khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn e. coli sinh beta lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện trần đề tỉnh sóc trăng

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y






VÕ QUỐC NGUYỄN










Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BÁC SĨ THÚ Y


KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN E. coli
SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN
GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC
HUYỆN TRẦN ĐỀ TỈNH SÓC TRĂNG

Cần Thơ, 2014

i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y





Luận văn tốt nghiệp
Ngành BÁC SĨ THÚ Y











Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
HUỲNH NGỌC TRANG VÕ QUỐC NGUYỄN
MSSV: 3102967
Lớp: CN10Y4A1 – K36


Cần Thơ, 2014

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN E. coli
SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN
GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC
HUYỆN TRẦN ĐỀ TỈNH SÓC TRĂNG

ii


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli sinh beta lactamase phổ
rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng”, do
sinh viên Võ Quốc Nguyễn thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Thú Y, khoa
Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ. Từ tháng 8 đến
tháng 12 năm 2014.


Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Bộ Môn Giảng viên hƣớng dẫn


Huỳnh Ngọc Trang


Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

iii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn ngoài nổ lực của bản thân, còn có
nguồn động viên và dạy bảo tận tình của cha mẹ và thầy cô. Tôi xin thành kính dâng
lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, ngƣời đã dành cả cuộc đời cho tôi cất bƣớc đến
trƣờng.
Xin chân thành cảm ơn cô Bùi Thị Lê Minh và cô Huỳnh Ngọc Trang chỉ bảo, tận
tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài. Quý thầy cô Bộ môn Thú Y và Bộ môn
Chăn Nuôi đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, lẫn nhận
thức xã hội trong quá trình học tập tại trƣờng .
Xin chân thành cảm ơn tất cả các anh chị cao học k19, các bạn bè của lớp Dƣợc Thú
y k36 các em thú y k37 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề
tài.
Cuối lời xin chúc quý thầy cô cùng anh, chị, em và các bạn dồi dào sức khỏe và
thành đạt trong cuộc sống.


Võ Quốc Nguyễn
iv

TÓM LƢỢC
Đề tại được thực hiện để khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli ESBL
trên gà khỏe tại huyện Trần Đề. Qua khảo sát 22 còn gà khỏe tại 2 trại huyện Trần
Đề tỉnh Sóc Trăng bằng phương pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm kháng sinh đồ, từ
tháng 8 đến tháng 12 năm 2014. Kết quả sự hiện diện E. coli ESBL trên gà khỏe có
tỉ lệ khá cao 50%. Sự hiện diện E. coli ESBL trên phân 50%, thịt 4,54%, phổi
18,18%, không phát hiện E. coli sinh ESBL trên gan. Từ 11 mẫu dương tính E. coli
ESBL chon 23 khuẩn lạc E. coli sinh ESBL để kiểm tra tính nhạy cảm với kháng
sinh ghi nhân được vi khuẩn kháng với ampicillin, cofaclor đồng tỉ lệ 100%,
trimethoprim – sulfamethoxazole 95,65% và cefuroxime 86,96%. Tuy nhiên, vi
khuẩn còn nhạy với amikacin, doxycycline đồng tỉ lệ 100%, fosfomycin 95,65%.
Các chủng E. coli ESBL đa kháng từ 4 đến 9 loại kháng sinh với 14 kiểu hình đa
kháng, trong đó kháng cùng lúc 6 loại kháng sinh 43,47% là phổ biến.

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Chữ viết đầy đủ
CSLI
Clinical and Laboratory Standards Institute
E. coli
Escheriachia coli
MHA
Mueller Hinton Agar
NA
Nutrient Agar
MR
Methyl Red
VP
Voges ProsKauer
MC
MacConkey Agar
ESBL
Extended spectrum beta lactamase
PBP
Penicillin – binding protein

vi

MỤC LỤC

TRANG BÌA .i
TRANG DUYỆT ii
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM LƢỢC iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH SÁCH BẢNG viii
DANH SÁCH HÌNH ix
CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli 2
2.1.1 Đặc điểm hình thái 2
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 2
2.1.3 Đặc điểm sinh hóa 3

2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh 4
2.2 Kháng sinh nhóm beta lactam 5
2.2.1 Cấu trúc kháng sinh nhóm beta lactam 5
2.2.2 Phân loại kháng sinh nhóm beta lactam 5
2.2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta lactam 6
2.3 Đề kháng kháng sinh 6
2.3.1 Hiện tƣợng đề kháng kháng sinh 6
2.3.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh 7
2.4 Men beta lactamase phổ rộng 7
2.4.1 Tổng quan về ESBL 7
2.4.2 Một số phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 8
2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 12
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng 12
3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 12
vii

3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 12
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 12
3.2.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn E. coli ESBL 13
3.3 Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ 14
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 17
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
4.1. Kết quả sự hiện diện E. coli ESBL trên gà khỏe tại huyện Trần Đề tỉnh Sóc
Trăng. 18
4.2 Kết quả sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên thân thịt và mẫu phân
của gà khỏe 19
4.3 Kết quả khảo sát tính nhạy cảm của E. coli ESBL với một số kháng sinh 21
4.4 Kết quả tính đa kháng của vi khuẩn E. coli ESBL 23

CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25
5.1 Kết luận 25
5.2 Đề nghị 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 26
PHỤ CHƢƠNG 29


viii

DANH SÁCH BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
3.1
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
15
3.2
Tiêu chuẩn phân tích kết quả đƣờng kính vô khuẩn của kháng
sinh (CLSI, 2014)
16
4.1
Tỉ lệ gà khỏe dƣơng tính với E. coli ESBL
18
4.2
Tỉ lệ dƣơng tính với E. coli ESBL của phân, gan, thịt, phổi
19
4.3
Tỉ lệ dƣơng tính với E. coli ESBL của phân, gan, thịt, phổi
giữa gà thịt và gà đẻ
20

4.4
Đánh giá tính kháng, trung gian, nhạy đối với kháng sinh của
vi khuẩn E. coli ESBL
21
4.5
Tỉ lệ đa kháng và kiểu hình đa kháng của E. coli ESBL
23


ix

DANH SÁCH HÌNH
Hình
Tên Hình
Trang
1
Vi khuẩn E. coli dƣới kính hiển vi quang học (X=10µm)
3
2
Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
13
3
Phản ứng sinh hóa xác định E. coli
15
4
Vi khuẩn E. coli trên môi trƣờng MC
15

1

CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, ngành chăn nuôi nƣớc ta đã có những bƣớc phát triển mạnh mẽ cả về số
lƣợng và chất lƣợng, đặc biệt chăn nuôi gà đang khẳng định một vị trí quan trọng
trong việc cung cấp thực phẩm ở đồng bằng song Cửu Long. Song song với việc
phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi cùng với sự thay đổi của môi trƣờng thì
việc xuất hiện dịch bệnh là không tránh khỏi. Để ứng phó với vấn đề dịch bệnh
cũng nhƣ là hạn chế sự bùng phát của mầm bệnh thì sử dụng kháng sinh và thuốc
thú y trong điều trị ngày càng nhiều, tuy nhiên việc sử dụng rộng rãi kháng sinh tạo
điều kiện để vi khuẩn E. coli có khả năng kháng kháng sinh. Trong đó bệnh nhiễm
khuẩn E. coli là bệnh nhiễm khuẩn phổ biến nhất trên gia cầm. Vi khuẩn E. coli
kháng kháng sinh nhóm beta lactam bằng cách sinh men beta lactamase phổ rộng
(ESBL) là một trong những mối nguy hiểm và ngày càng nghiêm trọng gây nhiều
khó khăn trong điều trị. Sự hiện diện của gene ESBL trong E. coli từ động vật sản
xuất thực phẩm nhƣ gà có thể gây nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời (Laube,
2013).
Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL đã
xuất hiện trên gà khỏe, theo nghiên cứu của Delphine Girlich (2007) có E. coli
ESBL 10,7% có trong phân manh tràng của gà khỏe ở lò giết mổ tại Pháp. Năm
2013, Gundogan and Avci phân lập 66,6% E. coli ESBL trong thịt gà tại Thổ Nhĩ
Kỳ. Theo kết quả nghiên cứu của Stefan Börjesson et al. (2013) có 44% (44/100)
các mẫu thịt gà ở Thụy Điển phát hiện E. Coli ESBL. Tuy nhiên, ở Việt Nam các
nghiên cứu về E. coli ESBL trên vật nuôi nói chung hay trên gà nói riêng chƣa đƣợc
nghiên cứu nhiều. Trần Đề là một trong những huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng với
nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên, kinh tế phù hợp để phát triển ngành chăn nuôi gà
và đang hình thành một số trang trại chăn nuôi tập trung, công nghiêp với các mô
hình sản xuất liên doanh, do đó việc nghiên cứu sự hiện diện E. coli ESBL là rất cần
thiết. Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli sinh beta lactamase phổ
rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng” đƣợc
thực hiện.
Mục tiêu của đề tài:

- Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên gà khỏe ở huyện Trần Đề
tỉnh Sóc Trăng
- Thử tính nhạy cảm đối với một số loại kháng sinh của vi khuẩn E. coli ESBL.



2

CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli
Trực khuẩn ruột già Escherichia coli (E. coli) còn có tên là Bacterium coli
commune, Bacillus coli communis đƣợc Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ
em bị tiêu chảy. Đây là một trong những loài vi khuẩn sống ký sinh trong đƣờng
ruột của động vật máu nóng (chim và loài hữu nhũ). Vi khuẩn E. coli thuộc: lớp
Schgzomycetes, bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae, tộc 1 Escherichiae, giống
Escherichia, loài Escherichia coli.
Hệ thống tiêu hóa của con vật mới sinh sẽ nhanh chóng nhiễm vi khuẩn trong đó có
E. coli tạo nên hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Nồng độ vi khuẩn E. coli thƣờng thấp ở
ruột non, tăng dần và có nồng độ cao nhất ở ruột già. Hầu hết E. coli là sinh vật
sống cộng sinh, chúng sống trong đƣờng ruột nhƣng không có hại cho vật chủ. Chỉ
một phần nhỏ số chủng có thể sản xuất yếu tố độc lực và gây hại con vật (Gyles and
Fairbrother, 2010).
2.1.1 Đặc điểm hình thái
E. coli là trực khuẩn ngắn, Gram âm, có hình dạng đồng nhất, không có khả năng
hình thành nha bào. Vi khuẩn này có thể thay đổi về kích thƣớc và hình dạng ở
trong tế bào vi khuẩn có kích thƣớc nhỏ hơn vi khuẩn ở dạng tự do, thƣờng là 2 -3 x
0,6µm. Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli di động và có lông roi, có thể phát triển
ở điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí trong các môi trƣờng dinh dƣỡng ở nhiệt độ
18 – 44
o

C (Hồ Thị Việt Thu, 2012).
Thân E. coli đƣợc bao phủ bởi những sợi protein có chức năng bám dính và giúp cơ
thể di động. E. coli bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở 2 đầu, khoảng
giữa nhạt. Nếu cố định bằng acid osmic rồi quan sát dƣới kính hiển vi thấy tế bào
E. coli có nhân, đó là một khối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng (Nguyễn Nhƣ
Thanh, 1997).
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, một số chủng
có thể phát triển đƣợc ở các môi trƣờng tổng hợp đơn giản nên ngƣời ta đã chọn
chúng làm mẫu để nghiên cứu về sinh vật học.
E. coli là trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ từ
5-40
o
C, nhiệt độ thích hợp là 37
o
C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4, có thể phát triển đƣợc
ở pH từ 5 - 8 (Lƣu Hữu Mãnh, 2009).
Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng (NA): sau khi ủ 24 giờ ở 37
o
C hình thành khuẩn lạc
tròn, bóng ƣớt, không trong suốt màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đƣờng kính 1-3 mm.
Thời gian ủ kéo dài thì khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc lan rộng ra. Chúng ta có
thể quan sát thấy cả khuẩn lạc khô nhăn và dạng trơn, bóng thƣờng đƣợc dùng làm
môi trƣờng lƣu giữ chủng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
3

Trên môi trƣờng MacConkey vi khuẩn lên men đƣờng lactose và hình thành những
khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy.
Môi trƣờng Mueller-Hinton Agar là môi trƣờng trong, dùng cho thử nghiệm tính
nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trƣờng cũng thƣờng đƣợc dùng để thử

nghiệm sự thuỷ phân tinh bột.
Hình 1. Vi khuẩn E. coli dƣới kính hiển vi quang học (X=10µm)
/>ges/index_gram_stain_images.html
2.1.3 Đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn E. coli lên men sinh hới các loại đƣờng: lactose, fructose, glucose,
levulose, galactose, xylose, ramnose, mannit. Không lên men đƣờng andonit và
inozit. Tất cả E. coli đều lên men đƣờng lactose nhanh và sinh hơi (ở 44 ± 0,5
o
C),
đó là đặc điểm quan trọng mà ngƣời ta dựa vào đó để phân biệt E. coli và
Salmonella (Lƣu Hữu Mãnh, 2009).
Theo Nguyễn Ngọc Hải (2012) vi khuẩn đƣợc định danh bằng phản ứng sinh hóa
nhƣ khả năng tạo Indol, phản ứng VP, phản ứng MR, khả năng sử dụng Citrate.
Khả năng tạo Indol nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải tryptophan trong
môi trƣờng tạo thành Indol khi kết hợp với paradimethylamino – benzaldehyd co
trong thuốc thử kowacs sẽ tạo thành hợp chất rosindol có màu đỏ. Vi khuẩn E. coli
trong môi trƣờng dinh dƣỡng Nutrient broth có chứa pepton khi nhỏ thuốc thử
kowacs vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dƣơng tính
và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì Indole âm
tính.
Phản ứng Methyl Red nhiều vi khuẩn có khả năng oxy hóa đƣờng glucose tạo thành
acid pyruvic. Acid pyruvic sinh ra chuyển hóa thành nhiều loại acid hữu cơ nhác
nhau làm cho pH môi trƣờng nuôi cấy bi hạ thấp xuống dƣới 4,5. Ở độ pH này chất
chỉ thị màu methyl red khi đƣợc nhỏ vào sẽ vẫn giữ màu đỏ. Nhỏ lên bề mặt môi
4

trƣờng ít giọt thuốc thử Methel Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện
trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại.
Phản ứng Voges – Proskauer (VP) một số vi sinh vật có khả năng oxy hóa đƣờng
glucose tạo thành acid pyruvic, nhƣng lại không chuyển hóa acid pyruvic thành các

acid hữu cơ mà thành hợp chất acetyl methyl carbinol (actoine). Actoine trong môi
trƣờng kiềm cao sẽ bị oxy hóa thành diacetyl. Diacetyl sinh ra sẽ kết hợp với nhóm
guanine của arginine có trong pepton tạo thành phức chất có màu đỏ với thuốc thử α
– naphtol. Khi nhỏ thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ
thì phản ứng dƣơng tính, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì
phản ứng âm tính.
Khả năng sử dụng Citrat trong môi trƣờng có chứa hợp chất sodium citrate, một số
vi khuẩn có khả năng sử dụng đƣợc citrate và làm thừa ra các gốc Na
+
khiến cho
môi trƣờng trở nên chuyển từ xanh lá cây sang màu xanh dƣơng. Trong môi trƣờng
Simmon citrat nguồn cacbon duy nhất là citrat, vi khuẩn sử dụng citrat sẽ kiềm hóa
môi trƣờng làm môi trƣờng đổi từ xanh lục sang xanh lơ. E.coli không có khả năng
sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất, môi trƣờng không đổi màu.
2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh
Vi khuẩn có thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 60
o
C trong 30 phút, ở 70
o
C vi khuẩn bị vô
hoạt trong 2 phút, trong điều kiện khô vi khuẩn có thể sống lâu. Vi khuẩn có khả
năng đề kháng với nhiều kim loại nặng nhƣ: arsenic, đồng, kẽm, thủy ngân và các
chất sát trùng nhƣ hỗn hợp ammonium, oxy già, formadehyde và chlorhexidine (Hồ
Thị Việt Thu, 2012).
Các chất sát trùng nhƣ acide phenic, biclorua thủy ngân, formon, hydroperoxid
0,1% diệt vi khuẩn sau 5 phút, nhƣng vi khuẩn đề kháng mạnh với sự sấy khô. Tuy
nhiên, ở môi trƣờng bên ngoài các chủng E. coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng
(Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
Kháng nguyên
Theo Lƣu Hữu Mãnh (2009) cấu trúc kháng nguyên của E. coli rất phức tạp bao

gồm: O, H, K.
Kháng nguyên O (somatic antigen – kháng nguyên thân): là thành phần chính của
thân vi khuẩn và cũng đƣợc coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. Kháng nguyên
O đƣợc coi nhƣ một nội độc tố có thể tìm thấy ở màng ngoài vỏ bọc vi khuẩn và
thƣờng xuyên đƣợc giải phóng vào môi trƣờng nuôi cấy.
Kháng nguyên H (flagellar antigen-kháng nguyên lông): kháng nguyên H của vi
khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý
nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít đƣợc quan tâm nghiên cứu, nhƣng
có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống, loài của vi khuẩn.
5

Kháng nguyên K (capsular antigen-kháng nguyên giáp mô): vai trò của chúng chƣa
đƣợc thống nhất, có ngƣời cho rằng nó không có ý nghĩa về độc lực. Cũng có ý kiến
khác cho rằng kháng nguyên K cũng có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo
vệ vi khuẩn trƣớc các yếu tố của cơ thể.
Độc tố
E. coli có thể sinh ra 2 loại nội độc tố và ngoại độc tố:
Nội độc tố (endotoxin) là những độc tố do vi khuẩn sản sinh ra nhƣng chỉ đƣợc bài
xuất ra ngoài khi nào vi khuẩn bị dung giải. Thành phần hóa học của nó là một hợp
chất gồm: glucid, lipid, protid chịu đƣợc nhiệt độ cao (Trần Linh Thƣớc, 2003).
Ngoại độc tố (exotoxin) là những chất độc do vi khuẩn tiết ra ngoài. Ngoại độc tố
có bản chất protein, không chịu nhiệt (60 – 80
o
C) bị phá hủy bởi các phân hóa tố
làm mất tác dụng. Ngoại độc tố dễ tan và dễ lan rộng. Nó thƣờng gây hại bằng cách
tác động vào tổ chức thần kinh hay vào máu làm tang huyết cầu. Ngoại độc tố gồm
2 loại: độc tố làm tan huyết và độc tố đƣờng ruột enterotoxin .
Tính gây bệnh
E. coli có sẵn trong ruột của động vật nhƣng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề
kháng của con vật giảm sút. Bệnh do trực khuẩn E. coli có thể gây xảy ra nhƣ một

bệnh truyền nhiễm kế phát trên cơ sở thiếu vitamin và mắc các bệnh virus và ký
sinh trùng. E. coli thƣờng gây bênh cho gia súc mới đẻ từ 2- 3 ngày hoặc từ 4 – 8
ngày (Lƣu Hữu Mãnh, 2009).
Nguồn lây bệnh E. coli chủ yếu là từ gà bệnh và gà khỏe mang trùng bài xuất mầm
bệnh ra môi trƣờng nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các loài gậm nhấm lây
truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từ môi trƣờng ngoài vào
(Nguyễn Xuân Bình, 2005).
2.2 Kháng sinh nhóm beta lactam
2.2.1 Cấu trúc kháng sinh nhóm beta lactam
Tất cả các kháng sinh nhóm B-lactam đều có vòng B-lactam trong cấu trúc phân tử
Vòng beta-lactam có cấu trúc không gian hóa học 4 cạnh gồm 3 nguyên tử C và một
nguyên tử N (Nguyễn Thị Vinh, 2007).
2.2.2 Phân loại kháng sinh nhóm beta lactam
Theo Hoàng Tích Tuyền (1998) đƣợc trích dẫn từ Hà Vũ Minh Trang (2012) kháng
sinh nhóm beta lactam gồm có 2 nhóm: peniciliins và cephalosporins.
Phân nhóm peniciliins gồm có: benzylpenicillin, phenoxypenicillin, penicillin
kháng penicillinase, aminopenicillin, carboxypenicillin, ureidopenicillin,
carbapenem.
6

Nhóm kết hợp ức chế beta-lactamase: có tác dụng bất hoạt cầu ESBL. Ví dụ:
Amoxicillin kết hợp clavulanic acid (AMC), ampicillin kết hợp sulbactam (SAM),
hay là piperacillin kết hợp tazobactam (TZP).
Phân nhóm cephalosporin gồm có: Cephalosporins thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và thế
hệ 4. Các Cephalosporins phổ rộng nhƣ cefotazidime, ceftriaxone đƣợc gọi là
oxyimino-beta-lactam. Một số kháng sinh về mặt lý thuyết và thử nghiệm trên
invitro không bị phân hủy bởi ESBL gọi là cephamycin nhƣ: cefoxitin, cefotetan và
cefmetazole. Cephamycin gồm các cephalosporin có chuỗi bên 7a-methoxy bị ngăn
chặn bằng thủy phân do các ESBL và các Beta-lactamase lớp A và lớp D.
2.2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta lactam

Theo Võ Thị Trà An (2012) kháng sinh ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn
bằng cách can thiệp vào các enzyme transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên
kết của chuổi peptidoglycan. Các enzyme này liên kết với 1 nhóm protein nằm ở
bên ngoài màng nguyên sinh chất PBP (penicillin – binding protein). Nhƣ vậy, điểm
tác động của kháng sinh nhóm beta lactam chính là PBP. Mức độ mẫn cảm của vi
khuẩn với một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mực độ gắn kết vơi PBP,
khả năng xâm nhập vào tế bào và khả năng kháng đƣợc các enzyme beta lactam.
Beta- lactam không chỉ ức chế những liên kết nối cuối cùng của peptidoglycan trong
tiến trình tổng hợp thành vi khuẩn mà còn gây tiết lipoteichoic acid tạo phản ứng tự
ly giải hay tự sát của vi khuẩn do sự hƣ hỏng peptidoglycan. Beta lactam có tác
động sát khuẩn phụ thuộc thời gian, nghĩa là phải đảm bảo rằng trong thời gian trị
liệu nồng độ kháng sinh trong huyết tƣơng hoặc mô bào đạt trên MIC. Tuy nhiên,
do beta- lactam chỉ tác động lên vi khuẩn trong giai đoạn tăng trƣởng (giai đoạn
tổng hợp thành), ở nồng độ quá cao trên mức nồng độ sát khuẩn tốt nhất sẽ gây hiệu
ứng Eagle (hiệu ứng ngƣợc), nghĩa là giảm khả năng sát khuẩn. Đây là một khái
niệm quan trọng để tránh sử dụng quá liều kháng sinh nhóm này.
2.3 Đề kháng kháng sinh
2.3.1 Hiện tƣợng đề kháng kháng sinh
Theo Võ Thị Trà An (2012) mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị
bệnh cho ngƣời và thú đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế, việc dùng
kháng sinh đã đồng thời tạo nên một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn. Việc dùng
kháng sinh sẽ luôn tạo ra sự đề kháng với chính nó ở một mức độ nhất định trong
quần thể vi khuẩn.
Đề kháng kháng sinh đƣợc phân loại gồm:
*Kháng tự nhiên
Vi khuẩn đã có tính kháng thuốc từ trƣớc khi tiếp xúc với kháng sinh mỗi loài hoặc
mỗi giống đƣợc đặc trƣng và phát họa phổ hoạt động kháng sinh riêng. Các gene đề
7

kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn. Đề kháng tự nhiên là đặc điểm có ở

tất cả các chủng của cùng một loài, và đƣợc biết ngay từ lúc đầu khi nghiên cứu xác
định hoạt tính của kháng sinh và xác định phổ tác dụng của thuốc kháng sinh.
*Kháng mắc phải
Do đột biến: vi khuẩn có chu kỳ phát triển từ vài giây đến vài phút nên chúng rất
linh hoạt trong biến đổi để phù hợp với những thay đổi của môi trƣờng, đề kháng do
đột biến xảy ra từ từ và là một tiến trình tích lũy (Võ Thị Trà An, 2012). Việc đột
biến nhiễm sắc thể liên quan tới nhiều kháng sinh mới. Việc xuất hiện các đột biến
có tần suất thay đổi theo vi khuẩn và theo kháng sinh.
Do plasmid: nhiều plasmid khác nhau có thể trùng hợp trong cùng một vi khuẩn và
phối hợp với một sự đề kháng nội tại dẫn đến đa đề kháng
Do transposon các plasmid đề kháng có thể tiến triển in vitro do tiếp thu hay mất đi
lần lƣợt những đặc tính đề kháng, hệ quả của tính chất chuyển giao đƣợc của phần
lớn các gene. Các transposon là hệ quả của ADN có thể đổi chỗ các replicon lẫn
nhau (chuyển vị nội phân tử) hay tại một nơi của cùng một replicon (chuyển vị
ngoại phân tử), mặc dù không có sự tƣơng đồng giữa các ADN mà chúng tác dụng.
Tuy nhiên, đôi khi có những vùng gián tiếp riêng.
2.3.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh
Theo Võ Thị Trà An (2012) các vi khuẩn đề kháng có thể sinh ra một enzym phá
hủy hoặc làm bất hoạt thuốc. Ví dụ: β-lactamase phá vỡ các vòng β-lactam của
penicillin và các phân tử tƣơng tự, biến nó thành dạng không hoạt động. Các tác
nhân gây bệnh đề kháng có thể làm chậm hoặc ngăn ngừa sự xâm nhập của thuốc
vào tế bào. Cơ chế này thƣờng có liên quan đến những sự thay đổi trong cấu trúc
hoặc điện tích của các protein màng tế bào chất tạo nên các kênh hay các lỗ. Các
protein này nằm trong màng ngoài của vi khuẩn Gram âm gọi là các porin. Các
protein porin bị thay đổi bắt nguồn từ những thay đổi trong các gene nhiễm sắc thể.
Các thế bào đề kháng có thể làm thay đổi thụ thể đối với thuốc do vậy nó không thể
gắn vào hoặc liên kết một cách hiệu quả tới đích của nó. Các tế bào đề kháng có thể
làm thay đổi hóa học trao đổi chất của chúng hoặc chúng có thể từ bỏ toàn bộ các
bƣớc trao đổi chất mẫn cảm. Các tế bào đề kháng có thể bơm thuốc ra khỏi tế bào
trƣớc khi thuốc có thể gây tác dụng.

2.4 Men beta lactamase phổ mở rộng
2.4.1 Tổng quan về ESBL
Vào năm 1965, lần đầu tiên trong lịch sử, các nhà khoa học đã phát hiện ra enzym
TEM – 1, là enzym β-lactamase truyền qua plasmid đƣợc phân lập trên bệnh nhân
tên la Temoniera – một ngƣời Hy lạp – bị nhiễm trùng huyết do E. coli. Ngày nay,
đã có hơn 200 loại men ESBL đƣợc các chủng vi khuẩn sinh sản có mặt khắp nơi
8

trên thế giới với tần suất khác nhau tùy theo mỗi nƣớc, mỗi khu vực. Số loại men
ESBL mới đƣợc phát hiện ngày càng nhiều, các nhà khoa học nhận thấy còn có rất
nhiều chủng trực khuẩn Gram âm khác sinh men beta lactam (Trích dẫn của Hà Vũ
Minh Trang, 2012).
2.4.2 Một số phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL
Xét nghiệm xác định ESBL dựa vào tìm kiếm sự cộng hƣởng giữa oxymino –
cephalosporin và clavulanate. Vì clavulanate có tác dụng ức chế ESBL. Nhiều
phƣơng pháp phát hiện ESBL đƣợc đề nghị dựa trên nguyên tắc đĩa khuyếch tán của
Kirby – Bauer (1966). Hiện nay, các phƣơng pháp cộng hƣởng đang đƣợc sử dụng
rộng rãi là: Phƣơng pháp đĩa đôi, phƣơng pháp đĩa kết hợp và phƣơng pháp E – test.
Phƣơng pháp đĩa đôi
Dựa trên nguyên tắc clavulanic acid ức chế ESBL nên làm giảm mức độ đề kháng
của cephalosporins và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporins
khi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa clavulanic acid. Vi khuẩn đƣợc cấy trên đĩa
thạch Mueller – Hinton. Đặt đĩa cephalosporin (30µg) với đĩa amoxicillin –
clavulanate (20µg) cách nhau 20 – 25mm trên mặt thạch. Trƣớc đây, khoảng cách
yêu cầu là 30mm, nhƣng hiện nay, khoảng cách đƣợc giảm xuống để tăng độ nhảy
cảm của phƣơng pháp. Có cộng hƣởng khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa
cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate.
Phƣơng pháp đĩa kết hợp: Sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporins thế
hệ 3 và cephalosporins thế hệ 3 tƣơng ứng phối hợp với clavulanic acid. Vi khuẩn
tiết ESBL khi hiệu số đƣờng kính vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporins có phối

hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm.
Tiêu chuẩn CLSI, 2014 yêu cầu với phƣơng pháp này cần phải thực hiện đồng thời
trên cả hai hệ thống là : cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid (30/10µg);
ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid (30/10µg)
Phƣơng pháp E – test: Dùng que E – test một đầu là dãy chứa nồng độ của
cephalosporin và đầu kia là dãy nồng độ của cephalosporin/ clavulanic acid. ESBL
sẽ có vùng ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid, phần
còn lại không có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức
chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh
ức chế. Vi khuẩn sinh ESBL dƣơng tính sẽ có vùng ức chế hình eclip và nồng độ
MIC ở vùng kháng sinh không kết hợp với clavulanic acid tăng gấp 8 lần phần còn
lại.
Phƣơng pháp ChromID ESBL agar môi trƣờng ChromID ESBL chứa kháng sinh
cefpodoxime và chất màu, nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime có
9

khả năng phát triển trên môi trƣờng ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có
màu sắc khác nhau, đặc trƣng cho một số loài vi khuẩn.
Phƣơng pháp Vitek ESBL test phƣơng pháp này dựng card MIC có chứa
cephalosporin nồng độ bắt đầu từ 0,5µg/ml trộn với clavulanic acid nồng độ 4
µg/ml. Kết quả nếu vi khuẩn có ESBL sẽ cho MIC cephalosporin >= 8 µg/ml.
Phƣơng pháp Micro scan panels tấm panel nhựa có 4 giếng chứa môi trƣờng
kháng sinh cephalosporin và cephalosporin/clavulanic acid, cấy vi khuẩn vào các
giếng rồi để vào tủ ấm 18 – 24 giờ đọc kết quả, nếu ESBL dƣơng tính, vi khuẩn sẽ
không mọc ở giếng có cephalosporin kết hợp clavulanic acid.
Phƣơng pháp máy định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ BD Phoenix với 5
hàng giếng có chứa kháng sinh gồm 2 hàng đầu cefodoxime, ceftazidime, và các
hàng sau là ceftazidime kết hợp clavulanic acid, cefotaxime kết hợp clavulanic acid,
ceftriaxone kết hợp clavulanic acid. Nếu vi khuẩn sinh ESBL dƣơng tính, máy sẽ tự
động báo kết quả và cho thông tin liên quan.

2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế thới
Theo Ilse Overdevest et al. (2011), khảo sát từ 927 mẫu phân trực tràng trên ngƣời
tại 4 bệnh viện phía nam Hà Lan, 89 mẫu thịt gà và 85 mẫu thịt bò và 57 mẫu thịt
heo. Kết quả đa phần E. coli ESBL dƣơng tính trên thịt gà (68/89) 76,8%, thịt bò
4,7% (4/85), và thịt heo 1,8% (1/57). Có tổng cộng 4,9% (4,5/927) mẫu phân trực
tràng trên ngƣời dƣơng tính với E. coli ESBL. Kết quả giải trình tự gene mã hóa cho
thấy các gene ESBL chiếm ƣu thế trong thịt gà và mẫu phân ở ngƣời tƣơng đồng
nhau. Những phát hiện của nghiên cứu cho thấy mối quan hệ sự tƣơng đồng các
gene ESBL trên gà và ngƣời cùng sự hiện diện phong phú gene ESBL trong thức ăn
có thể có một ảnh hƣởng nghiêm trọng trong lựa chọn kháng sinh điều trị cho các
bệnh nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn E. coli.
Li Yuan et al. (2009) thu thập 51 mẫu gan của gà bệnh chết từ 14 trang trại gà ở Hà
Nam Trung Quốc năm 2008. Kết quả 60,8% (31/51) mẫu dƣơng tính với E. coli
ESBL. Phần lớn các chủng cũng đều kháng với nhóm beta-lactam, và kháng với
gentamicin (87,1%), amikacin (80,6%), enrofloxacin (80,6%) và sulfamethox-azole
/ trimethoprim (90,3%).
Nghiên cứu của Annemieke Smet et al. (2008), lấy ngẫu nhiên 498 mẫu phân manh
tràng từ 5 trang trại gà thịt 5 tuần tuổi ngẫu nhiên ở Bỉ. Kết quả có 26,7% (133/498)
mẫu dƣơng tính với E. coli ESBL. Các mẫu đều kháng vơi nhóm beta lactam và
kháng với kanamycin 7,5%, gentamicin 4%, streptomycin 30,2%, tetracycline
48,1%, trimethoprim 64,4%. Tỉ lệ đa kháng cho thấy 76% E. coli ESBL có khả
năng kháng trên 2 loại kháng sinh, 4% kháng với 8 kháng sinh không thuốc nhóm
beta lactam.
10

Nghiên cứu Delphine Girlich et al. (2007) phân tích trong 112 mẫu manh tràng gia
cầm khỏe mạnh trong cơ sở giết mổ của bảy huyện ở Pháp vào năm 2005, trong đó
có 10,7% (12/112) mẫu có E. coli ESBL các mẫu đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch
MacConkey chứa ceftazidime (1 ug/ml) hoặc cefotaxime (1 ug/ml).
Laube et al. (2013) E. coli kháng kháng sinh nhóm beta-lactam do sản xuất ESBL

ngày càng tăng hiện đang là vấn đề làm hạn chế đáng kể sự lựa chọn điều trị trong
cả y học trên con ngƣời và thú y. Sự hiện diện của gene ESBL trong E. coli từ động
vật sản xuất thực phẩm nhƣ gà có thể gây nguy hiểm sức khỏe con ngƣời. Khảo sát
140 mẫu phân manh tràng trên gà ( 20 mẫu của mỗi trang trại ở 3 thời điểm khác
nhau) và 20 mẫu phân sàn, 21 mẫu chất đệm chuồng, 21 mẫu swab ủng, 83 swab
phân, 21 mẫu rạt bụi (200g phân và 200g rác, khoảng 2 g gộp các mẫu bụi) đƣợc
thu thập từ ít nhất 10 điểm khác nhau trên mỗi lần lấy mẫu từ 7 trang trại khác nhau
ở Đức 2013. Kết quả tỉ lệ E. coli dƣơng tính với ESBL từ mẫu phân manh tràng gà
1-2 ngày tuổi 36,42 % (51/140), gà 14-18 ngày tuổi 53,57% (75/140), gà 26-35
ngày tuổi 54,28% (76/140). Phân sàn 100% (20/20), ổ rơm 95.2% (20/21), swab
ủng 90.4% (19/21), swab phân 54.2% (45/83), mẫu bụi 71.4% (15/21) .
Theo Cindy Dierikx et al. (2012) lấy 25 hoặc 41 bệnh phẩm manh tràng đƣợc thu
thập từ gà thịt ở mỗi 26 trang trại và 18 mẫu phân từ 18 nông dân gà thịt đƣợc phân
tích để xác định sự hiện diện của ESBL. Kết quả gà từ tất cả các trại phân lập
E. coli ESBL có tỉ lệ ≥80% trong 22/26 trại và 33% (6/18) mẫu phân từ nông dân
dƣơng tính với E. coli ESBL. Nghiên cứu này cho thấy một tỷ lệ cao E. coli ESBL
trên gà thịt ở các trang trại Hà Lan và trên nông dân, đây là điều không mong muốn
ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
Valeria Bortolaia et al. (2010) thử nghiệm sự nhạy cảm của vi khuẩn E. coli ESBL
với kháng sinh của 67 E. coli ESBL từ 1 trang trại gà giống và 4 trang trại gà thịt
nằm ở Đông Bắc Italy . Lấy 18 mẫu thử kháng sinh đồ trong đó trại 1: gà thịt 12
ngày tuổi (n=3), trại 2: gà thịt 35 ngày (n=2), trại 3: gà thịt 70 ngày (n=8), trại 4:
(n=1) gà thịt 35 ngày tuổi, trại 5: gà giống (n=4). Kết quả 94% (17/18) phân lập
đƣợc kháng với tetracycline, và 83% (15/18) phân lập đƣợc kháng với nalidixic
axit, 44% (8/18) trong số đó đã kháng ciprofloxacin. Sulfon-amide kháng hoặc kết
hợp với trimethoprim đƣợc phát hiện là 22% (4/18) và 55% (10/18) tƣơng ứng.
Nhạy với amikacin, colistin, và imipenem. Đa kháng với 4-5 loại kháng sinh
(33,3%), kháng với 6 loại kháng sinh (5,5%), trên 7 loại kháng sinh (39%).
Theo Nghiên cứu của Randall et al. ( 2011) về tỷ lệ nhiễm E. coli mở rộng phổ
beta-lactamase (CTX-M và TEM-52) từ gà thịt và gà tây trong Vƣơng quốc Anh từ

năm 2006 và 2009. Thử kháng sinh đồ từ 23 mẫu gà tây không có mẫu nào trong số
các mẫu kháng với amikacin, nhƣng kháng với ampicillin 100%, streptomycin
39,1%, sulphonamide 78,3% và trimethoprim/sulfamethoxazole 43,5%. Đa kháng
11

với hơn 4 loại kháng sinh bất kỳ với tỉ lệ 70% (tetracycline, gentamicin,
streptomycin, ampicillin). Theo Randall thì sự đề kháng kháng sinh của đàn gà thịt
lớn hơn nhiều so với đàn gà giống, đề kháng kháng sinh nhƣ ampicillin,
streptomycin, sulphonamide, trimethoprim/ sulpho-namides và tetracycline phổ biến
ở cả gà giống và gà thịt .
Theo nghiên cứu của Gundogan and Avci, (2013) phân lập từ 15 mẫu thịt gà, kết
quả 66,6% (10/15) mẫu thịt gà nhiễm E. coli ESBL. E.coli phân lập kháng với
ampicillin (100%), tetracycline (77,8%) và nhạy với gentamicin (93,3%) và
amikacin (95,6%). Ba mƣơi (66,7%) E. coli phân lập kháng với 1 - 2 kháng sinh,
và nhiều khả năng chống nhiều hơn ba loại kháng sinh 37,8%.
Theo Stefan Börjesson et al. (2013) có 44% (44/100) các mẫu thịt gà ở Thụy Điển
phát hiện E. Coli ESBL. Sự xuất hiện E. coli ESBL trong gà ở Thủy Điển là do lây
truyền dọc từ nhập khẩu con giống.
Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về E. coli ESBL trên vật nuôi nói chung hay
trên gà nói riêng chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều.


12

CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng
Thời gian từ tháng 8 đến 12 năm 2014.
Địa điểm thu thập mẫu tại một số trại thuộc huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng.
Địa điểm phân lập tại phòng vi sinh bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học

ứng dụng trƣờng Đại học Cần Thơ.
Đối tƣợng nghiên cứu mẫu gan, thịt, phổi, phân gà đẻ và gà thịt khỏe.
3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, autoclave, máy dập mẫu, cân điện
tử.
Dụng cụ xét nghiệm: khay inox, dao mổ, kéo mổ, pen thẳng, kẹp, pen cong, thùng
bảo ôn, túi nylon, găng tay, tâm bông, cồn , đĩa petri, ống nghiệm, que cấy,
micropipette, đĩa.
Hóa chất Nutrient Agar (Merck KgaA, Germany), MacConkey Agar (Merck KgaA,
Germany), Voges Proskauer (Merck KgaA, Germany), Simmons Citrate Agar
(Merck KgaA, Germany), Methyl Red (Merck KgaA, Germany), Trypton Water
(Merck KgaA, Germany), MHA (Merck KgaA, Germany).
Loại kháng sinh sử dụng:
Ceftazidime (Caz) ( 30µg , ceftazidime 30µg + clavulanic acid 10µg, cefotaxime
(Ctx) 30µg, cefotaxime 30µg + clavulanic acid 10µg, ampicillin (Am) 10µg,
cefuroxime 30µg, cefaclor (Cf) 30µg, tetrecyline (Tc) 30µg, doxycyline (Dc) 30µg,
fosfomycin (Fo) 200µg, trimethoprim - sulfamethoxazole (SXT) 1,25/32,75 µg,
ofloxacin (Of) 5µg, norfloxacin (Nor) 10µg, amikacin (Ak) 30µg, gentamycin (Gm)
10µg, kanamycin (Km) 30µg, streptomycin (Str) 10µg của công ty Nam Khoa.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Chọn ngẫu nhiên 22 con gà khỏe, trong đó có 11 gà đẻ và 11 gà thịt xuất chuồng
không có dấu hiệu của bệnh từ một số trang trại ở huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng
Mẫu phân đƣợc lấy trực tiếp từ lỗ huyệt của gà, dùng bông thấm cồn 70
o
sát trùng
xung quanh hậu môn, dùng que tăm bông vô trùng lấy phân ở lỗ huyệt của gà sau
đó cho vào ống chứa môi trƣờng Cary-Blair để bảo quản mẫu và trữ lạnh để vận
chuyển về phòng thí nghiệm.
Mẫu nội tạng trƣớc khi lấy mẫu sát trùng vị trí lấy mẫu bằng cồn 70

0
dùng kéo vô
trùng cắt nhẹ bề mặt nội tạng tại vị trí đã vô trùng, dùng kẹp vô trùng lấy một ít mô
13

bên trong cấy vào túi nylon có chứa pepton, ghi ký hiệu mẫu, trữ lạnh, vận chuyển
về phòng thí nghiệm.
3.2.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
Phân lập vi khuẩn E. coli ESBL bằng phƣơng pháp đĩa kết hợp

Mẫu (gan, thịt, phổi, phân)

MC bổ sung kháng sinh Ceftazidime 2mg/l

Cấy lên môi trƣờng NA

Thử nghiệm sinh hóa

Indol(+) MR(+) VP(-) Critrate(-)

Khẳng định E. coli


Cấy vi khuẩn lên môi trƣờng MHA sau đó đặt
kháng sinh ceftazidim, ceftazidim +clavulanic acid hoặc
cefotaxim, cefotaxim + clavulanic acid

Khẳng định E. coli ESBL nếu đƣờng kính vòng vô khuẩn
ceftazidime/clavulanic acid – ceftazidime và/hoặc
cefotaxime/clavulanic acid – cefotaxime ≥5mm(CLSI, 2014)

Hình 2 Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli ESBL

37
0
C/24 giờ
Tạo huyễn dịch vi khuẩn
(nồng độ 10
8
vi khuẩn/ml)
37
0
C/18 - 20 giờ
37
0
C/24 giờ
37
0
C/24 giờ
14

Mẫu đƣợc cấy lên môi trƣờng MC có kháng sinh ceftazidime 2mg/l . Đối với mẫu
phân ta cấy trƣợc tiếp lên môi trƣờng MC có kháng sinh. Sau khi cấy mẫu lên môi
trƣờng MC ủ ấm ở 37
o
C trong 24 giờ. Trên môi trƣờng MC vi khuẩn E. coli hình
thành khuẩn lạc to, tròn, màu hồng, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2-3mm, ta
chọn 3 – 5 khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli tiến hành cấy trên đĩa thạch môi trƣờng NA
ủ ấm ở 37
o

C trong 24 giờ sau đó tiến hành kiểm tra sinh hóa xác định vi khuẩn E.
coli bằng phản ứng IMVic.
Sau khi xác định vi khuẩn E. coli ta dùng que cấy chuyển khuẩn lạc vào ống nghiệm
chứa 9ml nƣớc sinh lý 0,9% tiếp theo ta đem so độ đục trong ống nghiệm với độ
đục của dung dịch chuẩn MacFarland 0,5 (10
8
vi khuẩn/ml), có thể điều chỉnh độ
đục bằng cách cho thêm nƣớc muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn. Sau đó dùng
que tăm bông vô trùng nhúng vào ống canh khuẩn, ép lên thành ống nghiệm cho ráo
nƣớc sau đó lấy ra dàn đều lên mặt thạch MHA. Chờ mặt thạch khô, dùng kẹp vô
trùng đặt 4 đĩa kháng sinh ceftazidime, ceftazidime + clavulanic acid, cefotaxime,
cefotaxime + clavulanic acid dàn đều lên mặt thạch. Đặt đĩa kháng sinh sao cho
chúng cách nhau 2,5 - 3cm và cách rìa đĩa thạch từ 2 – 2,5cm. Để các đĩa thạch ở
nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên
mặt thạch. Lật ngƣợc các đĩa thạch và ủ ấm ở 37
o
C trong vòng 18 – 20 giờ. Sau khi
ủ ấm đo đƣờng kính vòng vô khuẩn nếu đƣờng kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng
sinh có clavulanic acid trừ đi đĩa kháng sinh không có clavulanic acid lớn hơn hoặc
bằng 5mm thì khẳng định là E. coli ESBL và ghi nhận kết quả (CLSI, 2014).
Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli sau khi đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng NA, tiến hành kiểm tra đặc
tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trƣờng LIM, VP, MR-VP và Simmons’
Citrat.
Môi trƣờng LIM dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Trên môi trƣờng
này, sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs’ vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện vòng
đỏ thì phản ứng dƣơng tính và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất
hiện vòng đỏ thì Indole âm tính.
Môi trƣờng VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi
khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trƣờng. Ngƣợc lại, vi khuẩn không có

khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đƣờng que cấy, môi trƣờng
xung quanh trong. Trên môi trƣờng VP, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu
trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton.
Ngƣợc lại, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không
có khả năng sinh aceton.
15

Môi trƣờng MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đƣờng của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt
môi trƣờng vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ xuất
hiện trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại.
Môi trƣờng Simmons’ citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn
carbon của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, vi khuẩn cho kết quả dƣơng tính khi
màu của môi trƣờng chuyển từ xanh lục sang xanh dƣơng.



Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
Thử nghiệm
Kết quả
Glycose
Dƣơng tính
Lactose
Dƣơng tính
H
2
S
Âm tính
Simoms Citrate
Âm tính
Indole

Dƣơng tính
Methy Red
Dƣơng tính
VP
Âm tính
3.3 Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ
Vi khuẩn E. coli ESBL tạo huyễn dich trong ống nghiệm có độ đục bằng với độ đục
của dung dịch chuẩn Mac Farland 0,5 bằng cách so độ đục của 2 ống nghiệm trên
nền giấy trắng có kẻ vạch đen sau đó dùn g que tăm bông vô trùng nhúng vào ống
Hình 3 Phản ứng sinh hóa xác
định E. coli
Hình 4 Vi khuẩn E. coli trên
môi trƣờng MC