Nghiên cứu xây dựng phương pháp đinh lượng rosiglitazone trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

B ộ Y TÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
******* H« ** *
NGUYÊN XUÂN THÀNH
NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ROSIGLITAZONE TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ược SỸ ĐẠI HỌC KHÓA 2 0 0 2 - 2007)
Người hướng dẫn: Th.s. Nguyễn Lâm Hồng
T.s Phùng Thị Vinh
Nai thưc hiên: Trung tâm đánh giá tương đương sinh học -
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Thời gian thưc hiên: Từ tháng 3/2007 đến tháng 5/2007
HÀ NÔI 5/2007
LỜI CẢM ƠN
Sau hơn ba tháng thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm
hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết 0 fn của mình
với những người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian qua.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới T.s Phùng Thị
Vinh - Giám đốc Trung tâm đánh giá tương đương sinh học - Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung ương , Thạc sỹ Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên bộ môn
Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã trực tiếp hưómg
dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xm chân thành cảm 0 fn Thạc sỹ Tạ Mạnh Hùng, Dược sỹ Trần Hoàng
cùng toàn thể cán bộ Trung tâm đánh giá tưong đương sinh học - Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung ương đã tận tình ehỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm om đến các thầy cô giáo, các cán bộ trong toàn
trường đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong quá tìình học tập tại trường.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới toàn thể bạn bè, đồng

nghiệp và những người thân đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình
học tập và làm khóa luận tốt nghiệp.
Một lần nữa tôi xin chân thành cám ơn.
Hà nội ngày 19 tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Nguyễn Xuân Thành
RGZ
PRP
EtOH
MeOH
MeCN
IS
SKD
HPLC
LLOQ
ULOQ
LQC
MQC
QC
HQC
RSD
SD
TB
CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIET TẮT
Rosiglitazone
Propylparaben
Ethanol
Methanol
Acetonitril
Nội chuẩn ( Internal Standard)

Sinh khả dụng
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid
Chromatography )
Giới hạn định lượng dưới ( Lower Limit of
Quantification)
Giới hạn định lượng frên ( Upper Limit of
Quantification )
Mau kiểm chứng nồng độ thấp ( Low Quality Control
sample )
Mau kiểm chứng nồng độ trung bình ( Middle Quality
Control sample)
Mau kiểm chứng ( Quality Control Sample )
sample )
Mầu kiểm chứng nồng độ cao ( High Quality Control
Độ lệch chuẩn tương đối ( Relative Standard
Deviation )
Độ lệch chuẩn (Standard Deviation )
Trung bình
Danh mục các hình
Hình Nội dung Trang
1.1 Sơ đồ cẩu tạo chung cho mảy SK lỏng hiệu năng cao 6
2.1 Sơ đồ các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết 24
lỏng-lỏng
2 . 2 sẳc kỷ đồ mẫu chuẩn xử lýbằngCH2CỈ2 24
2.3 sẳc kỷ đồ mẫu chuẩn xử lý bằng hỗn hợp 24
CH¿l2:(C2Hs)20 tỷ lệ 3:7 (v/v)
2.4 Sắc đồ khảo sát phổ phát xạ 25
2.5 Sắc đồ khảo sát phổ kích thích 25
2 . 6 sẳc kỷ đồ dung dịch nội chuẩn trong pha động 26
2.7 7 sẳc kỷ đồ mẫu huyết tương trắng 29

2.8 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có nội chuẩn PRP 29
(ÍR~ 7,5 phút¿
2.9 Sắc kỷ đồ mẫu chuẩn(ÍR~ 9,5phút, nồng độ 29
800ng/mL)
2.10 Đường chuẩn biểu thị mổi tương quan giữa tỷ lệ diện 31
tích pic RGZ/PRP và nồng độ RGZ trong huyết
tương.
Danh mục các bảng
Bảng Nội Dung Trang
1.1 Một số cồng trình định lượng Rosiglitazone 13
bấngHPLC
2.1 Kết quả xác định độ phù hợp của hệ thống sắc ký 28
2.2 Sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn/nội 30
chuẩn và nồng độ RGZ chuẩn pha trong
huyết tương
2.3 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới 32
2.4 Kết quả xác định độ đủng, độ lặp lại trong ngày 33
2.5 Kết quả xác định độ đủng, độ lặp lại khác ngày 34
2.6 Kết quả xác định hiệu xuất chiết nội chuẩn 35
2.7 Kết quả xác định hiệu xuất chiết RGZ 35
2.8 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu sau 3 chu 36
kỳ đông-rã đông
2.9 Xác định độ ổn định trong quá trình xử lỷ mẫu 37
2.10 Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 38
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐẺ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về Ròsỉglỉtazone 3
1.1.1. Công thức hóa học 3
1.1.2. Tên khoa học 3

1.1.3. Tính chất 3
1.1.4. Đặc điểm dược học 3
1.1.5. Chỉ định điều trị 4
1.1.6 . Liều dùng và cách dùng của RGZ 4
1.1.7. Chống chỉ định 4
1.1.8. Định lượng RGZ ừong dịch sinh học 5
1.2. Tổng quan về HPLC 5
1.2.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 5
1.2.2. Phân loại sắc ký lỏng hiệu năng cao 6
1.2.3. Một số thông số đặc trưng cho HPLC 7
1.2.4. Một số phương pháp định lượng bằng HPLC 10
1.3. Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học 14
1.3.1. khái niệm 14
1.3.2. Nội dung thẩm định phưomg pháp 14
PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16
2.1. Điều kiện thực nghiệm, nội dung và phương pháp nghiên cứu 16
2.1.1. Điều kiện thực nghiệm 16
2.1.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 17
2.1.4. Phương pháp xử lý số liệu 22
2.2. Kết quả nghiên cứu và nhận xét 22
2.2.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng 22
2.2.2 .Thẩm định phương pháp phân tích 2 8
2.3. Bàn luận 38
PHẨN 3: KÉT LUẬN VÀ ĐẺ XUẤT 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐÈ
Hiện nay, nền công nghiệp dược phẩm nước ta đang có những bước phát
triển rất mạnh mẽ. Với cùng một dược chất, các nhà sản xuất đã nghiên cứu

và tạo ra cho mình một sản phẩm riêng bằng cách tạo ra dạng bào chế mới, có
thêm thành phần mới, hàm lượng mới và xuất hiện trên thị trường với một
biệt dược mới. Do đó, trên thị trường dược phẩm Việt Nam đang lưu hành
nhiều chế phẩm thuốc cùng tác dụng điều trị nhưng giá thành và chất lượng
rất khác nhau đã gây khó khăn cho bác sĩ cũng như người sử dụng trong việc
lựa chọn thuốc. Qui định về đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đưomg
sinh học (TĐSH) là cần thiết để đưa ra thị trường những chế phẩm TĐSH có
thể dùng thay thế nhau ữong điều trị lâm sàng nhằm giúp các cơ quan quản lí
lựa chọn những chế phẩm thuốc đạt chất lượng, hiệu quả và an toàn trong
điều trị. Bên cạnh đó, buộc các nhà sản xuất phải không ngừng nâng cao chất
lượng sản phẩm, uy tín và thương hiệu của mình.
Để tìiực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH, một ừong
những nội dung quan tì-ọng là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý
mẫu và phân tích định lượng thuốc ừong dịch sinh học (máu, huyết tương,
nước tiểu, Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thưòng gặp nhiều
khó khăn do thuốc sau khi vào cơ thể thường bị chuyển hóa thành nhiều dẫn
chất khác, nồng độ thuốc trong mẫu thường rất thấp và có rất nhiều tạp. Chính
vì vậy, theo quy định chung về phân tích thuốc ứong dịch sinh học, phưomg
pháp phân tích phải được thẩm định và đánh giá rất chặt chẽ theo những qui
định riêng để đảm bảo kết quả thử nghiệm đúng và chính xác.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài;
**Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Rosiglỉtaione trong
huyết tương bằng sắc kỷ lỏng hiệu năng cao”
Với các mục tiêu sau:
- Nghiên cứu xây dựng qui trình xử lý và định lượng rosiglitazone trong
huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng, từ đó đề ra quy trình
phân tích thưòmg quy để định lượng rosiglitazone trong huyết tương.
Chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu thu được của đề tài có giá trị thực
tiễn, làm cơ sở ứng dụng tì*ong xác định và đánh giá tương đương sinh học.

PHẦN 1 : TỎNG QUAN
1.1. Tổng quan về Rosỉglitazone (RGZ) :
L L L Công thức hóa học [16; 18]
- Công thức phân tử : C18H19N3O3 S.C4H4 O4
- Khối lượng phân tử : 473,52 (357,44 dạng base)
- Công thức cấu tạo ;
H . "Ịl'
HÒ*
-COOH
COOH
7.7.2. Tên khoa học [16]
(±)-5-[[4-[2-methyl-2-pyrydinylamino) ethoxy] phenyl] methyl] -2,4-
thiazolidinedione, (Z)-2-butenedioate (1:1).
7.7.5. Tính chất [10; 15; 16]
- Là chất rắn có màu trắng đến trắng đục, có nhiệt độ nóng chảy từ
Ì22°c

đến 123°c. Rosiglitazone maleate dễ tan trong ethanol và dung dịch đệm có
p H 2 ,3 .
- Hệ số phân bố dầu/nước của RGZ là logP = 2,1 [], do đó có khả năng
dùng phưcmg pháp chiết lỏng - lỏng bằng dung môi hữu cơ để chiết tách RGZ
ừong dịch sinh học.
- Gía trị pKa của RGZ maleate là 6 , 8 và 6,1.
- RGZ có khả năng phát huỳnh quang tự nhiên (Em= 367nm) khi bị kích
thích dưới bức xạ Ex= 247 nm, vì vậy có thể định lượng RGZ bằng phưomg
pháp HPLC với detector huỳnh quang.
1.1.4. Đặc điểm dược học
a. Dược lầm sàng [7]
Rosiglitazone thuộc nhóm Thiazolidinedione chống đái tháo đường.
Có tác dụng cải thiện kiểm soát đường huyết bằng cách tăng nhạy cảm với

Insulin ữong khi giảm lượng insulin ừong máu.
K Dược động học [15; 16; 17; 18]
RGZ hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, nồng độ tối đa trong huyết tương đạt
được 1 giờ sau khi uống. SKD tuyệt đối của Rosiglitazone là 99%. Thức ăn
không ảnh hưởng tới tổng lượng hấp thu (AUC), tuy nhiên lại làm giảm Cmax
(giảm khoảng 20% đến 28%) và làm chậm Tmax (1.75 giờ). Với liều 4 mg và
8 mg, uống xa bữa ăn, nồng độ đỉnh trong huyết tương trung bình đạt từ 560
và 650 ng/mL. Nồng độ tối đa trong huyết tưomg (Cmax) và diện tích dưới
đưÒTig cong (AUC) của RGZ tăng tỷ lệ với liều dùng cao hơn liều điều ừỊ.
Khoảng 99,8% RGZ liên kết với protein huyết tương, chủ yếu là albumin.
RGZ chuyển hóa rộng rãi và bài tiết qua thận dưới dạng không đổi. Thời gian
bán thải khoảng 3-4 giờ và không phụ thuộc liều dùng.[]
1.1.5. Chỉ định điều trị [10; 16]
- RGZ được dùng như như một đơn trị liệu hỗ trợ cho chế độ ăn và tập thể
dục nhằm cải thiện đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường typ 2 .
- RGZ còn được dùng phối hợp với Metformin (Biệt dược Avandamet), các
Sulfamide hạ đường huyết, insulin khi chế độ ăn, tập thể dục và đơn trị liệu
bằng các thuốc này không có kết quả trong kiểm soát đường huyết thích đáng
ở bệnh nhân tiểu đường typ 2 .
1.1.6. Liều dùng và cách dùng của RGZ [10; 15; 16]
- Liều khởi đầu thường dùng là 4mg, uống 1 lần duy nhất hoặc chia làm 2 lần
mỗi ngày.
- Đối với bệnh nhân đáp ứng kém sau 12 tuần điều trị, có thể tăng liều lên
8 mg uống 1 lần duy nhất hoặc chia làm 2 lần mỗi ngày.
- Có thể uống cùng thức ăn hoặc không.
7.7.7. Chổng chỉ định [10; 16]
- Sử dụng cho bệnh nhân có tiền sử quá mẫn với RGZ.
- Nhiễm toan ceton hay tiền hôn mê ở bệnh nhân tiểu đường.
1.1.8. Định lượng RGZ trong dịch sinh học
Để định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu)

thường sử dụng các phương pháp phân tích hoá lý (điện di mao quản, sắc ký
khí, sắc ký lỏng ). Đối với một số hoạt chất có tác dụng dược lý đặc hiệu có
thể định lượng bằng phương pháp vi sinh (một số chất kháng sinh/Tcháng
khuẩn) hoặc phương pháp miễn dịch đặc hiệu. So với các phương pháp vi
sinh, miễn dịch; phương pháp phân tích hoá lý có phạm vi ứng dụng rộng hơn
và thường cho kết quả ổn định cũng như dễ ưiển khai hơn, trong đó sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được sử dụng ứong nghiên cứu SKD và
TĐSH. Hiện nay phương pháp HPLC cũng đang được áp dụng để định lượng
RGZ trong chế phẩm hay trong dịch sinh học.
1.2. Tổng quan về HPLC: [1; 3; 5]
1.2.1. Khải niệm sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp là kỹ thuật dùng để phân
tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa ữên ái lực khác nhau
giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau -pha
động và pha tĩnh. Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích được
tiêm vào cột sắc ký, chúng sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ
thuộc bản chất hạt nhồi và chất cần phân tích. Khi bơm dung môi pha động
qua cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ di chuyển
qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách của các chất. Các chấi sau
khi đi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được chuyển qua bộ phận
xử lý kết quả [6 ].
Thứ tự và hiệu quả của quá ứình tách được quyết định bởi tổng hợp của 3
lực tirong tác : Chất phân tích
Pha động <

►Phatĩnh
> Sơ đồ nguyên tắc chung cho các mảy SK lỏng hiệu năng cao :[1 ]
Gồm 6 bộ phận chính:
cột sắc ký
HPLC Column

• âsn
dung môi B
Sotveme
SoivẹrtiA
OỊ^Ì
injeciOí
AuwSampler
Sampỉ« Manage»
Chromatoạrarn
PlMMt ■ YMlúMr. f%*d B«J*
Cỡir^t^ ữdta Sị»hm
— vi
s a r
mẫn tiêm
Detector
duĩiẴ môi A
Pumps
Sotwefit Maíiager
Soỉựẹni Defuvefy Syatefn
GRADIENT
Waste
Hệ thống bơm
Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo chung cho máy SK lỏng hiệu năng cao
Trong đó Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và
cho các tín hiệu được ghi ừên sắc đồ. Có nhiều loại detector như detetor hấp
thụ u v , detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay
hơi Trong nghiên cứu khóa luận này chúng tôi sử dụng detector huỳnh
quang dựa vào đặc điểm phát huỳnh quang tự nhiên của RGZ.
1.2.2. Phân loại sắc kỷ lỏng hiệu năng cao [ỉ; 3; 5]
Tùy thuộc vào bản chất các pha, bản chất hiện tượng SK, kỹ thuật và

phương tiện SK mà ta phân ra làm nhiều loại SK khác nhau như SK hấp phụ,
SK phân bố, SK trao đổi ion, .Trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi chỉ
đề cập đến sắc ký phân bố hiệu năng cao - sắc ký phân bố pha liên kết, là kỹ
tìiuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay.
> SK phân bổ pha liên kết [1; 5]
ở đây pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang rắn như SÌO2 , AI2 O3,
Zn0 2 Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxyd (silica), nhóm
OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất
siloxan:
CHs CHs CH3 CH3
-Si-OH + Cl-Si—R
CH3
Be mặt của
silica
CH3
Dan chất
Clorosilan
-Si-0- Si —R
CH3 CH3
Dan chất
siloxan
* Neu R là một nhóm khá phân cực như alkylamin -(CH2 )n NH2 hay
alkylnitril -(CH2 )n- CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc kỷ
phân bố pha thuận,
Trong sắc ký pha thuận các chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên rồi
đến các chất phân cực mạnh hơn. Khi tăng độ phân cực của pha động, thời
gian liru giảm dần.
* Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8 ), octadecy (C18) hay
phenyl và dung môi phân cực như MeOH, MeCN thì có sẳc kỷ phân bổ pha
đảo (ở đây pha tĩnh ít phân cực hom pha động, ữái với truyền thống của sắc ký

trước đây là pha tĩnh phân cực hon pha động).
Trong sắc ký pha đảo các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên rồi
đến các chất ít phân cực và chất không phân cực ra sau. Khi tăng độ phân cực
của pha động, tíiời gian lưu tăng lên.
Hiện nay sác ký phân bố pha đảo được dùng rất rộng rãi vì nó cho kết quả
tách tốt với rất nhiều đối tượng tách.
1.2.3. Một sổ thông sổ đặc trưng cho HPLC [1; 3; 5]
* Thời gian lưu ÍR ( Retention time )
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính tìr lúc tiêm mẫu vào cột đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.Thời gian lưu là đại lượng để phát
hiện định tính các chất.
Trong một phép phân tích; nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu quá lớn
tìiì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích kéo dài.
* Hệ sổ phân bổ K
Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân
bốK: ^
m
(Cs và Cm lần lượt là nồng độ mol của chất tan frong pha tĩnh và pha động).
Ái lực tưomg đối của chất tan với hai pha sẽ lượng giá hệ số K.
- Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm.
- Nếu các chất frong hỗn hợp có hằng số K càng khác nhau nhiều thì khả
năng tách diễn ra càng dễ dàng hom.
* Hệ sổ dung lượng : k' (tỷ sổ phân bổ khối lượng Dm )
Bản chất của quá tìinh sắc ký là sự phân bố chất tan giữa 2 pha, sự phân bố
này được đặc trưng bằng hệ số dung lượng k'.
D „=k' = K . ^ =
Vm Qm
(k' bằng tỷ số giữa lượng chất tan A frong pha tĩnh và ữong pha động)
Trong đó :
K : Hệ số phân bố

Vs, Vm : Thể tích pha tĩnh và thể tích pha động
Qs, Qm : Lượng chất ữong pha động và Lượng chất ừong pha tĩnh
Hệ số dung lượng của một chất thành phần được xác định từ sắc đồ theo
công thức:
ỵ> =. ~^o — Ị
t o t o
to! ( còn gọi là thời gian chết ) là thời gian để pha động ra khỏi cột.
Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém, k' lớn thì pic bị doãng. Trong
thực tế k' từ 1 đến 5 là tối ưu.
* Sổ đĩa lý thuyết ( thể thị hiệu lực của cột sắc ký )
Nếu cột sắc ký có chiều dài là L thì ta có số lý thuyết của cột là:
N
H
( H là chiều cao đĩa lý thuyết)
Nếu N càng cao thì hiệu lực cột càng lớn. Yêu cầu cụ thể về số đĩa lý
thuyết sẽ được quy định trong tìmg phép phân tích. Trong thực tế N nằm
trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.
Số đĩa lý thuyết được tính toán từ số liệu thu được ừong điều kiện đẳng
nhiệt bằng biểu thức;
2 h
hoặc N= 16.
Trong đó : - W i/2h là chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic
- W h là chiều rộng của pic đo ở đáy pic
* Độ chọn lọc a
Để đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng
hệ số chọn lọc a:
a
'B _ "R,B
^R,A
Theo quy ước, ở đây chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên a luôn lớn

hơn 1. Thường chọn a dao động trong khoảng 1,05 + 2. Nếu a lớn quá thì thời
gian phân tích sẽ dài.
* Độ phân giải:
Là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau ừên cùng một điều
kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 2 pic cạnh nhau được tính theo 1 frong 3
công thức sau:
a 1+ẳ; 4
Trong đó:
- ÍRA, ÍRB lần lượt là thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất A và B.
- W a , W b lần lượt là độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B.
- W i/
2
A W i/
2
B là độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A và B.
- a là độ chọn lọc, N là số đĩa Iv thuyết.
1.2.4. Một sổ phương pháp định lượng bằng HPLC: [1; 3; 4; 5]
Tất cả các phưong pháp địnli lưọfng bằng sắc ký đều dựa trên ngiiyên tắc;
Diện tích pic và chiều cao của pic tỷ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích.
♦ Phưms pháp dùns chuẩn nsoai::
- Đây là phưong pháp định lượng cơ bản trong đó cả 2 mẫu thử và chuẩn
đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. So sánh diện tích hay chiều
cao pic của mẫu thử với mẫu chuẩn để tính nồng độ các chất ừong mẫu.
- Có thể sử dụng phưomg pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.
<=> Chuẩn hóa một điểm;
- Chọn nồng độ mẫu thử xấp xỉ nồng độ mẫu chuẩn và tiến hành sắc ký
trên cùng một điều kiện. Nồng độ mẫu thử được tính theo công thức:
c ,= s
Ss
=> Chuẩn hóa nhiều điểm:

- Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần (5-7 nồng độ) rồi tiến
hành sắc ký, ghi đáp ứng pic ở mỗi nồng độ.
-Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa đáp ứng pic với
nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để xác
định nồng độ chất cần xác định (độ lớn diện tích pic của mẫu thử phải nằm
ừong đoạn tuyến tính của đường chuẩn).
* Phươns pháp dùns chuẩn nôi:
- Thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nliaii của một
chất tinh khiết (gọi là nội chuẩn) rồi tiến hành sắc ký trong cùng một điều
kiện.
- Từ những đáp ứng pic thu được của chuẩn, nội chuẩn và mẫii thử có thể
xác định được hàm lirợng thành phần cần định lượng trong raẫii thử một cách
chính xác.
|=> Phương pháp chuẩn hóa 1 điểm:
- Nội chuẩn được thêm vào cả 2 mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký.
- Vi đáp ứng của chất chuẩn và nội chuẩn với detector là không cùng độ nhạy
nên trước hết ta xác định hệ số đáp ứng để hiệu chỉnh trong tính kết quả:
frong đó: Cs; Cis là nồng độ của chất chuẩn, chuẩn nội.
Ss; Sis là diện tích pic chuẩn và chuẩn nội.
- Lượng hay nồng độ của thành phần trong mẫu thử được tính như sau:
C, = C ,s .F x Ạ
'=> Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm;
- Chuẩn bị dãy 5-7 mẫu chuẩn có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả
cùng thêm vào cùng một lượng chất chuẩn nội.
- Tiến hành sắc ký, ghi lại đáp ứng pic của mỗi mẫu. Xây dựng đường chuẩn
thể hiện mối quan hệ giữa tỷ lệ diện tích pic của chuẩn/chuẩn nội với tỷ lệ
nồng độ chuẩn/chuẩn nội.
- Song song tiến hành với mẫu thử có chứa cùng một lượng nội chuẩn tương
tự. Xác định tỷ lệ diện tích pic của chuẩn/nội chuẩn. Dựa vào đường chuẩn để
xác định nồng độ chất thử.

* Phươns pháp thêm chuẩn:
<=> Kỹ thuật thêm 1 điểm:
- Chuẩn bị mẫu thử
- Thêm vào mẫu thử một lượng đã biết của chất chuẩn
- Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng một điều kiện.
- Nồng độ chưa biết Ct của mẫu thử được tính theo công thức:
|=> Kỹ thuật thêm đường chuẩn:
- Chuẩn bị một dãy trong đó nồng độ mẫu thử không thay đổi còn nồng
độ chất chuẩn ngoại tăng dần.
- Xử ký mẫu rồi tiến hành sắc ký -► Dựng đường chuẩn mối tương quan
giữa diện tích pic mẫu tổng với lượng chất chuẩn thêm vào.
<=> Giao điểm của đường chuẩn kéo dài với trục hoành chính là nồng độ cần
xác định.
* Phươns pháp chuẩn hóa diên tích:
Nguvên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất tì*ong hỗn hợp nhiều
tìiành phần được tính bằng tỷ lệ phần ứăm diện tích pic của nó so với tổng
diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc đồ.
% ^ = - ^ x l O O %
n
=> Yêu cầu của phưoTig pháp này là tất cả các ứiành phần đều phải được rửa
giải và được phát hiện bởi Detector với đáp ứng như nhau.
MỘT SỐ CÔNG TRÌNH ĐpH LƯỢNG ROSIGLITAZONE BẢNG HPLC
s
tt
Tài
liệu
Điều kiện sắc 1^
Chất
chuân
nội

Xử lý mẫu
Cột
Pha động
Detector
1
[14]
YMC-Pack
proClS
(150x2.1m
m,5|am)
Đệm Amoni acetat
(0,02M, pH6.5) :
ACN. Tỷ lệ 47:53,
v/v
Tốc độ 0.2mL/phút
MS-MS
Citalopram
( 70 ng/mL)
Chiết lỏng-lỏng
bằng MeCN
Ly tâm 1300
vòng/phút trong
1 0 phút
2 [19]
MAX-RP
(150x4.6m
m,4^m).Nh
iệt độ eột
30°c
Đệm Amoni acetat

(0,0IM, pH 7.0) :
ACN. Tỷ lệ 65:35,
v/v
Tốc độ ImL/phút
(Ex/E„) =
250/390
(3S)-3-
OH-
Quinidin
Chiết SPE bằng
cộtC4
3
[17]
Cột phenyl
(250x4.6m
m,5^m)
Đệm Amoni acetat
(0,0IM, pH 5) :
ACN. Tỷ lệ 60:40,
v/v
Tốc độ ImL/phút
(Ex/E„,)RG
z= 247/367
(Ex/E„,)IS
= 235/310
Betaxolol
Chiêt băng
MeCN
Ly tâm 3000g
trong 10 phút

Bốc hơi dung
môi (45°c, N
2
)
4
[11]
Novapak
C18
(100x5mm,
4nm)
Cột bảo vệ
Guard-pak
C18
Đệm
Amoniacetat(0,01
M, pH 8) -
MeCN,65:35,v/v
(Ex/E„,)RG
z= 247/367 SB-204882
Sử dụng hệ
thống làm giàu
mẫu tự động
(ASTED)
Bans L I : Một sô công tìình định lượng Rosiglitazone băng HPLC
Nhân xét:
- Phương pháp 7: Có độ nhạy cao, LLOQ rất nhỏ 1,0 ng/mL. Quy trình xử
lý mẫu khá đơn giản, tuy nhiên phương pháp phổ khối {mass spectrum) là một
phưomg pháp mới với thiết bị hiện đại và đắt tiền mà hiện nay có rất ít phòng
tìií nghiệm ở Việt Nam có thiết bị này.
- Phương pháp 2\ Được sử dụng để định lượng RGZ trong huyết tưong. Tuy

nhiên, qui trình xử lý mẫu bằng SPE tương đối phức tạp và chi phí cao. Trong
điều kiện các phòng thí nghiệm ở nước ta hiện nay, việc áp dụng phương pháp
này trong thực tế còn gặp nhiều khó khăn do rất ít phòng thí nghiệm có đủ
kinh phí để mua cột chiết, frang thiết bị chiết pha rắn.
- Phương pháp S : Quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng - lỏng, chương trình
chạy sắc ký đơn giản, phương pháp sử dụng detector huỳnh quang cho giới
hạn định lượng 100 - 1000 ng/mL. Tuy vậy, thông tin về phương pháp không
đầy đủ và các phương pháp này cũng mới chỉ thẩm định một vài chỉ tiêu chưa
đáp ứng qui định của FDA.
- Phương pháp 4: Giá trị LOD của phưong pháp khoảng 3-100 ng/mL
chứng tỏ phưong pháp có độ nhạy rất cao, nhưng xử lý mẫu sử dụng thiết bị
ASTED ( hệ thống làm giàu mẫu tự động) không phù hợp với điều kiện kỹ
thuật phòng thí nghiệm ở nước ta.
Trên cơ sở tham khảo các phương pháp định lượng đã được công bố,
chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng RGZ trong huyết tương
với detector huỳnh quang có độ đúng, độ chính xác, phù hợp ừong nghiên
cứu đánh giá SKD và TĐSH, đồng thời phù hợp với điều kiện trang thiết bị và
khả năng kinh phí của nhiều phòng thí nghiệm trong cả nước.
1.3. Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học
L3.1. Khái niệm [2; 6]
Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học là
quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm
đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các
ứng dụng phân tích thực tế. Hay thẩm định một phương pháp phân tích dược
chất trong dịch sinh học là một quá trình nhằm chứng minh rằng phương pháp
phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu
được khảo sát.
1.3.2. Nội dung thẩm định phương pháp [2; 3; 6; 9; 12; 13; 21]
a. Tỉnh chọn lọc - đặc hiệu (Selectivity - Specificity):
Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng

chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác, có thể là tạp chất, hoặc các
thành phần cản frở khác.
Nói cách khác tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có
khả năng nhận diện chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất
khác. Do vậy kết quả thu được trên sắc đồ, (tìr mẫu trắng, mẫu thử và mẫu
chuẩn pha trong mẫu trắng), pic của chất cần phân tích phân tách hoàn toàn
với các pic tạp.
b. Xây dựng đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tỉnh (Linearity):
Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic và
nồng độ thuốc trong dịch sinh học.
Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được
từ phương pháp phân tích hồi quy.
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ tìr thấp nhất đến cao nhất trong một
đưcmg chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đưòng chuẩn phải có ít nhất 5 nồng độ
của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học. Khoảng tuyến tính
phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu cần phân tích.
c. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):
Mầu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là
LLOQ nếu thỏa mãn:
- Đáp ứng ở nồng độ này phải > 5 lần đáp ứng của mẫu ừắng.
- Pic của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm tách riêng và có thể tái
lập với độ đúng từ 80-120%
d. Độ đủng (Accuracy) :
Độ đúng của một phương pháp phân tích là giá trị phản ánh độ gần sát của
kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết.
Hầu hết các phép đo trong phân tích về bản chất đều mang tính tương đối,
có nghĩa là kết quả thu được đều dựa vào việc so sánh đáp ứng của mẫu thử
so với chất chuẩn tin cậy.
e. Độ chính xác (Precision):
Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa

các kết quả riêng biệt khi qui ừình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều
lần ừên cùng một mẫu đồng nhất. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch
chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tưong đối (RSD).
f.ĐỘ ổn định của chất phân tích (Stability of the samples):
Để đánh giá độ ổn định, người ta so sánh kết quả phân tích mẫu bảo quản
với các mẫu mới chuẩn bị. Kết quả so sánh được đánh giá theo thống kê dựa
frên độ tin cậy áp dụng trong đánh giá sinh học.
Độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học gồm
+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông - rã đông.
+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử
sau khi đã chiết tách.
+ Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong thời gian dự
định.
PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Điều kiện thực nghiệm, nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.7.7. Điều kiện thực nghiệm
a.Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
- Chất chuẩn và nội chuẩn:
+ Rosiglitazone maleat - Viện Kiểm nghiệm thuốc TW; hàm lượng: 98%
(nguyên trạng), số lô: 20051108
+ Propylparaben - Viện Kiểm nghiệm thuốc TW; hàm lượng 99.7%, độ ẩm
0.9%.
- Dung môi, hóa chất:
+ NaOH, Naứi acetat, acid acetic, đạt tiêu chuẩn PA.
+ MeOH, MeCN, dicloromethan, diethylether loại tinh khiết HPLC dùng
trong chiết tách và khai triển sắc ký
- Huyết tưoTig frắng: Viện huyết học và truyền máu TW, Chọn các lô huyết
tương không có nhiều pic lạ rải rác ừong khoảng thời gian 4-10 phút.
b. Dụng cụ, thiết bị
Tất cả các dụng cụ, thiết bị đều được chuẩn hóa theo ISO/IEC 17025 -

2005 và GLP bao gồm :
+ Máy HPLC - SHIMADRU: Bơm LC-20AT, Detector Model RF
lOAXL, tiêm mẫu tự động (Autosampler) SIL20AC, buồng ổn nhiệt cột
(Oven) CTO-20A và bộ phận kết nối CBM-20A.
+ Cân phân tích Sartorius CP 224 (d = 0,lmg, e = 0,lmg).
+ Cân kỹ thuật Sartorius E412 ( d = 0,01g).
+ Máy ly tâm lạnh Saitorius Sigma 2 - 16K.
+ Bơm hút chân không Sartorius.
+ Máy lắc xoáy Vortor genie 2.
+ Tủ lạnh sâu (- 40°C), Sanyo MDF - 236.
+ Micropipet eppendord 1-10 \i\, 10 - lOO^il, 100 - lOOỌ
+ Bình định mức, ống đong, pipet định mức và các dụng cụ phân tích
khác.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng phương pháp định lượng rosiglitazone trong huyết tương bằng
HPLC:
- Qui ừình chiết tách RGZ; Khảo sát trên các mẫu tự tạo để lựa chọn
phương pháp xử lý mẫu thích hợp dựa ừên các nguyên lý chiết.
- Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo
phân tách RGZ khỏi thành phần tạp trong huyết tương, cho phép xác định
lượng lượng RGZ có ứong mẫu với độ chính xác thích hợp.
- Thẩm định phưomg pháp phân tích về các chỉ tiêu: tính đặc hiệu - chọn
lọc, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng, hiệu xuất chiết, độ ổn định
của RGZ trong huyết tương.
2.7.5. Phương pháp nghiên cứu
❖ Chuẩn bi mẫu:
> Mấu chuẩn:
+ Pha dung dịch chuẩn gốc: nồng độ chính xác khoảng 1,0 mg RGZ/mL
MeOH.
+ Pha dung dịch chuẩn làm việc (20ng/mL); lấy 1,0 mL dung dịch chuẩn

gốc,bốc hơi dung môi (40°c, khí N2). Hòa tan cắn trong 5,0 mL huyết tương
trắng.
-► Mầu chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tưong trắng để
thu được các mẫu chuẩn có nồng độ RGZ từ 1 / 2 0 hoặc 1/30 Cmax đến 2 -3 lần
Cmax-
> Mau trắng: Huyết tương trắng không chứa RGZ.
> Mau kiểm chứng (QC);
+ Được chuẩn bị tương tự mẫu chuẩn nhưng từ dung dịch chuẩn gốc độc
lập với dung dịch chuẩn gốc để pha mẫu chuẩn.
+ Gồm 3 loại mẫu QC: Mẩu LQC có nồng độ bằng 3 lần nồng độ mẫu
LLOQ; mẫu MQC có nồng độ bằng 50-80% nồng độ Cmax và mẫu LQC có
nồng độ bằng khoảng 60-80% nồng độ mẫu ULOQ.
A. Xầy dựng quy trình chiết RGZ
Khảo sát chiết RGZ bằng một số phương pháp:
* Phương pháp chiết pha rắn (Rẳn-lỏng):
Lựa chọn cột pha rắn thích hợp và dung môi rửa giải, dung môi loại tạp
phù hợp để áp dụng vào quy trình chiết RGZ gồm các bước: Hoạt hóa cột
chuyển mẫu lên cột làm khô rửa giải -♦ thu dịch chiết dung môi bốc
hơi dung môi thu cắn.
* Phương pháp loại tủa protein:
Tủa protein với các tác nhân gây tủa là acid (perdone, ứicloracetic,
trifluoracetic) hoặc dung môi (MeOH, MeCN).
* Phương pháp chiết lỏng - lỏng:
Lựa chọn dung môi hữu cơ tìiích hợp dựa vào cân bằng nước - dung môi
hữu cơ không tan ữong nước để tách RGZ ra khỏi huyết tương (hệ số phân bố
dầu nước của RGZ là logP = 2,1).
> Dựa vào các tài liệu tham khảo để khảo sát phương pháp xử lý mẫu,
chiết tách RGZ từ huyết tương frén các mẫu: mẫu chuẩn RGZ hòa tan trong
pha động, mẫu huyết tương tráng và các mẫu chuẩn RGZ hòa tan ừong các
HT trắng có nồng độ sấp xỉ Cmax.

B. Xác định điều kiện sẳc kỷ:
Khảo sát bước sóng bức xạ kích thích và bức xạ phát xạ
- Têm mẫu là dung dịch RGZ/pha động có nồng độ = 100 ng/iĩiL vào ống
củầ detector huỳnh quang.
- Cố định bước sóng kích thích ở 247 nm, quét bước sóng phát xạ.
- Cố định bước sóng phát xạ ở 367 nm , quét bước sóng kích thích.
<=> Từ kết quả quét chọn ra bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ.
Khảo sát điều kiện sắc ký:
Tiến hành khảo sát ữên hệ thống sắc ký SHIMADRU với các điều kiện
sắc ký khác nhau như;
+ Cột pha đảo C18 của các hãng khác nhau.
+ Thành phần tỷ lệ của pha động khác nhau.
+ Tốc độ bơm, thể tích tiêm.
+ Lựa chọn chất thích hợp làm nội chuẩn,
c. Thẩm định phương pháp
Tiến hành thẩm định frên các mẫu frắng, mẫu chuẩn và mẫu kiểm chứng.
Các chỉ tiêu thẩm định gồm:
* Tỉnh đặc hiệu - chọn lọc
- Xử lý mẫu theo qui trình đã được lựa chọn. Tiến hành sắc ký các mẫu
mẫu trắng; mẫu trắng có nội chuẩn ; mẫu chuẩn và các mẫu thử. Ghi lại các
sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí ứng với thời gian lưu của hoạt chất và
nội chuẩn.
Yêu cầu:
> Phải đảm bảo có khả năng nhận diện, phân biệt được RGZ và không bị ảnh
hưởng bởi các tạp chất có trong mẫu.
> Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của RGZ phải
không vượt quá 2 0 % đáp ứng của mẫu chuẩn.
> Đáp ứng của mẫu ữắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của nội chuẩn
phải không được vượt quá 5% đáp ứng của nội chuẩn.
* Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

- Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn RGZ ữong huyết tương có nồng độ
tương ứng từ 1 / 2 0 hoặc 1/30 Cmaxtới 2 - 3 lần nồng độ Cmax.
- Từ đáp ứng pic của RGZ và IS tại các nồng độ tương ứng, xây dựng
đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa tỷ lệ đáp ứng pic của RGZ/IS và
nồng độ RGZ có frong mẫu.
Yêu cầu:
> Đưòmg chuẩn phải có hệ số tương quan > 0,98 và ít nhất 75% số điểm của
đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ
cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng điểm
tíiấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 2 0 %.
* Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
- Tiến hành sắc ký các mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ 1/10 - 1/30
nồng Cmax (khoảng 2 0 - 60 ng/mL huyết tương). Ghi lại đáp ứng pic của mẫu
trắng và mẫu chuẩn.
Nồng độ được coi là giới hạn định lượng dưới của phương pháp nếu:
> Nồng độ đó cho pic RGZ tách biệt với các pic tạp, có độ đúng từ 80% -
120 %.
> Độ lặp lại với giá trị RSD < 20% và đáp ứng pic RGZ > 5 lần đáp ứng của
mẫu trắng tại thời điểm đó.
* Độ đủng
Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lô
mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập có cùng nồng độ.
Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn pha trong
huyết tưomg trắng, tiến hành trong cùng điều kiện.
=> So sánh giá trị trung bình của các lần định lượng của mỗi nồng độ với
giá trị thực có trong mẫu. Độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải
nằm trong khoảng từ 85% đến 115%.
* Độ lặp lại
- Độ lặp lại trong ngày: Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa
giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một

ngày. Giá trị RSD phải < 15%.
- Độ lặp lại giữa các ngày: Tiến hành tương tự như xác định độ lặp lại
trong ngày, sắc ký các mẫu QC. Tính giá trị RSD của kết quả định lượng cho