH 7,0-7,4; Thạch 20,Og; tiệt trùng ở latt/30
phút.
+ MT4 (ISP6); Pepton 20,Og; sắt amoni citrat 0,50g; K2HPO4 l,00g; Na2So03
0,08g; Thạch 15,00g; Cao nấm men l,00g; Nước cất vừa đủ lOOOml; pH 7,0-7,2; tiệt
trùng ở latt/30 phút.
+ MT5 (ISP7): Glycerin 15,0g; L-tyrosine 0,5g; L-asparagine l,Og; K2HPO4
0,5g; MgS04.7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS04.7H20 0,0 Ig; Nước cất vừa đủ lOOOml;
Muối vi lượng l,Oml; pH 7,0-7,2; Thạch 20,Og; tiệt trùng ở latt/30 phút.
+ MT6'(ISP9): (NH4)2SƠ4 2,64g; KH2PO4 2,38g; K2HPO4.3H2O 5,65g;
MgS04.7H2Ơ l,00g; MT B l,00ml; Nưóc cất vừa đủ lOOOml; pH 6,8-7,2;

Thạch 15,00g; tiệt trùng ở latt/30 phút.
Trong đó MT B: CUSO4.H2O 0,064g; FeS04.7H2Ơ 0,01 Ig; MnCl2.4H20
0,079g; ZnS04.7H20 0,015g; Nước cất vừa đủ lOml.
* Dung dịch muối vi lượng gồm: FeS04.7H20 0,lg; MnCl2.4H20 0,lg;
ZnS04.7H20 0,lg; Nước cất vừa đủ lOOml.
* Các nguồn đường gồm các dung dịch đường 10% của các đường sau:
D-xylose; D-mannitol; D-fructose; Rhamnose; Raffinose; Saccarose;
L-arabinose; I-inositol. Các dung dịch đường này hấp ở nồi hấp 15 phút đổng thời
mở hết van xả, hấp 2 lần mỗi lần cách nhau 24 giờ.
□ Tác nhân đột biến:
Tác nhân đột biến đã sử dụng là ánh sáng tử ngoại u v , nguồn phát là đèn tử
ngoại Toshiba 60W, điện thế 220V.
□ Dung môi chiết:
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm chiết xuất
kháng sinh từ dịch lên men bằng các dung môi sau;
- Etyl acetat (d = 0,902; T^s = 77,15°C)
- Butyl acetat (d = 0,880-0,885; T^s = 117-118°C)
□ Nguyên liệu dùng cho sắc ký:
Bản mỏng sắc ký tráng sẵn silicagel 60 F254, Merck.
Dung môi chạy sắc ký; Metanol, etanol, NH4OH 25%, etyl acetat, acid
formic, butanol
□ Một số dụng cụ thiết bị đã sử dụng:
Máy lắc tròn, tủ cấy vô trùng, cân phân tích, cân điện, nồi hấp, tủ ấm, kính
hiển vi điện tử
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm:
A. Phương pháp giữ giống trong ống nghiệm:
Pha MT phân lập (MTl), chỉnh pH, đun sôi 3 phút, phân đều vào ống nghiệm
mỗi ống 5-6ml, tiệt trùng ở latt/30 phút rồi đặt thạch nghiêng, khi môi trường đã
nguội dùng que cấy vô trùng cấy zigzăc các bào tử Streptomyces 318 âã chọn và
không bị lây nhiễm lên bề mặt thạch nghiêng, để cho phát triển ở 30°c, sau 6-14

ngày đem cất giữ trong tủ lạnh 4-10°C trong vòng 3-6 tháng và dùng để tiến hành
các nghiên cứu tiếp theo. (Ị
B. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh: '
ở đây ta sử dụng phương pháp khuyếch tán với 3 cách khác nhau tiiỳ theo
mẫu cần thử (phương pháp khoanh giấy lọc, đục lỗ thạch và khối thạch).
Nguyên tắc: Trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v kiểm định ta đưa mẫu
thử vào theo 3 cách trên, trong thời gian nuôi cấy kháng sinh sẽ khuyếch tán vào MT
và ức chế sự phát triển của v s v kiểm định.
Tiến hành: v s v kiểm định được cấy từ ống giữ giống thạch nghiêng sang
những ống nghiệm chứa sẵn MT canh thang để cho phát triển ở 37°c trong 18-24
giờ. Tiến hành pha MT thạch thường kiểm tra pH, tiệt trùng ở latt/30 phút, chờ
nguội đến 45-50°C rồi cho MT chứa giống v s v kiểm định vào theo tỷ lệ
Ị
í
Vgiống/Vthạch thưòng=5/200, lắc để v s v kiểm định phân tán đều trong MT, dùng
pipet vô trùng hút nhanh, chính xác 20ml cho vào các đĩa Petri vô trùng để nguội
hẳn rồi đưa mẫu thử vào mỗi đĩa, mỗi mẫu thử lấy 3 số liệu. , 7
Mẫu thử là các khối thạch chứa kháng sinh: Dùng patuyn vô trùng chuyển
các khối thạch ( o = 6mm) đặt trực tiếp lên bề mặt thạch chứa v s v kiểm định.
Mẫu thử là các khoanh giấy lọc: Tẩm kháng sinh cần thử lên khoanh giấy lọc
trong 3-5 phút, làm 3 lần, sấy nhẹ cho khô ở nhiệt độ nhỏ hơn 50°c, dùng panh vô
trùng đặt các khoanh giấy lọc lên bề mặt đĩa thạch chứa v s v kiểm định.
Mẫu thử là các dung dịch (dịch lên men, dịch chiết nước); Dùng bộ dụng cụ
đục lỗ thạch đục lỗ trên mặt thạch ( o = 6mm) dùng pipet vô trùng nhỏ vào mỗi lỗ
0,05ml dịch cần thử.
Sau khi đưa mẫu thử vào, đem các đĩa Petri ủ ở nhiệt độ 3TC trong tủ ấm 18-
24 giờ cho v s v kiểm định phát triển, đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng
thước kẹp panmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả thực nghiệm được xử lý theo
phương pháp toán thống kê.
c. Phương pháp cải tạo và chọn giống;

• Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên: ^
Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 318 b ngày
tuổi thứ 6 cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán
đều trong nước ta được hỗn dịch có chứa bào tử xạ khuẩn, cho Iml hỗn dịch bào tử ở
trên vào một ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng ta được hỗn dịch bào tử có độ
pha loãng 10’^ tiếp tục như vậy để có hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10"'". Lần lượt
lấy 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10 "’, 10 '' nhỏ lên bề mặt thạch của MT
phân lập (MTl) trong hộp Petri (20ml MT trong mỗi đĩa), rồi dùng que chcing vô
trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch, để cho phát triển ở 30*^0 trong 6
ngày. Sau 6 ngày nuôi cấy bào tử phát triển thành khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc
phát triển tốt và riêng rẽ để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo. Cạo một vòng que cấy
bào tử trên bề mặt khuẩn lạc cấy lên bề mặt thạch của MT phân lập, mỗi khuẩn lạc
cấy trên một hộp Petri và một ống nghiệm riêng rẽ, đánh số, tiến hành với 32 khuẩn
lạc. Để các hộp Petri và ống nghiệm này vào tủ ấm ở 3Ơ°C cho xạ khuẩn phát triển.
Sau 6 ngày nuôi cấy dùng bộ đục lỗ thạch ( o = 6mm) đục các khối thạch ở vị trí
phát triển tốt trên các hộp Petri mang thử hoạt tính STH kháng sinh theo phương
pháp khối thạch, từ đó lựa chọn 3-5 chủng tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp
theo.
• Phương pháp đột biến bằng ánh sáng uV :
Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 318 cho vào lOml nước cất vô
trùng, lắc cho bào tử phân tán đều trong nước tạo hỗn dịch, dùng pipet vô trùng hút
9ml hỗn dịch trên cho vào hộp Petri đường kính D = 80mm, Iml hỗn dịch giữ lại
làm mẫu để đối chứng.
Hộp Petri có chứa hỗn dịch bào tử được mang chiếu ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng Ă = 254nm với các thông số sau;
Khoảng cách chiếu 1 = 60cm.
Thời gian chiếu t = 5 phút.
Hỗn dịch bào tử sau khi chiếu được đưa vào chỗ tối 2 giờ sau đó được pha
loãng đến độ pha loãng 10""^, 10 '^ rồi hút chính xác 0,lml hỗn dịch bào tử sau đột
biến ở hai độ pha loãng trên bằng pipet vô trùng rồi nhỏ lên bề mặt MTl trong hộp

Petri và dàn đều.
Với hỗn dịch bào tử giữ lại để đối chứng ta pha loãng đến độ pha loãng l O'*’,
hút chính xác 0,lml hỗn dịch bào tử này nhỏ lên bề mặt MTl dàn đều. Với mỗi độ
pha loãng ta làm ba hộp Petri song song.
Đem các hộp Petri nuôi cấy ở trong 6 ngày, sau khi đủ thời gian nuôi
cấy các bào tử sẽ phát triển thành các khuẩn lạc, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát
triển tốt và riêng rẽ, mỗi khuẩn lạc cấy vào một hộp Petri chứa 20ml MTl và một
ống thạch nghiêng chứa MTl, đánh số biến chủng sau đột biến, tiến hành trên 32
khuẩn lạc tức là 32 biến chủng và một khuẩn lạc của chứng. Đem các hộp Petri và
các ống nghiệm để ở 30°c trong 6 ngày cho xạ khuẩn phát triển, sau 6 ngày lấy các
hộp Petri đục các khối thạch có Streptomyces 318 phát triển tốt đem thử khả năng
STH kháng sinh theo phương pháp khối thạch, mỗi biến chủng làm 3 thí nghiệm
song song.