Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 16 34

B ộ YTỂ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ca
NGUYỄN THỊ LỆ NINH
GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u LÊN MEN SINH TỎNG HỢP
KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 16.34
(KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2002-2007)
Người hướng dẫn : PGS-TS.Cao Văn Thu
Nơi thực hiện : Bộ môn Vi Sinh và Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: 02-05/2007
HÀ NỘI, 05/2007
;oU-
LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp khóa luận được hoàn thành, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân
thành, lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo PGS. TS Cao Văn Thu - người đã
trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm 0 fn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên
đang giảng dạy, làm việc tại bộ môn Vi Sinh và Sinh Học, bộ môn Công
nghiệp Dược đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy
giáo, cô giáo trưcmg Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường .
Cuối cùng tôi xin cảm 0 fĩi gia đình, bạn bè, những người đã giúp đỡ và
ủng hộ tôi để có kết quả như hôm nay.
Với thời gian thực nghiệm có hạn, khóa luận chắc chắn còn nhiều điều
thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô giáo, bạn bè đồng
nghiệp để khóa luận hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2007
Sinh viên

Nguyễn Thị Lệ Ninh
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN Đ Ề 1
PHẦN 1 - TỔNG QUAN

.
2
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH
2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2
1.1.4. Tính kháng ứiuốc kháng sinh của vi khuẩn

3
1.1.5. Nguyên tắc sử dụng kháng sinh
3
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN 4
1.2.1. Xạ khuẩn (Lớp phụ Actỉnomycetales)
4
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces

5
1.2.3. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Sft’eptomyces
6
1.3. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH

8
1.3.1. Giống vi sinh vật 8

1.3.2. Lên men [5],[9] 8
1.4. TUYÊN CHỌN, CẢI TẠO VÀ BẢO QUẢN GIỐNG XẠ KHUẨN. 10
1.4.1. Tuyển chọn, cải tạo giống xạ khuẩn

10
1.4.2. Bảo quản giống xạ khuẩn 12
1.5. CmẾT TÁCH, TINH CHẾ KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN MEN 12
1.5.1. Chiết x u ấ t

12
1.5.2. Tách sản phẩm 12
1.5.3. Tinh chế 13
1.6. MỘT SỐ NGHIÊN cứu MỚI TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC. 14
1.6.1. PR207944, một kháng sinh chống nấm từ Chaetomium sp. No. 217
. Sự phân lập và làm rõ cấu trúc 14
1 .6 .2 . Ảnh hưởng của các tác nhân gây thoái biến acid clavunalic trong
lên men có bổ sung chủng Streptomyces clavulỉgerus 14
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

16
2.1.1. Nguyên vật liệu
16
2.1.2 Các phương pháp thực nghiệm:

19
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

24
2.2.1. Hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces 16.34 trên một số vi

khuẩn kiểm định 24
2.2.2. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên
25
2.2.3. Kết quả đột biến cải tạo giống
26
2.2.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh
29
2.2.5. Kết quả chiết xuất kháng sinh

31
2.2.6 Kết quả sắc ký lớp mỏng 32
2.2.7. Kết quả kiểm tra sự thay đổi của bột kháng sinh thô

32
2.2.8. Kết quả sắc ký trên cột 33
2.2.9. Kết quả kiểm tra sự biến đổi hoạt tính của kháng sinh đã tinh chế
35
2.2.10. Kết quả thử khả năng chống nấm 36
2.2.11. Kết quả sắc ký kháng sinh chống nấm 37
PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39
3.1. KẾT LUẬN 39
3.2. ĐỀ XUẤT 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40
CHÚ GIẢI CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Acid deoxyribonucleic.
A. nỉger
Aspergillus niger.
ARN
Acid ribonucleic.

B. cereus
Bacillus cereus ATCC 9946.
B. pumỉlus
Bacillus pumilus fin c c 10241.
B. subtỉlis
Bacillus subtilis ATCC 6633.
c. albicans
Candida albicans.
D (mm)
Đưcmg kính trung bình vòng vô khuẩn (vô nấm).
E. Colỉ
Escherichia coli ATCC 25922.
Gr(-) Gram âm.
Gr(+) Gram dương.
KS
Kháng sinh.
MC
Mầu chứng
MT Môi trưcmg.
MTdd
Môi trường dung dịch.
p. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VM 201.
PL Phần phụ lục.
P. mirabilis
Proteus mỉrabỉlis BV 108.
SKLM
Sắc ký lóp mỏng.
S. aureus
Staphỉlococcus aureus ATCC 1128.
S. flexneri

Shigella flexneri DT 112.
STT Số thứ tự
vsv
Vi sinh vật
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển như vũ bão của vi sinh vật học, với phát minh vĩ đại về
Penicillin cùng với việc phát triển và hoàn thiện của công nghệ lên men hiện
đại tạo ra cho nhân loại chất kháng sinh, công cụ hữu hiệu để đấu tranh chống
lại các bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo, bệnh ung thư và mở ra “ kỷ nguyên
vàng ” cho ngành công nghệ sản xuất các chế phẩm này.Tuy nhiên thực tiễn
điều trị cho thấy, lịch sử vấn đề kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh gần như
đồng hành với lịch sử ứng dụng chất kháng sinh và vấn đề này có xu hướng
xuất hiện ngày càng thường xuyên, với mức độ ngày càng trầm trọng hoTi. Do
đó nhu cầu nghiên cứu, sản xuất các chất kháng sinh mới với các đặc tính ưu
việt hơn là rất cấp thiết.
Trong số hcm 10.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì
khoảng 6 6 % là do xạ khuẩn tạo ra. Trong số đó đáng chú ý là các xạ khuẩn
chi Streptomyces - kháng sinh do chi xạ khuẩn này sinh tổng hợp ra rất đa
dạng, có phổ tác dụng rộng; một số loài trong chi còn có khả năng sinh tổng
hợp các kháng sinh chống ung thư.
Nghiên cứu xạ khuẩn nói chung, xạ khuẩn chi Sừeptomyces nói riêng để
tạo ra kháng sinh luôn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học. ở Việt Nam,
các chủng xạ khuẩn thuộc chi Sừ-eptomyces đã được phân lập, nghiên cứu rộng
rãi nhằm phục vụ cho việc tìm kiếm kháng sinh mới, ứng dụng trong điều trị.
Do đó, tôi lựa chọn đề tài: “ Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng
hợp kháng sinh nìíìỉ Strepíomyces 16.34 ” với mục tiêu sau:
- Tiến hành nghiên cứu cải tạo giống nhằm tạo ra chủng có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh cao hơn so với chủng gốc.
- Bước đầu lựa chọn môi trưòng lên men.
- Nghiên cứu phương pháp chiết tách, tinh chế các thành phần kháng sinh.

PHẢN 1 - TỎNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VÈ KHÁNG SINH
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [1]
Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh. Song có thể nêu lên
một định nghĩa được coi là khá hoàn chỉnh: Kháng sinh là những sản phẩm
đặc biệt nhận được từ vỉ sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác cỏ hoạt tỉnh
sinh học cao,cỏ tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một
nhỏm vỉ sinh vật xác định (vỉ khuẩn, nấm, nguyên sình động vật v.v ) hay tế
bào ung thư ở nồng độ thấp.
1.1.2. Phân loại kháng sinh [3]
Có thể phân loại kháng sinh theo nguồn gốc (kháng sinh do xạ khuẩn, vi
khuẩn, nấm) tạo ra; theo cơ chế tác dụng (kháng sinh tác dụng lên thành tế
bào, lên tổng hợp protein, tổng hợp ADN, ARN v.v ) và phân loại theo cấu
trúc hóa học. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất,
gồm các nhóm:
- Nhóm beta lactam - Nhóm tetracyclin
- Nhóm aminoglycosid - Nhóm peptid
- Nhóm macrolid - Nhóm quinolon
- Nhóm lincosamid - Nhóm co-trimoxazol
- Nhóm phenicol
- Các kháng sinh khác: Rifamicin, kháng sinh chống nấm, chống ung thư
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [3]
Các kháng sinh thường tác dụng lên khuẩn theo các cơ chế sau:
- ức chế tổng họp vách tế bào vi khuẩn.
- ức chế tổng họp protêin của vi khuẩn.
- ức chế tổng họp aicd nucleic.
- Thay đổi tính thấm của màng.
- Kháng chuyển hóa (ức chế tổng hợp acid folic).
- ứ c chế trao đổi chất hô hấp.
1.1.4. Tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn [l]y[3]

Định nghĩa; Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi(tì^^hạy cảm
ban đầu của nỏ U'ong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của KS hay
hóa trị liệu.
Hiện tượng kháng KS và hóa trị liệu đã xuất hiện ở hầu hết các loài
v sv . Sự phát triển của sinh học phân tử trong những năm gần đây tạo cơ sở
để nghiên cứu một cách toàn diện bản chất phân tử của tính kháng thuốc ở vi
khuẩn. Thành công trong nghiên cứu di truyền tính kháng thuốc ở vi khuẩn đã
khẳng định là có kháng thuốc đột biến NST và kháng thuốc plasmid. Tính
kháng tìiuốc của vi khuẩn có các cơ chế sâu hơn sau:
- Thay đổi vị trí hay đích tác dụng của KS làm cho KS không thể tấn công
vào tế bào này được.
- Thay đổi cấu ừúc của thành tế bào làm KS không xâm nhập vào tế bào được.
- Tiết ra những enzym cảm ứng để khử hoạt tính của KS trước khi bị tác
dụng của thuốc.
- Làm mất hiệu lực của thuốc bằng cách thích ứng mới của trao đổi chất
đặc biệt của tế bào vi khuẩn.
1.1.5. Nguyên tắc sử dụng kháng sinh [1],[5]
Đe khắc phục hiện tưọng kháng thuốc của v s v gây bệnh, giải pháp có
thể là sử dụng các KS mới, Tuy nhiên việc tìm kiếm, phát hiện và sản xuất ra
một KS mới là cả một khối lượng công việc khổng lồ, tiêu tốn rất nhiều thời
gian, nhân lực và tiền bạc. Đồng thời để sự kháng thuốc xảy ra cũng đồng
nghĩa với việc phải trả giá bằng sức khỏe và tính mạng của bệnh nhân. Chính
vì vậy mọi nỗ lực nhằm hạn chế xuất hiện khả năng kháng thuốc càng trở nên
cần thiết và hiệu quả, cần triệt để tôn trọng các nguyên tắc sử dụng KS sau:
Phân lập vsv gây bệnh và thử độ nhạy cảm của nó với các KS bằng
phương pháp khoanh giấy lọc (KS đồ).
Chọn KS có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với v s v gây bệnh.
Qui định liều dùng và thời gian điều trị thích hợp, đường đưa KS vào
cơ thể.
Phối hợp KS với các chế phẩm khác nhằm tăng tác dụng và giảm các

phản ứng không mong muốn.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VÈ XẠ KHUẨN
1.2.1. Xạ khuẩn (Lớp ^hụ Acíinomycetales) [5],[6],[8]
Đặc điểm chung: Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi
trong tự nhiên. Đa số xạ khuẩn là các v s v Gr(+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu
tạo dạng sợi phân nhánh. Xạ khuẩn có khả năng sản sinh nhiều loại sản phẩm
trao đổi chất quan trọng như: KS, enzym, một số vitamin và acid hữu cơ.
Trong só hơn 10.000 KS hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng 6 6 %
là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn gây bệnh cho người hoặc động vật là trường
hợp rất hạn hữu (Streptomyces ixraeỉi).
❖ Đặc điểm hình thái xạ khuẩn: Xạ khuẩn phát triển thành hệ sợi. Hệ
sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty
cơ chất là khuẩn ty cơ bản còn khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh hay yếu,
thậm chí hầu như không phát triển tùy từng chi từng loài.
Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn; màu sắc phong phú,có thể
gặp các màu da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu, trắng, vàng, xám Khuẩn ty cơ
chất có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố chỉ tan trong nước,
có loại phụ thuộc pH, có loại chỉ tan trong dung môi hữu cơ. Trong môi
trường đặc hiệu có loại xạ khuẩn có thể tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen.
Khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì dài ra trong không
khí thành những khuẩn ty khí sinh.
Tập hợp một tập đoàn xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ
khuẩn. Khuẩn lạc xạ khuẩn có dạng thô ráp, dạng phấn không trong suốt, có
các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ,
❖ Đặc điểm cẩu tạo tế bào:
- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn ứiay đổi trong khoảng từ 0,3-1,0 Ịim đến lụm.
- Thành tế bào có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm.
- Màng tế bào chất: chủ yếu là phospholipid và protein, dày 7,5-10 nm.
- Mezosom; hình phiến, hình bọng hay hình ống.
- Các thể ẩn nhập trong tế bào chất: gồm các hạt polysaccarid, các hạt

polyphosphat.
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces [5],[7],[8]
❖ Đặc điểm hình thái:
- Khuẩn lạc:
+ Tạo thành cụm, bề mặt khô, xù xì, được bao phủ bởi một lớp bột mịn
như bụi phấn hoặc bởi những sợi nhỏ bông như lông tơ.
+ Khuẩn lạc có chân khá vững chắc khó tách khỏi môi trường nuôi cấy.
+ Hệ sợi của khuẩn lạc: khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trưòng nuôi cấy, không phân cắt
trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi.
Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không
khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các
chuỗi bào tử.
- Chuỗi bào tử: có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản
như thẳng, uốn cong, móc câu đon hay kép, xoắn lò xo.
- Bào tử trần:
+ Được hình thành do sự phân cắt của chuỗi bào tử, là cơ quan sinh sản
chủ yếu của xạ khuẩn.
+ Bào tử trần có thể có hình cầu, hình bầu dục, hình que, hình trụ. Các
bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi từ 3-50 bào tử hoặc nhiều hơn.
+ Bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì mụn com (wa), có gai (sp)
hoặc có tóc (ha).
❖ Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là vsv dị dưỡng, nguồn cacbon
thường dùng là đường, tinh bột và nhiều chất hữu cơ khác; nguồn nitơ hữu cơ
là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men; nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amoni.
Streptomyces là loài xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của chúng
thưòng là 25® c - 30” c, một số loài có thể mọc tốt ở nhiệt độ cao hơn, pH tối
ưu thường là 6 , 8 - 7,5.
❖ Khả năng tạo sắc tố:

Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc
tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố của khuẩn ty cơ chất và sắc tố melanoid.
1.2.3. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces [5],[12]
Những kháng sinh do các loài của chi Sü'eptomyces tổng hợp rất đa
dạng. Có thể sắp xếp như sau:
STT
Nhóm kháng sinh
Kháng sinh được tạo
thành
Chủng Streptomyces
sinh tổng hợp
1
Kanamycin
Sừ", kanamycetỉcus
Neomycin
Str.Jradiae
Aminoglycosid
Tobramycin
Sừ", tenebrarỉus
Streptomycin
Sừ'.griseus
Paromomycin
Str.rimous
Spectinomycin
Str.spectabilus
2
Oxytetracyclin
Str.rỉmous
Tetracyclin
Tetracyclin

Str. aureo/aciens
Str. vỉridi/aciens
3 Erythromycin
Str.erythreus
Macrolid
Oleandomycin
Str.antibỉotỉcus
Spiramycin
Str. ambo/aciens
4
Kháng sinh poly-en
Nystatin
Str.nourseỉ
Amphotericin B
Str.nodosus
5
Những kháng sinh
Actinomycin
Str.antỉbỉoticus
khác
Str. chrysomallus
Sừ'.paralus
Daunomycin
Str. coerulerubỉdus
Sừ peuceticus
Hàng năm toàn thế giới sản xuất khoảng 100.000 tấn KS các loại và có
khoảng 100 chất KS mới được các nhà nghiên cứu công bố. Trong tưong lai
chắc chắn còn rất nhiều chất KS mới được phát hiện và tổng hợp.
1.3. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH
Lên men sinh tổng họrp KS là quá trình nuôi cấy v s v trong môi trưcmg

dinh dưỡng với những điều kiện ngoại cảnh như pH, nhiệt độ, thời gian tốt
nhất để v s v sinh trưởng và phát triển, mục đích cuối cùng để tạo được KS
nhiều nhất.
1.3.1. Giống vi sinh vật
Trong lên men, ngoài điều kiện cần có một quy ừình công nghệ hợp lý thì
vấn đề giống là khâu rất quan trọng, quyết định giá trị kinh tế của quá trình sản
xuất. Giống v s v dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào sinh dưỡng
đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao nhất.
1.3.2. Lên men [5],[9]
Có 2 kiểu lên men chính là lên men bề mặt và lên men chìm.
❖ Lên men bề mặt: vsv được cấy sẽ phát ưiển trên bề mặt môi trưcmg
rắn, đặc hay lỏng, v s v hấp thụ các chất của môi trường và sử dụng oxi không
khí để hô hấp trên bề mặt của môi trường dinh dưỡng. Vì vậy yêu cầu của lên
men bề mặt là bề mặt lên men phải rộng và không quá sâu (5-10 cm), đồng thời
phải giữ độ ẩm môi trường khoảng 60 % để tránh khô bề mặt môi trường.
ưu điểm: đơn giản, đầu tư ban đầu thấp, dễ thực hiện.
Nhược điểm: đòi hỏi mặt bằng lớn, khó cơ khí hóa và tự động hóa, giá
thành cao do đó trong công nghiệp KS không áp dụng lên men bề mặt trong
sản xuất mà chỉ sử dụng trong các phòng thí nghiệm để chọn giống.
❖ Lên men chìm: là kiểu lên men mà v s v phát triển trong không gian 3
chiều của môi trường lỏng.
Trước khi lên men cần có giai đoạn tạo giống. Tỷ lệ giống trong môi
trưcmg lên men:l%-10%. Trong khi lên men có thể phải cho thêm các chất
phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, ), chất điều chỉnh pH hay đệm pH nhằm
đảm bảo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men. Tùy thuộc vào sản phẩm
mà thời gian lên men có thể từ 50-120 giờ, tuy nhiên hiệu quả lên men tăng
lên khi thời gian lên men được rút xuống.
ưu điểm: sử dụng triệt để môi trường dinh dưỡng, hiệu xuất cao, tiết kiệm
mặt bằng, dễ cơ giới hóa và tự động hóa.
Nhược điểm: đòi hỏi chịu áp lực cao, có nguy cơ bị nhiễm trùng toàn bộ.

Tuy nhiên chính do có những ưu điểm vượt trội mà tuyệt đại đa số KS ngày
nay đều được sản xuất bằng phương pháp lên men chìm.
Lên men chìm được chia thành lên men gián đoạn, lên men có bổ sung, lên
men liên tục và lên men bán liên tục.
> Lên men gián đoạn (lên men có chu kỳ): là quá trình lên men được coi
như một hệ thống đóng kín. Trong suốt thời gian lên men không có bất cứ
một tác động bổ sung nào vào hệ thống ngoại trừ việc thông khí, dùng đệm
điều chỉnh pH, dùng chất phá bọt,vsv sẽ phát triển qua 4 giai đoạn được gọi
là các pha; pha tiềm tàng, pha log, pha dừng và pha suy tàn. Người ta kết thúc
quá trình lên men vào giai đoạn nào phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt
chất bị đình chỉ ở pha nào trong chu kỳ sinh trưỏng của vsv hoặc việc sinh
tổng hợp đã chậm lại và việc duy trì tiếp tục quá trình lên men không còn
kinh tế nữa.
> Lên men có bổ sung’, thực chất là kỹ thuật kéo dài chu kỳ phát triển của
vsv khi ta cho thêm môi trường mới vào dịch lên men một cách ổn định,
thay đổi hay định kỳ nhưng không lấy bớt dịch lên men ra.
> Lên men liên tục: quá trình lên men môi trưòng dinh dưỡng được bổ
sung liên tục vào bình lên men, đồng thời cùng lúc đó lấy ra *đồng thể tích
dịch lên men.
> Lên men bản liên tục: trong quá ừình lên men việc rút bớt dịch lên men
và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng không xảy ra liên tục mà định kỳ sau
những khoảng thời gian nhất định.
1.4. TUYỂN CHỌN, CẢI TẠO VÀ BẢO QUẢN GIỐNG XẠ KHUẨN
1.4.1. Tuyển chọn, cải tạo giống xạ khuẩn [1 ],[9],[11]
❖ Mục đích:
Tạo ra các biến chủng để nâng cao khả năng sản xuất KS của các chủng
v s v so với chủng dại hàng chục, tì-ăm lần.
❖ Cơ sở của phương pháp:
- Lựa chọn thường xuyên các chủng vsv dùng trong sản xuất nhằm giữ
được các cá thể tốt trong quần thể v s v dễ dàng thích nghi trong điều kiện sản

xuất nhất định (thành phần môi trường lên men, nhiệt độ lên men, pH, điều
kiện khuấy trộn cơ học và cung cấp không khí cho quá trình lên men).
- Gây đột biến nhân tạo và sàng lọc với mục đích để tìm ra các chủng vsv
có hiệu quả cho sản xuất.
- Sử dụng kỹ thuật gen và các phương pháp tái tổ hợp, sử dụng các khả
năng biến nạp, tiếp hợp, tải nạp, lai tế bào chất ở v s v để tạo ra các cá thể
mới theo mục đích sử dụng.
❖ Các phương pháp
> Chọn chủng có hoạt tỉnh cao bằng phép chọn lọc tự nhiên:
Các v s v có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có hoạt tính KS mạnh hơn 10%-20% các cá thể khác.
Cầc phải chọn lọc lấy cá thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp.
Trong thực tế việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có hoạt tính cao chỉ để
nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được
những chủng có khả năng siêu tổng hợp KS người ta áp dụng phương pháp
đột biến nhân tạo.
> Đột biến nhân tạo: Vì tiêu chuẩn chủng có hoạt tính cao chịu ảnh
hưỏfng bởi nhiều gen nên thường phải qua nhiều bước gây đột biến và chọn
giống mới có thể làm tăng hoạt tính một cách đáng kể.
Cho tác dụng của các tác nhân gây đột biến mạnh như tia u v , X hay
những hóa chất: hydroxylamin, nitrit Các tác nhân với liều lượng và thời
gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các vsv. Những cá thể nào nếu còn sống
sót sẽ có sự biến đổi ở nhiễm sắc thể, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc
là mất khả năng tạo ra KS (đột biến âm tính) hoặc là tăng hiệu suất sinh tổng
hợp KS lên nhiều lần (đột biến dương tính).
Đột biến bằng ánh sáng u v thường được sử dụng khá phổ biến trong di
truyền chọn giống vsv, Ánh sáng u v tác dụng chủ yếu lên acid nucleic,
mạnh nhất là vùng 260 nm, dẫn đến hiện tượng dime hóa timin, ở đây 2 timin
gần nhau được liên kết cộng hóa trị với nhau ở nguyên tử c số 5 và 6 . Hậu
quả là sao chép bị sai lầm vì ADN-polymerase dễ lắp một nucleotid không

chính xác vào vị trí trên. Do tác dụng của ánh sáng u v trên sợi ADN xuất
hiện một dime pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4, ở đây C- 6 của
pyrimidin 5’(T hoặc C) được liên kết với C-4 của pyrimidin 3’ (thường là C).
Sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu gây nên đột biến bởi ánh sáng uv .
Các yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng gây chết và tần số phát sinh đột biến:
- Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 tham số là thời gian chiếu, khoảng
cách chiếu và độ pha loãng bào tử. Thường thì đột biến dương sẽ xuất hiện ở
những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0 ,1 %-1 %, còn đột biến âm sẽ
xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hon,
- Ánh sáng thưòmg: Sau khi đột biến bằng ánh sáng tử ngoại, nếu đem chiếu
ánh sáng thưÒTig ( \ = 320-480 nm) trở lại tìiì sẽ có khoảng 50%-80% tế bào
được phục hồi do tác dụng của men photolyase. Hiện tượng này gọi là quang
phục hoạt.
- Các yếu tố khác: Ngoài các yếu tố trên thì nhiệt độ, pH, thành phần mô
trưcmg, trạng thái sinh lý của v s v đem đột biến cũng ảnh hưởng đến hiệu quả
chiếu ánh sáng u v .
1.4.2. Bảo quản giống xạ khuẩn [9]
Mục đích: Giữ cho vsv có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền
không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vsv lạ.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp giữ giống vsv. Tùy theo các trang
thiết bị và loại vsv cần giữ mà chúng ta có thể phương pháp nào.
Đối với giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, đon giản nhất có thể sử
dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng trong tủ lạnh.
1.5. CHIẾT TÁCH, TINH CHẾ KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN MEN
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp do đó kết thúc quá trình lên men
KS có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men đồng thời có thể có
nhiều thành phần KS và các tạp chất khác, vì vậy phải chiết tách để thu lấy
KS tinh khiết.
1.5.1. Chiết xuất [1],[2]
Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp)

để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa 2 pha không hòa lẫn được
vào nhau.
Tùy theo chất KS và bản chất hóa học của nó mà ta có thể chọn các
phương pháp chiết xuất và tinh chế thích hợp, có thể chiết bằng dung môi hữu
cơ, bằng trao đổi ionid hoặc bằng phương pháp kết tủa.
1.5.2. Tách sản phẩm [2]
Tách là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ
hỗn hợp tạp đến những hỗn họp đơn giản và hỗn hợp đơn giản tách
riêng từng chất.
Phương pháp tách hỗn hợp thường dmig nhất là phương pháp chuyển pha:
Đe chuyển một chất hay hỗn họp chất từ pha này sang pha khác, người ta
thưòng dùng một dung môi thích hợp. Trong nhóm này có các phưoTig pháp:
chiết, thẩm thấu và các phương pháp sắc ký.
Sắc ký là nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của
một hỗn hợp. Sự tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất
khác nhau vào 2 pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh,
một pha động. Qúa trình tách sắc ký thưòng gồm ba giai đoạn: đưa hỗn hợp
lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và phát hiện các chất.
Sắc ký lóp mỏng dùng để tìm điều kiện tối ưu cho sự tách bằng sắc ký
lỏng trên cột. SKLM có thể tiến hành nhanh chóng và ít tốn kém các thí
nghiệm thăm dò cho sắc ký cột.
SKLM thường được tiến hành trên một bản kim loại hay ứiuỷ tinh có rải
một lớp mỏng dính chắc của các hạt bột mịn. Lớp mỏng này thưcmg được
dùng làm pha tĩnh. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do
tác động của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thế.
1.5.3. Tinh chế [2].
Áp dụng quá trình tách bằng sắc ký cột để tinh chế, thu KS tinh khiết cho
các nghiên cứu tiếp theo.
Sắc ký cột là sắc ký trong đó chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha tĩnh

được nhồi ữong ống hình trụ gọi là cột, nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi
liên tục với nhiều hệ dumg môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.
Cột sắc ký :Là những ống hình trụ bằng ứiủy tinh dài 30-70 cm, đường
kính 1-5 cm, đầu dưới có vòi và một khóa điều chỉnh tốc độ.
Hóa chất nhồi cột: Có thể là cellulose, gel của acid silic không hoạt hóa,
oxit nhôm, silicagel, CaCOa Các chất dùng cho sắc ký cột đều phải được
chuẩn hóa để việc sử dụng được dễ dàng thuận lợi.
Dung môi: Các hệ dung môi dùng cho SKLM đều có thể dùng cho sắc ký
cột: Clorofom, aceton, n-butanol
1.6. MỘT SỐ NGHIÊN c ứ u MỚI TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
1.6.1. FR207944, một kháng sinh chống nấm từ Chaetomỉum sp. No. 217 .
Sự phân lập và làm rõ cấu trúc [13],[14],[15]
Các tác giả đã phát hiện ra hoạt chất FR 20794 tạo ra bởi Chaetomium
sp. No. 217 trong khi sàng lọc những kháng sinh chống nấm từ những sản
phẩm tự nhiên. RF207944 giống hệt với fuscoatroside là một chất chống
Aspergỉlus ýỉavus. Có mối liên hệ hóa học lập thể giữa FR207944
với WF11605 (16-Oxo-RF207944) trên cơ sở phân tích nhiễu xạ rơnghen tinh
thể đơn.
Môi trưcmg nuôi cấy lỏng (160 lít) được chiết cùng với hỗn hợp 80 lít
aceton và 80 lít methanol được khuấy trộn trong 2 giờ tại nhiệt độ phòng. Hỗn
hợp cuối cùng được lọc nhờ sự hỗ trợ của đất lọc. Dịch lọc được cho qua một
cột ( 6 lít) SEPABEADS SP-207. Cột được rửa cùng với 50% methanol
nước, sau đó phản hấp phụ với methanol (30 lít). Phần hoạt động được cô đặc
dưới áp suất giảm thu được tinh thể thô. Tinh thể thô được hòa tan, lọc, sấy
khô trong một lượng nhỏ tetrahydrofuran và được kết tinh từ methanol. Tinh
thể được lọc và sấy khô tìiu 10,28 gam chất FR207944 tinh thể hình kim
không màu, ( [ a fĩ,= -22^ ; pyridine, c 0.5). Điểm nóng chảy là 250^c. Phổ
ESI - MS của FR207944 cho thấy phân tử lượng Pseudoion ([M+H]^ là 679.
Sử dụng sự phân tích nguyên tố và phân tích phổ NMR, công thức
phân tử của RF207944 được xác định là CagHôiOio.

1.6.2. Ảnh hưởng của các tác nhân gây thoái biến acid clavunalic trong
lên men có bổ sung chủng Streptomyces clavulỉgerus [16],[17]
Acid clavunalic là một kháng sinh quan trọng thuộc nhóm ức chế |3 -
lactamase, chiết từ môi trường nuôi cấy Streptomyces clavulỉgerus. Acid
clavimalic là một kháng sinh không bền và sự thoái biến sản phẩm đư ợc(& ^
ra trong nghiên cứu này là do sự tác động của nhiều yếu tố trong quá trình lên
men có bổ sung chủng Streptomyces clavulỉgerus.
Johannes và cộng sự đã tiến hành 3 dãy thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng
của các tác nhân gây thoái biến acid clavunalic trong điều kiện lên men có bổ
sung:
Thí nghiệm 1: Anh hưỏmg của thành phần môi trường đơn lẻ đến tốc độ
thoái biến.
Thí nghiệm 2: Quá trình thoái biến được tìieo dõi ở pha tăng trưởng khi
nuôi cấy chủng Streptomyces clavuỉigerus.
Thí nghiệm 3: Tốc độ thoái biến acid clavunalic trong dịch lên men.
Qua các thí nghiệm đã nhận thấy rằng:
- Nồng độ amoni, glycerin cao là nguyên nhân chính gây tăng hệ số tốc
độ thoái biến (kd). Trong khi đó nồng độ magie cao sẽ làm giảm hệ số tốc độ
thoái biến, tuy nhiên nó ảnh hưởng đến sự tạo thành sinh khối và quá trình
tinh chế sau này.
- Trong lên men có bổ sung hệ số tốc độ thoái biến tăng một phần do
phản ứng enzym hoặc do enzym xúc tác.
- Nhiệt độ càng cao thì khả năng thoái biến acid clavunalic càng tăng.
Vì vậy quá trình thoái biến acid clavunalic là một khía cạnh quan trọng
không thể không chú ý khi thực hiện tối ưu hóa trong giai đoạn lên men có bổ
sung tạo sản phẩm có hoạt tính kháng sinh cao.
PHẦN 2 - THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM
2.1.1. Nguyên vật liệu
❖ Giống xạ khuẩn:

Chủng xạ khuẩn Streptomyces 16.34 đã được phân lập và tuyển chọn do
bộ môn Vi sinh và Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
❖ Giống vsvkiểm định:
Giống v s v kiểm định do bộ môn Vi Sinh và Sinh học, TmÒTig Đại Học
Dược Hà Nội cung cấp.
Vi khuẩn Gr(-): Vi khuẩn Gr(+):
- E. coli. - s. aureus.
- p. mirabilis. - B. pumilus.
- s. flexneri. - B. subtỉlỉs.
- s. typhỉ. - B. cereus.
- p. aeruginosa. - s. lutea.
Vi nấm kiểm định: c. albỉcans, mốc đen A. niger, mốc xanh spl.
❖ Môi trường: Các môi trưcmg này được tiệt trùng bằng hơi nước ở
latm/ 30 phút.
^ Các môi trường nuôi cấy vsvkiểm định: (bảng 1).
Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy v s v kiểm định
^\T h ành phần
NaCl
(%)
Cao thịt
(%)
Pepton
(%)
Thạch
(%)
pH
Canh thang
0,5 0,3 0,5
—
7,0-7,4

Thạch thưcmg
0,5
0,3 0,5 1 ,6 - 1 , 8
Các môi ừ-ường nuôi cấy vi nấm kiểm định: (bảng 2).
Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy vi nấm kiểm định
^ ^ T h à n h phần
Glucoza
(%)
Pepton
(%)
Nước
(%)
pH
Sabouraud lỏng
2 , 0 1 , 0
Vừa đủ
6,5
Sabouraud đặc
2 , 0
1 , 0
Vừa đủ
Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: (bảng 3).
Bảng 3: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/lOOml)
Thành phân
MTl
MT3 MT4
Tinh bột 2
Lactoza
3
Glucoza 2

Cao ngô
0,5
0,5
KNO3
0 , 1
NH4NO3
0 , 2 0 , 2
CâC0 3
0,3 0,4
FeS0 4 .7 H2 Ơ 0 , 0 0 1
KH2 PO4
0,05
0 , 1
0,05
MgS04.7H20 0,05 0,25 0,15
NaCl
0,05
Thạch 1 , 8 2 2
Nước 1 0 0 1 0 0 1 0 0
pH
7,0 -7,2
7,0 -7,2 7,0 -7,2
Các môi trường lên men: Có thành phần tưong ứng môi trường
nuôi cấy xạ khuẩn nhưng bỏ thạch.
❖ Dụng cụ, hóa chất
^ Các dung môi đã sử dụng:
Bảng 4: Các dung môi hữu cơ đã sử dụng
Dung môi
Khối lượng riêng
[g/cm^]

Nhiệt độ sôi [V]
Methanol
0,791-0,793 64,5
NH4 OH 25%
0 , 8 8
Ethanol
0.789-0,791
78,3
Dimetylformamid
0,95
153
n- butanol
1,470- 1,48
117
Aceton
0,79 56
Butylacetat
0,880-0,885 118
Triethylamin
0,726-0,728
90
Vật liệu dùng trong sắc kỷ:
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck.
- Hạt Silicagel 60 F245, Merck, cỡ hạt 0,063 - 0,2 mm.
- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi dùng trong bảng 4.
- Bình chạy sắc ký, buret 25ml, mao quản.
Mảy móc, thiết bị, dụng cụ:
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Hic LAVE HVE- 25, hình P.IO (PL)
- Tủ cấy Sanyo Clean Bench.
- Tủ sấy SHALLAB MODEL - 1350 FX.

- Tủ ấm Trung Quốc, Binder, Memmert.
(^^Cạc^ỳ thuật Precisa Bj 210C, Sartorius TE 212 , cân phân tích
Srtoius Bp 121 s.
- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng u v (\= 245 nm) nguồn phát
Toshiba 60 w, điện thế 220 V.
- Máy lắc Taitec Bio- Shaker BR 300 LF, hình P.9 (PL).
- Máy cất quay Buchi WeterBath B480 (Bộ môn công nghiệp dược -
Trưcmg ĐH Dược Hà Nội).
- Thước kẹp Panmer có độ chính xác 0,02 mm.
- Pipet các loại, ống đong, cốc có mỏ, hộp Petri
2.1.2 Các phương pháp thực nghiệm:
❖ Phương pháp nuôi cấy và giữ giống:
Giống Streptomyces 16.34 được cấy trên ống thạch nghiêng MT3, ủ cho
phát triển ở 30°c, trong 7-10 ngày. Giống Streptomyces 16.34 sau khi phát
triển được cất giữ trong tủ lạnh 2- 4®c, định kỳ 3- 6 tháng cấy truyền.
❖ Đảnh giá hoạt tính kháng sinh bằng phưong pháp khuy ếch tản:
Nguyên tắc : Mầu thử đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v kiểm
định.KS từ mẫu thử sẽ khuyếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát
triển của v s v kiểm định tạo ứiành vòng vô khuẩn,
Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường cấy v s v kiểm định:
v s v kiểm định được cấy vào môi trường thích hợp (canh thang cho vi
khuẩn và ^ a ^ u ru ^ ^ h o nấm men), rồi ủ ở nhiệt độ thích hợp (37°c cho vi
khuẩn, 28 - 30®c cho nấm men) trong 1 8-24 giờ (hỗn dịch bào tử nấm mốc
được chuẩn bị trong dung dịch tween 80 2 0 % ), sẽ được hỗn dich v s v có
nồng độ từ 1 0 ^-1 0 ^ tế bào/ ml.
Cấy hỗn dịch này vào môi trường kiểm định đã tiệt trùng và để nguội ở
45-50®C lắc tròn đều, rồi đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/ đĩa.
- Đưa mẫu thử vào đĩa Petri chứa môi trưcmg đã cấy vsv kiểm định trên
theo sơ đồ định sẵn.Có 3 cách:

+ Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch đưòng kính 6,0 mm có chứa
vsv sinh tổng hợp KS lên bề mặt môi trường đã cấy vsv kiểm định,
+ Phưong pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc đưcmg kính 6,0 mm
vô trùng đã được tẩm dịch chiết dung dịch của mẫu thử, sấy khô ở t®c <50^c,
sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy vsv kiểm định.
+ Phưorng pháp giếng thạch: Đục các giếng (đường kính 6,0 mm) trên
môi trưòng đã cấy v s v kiểm định, sau đó nhỏ mẫu thử vào, mỗi giếng nhỏ
0,05 ml
- Nuôi cấy: Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích
hợp (t®c = 37®c đối với vi khuẩn, 28® c - 30®c cho nấm men, nấm mốc),
trong 18 - 20 giờ cho vi khuẩn và nấm men, 48 giờ cho nấm mốc.
- Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp^ m è r ^
có độ chính xác 0,02 mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đưcmg kính vòng
vô khuẩn (vô nấm), xử lý theo công thức:
ẺA %iD-Df
D = m

s

n \ n -\
D: đường kính trung bình vòng vô khuẩn (vô nấm),
Dj :Đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) thứ i,
s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
n :SỐ thí nghiệm làm song song ( nếu không xác định khác đi thì số thí
nghiệm song song ở đây là 3).
❖ Phương pháp cải tạo giống VSV:
> Chọn lọc tự nhiên:
- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 16.34
cho vào ống nghiệm chứa 1 0 ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán