Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng xạ khuẩn streptomyces 19 2 11

Bộ y tê
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI
= = == = oOo = = == =
NGUYỄN ĐỨC DŨNG
m
GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u LÊN MEN SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH
Từ CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES 19.2.11
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999 - 2004)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
: TS. CAO VĂN THƯ
: Bộ môn Công nghiệp Dược
Thời gian thực hiện : 15/01/2004-^0/05/2004
Hà Nội tháng 5 - 2004
M Ờ a & À A L Ơ n t
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới:
Thầy giáo, Tiến sĩ Cao Văn Thu.
Người đã tận tình chỉ bảo và giành nhiều thời gian giúp đỡ em trong suốt quá
trình thực hiện khoá luận.
Nhân dịp này em xin chân thành cảm Ơ1Í tới tất cả các thầy, cô giáo, các cán
bộ kỹ thuật viên thuộc Bộ môn Công nghiệp Dược cùng toàn thể các phòng
ban, ban giám hiệu Trường Đại Học Dược Hà Nội, gia đình và bạn bè đã tạo
điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn này ỉ
Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2004
Sinh viên
Nguyễn Đức Dũng
MỤC LỤC
Tiêu đề Trang
Đặt vấn đề 3
Phần 1: Tổng quan 4
1.1. Vài nét về kháng sinh 4

1.1.1. Định nghĩa: 4
1.1.2.Tính kháng kháng sinh: 4
1.2. Đặc điểm chung về Streptomyces 4
1.2.1. Một số đặc điểm về hình thái của chi Streptomyces:

4
1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Streptomyces

5
1.2.3. Một số kháng sinh được Streptomyces sinh tổng hợp

5
1.3. Cải tạo giống vi sinh yật 6
1.3.2. Đột biến nhân tạo 7
1.4. Lên men: 8
1.4.1. Lên men bề mặt 8
1.4.2. Lên men chìm
9
1.5. Chiết tách và tinh chế: 10
1.5.1. Phương pháp chia cắt pha: 11
1.5.2. Phương pháp chuyển pha: 11
1.6. Mốt số thành tựu trong nghiên cứu sản xuất kháng sinh và ứng
dụng kháng sinh ngoài y học 15
1.6.1. Thành tựu trong nghiên cứu, sản xuất kháng sinh 15
1.6.2. ứng dụng kháng sinh ngoài y học 17
Phần 2 :Thực nghiệm và kết quả 19
2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm

19
2.1.1.Nguyên vật liệu 19

2.1.2. Các phương pháp thực nghiệm

24
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét: 30
2.2.1 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces
19.2.11 trên môi trường phân lập MT3
30
2.2.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy và các v s v kiểm định đối với
Streptomyces 19.2.11 31
2.2.3. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên: 32
2.2.4. Kết quả đột biến cải tạo giống: 33
2.2.5 Kết quả lựa chọn môi trường lên men chìm 34
2.2.6. Các kết quả lên men chìm 35
2.2.7 Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh

36
2.2.8. Lựa chọn dung môi chiết thích hợp kháng sinh từ dịch lên
men 37
2.2.9 Kết quả phân loại theo ISP 38
2.2.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng : 38
2.2.11. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trong sinh khối:

39
Phần 3. Kết luận và đề xuất 40
3.1. Kết luận 40
3.2 Đề xuất 40
Phụ lục
Tài liệu tham khảo
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid Deoxyribonucleic

As Aspergillus niger DIPIC 109
Be Bacillus cereus ATCC 9946
Bp Bacillus pumilus ATcc 10241
Bs Bacillus subtilis ATCC 6633
D (mm) Đường kính vòng vô khuẩn trung bình
EC Escherichia coli ATCC 25922.
Gy Grey - xám
ha Hairy - tóc rối
ISP International Streptomyces Project- Chương trình Streptomyces
quốc tế.
MT Môi trường
MTdd Môi trường dung dịch
Pro Proteus mirabilis BV 108
Pseu Pseudomonas aeruginosa VM 201
RA Rectinaculiaperti - móc câu, một vòng xoắn đơn
RAS Rectinaculiapertispirales - móc câu, một vòng xoắn đơn, lò xo.
s Độ lệch thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh.
Sal Salmonella typhi DT 220.
Shi Shigella flexneri DT 112
SI Sarcina lutea ATTC 9341
sm Smooth - nhẩn
sp Spiny - gai
Sta Staphylococcus aureus ATTC 1228
VK Vi khuẩn
v s v Vi sinh vật
Wa Sần sùi da CÓC
y Yellow-Vàng
ĐẶT VÂN ĐỂ
Năm 1928 Alexander Fleming lần đầu tiên phát hiện ra Penicillin đến
nay các nhà khoa học đã tìm ra khoảng 20 họ kháng sinh khác nhau với hàng

ngàn sản phẩm được bào chế dưới các dạng khác nhau phục vụ cho công tác
phòng và chữa bệnh. Và người ta đánh giá kháng sinh là một trong số các
thuốc chữa bệnh cứu sống người hiệu quả nhất.
Hiện nay mô hình bệnh tật ở Việt Nam cũng như trên thế giới diễn biến
rất phức tạp bệnh nhiễm trùng cũng như tình hình vi sinh vật kháng thuốc
ngày càng nhiều .Vì vậy việc tìm ra kháng sinh mới đưa vào điều trị là rất cần
thiết.
Kháng sinh có thể được tìm ra bằng nhiều con đường khác nhau như tổng
hợp, bán tổng hợp. Trong đó tổng hợp kháng sinh bằng công nghệ sinh học
đóng vai trò hết sức quan trong. Trong số hơn 8000 kháng sinh đã tìm ra thì có
tới trên 60% là do lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn.
Hơn nữa điều kiện khí hậu của Việt Nam tạo nên hệ sinh thái xạ khuẩn
phát triển đa dạng và phong phú về chủng loại.Tại bộ môn công nghiệp Dược
trường đại học Dược Hà Nội đã khảo sát và cho thấy chủng Streptomyces
19.2.11 là chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt và có
triển vọng ứng dụng thực tiễn. Chính vì vậy chúng tôi đã chọn khoá luận với
tiêu đề ”Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng xạ
khuẩn Streptomyces 19.2.11” được thực hiện YỚi 4 mục tiêu:
1. Chọn giống sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất nhờ chọn lọc ngẫu nhiên
và đột biến cải tạo giống.
2. Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men tối ưu.
3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh lỷ nhằm phân loại và xác định
tên khoa học của chủng Streptomyces 19.2.11.
4. Nghiên cứu quy trình chiết tách và tinh chế sản phẩm.
1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. VÀI NÉT VỂ KHÁNG SINH
1.1.1. Định nghĩa [2],[3],[5],[11]:
Kháng sinh (Antibiotic) là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh
vật, hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm

hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi
khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.
1.1.2.Tính kháng kháng sinh [2],[3],[5],[11]:
Các nghiên cứu đều chứng tỏ rằng vi khuẩn kháng kháng sinh là một vấn
đề toàn cầu, các bệnh nhiễm khuẩn vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong.
Hiện nay con người tìm được quá ít thuốc mới để thay thế các loại thuốc đã
mất hiệu quả. Trong cuộc chạy đua để dành ưu thế giữa vi khuẩn và con
người, vi khuẩn đã vượt lên trước. Khả năng vi khuẩn biến đổi trở thành kháng
thuốc và khả năng con người đã kiểm soát được vi khuẩn đã cách xa nhau.
1.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỂ STREPTOMYCES[3]
1.2.1. Một Số đặc điểm về hình thái của chi Streptomyces:
Streptomyces là chi thuộc lớp phụ Actinomycetales phân bố rộng rãi
trong tự nhiên ở nhiều nơi: đất, bùn ao hồ, cát, nước Trung bình cứ 1 gam
đất nói chung có trên một triêu xạ khuẩn. Mật độ xạ khuẩn ở các mẫu đất
khác nhau rất khác nhau, phụ thuộc nhiều điều kiện: môi trường như độ ẩm,
nhiệt độ, dinh dưỡng, pH
Streptomyces tạo ra khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất, các khuẩn lạc
hình thành sau vài ngày nuôi cấy thường có mầu sắc hết sức phong phú, hay
gặp là màu trắng, màu xám, màu tím Khuẩn lạc thường có dạng thô ráp,
dạng phấn, không trong suốt, có thể có nếp toả ra hình phóng xạ.
2
Khuẩn ty cơ chất đang sinh trưởng có tính chất như xốp, bề mặt nhẩn
hoăc xù xì có xu hướng dính chặt vào môi trường.
Khuẩn ty khí sinh có đường kính từ 0,5 - 1,4 |LIIĨ1 và từ đó hình thành nên
những chuỗi bào tử. Đây là cơ sở sinh sản đặc trưng, chuỗi bào tử có cấu tạo
gồm một sợi trục, không có chức năng sinh sản, những đoạn phân nhánh cuối
cùng mới có khả năng sinh bào tử. Trên mỗi nhánh có từ 10 - 100 bào tử. Bào
tử có thể hình cầu, elip Đường kính của bào tử có kính thước tương ứng với
đường kính của khuẩn ty.
1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Streptomyces.

Streptomyces phát triển được ở nhiệt độ từ 20 - 40 °c. Nhưng điều kiện
phát triển tối thích của nó là 30 ± 2°c và ở pH:7,0 ± 0,2.
Một số đặc điểm của Streptomyces là sự tạo sắc tố hoà tan, khuẩn lạc có
màu sắc khác nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, đây cũng là
những cơ sở để giúp phân loại định tên loài cho các chủng Streptomyces.
Hầu hết các loài trong Streptomyces là vi khuẩn gram dương, hiếu khí,
sống hoại sinh trong đất và nước. Chúng có khả năng phân huỷ mạnh glucid,
có thành tế bào kiểu I chứa DAP (diaminopimelat) và glycin.
1.2.3. Một số kháng sinh được streptomyces sinh tổng hợp
Nhiều loài Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp tạo ra được nhiều
loại thuộc nhiều nhóm kháng sinh khác nhau như: aminoglycosid, phenicol,
macrolidỉincosamid, tetracylin
> Nhóm aminosid
+ Streptomycin do S.griseus (Waskman 1943)
+ Kanamycin do S.kanamycetiusịUmezawa 1957)
+ Torbramycin do S.tenebreus
+ Neomycin do s.ýradie
3
+Paromomycin do s.rimosus formaparomomycinus
+ Spectimomycin do S.pectabilis
'r Nhóm phenicol.
+ Cloramphenicol
> Nhóm tetracyclin
+ Tetracylin do S.aureofaciens
+ Oxytetracylin do S.rimosus
+ Clotetracylin do S.aureofaciens
> Nhóm macrolid:
+ Erythromycin do S.erythreus
+ Oleandomycin do S.antibioticus
+ Spiramycin do s.ambofaciens

y Nhóm lincosamid
+ Lincomycin do S.lincolnensis
r
Kháng sinh chống nấm
+ Nystatin do S.noursei
+ Amphotericin B do s. nodosus
1.3. CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT [1],[4],[7],[8],[11]
Hầu hết các vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập được từ các cơ chất
thiên nhiên thường có hoạt tính thấp, không đáp ứng được các yêu cầu của sản
xuất. Do đó, để thu được những chủng có hoạt tính cao, ổn định đưa vào sản
xuất cần phải tiến hành cải tạo giống bằng các biện pháp khác nhau.
1.3.1. Chọn lọc ngẫu nhiên[7],[ll]
4
Các vi sinh vật biến dị tự nhiên theo tần sô khác nhau có cá thể tăng hoạt
tính kháng sinh so YỚi cá thể khác. Ta cần chọn lấy những cá thể có hoạt tính
cao nhất để nghiên cứu tiếp.
Trên thực tế tần suất xuất hiện các biến chủng dương tính rất thấp và việc
chọn lọc tự nhiên các cá thể có hoạt tính kháng sinh cao chỉ để nghiên cứu
ban đầu ít có giá trị áp dụng vào sản xuất, để thu được những chủng có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh cao ta phải cải tạo giống.
1.3.2. Đột biến nhân tạo [4]:
Đột biến là quá trình làm thay đổi trình tự sắp xếp của các bazơ hoặc
thay đổi bản thân các bazơ trong ADN. Các yếu tố gây đột biến là các tác
nhân gây đột biến có thể làm thay đổi một vài nhược điểm của giống.
Đột biến nhân tạo là đột biến được tạo bởi các tác nhân đột biến với mục
đích nhằm nâng cao tần suất xuất hiện đột biến.
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học hiện đại và việc
tìm ra bản chất gen, hiểu bản chất đột biến và quá trình phát sinh đột biến.
Người ta có khả năng tạo ra đột biến mạnh để tăng hiệu quả trong quá trình
nghiên cứu sản xuất.

> Các tác nhân đột biến:
+ Tác nhân vật lý: Tia X, ánh sáng uv, tia Ỵ
+ Tác nhân hoá học: N - mustar, ethylenimin, HN02
+ Tác nhân sinh học: Đột biến do hiện tượng thiếu các bazơ, nitơ hay do
tác động của gen gây đột biến.
Trong khoá luận này chúng tôi nghiên cứu cải tạo giống bằng cách gây
đột biến bằng ánh sáng tử ngoại. Tia u v có khả năng đâm thấu tới nhân với tế
bào vi sinh vật nên được sử dụng rộng rãi trong công việc cải tạo giống.
> Cơ chê gây đột biến của tia UV:
5
Ánh sáng u v có tác dụng trên ADN và mạnh nhất ở bước sóng 260 nm,
gây dime hoá thymin (do làm đứt liên kết hydro trong mạch kép ADN). Ở đây
2 thymin gần nhau sẽ liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử C5 và C6, hậu
quả là sao chép bị nhầm. Do ADN- polymerase dễ lắp một nucleotit không
chính xác vào dime khác gọi là quang sản phẩm 6- 4. Ở đây C6 của pyrimidin
liên kết với C4 của pyrimindin 3. Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu
gây lên đột biến bởi tia uv.
'r
Các yếu tố ảnh hưởng đến hậu quả gây chết và tần số phát sình đột
biến:
+ Thời gian chiếu,
+ Khoảng cách chiếu,
+ Độ pha loãng
1.4. LÊN MEN [1],[7],[8],[10],[11]:
Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tối ưu để sản
xuất các sản phẩm trao đổi chất nhờ các vi sinh vật ấy hoặc các thành phần tế
bào của chúng.
Hầu hết các kháng sinh hiện có đều là sản phẩm của quá trình lên men
hoặc bán tổng hợp rất ít kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như
cloramphenicol.

Có 2 kiểu lên men chính:
+ Lên men bề mặt,
+ Lên men chìm.
1.4.1. Lên men bề mặt.
Vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt môi trường rắn hay lỏng hấp thụ
các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên
6
bề mặt môi trường dinh dưỡng. Vì yậy lên men bể mặt đòi hỏi phải có bề mặt
rộng lớn và lớp môi trường không quá sâu.
Lên men bề mặt có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp
nhưng cũng có nhược điểm : Hiệu suất sử dụng trường thấp, đòi hỏi diện tích
lớn, khó cơ giới tự động hoá, vì vậy không được áp dụng trong sản xuất công
nghiệp mà chỉ sử dụng để chọn giống trong phòng thí nghiệm.
1.4.2. Lên men chìm.
Đa số các kháng sinh hiện nay đều được sản xuất bằng phương pháp lên
men chìm. Ở phương pháp này vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường
lỏng, phát triển trong không gian 3 chiều. Giống lên men được tạo ra qua các
cấp nhân giống khác nhau.
+ Giống cấp I: Được nuôi cấy trong bình trên máy lắc,
+ Giống cấp II: Trong bình giống 50 lít,
+ Giống cấpIII: Nuôi cấy trong bình có dung tích 1-1,5 m3,
Tỷ lệ giống từ 1-10 %. Tuỳ thuộc vào sản phẩm và thời gian lên men có
thể kéo dài từ 96h - 180h, tuy nhiên hiệu quả lên men tăng lên khi thời gian
lên men được rút ngắn.
> Ưu điểm của lên men chìm:
+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý,
sinh hoá của vi sinh vật,
+ Hiệu suất sử dụng không gian cao,
+ Các thiết bị lên men chìm dễ cơ giới hoá tự động hoá tiết kiệm được
mặt bằng nhân công.

^ Nhược điểm của lên men chìm:
+ Lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị chịu áp
lực và vô trùng tuyệt đối đòi hỏi đầu tư lớn.
7
+ Lên men chìm được chia ra nhiều kiểu như: Lên men gián đoạn, lên
men có bổ sung và lên men liên tục.
♦♦♦ Lên men gián đoạn: Lên men gián đoạn như một hệ thống
đóng kín sau khi cấy giống trong điều kiện vô trùng, tiến hành lên men
trong điều kiện sinh lý tối ưu. Trong thời gian lên men ngoài cấp khí, chất
phá bọt, chất điều chỉnh pH ta không bổ sung gì thêm.
Để theo dõi quá trình lên men người ta tiến hành phân tích các mẫu dịnh
lên men mới lấy để xác định tham số chính.
♦♦♦ Lên men liên tục: Hệ thống lên men liên tục hoạt động như
một hệ mở. Trong quá trình lêm men vừa bổ sung liên tục môi trường dinh
dưỡng vừa lấy bớt ra đồng lượng dịch lên men đã biến đổi cùng vi sinh vật
trong đó giữ thể tích không đổi, lên men liên tục có sản lượng cao, có thời
gian chết ngắn hơn lên men gián đoạn.
Lên men có bổ sung là biến tướng phát triển tiếp tục của lên
men gián đoạn khi ta bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để tránh các ức
chế trao đổi chất của vi sinh vật nhằm tăng cường sinh tổng hợp hoạt chất.
Trong quá trình lên men, lượng giống, tuổi, cách nuôi cấy, điều kiện nuôi
cấy có ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình. Theo kinh nghiệm, nếu muốn
đạt hiệu suất sinh tổng hợp cao thì môi trường nhân giống phải khác môi
trường lên men.
1.5. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ [6],[9]:
Các sản phẩm mục tiêu có trong dịch lên men thường có nồng độ rất
thấp. Ngoài ra dịch lên men còn tồn tại nhiều sản phẩm phụ của quá trình trao
dổi chất khác. Do đó việc nghiên cứu quá trình chiết tách và nghiên cứu kháng
sinh là một việc vô cùng quan trọng.
Có hai phương pháp hay dùng nhất để chiết hỗn hợp đồng nhất đó là

phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha.
8
1.5.1. Phương pháp chia cắt pha [9]:
Đây là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất tách thành hỗn hợp không
đồng nhất.
• Loại bớt dung môi: Bằng cách cô đặc có thể tiến hành ở áp suất giảm.
Nếu cô ở áp suất thường thì hoạt chất dễ bị phân huỷ bởi nhiệt độ cao.
Nhưng ngược lại cô ở áp suất giảm (tiến hành phức tạp hơn) ở nhiệt độ thấp
hơn sẽ an toàn cho hợp chất hơn. Người ta thường dùng một bình cất quay
nối với một bơm chân không, dung môi ngưng đọng chảy qua một bình
khác. Sự quay làm tăng diện tích bề mặt bay hơi, do dung môi được tráng
lên thành bình.
• Giảm khả năng hoà tan của dung môi.
+ Thay đổi nhiệt độ,
+ Thêm chất lỏng không phải là dung môi vào dung dịch,
+ Phương pháp muối kết (dựa vào độ mạnh yếu khách nhau của các ion).
1.5.2. Phương pháp chuyển pha [6], [9]:
Dùng một dung môi hay một hệ dung môi thích hợp để chuyển một chất
từ pha này sang pha khác. Trong nhóm này hai phương pháp chiết và sắc ký là
hay được sử dụng để nghiên cứu kháng sinh.
♦♦♦ Phương pháp chiết:
• Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bô khác nhau của chất tan giữa hai pha
không đồng tan với nhau.
Nếu lắc dung dịch A có chứa chất tan s với dung môi B thì quá trình phân
bố chất tan s vào hai pha A và B đã được trạng thái cân bằng như sau:
c
K = —
q c,
Trong đó:
9

CB, CA lần lượt là nồng độ của chất s trong pha (A và B)
kq là hằng số cân bằng ờ nhiệt độ xác định trong những điều kiện lý
tưởng.
• Các phương pháp chiết:
+ Chiết một lần (chiết đơn) thường cho hiệu suất thấp.
+ Chiết lặp (chiết nhiều lần) cho hiệu suất cao, nhưng tốn thời gian và
công sức có thể chiết gián đoạn hay chiết liên tục.
+ Chiết ngược dòng: Dựa trên nguyên tắc dung mổi chiết và dung dịch
cần chiết chuyển động ngược chiều nhau hai pha tiếp xúc chặt chẽ, pha trộn và
di động ngược chiều nhau.
❖ Sắc ký:
> Sắc ký là phương pháp tách và phân tích các chất dựa vào sự phân bố
của chúng giữa hai pha: Pha động và pha tĩnh khi tiếp xúc với hai pha các cấu
tử hỗn hợp sẽ phân bố vào hai pha tương ứng với các phần tử của pha động
mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký.
Các chất khác nhau thì có các ái lực khác nhau, với pha động và pha tĩnh,
chất có ái lực lớn với pha tĩnh thì chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký
so với chất có ái lực yếu hơn với pha này do vậy các chất có thể được tách
riêng xa nhau.
> Theo bản chất có thể chia sắc ký thành 4 loại:
Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion và sắc ký trên gel
+ Sắc ký phân bố: Pha tĩnh là chất lỏng không hoà tan được với pha động
chất lỏng này được bao trên bể mặt chất rắn gọi là giá mang.
+ Sắc ký hấp phụ: Pha tĩnh là chất rắn có khả năng hấp phụ.
10
+ sắc ký trao đổi ion: Pha tĩnh là chất mang có nhóm hoạt hoá chứa các
ion trao đổi, sắc ký trao đổi ion dựa vào hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa
các ion trong dung dịch với các ion thành phần của chất trao đổi ion.
+ Sắc ký trên gel: Chất hấp phụ là các gel, pha tĩnh là dung môi nằm
trong lỗ xốp các hạt, pha dộng là dung môi giữa các hạt, các phân tử chất có

phân tử lượng lớn thì sẽ không bị giữ và di chuyển theo dung môi các phân tử
nhỏ chui vào các lỗ xốp. Khi rửa các phân tử sẽ ra lần lượt là các cỡ lớn đến
nhỏ. Có nhiều loại gel với các lỗ xốp khác nhau để tách phân tử có trọng
lượng khác nhau.
Khi chiết tách và tinh chế sản phẩm người ta dùng kết hợp cả hai phương
pháp: Phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha.
11
Sơ đồ chiết tách tinh chế
Dịch lên men
Phá vỡ-
Thuỷ phânr
/ w
Ap lực
Sản phẩm nội bào
r
p >
I
o
sr
Lọc, ly tâm,
ỉ
Sản phẩm ngoại bào
Dịch chiết
r
p >
I
á-
Làm sạch
Dịch làm sạch
Cô chân không, bốc hơi

Dịch cô đặc
Làm sạch
Sản phẩm kết tinh
Sản phẩm cuối cùng
12
1.6. MỐT SỐ THÀNH Tựu TRONG NGHIÊN cứ u SẢN XUẤT KHÁNG SINH VÀ
ỨNG DỤNG KHÁNG SINH NGOÀI Y HỌC.
1.6.1. Thành tựu trong nghiên cứu, sản xuất kháng sinh [12],[13],[16]:
* Ảnh hưởng của giai đoạn tiền lên men trong lên men acid Clavulanic [12].
Acid Clavulanic là một kháng sinh thuộc nhóm p - lactam, được tạo
thành từ chủng Streptomyces clavuligerus. Trong công trình này André A.
Neves và cộng sự đã tiến hành lên men trong hai nhóm A& B:
- Nhóm A: Tỷ lệ giống cấy vào bình lên men C1 là 14%(v/v) với giống
một ngày tuổi.
- Nhóm B: Tỷ lệ giống cấy vào bình lên men Cj là 7%(v/v) với giống hai
ngày tuổi.
Các kết quả đã cho thấy rằng Streptomyces cỉavuligerus sử dụng các
giống 48 h tuổi hoặc già hơn thì lượng acid Clavulanic tạo thành trong giai
đoạn nhân giống được chuyển sang quá trình lên men làm kéo dài pha tiềm
tàng, giảm qúa trình sinh tổng hợp kháng sinh. Pha tiềm tàng trong khi lên
men nhóm A ngắn hơn so với nhóm B. Điều đó khẳng định khi các mẻ lên
men sử dụng các giống với số ngày tuổi ngắn hơn thì pha tiềm tàng sẽ ngắn
hơn và hoạt tính kháng sinh tạo ra sẽ cao hơn.
Như vậy, để đảm bảo cho quá trình tối ưu hoá sản phẩm cần chọn giống
tiền lên men nhóm A với tỷ lệ giống 14%(v/v), một ngày tuổi, sẽ cho hoạt tính
kháng sinh cao có thể áp dụng trong quy mô sản xuất lớn.
* Nghiên cứu việc cố định tế bào trong lên men liên tục trong sản xuất
kasugamycin[ 13 ].
Kasugamycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid được ứng dụng
trong lĩnh vực nông nghiệp để chữa bệnh vàng lụi ở lúa, kasugamycin được

tạo ra từ chủng Streptomyces kasugaensis.
13
Chang Joon Kim và cộng sự đã thăm dò khả năng và điều kiện cố định tế
bào trong lên men liên tục và sử dụng các viên bi celite để cố định tế bào. Kết
quả đã cho thấy nồng độ tế bào trong dịch lên men giảm là do các viên bi chứa
các tế bào bất động bị giữ lại trong bộ tách các tế bào đã cố định. Trong thí
nghiệm này sử dụng đường maltose làm nguồn carbonhydrat. Kết quả đã cho
thấy rằng khi sử dụng gấp đôi nồng độ maltose thì các tế bào tự do được hình
thành nhều hơn do sự giải phóng nhiều tế bào hơn từ các viên bi.
Thí nghiệm sơ bộ đã khẳng định thành công đạt được trong việc cố định
tế bào của chủng Streptomyces kasugaensis khi lên men liên tục, hiệu suất
kháng sinh đạt được từ 9,8 - 16,1 mg/l/h cao cấp 14 - 23 lần so với lên men
mẻ gián đoạn thông thường
Như vậy vấn đề cố định tế bào trong lên men liên tục cần được nghiên
cứu để ứng dụng trong sản xuất kháng sinh với quy mô rộng.
* Ảnh hưởng của các tác nhân gây thoái biến acid Clavulanic trong lên men
có bổ sung chủng Streptomyces clavulỉgerus[ 16].
Acid Clavulanic là một kháng sinh quan trọng thuộc nhóm ức chế p -
lactamase, chiết từ môi trường nuôi cấy Streptomyces clavuligerus. Acid
Clavulanic là một kháng sinh không bền và sự thoái biến sản phẩm được đưa
ra trong nghiên cứu này là do sự tác động của nhiều yếu tố trong qúa trình lên
men có bổ sung chủng Streptomyces clavuligerus.
Johannes A.Roubos và cộng sự đã tiến hành 3 dẫy thí nghiệm nghiên cứu
ảnh hưởng của các tác nhân gây thoái biến acid Clavulanic trong điều kiện lên
men có bổ sung:
- Thí nghiêm 1: ảnh hưởng của thành phần môi trường đơn lẻ đến tốc độ
thoái biến.
- Thí nghiệm 2: Qúa trình thoái biến được theo dõi ở pha tăng trưởng
khi nuôi cấy chủng Streptomyces clavuligerus.
14

- Thí nghiệm 3: Tốc độ thoái biến acid Clavulanic trong dịch lên men.
Qua các thí nghiệm ta nhận thấy rằng:
- Nồng độ Amoni, Glycerin cao là nguyên nhân chính gây tăng hệ số tốc
độ thoái biến (kđ). Trong khi đó nồng độ Magiê cao sẽ làm giảm hệ số tốc độ
thoái biến, tuy nhiên nó ảnh hưởng đến sự tạo thành sinh khối và qúa trình
tinh chế sau này.
- Trong lên men có bổ sung hệ số tốc độ thoái biến tăng một phần do
phản ứng enzym hoặc do enzym xúc tác.
- Nhiệt độ càng cao thì khả năng thoái biến acid Clavulanic càng tăng.
Vì vậy quá trình thoái biến acid Clavulanic là một khía cạnh quan trọng
không thể không chú ý khi thực hiện tối ưu hoá trong giai đoạn lên men có bổ
sung tạo sản phẩm có hoạt tính kháng sinh cao.
1.6.2. ứng dụng kháng sinh ngoài y học.
Sau khi tìm ra kháng sinh áp dụng vào điều trị trên cơ sở con người các
nhà nghiên cứu và kinh tế đã kết hợp chặt chẽ với nhau nhằm phát huy tác
dụng của kháng sinh vào các lĩnh vực khác như trăn nuôi, trồng trọt và công
nghiệp thực phẩm.
* Trong chăn nuôi:
Kháng sinh không chỉ được dùng chữa bệnh cho gia súc gia cầm bị vi
sinh vật tấn công ở mức độ nào đó nó còn có vai trò kích thích tăng trọng,
kích thích sinh sản, giảm chi phí trong chăn nuôi. Trong đó phải kể đến các
kháng sinh như : Enduracidin, mikamicin, siomicin, thiopeptin, thiostrepton,
* Trong trồng trọt:
Các vi khuẩn, vi nấm, virus là nguyên nhân gây ra nhiều loại bệnh cho
cây trồng gây thất thu lớn. Theo số liệu của tổ chức FAO tổng số thiệt hại về
mùa màng do sâu bọ và cỏ dại gây ra chiếm tới 34 %, làm tổn thất nhiều triệu
15
$ USD. Chính vì thế việc đưa kháng sinh vào trồng trọt là một tất yếu. Một số
kháng sinh đã được sử dụng như :
- Griseofulvin : Chống bệnh do Botrytis ( rỉ sắt ở lúa mì)

- Polyoxin : Tạo ra bởi s.cacao, có hoạt tính chống nấm mạnh.
- Herbixidin Avà B là kháng sinh diệt cỏ.
Trong công nghiệp và thực phẩm :
Bảo quản thực phẩm tươi và các sản phẩm đóng hộp là vấn đề rất quan
trọng. Nguyên nhân gây hỏng thực phẩm là do vi sinh vật gây ra. Sau khi phân
huỷ thực phẩm chúng còn tiết ra các chất độc. Để hạn chế được điều đó nhiều
cơ sở công nghiệp đã đưa kháng sinh vào để làm chất bảo quản.
Tuy nhiên, theo khuyến cáo không nên sử dụng cùng một loại kháng sinh
vào cùng một lĩnh vực như thế sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật kháng lại kháng
sinh dễ dàng hơn. Do đó chỉ nên sử dụng một loại kháng sinh hoặc cho người
hoặc cho chăn nuôi, trồng trọt hay công nghiệp thực phẩm.
16
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM.
2.1.1.Nguyên vật liệu
r Chủng xạ khuẩn:
Chủng Streptomyces 19.2.1 ỉ giống gốc do phòng thí nghiệm v s - KS
bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược cung cấp.
> Giống vi sinh vật kiểm định:
Giống v s v kiểm định do bộ môn Công nghiệp Dược cung cấp.
• Vi khuẩn Gram(+):
Staphylo co aus aureus ATCC 1128 (Sta)
Bacillus pumiỉus ATCC 10241 (Bp)
Bacillus subtilỉs ATCC 6633 (Bs)
Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)
Sarcina lutea
ATCC 9341 (Sl)
• Vi khuẩn Gram (-):
Escherichia Coli ATCC 25922 (EC)
Proteus mirabilis BV 108 (Pro)

Shigella flexneri DT 112 (Shi)
Salmonella typhi DT 220 (Sal)
Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu).
'r Các mồi trường sử dụng được giới thiệu ở bảng 1.
17
Bdng ỉ: Thành phần các môi trường sử dụng (g/lOOml)
Thành phần MT1 MTldd
MT2
MT2dd
MT3
MT3dd MT4
MT4dd
MT5 MT5dd
MT6
MTỗdd
MT7
MT7
dd
Tinh bôt
2 2
2 2
2,4 2,4
lactose 3
3
Glucose
2 2
1 1
Cao ngô
0,5
0,5 0,5 0,5

Saccrose
3 3
2 2
Bổt đâu tương
1 1
Pepton
0,3 0,3
0,3 0,3
Cao thit
0,3
0,3 0,5 0,5
KNO,
0,1
0,1
KC1
0,05 0,05
NaNO, 0,2
0,2
NII4NO, 0,2 0,2 0,2 0,2
CaC01
0,3 0,3 0,4 0,4
0,2 0,2 0,4
0,4
(NH 4),s o 4
0,2
0,2
FeS04.7H,0
0,001 0,001
k h ,po 4 0,05 0,05
0,1

0,1
0,1 0,1
0,05 0,05
MgS04.7H,0 0,05 0,05
0,05 0,05 0,25
0,25 0,15 0,15
NaCl 0,05 0,05
0,1 0,1
0,5
0,5
Cao nấm men
0,5 0,5
Thach
1,8
0 2
0
2 0 2 0
2 0 2 0
1,6
0
Nước 100 100 100
100 100 100
100
100
100 100
100 100
100
100
PH
7,0 - 7,2 6,8 - 7,2

7 ,0 - 7,2 7,0-7,2
7,0 - 7,2
7,0 - 7,2
7,4-7,6
18
• Môi trường canh thang nuôi cấy vi khuẩn kiểm định:
NaCl 0,5 %
Pepton 0,5%
Cao thịt 0,3%
Nước cất vđ 30 ml
• Môi trường thạch thường:
NaCl 0,5%
Pepton 0,5%
Cao thịt 0,3%
Thạch 1,6%
Nước cất vđ 30ml
•Môi trường phân loại theo ISP (ISP 1 ISP 9).
+ Muối vi lượng: MnCl2.4H20 0,lg; FeS04.7H20 0,lg; ZnS04.7H20
0,lg; Nước cất vđ lOOml; pH: 7,0 - 7,2.
+ ISP 1: Trypton 5,0g; Cao nấm men 3,0 g; Nước cất 1000ml;pH: 7,0-
7,2.
+ ISP 2: Cao nấm men 4,0g; Dịch chiết malt 10,Og; Glucose 4,0g;
Thạch 20,Og; Nước cất lOOOml; pH:7,3-
+ ISP 3: Yến mạch 20,Og; Dung dịch muối vi lượng 1,0 ml;
Thạch 18,0 g; Nước cất vđ lOOOml; pH:7,2.
+ ISP 4: Tinh bột 10,Og; K2HPC>4l,0g; MgS04.7H20 l,0g; NaCl l,0g
(NH4)2S04 2,0g; CaC03 2,0g; Dung dịch muối vi lượng l,0ml; Thạch
20,Og
Nước cất vđ lOOOml; pH:7,0-7,4.
+ ISP 5: L- asparagine l,0g; Glycerin 10,Og; K2HP04 l,0g

19
Dung dịch muối vi lượng l,Oml; Thạch 20,0 g; Nước cất vđ 1000ml;
pH:7,0-7,4.
- Dung dịch A:
Pepton 20,0g;Sắt amoni citrat 0,5g;Na2S20 3 0,08g;K2HP04 l,Og
Nước cất 1000 ml.
+ ISP 6: Dung dịch A 36,0g;Cao nấm men l,Og;Thạch 15,0g;
Nước cất 1000ml;pH:7,0-7,2.
+ ISP 7: Glycerin 15,0g;L- tyrosine 0,5g;L- asparagine l,0g;
K2HP04 0,5g;MgS04.7H20 0,5g;NaCl 0,5g;FeS04.7H20 0,0lg Dung
dịch muối vi lượng l,Oml;Thạch 20,0g;Nước cất vd 1000 ml;pH:7,2-7,4.
+ ISP 9:
a.Các nguồn đường khử trùng được sử dụng:
1. D - glucose 7. D - fructose
2. L- arabinose 8. Rhamnose
3. Saccarose 9. Raffinose
4. D- xylose 10. Cellulose
5 .1- inositol
6. D - manitol
b. Dung dịch muối Pridham và Gottlieb:
CuS0 4.5H20 0,64g
FeS04.7H20 0,1 lg
MnCl2.4H20 0,79g
ZnS04.7H20 0,15g
Nước cất 100ml.
c. Môi trường thạch - muối khoáng(C):
20