Các phương pháp định lượng vi sinh vật trong hệ sinh thái

Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

mở đầu
Vi sinh vật bao gồm tất cả các sinh vật có kích thớc hiển vi, không thấy rõ đợc bằng mắt thờng m phải sử dụng kính hiển vi thờng hoặc kính hiển vi điện tử
để quan sát.
Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất,
trên núi cao, dới biển sâu, trên cơ thể, ngời, động vật, thực vật, trong thực phẩm,
trên mọi đồ vật...
Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh-địahoá học (biogeochemical cycles) nh vòng tuần hoàn C, vòng tuần hoàn n, vòng
tuần hoàn P, vòng tuần hoàn S, vòng tuần hoàn Fe...
Trong nớc, vi sinh vật có nhiều ở vùng duyên hải, vùng nớc nông và ngay cả ở
vùng nớc sâu, vùng đáy ao hồ.
Trong không khí, càng lên cao số lợng vi sinh vật càng ít. Số lợng vi sinh vật
trong không khí ở các khu dân c đông đúc cao hơn rất nhiều so với không khí
trên mặt biển và nhất là trong không khí ở Bắc cực, Nam cực...
Hầu nh không có hợp chất carbon nào (trừ kim cơng, đá graphít...) mà không
là thức ăn của những nhóm vi sinh vật nào đó (kể cả dầu mỏ, khí thiên nhiên,
formol. dioxin...). Vi sinh vật có rất phong phú các kiểu dinh dỡng khác nhau :
quang tự dỡng (photoautotrophy), quang dị dỡng (photoheterotrophy), hoá tự dỡng (chemoautotrophy), hoá dị dỡng (chemoheterotrophy).tự dỡng chất sinh trởng (auxoautotroph), dị dỡng chất sinh trởng (auxoheterotroph)...
Chính vì sự phong phú và đa dạng nh vậy nên việc tìm hiểu, nghiên cứu sự có
mặt và số lợng của chúng cũng nh cấu trúc và chức năng và sự phân bố của
chúng là vấn đề vô cùng quan trọng.
Hiện nay, có rất nhiều phơng pháp định lợng vi sinh vật trong hệ sinh thái bao
gồm các phơng pháp truyền thống và các phơng pháp hiện đại. Chính vì vậy, tôi
thực hiện tiểu luận:

Các phơng pháp định lợng vi sinh vật trong hệ sinh thái
nhằm cung cấp những sự lựa chọn thích hợp trong việc phân tích và định lợng vi
sinh vật của từng mẫu sinh thái cụ thể.

I. các phơng pháp định lợng vi sinh vật
trong mẫu sinh thái
I.1. Phơng pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi
I.1.1. Phơng pháp đếm trên các vết bôi đã đợc cố định và nhuộm màu (1)
CNSH 2006-2008

1


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Nguyên lý: Phơng pháp này nhằm đếm số lợng tế bào vi sinh vật trong một thể
tích xác định của dịch huyền phù nghiên cứu trực tiếp dới kính hiển vi dựa vào
việc cố định vết bôi. Việc cố định này cho phép giữ đợc tiêu bản lâu dài và
không cần đếm ngay khi thí nghiệm mà có thể vào một thời gian khác thuận tiện
hơn.
Tiến hành:
- Lấy một lợng xác định thể tích dịch huyền phhù nghiên cứu, thờng từ 0,02
0,05ml, trải lên một phiến kính, làm khô và đặt lên giấy kẻ ô ly để có đợc các ô
có diện tích 6 hay 4cm2.
- Thêm vài giọt thạch 0,03% vô trùng, dùng que cấy trộn nhanh rồi phân bố đều
ra trên diện tích đã vạch ra giấy.
- Làm khô trong không khí và cố định trong 20-30 phút bằng cồn 96% và nhuộm
trong thời gian xác định bằng một thuốc nhuộm nào đó.
- Rửa tiêu bản, làm khô
- Tính toán số lợng tế bào vi sinh vật bằng vật kính dầu qua các ô vuông của lới
thị kính đợc lắp vào trong thị kính. Tính số lợng qua 50 100 ô của lới. Độ
chính xác tối đa theo quan điểm thực tiễn sẽ đạt đợc khi tổng số tế bào đợc tính

là 600 1000 dơn vị. Từ số lợng này tính đợc số tế bào trung bình trong một ô:
Xtb = x n
n là số lợng các ô vuông đã đếm của lới
I.1.2. Phơng pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng
cầu
Nguyên lý:
Dựa vào sự có mặt của vi sinh vật trong các ô của lới đếm trong buồng đếm hông
cầu.
Tiến hành:
Dùng bông thấm nhẹ nớc cất khử trùng lên 2 khoảng bên của lới đếm. Đặt lá
kính lên sao cho lá kính dính chặt vào phiến kính. Cho canh trờng có chứa vi
sinh vật đã pha loãng chảy từ từ vào khoảng trống giữa lá kính và buồng đếm.
- Dùng buồng đếm 0,1mm
1/25mm2 thì số tế bào trong canh trờng sẽ là:
X = a x 0,1 x 1/25 x 1000 x f = 1/4 x a x 106 x f
Trong đó, a là số tế bào có trong một ô
f là hệ số pha loãng của canh trờng thí nghiệm
- Dùng buồng đếm 0,1mm deft 1/400mm2 thì số tế bào trong canh trờng sẽ là:
X = 4 x a x f x 106
Trong đó, X là số tế bào/ml canh trờng
a là số tế bào trong một ô
CNSH 2006-2008

2


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

f là hệ số pha loãng canh trờng
Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:
Ưu điểm:
Phơng pháp này cho kết quả tơng đối nhanh.
Thực hiện đơn giản
Nhợc điểm:


Độ chính xác thấp

Tốn sức lao động khi sử dụng kính hiển vi
Không có khả năng phân biệt và định lợng đợc tế bào sống và tế bào chết
Không thích hợp để định lợng vi sinh vật trong mẫu sinh thái do trong
mẫu sinh thái có chứa nhiều loại quần thể khác nhau ngoài ra còn có rất
nhiều cặn bẩn nên có thể không phân biệt đợc với vi sinh vật.
ứng dụng:
Phơng pháp đếm trực tiếp hiện nay vẫn đợc sử dụng trong việc xác định
tạp nhiễm trong qua trình lên men bia do nó đa ra kết quả ngay và khá đơn
giản để thực hiện.
Nó thích hợp để định lợng các vi sinh vật trong một canh trờng thuất khiết
với quần thể đã biết.
I.1.3. Nhuộm huỳnh quang bằng thuốc nhuộm DEFT (Direct
Epifluorescent)
Nguyên lý:
DEFT là một phơng pháp phân tích vi sinh vật trong đó các vi sinh vật đợc bắt
giữ vào trong một màng lọc, ở đó chúng đợc nhuộm thuốc nhuộm đặc hiệu (đặc
hiệu DNA, RNA...) có khả năng phát huỳnh quang nh arine orange. Quan sát dới
kính hiển vi cho phép định lợng nhanh các vi sinh vật có trong mẫu (bai DEFT).
Acridine Orange:
Acridine orange là 1 loại thuốc nhuộm huỳnh quang chọn lọc acid nucleic sử

dụng để phát hiện tế bào. Acridine orange có tính thấm tế bào và tơng tác với
DNA và RNA bằng việc cài vào hoặc bằng lực hút tĩnh điện. Khi liên kết với
DNA, nó rất giống với fluorescein với sự kích thích lớn nhất ở bớc sóng 520nm
và phát xạ lớn nhất ở 525nm (màu xanh lá cây). Khi liên kết với RNA, nó thay
đổi bớc sóng kích thích thành 460 (màu xanh da trời) và bớc sóng phát xạ lớn
nhất là 650nm (màu đỏ). Acridine orange có thể đợc sử dụng liên kết với
ethidium bromide để phân biệt sự khác nhau giữa tế bào hoạt động và không
CNSH 2006-2008

3


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

hoạt động, tế bào đang sinh sôi nảy nở. Acridine orange cũng đợc sử dụng để đo
apoptosis và phát hiện sự thay đổi pH nội bào, hoạt động của bơm proton (13).

Hình I.1. Cấu trúc Acridine Orange

Hình I.2. Tế bào Bacillus subtilis trớc và sau khi xử lý nhiệt và nhuộm
Acridine Orange
Tế bào sống: xanh
Tế bào chết: vàng
Baclight:
Baclight là một loại thuốc nhuộm 2 thành phần phổ biến dựa trên sự phát huỳnh
quang để xác định sự sống của tế bào. Hai thành phần bao gồm: hexidium iodide
(HI) màu vàng và SYTO9 màu xanh lá cây. Cả 2 thành phần này thuốc nhuộm
DNA và có khả năng phát huỳnh quang khi liên kết với DNA sợi kép và không

phát quang trong dung dịch. Các 2 thành phần đều bị kích thích bởi ánh sáng
xanh da trời gần 490nm. SYTO9 có tính thấm cao với màng tế bào vi khuẩn và
đánh dấu DNA vi khuẩn bằng sự phát huỳnh quang màu xanh lá cây sáng. HI
chỉ thấm vào màng tế bào vi khuẩn Gram dơng và liên kết DNA với ái lực lớn
hơn so với SYTO9. Do đó, HI thích hợp để đánh dấu DNA vi khuẩn Gram dơng
với huỳnh quang màu vàng sáng. Hệ thống Baclight đòi hòi phải có màng tế bào
sống và còn nguyên để đảm bảo tính thấm màng vi khuẩn Gram dơng và Gram
âm (3).

CNSH 2006-2008

4


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Hình I.3 . Tế bào S. epidermidis sau khi xử lý với kháng sinh và nhuộm
Baclight
A. Màng sinh học còn nguyên
B. Màng sinh học đã bị phá hủy
C. Các tế bào phù du
Dapi:
DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole) là một chất phát huỳnh quang khi tơng
tác với DNA sợi kép, nó có tính đặc hiệu huỳnh quang với AT, AU và IC. Do đặc
tính này nên DAPI là một công cụ hữu ích trong các khảo sát mật độ. Khi DAPI
liên kết với DNA, sự phát huỳnh quang của nó tăng mạnh, nhng có banừg chứng
cho rằng DAPI liên kết những rãnh nhỏ và ổn định bởi liên kết hydro giữa DAPI
và nhóm nhận của cặp base AT, AU,IC (14).

Hình I.3. Vi khuẩn dị dỡng nhuộm DAPI
Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:
Ưu điểm:

CNSH 2006-2008

5


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Có thể phân biệt đợc tế bào sống và tế bào chết. Riêng DAPI không phân
biệt đợc tế báo sống, tế bào chết do chúng chỉ đặc hiệu DNA mà tế bào
chết vẫn chứa DNA.
Không thể định lợng chính xác từng loài.
Nhợc điểm:
Khó định lợng đợc chính xác trogn mẫu sinh thái do có quá nhiều quần
thể.
Việc đếm trên kính có thể dẫn đến sai số do thao tác làm tiêu bản.
ứng dụng:
Phơng pháp này đã đợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu định lợng trực
tiếp vi sinh vật nh nghiên cứu môi trờng, sản xuất thuốc, dự đoán nguy cơ của
thực phẩm. Ví dụ, DEFT đợc sử dụng trong phát hiện các vi sinh vật có trong sữa
nguyên liệu trong thời gian 20 phút.
I.1.4. Phơng pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp (Direct Fluorescent
Antibody Test)
Phơng pháp sử dụng để phát hiện sự có mặt của một phân tử kháng nguyên

(protein đặc hiệu điển hình trên bề mặt của virus, vi khuẩn hoặc các vi sinh vật
khác). Các chất phát huỳnh quang đợc gắn vào vùng bảo thủ của kháng thể. Nếu
kháng nguyên có mặt, kháng thể sẽ liên kết để tạo thành những protein phức đặc
hiệu và rất nhạy.

individual Legionells cells labeled

CNSH 2006-2008

Cryptosporidium oocysts (smaller

6


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật
with FITC-tagged antibody

Phạm Kiều Thúy

green spheres) labeled with FITCtagged antibody

Hình I.4. Mô tả phơng pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp
Ưu điểm:
Nhạy và đặc hiệu khi sử dụng kháng thể đơn dòng cũng nh kháng thể đa
dòng.
Có thể sử dụng đối với các vi sinh vật không thể nuôi cấy dễ dàng
Có thể đánh dấu, phát hiện đợc từng tế bào
Có thể quan sát đợc các tế bào trong môi trờng tự nhiên
Có thể sử dụng nhiều dạng nhiều loại kháng thể đánh dấu huỳnh quang
với các màu khác nhau để quan sát đợc nhiều loại tế bào trong một mẫu.

Nhợc điểm:
Có thể xảy ra sự liên kết chéo, điều này có thể khắc phụ bằng cách sử
dụng kháng thể đơn dòng song lại rất khó khăn trong việc tạo kháng thể
đơn dòng.
Quá trình thao tác phải thực hiện cẩn thận để tránh dơng tính giả và âm
tính giả.
Phơng pháp này chỉ đợc sử dụng với mục đích định lợng những quần thể
đã biết.
ứng dụng:
Kĩ thuật này đã đợc áp dụng rộng rãi, ví dụ định lợng nhanh vi khuẩn E. coli
O157: H7 trong thịt bò. Mẫu đợc nhuộm kháng thể đa dòng kháng O157 đợc
đánh dáu hùynh quang và kiểm tra trên kính hiển vi huỳnh quang. Độ nhạy đợc
so sánh với các phơng pháp chuẩn và cho thấy nó có khả năng phát hiện đợc sự
có mặt của mầm bệnh ở mức 16 CFU/g và thời gian cho kết quả là 1h (DEFT).
I.2. Phơng pháp đếm trực tiếp trên đĩa (1)
Nguyên lý:
Phơng pháp định lợng tế bào dựa trên sự hình thành khuẩn lạc trên môi trờng đặc
trng. Khi đó, coi mỗi khuẩn lạc là kết quả cảu sự phát triển từ một tế bào.

CNSH 2006-2008

7


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Hình I.5. Xác định vi sinh vật tổng số bằng phơng pháp đĩa thạch
Tiến hành:

Tùy từng loại mẫu sinh thái và tùy mục đích nghiên cứu mà có phơng pháp cũng
nh môi trờng đặc hiệu riêng.
- Các mẫu đợc pha loãng ở nồng độ thích hợp sau đó cấy trải lên đĩa môi trờng.
- Nuôi cấy ở các điều kiện hiếu khí, kị khí, nhiệt độ và thời gian khác nhau tùy
thuộc điều kiện sinh trởngvà phát triển của từng loại vi sinh vật và tùy mục đích.
- Xác định mật độ vi sinh vật tổng số trong mẫu: Chọn các đĩa khuẩn lạc có số
khuẩn lạc nằm trong phạm vi đáng tin cậy 25-250 khuẩn lạc. Số lợng vi sinh vật
sẽ đợc xác định bằng công thức:
N = C / [ (1 * n1) + (0.1 * n2) ] * (d)
N là số khuẩn lạc trên một đĩa
C = Tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa
n1 = Số đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên
n2 = Số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ 2
d = Nồng độ pha loãng đầu tiên xuất hiện khuẩn lạc
Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:
Ưu điểm:
Phơng pháp này tơng đối đơn giản, dễ thao tác.
Chi phí máy móc, thiết bị thấp.
Nhợc điểm:
Phơng pháp này không thích hợp cho việc định lợng vi sinh vật trong mẫu sinh
thái vì:
Chỉ có khả năng phát hiện và định lợng những vi sinh vật sống có khả
năng nuôi cấy đợc mà không xác định đợc những vi sinh vật sống không
có khả năng nuôi cấy đợc.
CNSH 2006-2008

8


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Cần có môi trờng chọn lọc đối với từng loại vi sinh vật để phân lập.
Cần kết hợp sử dụng các phơng pháp làm giàu, các thử nghiệm sinh lý
sinh hóa để phát hiện từng loại vi sinh vật.
Tốn thời gian và công sức.
ứng dụng:
Phơng pháp này hiện nay vẫn đợc áp dụng để định lợng các vi sinh vật trong các
mẫu nớc, mỹ phẩm, thực phẩm. Tuy nhiên, phơng pháp thích hợp nhất đối với
việc đinh lợng những canh trờng thuần khiết 1 loại vi sinh vật cụ thể đã biết và
có khả năng nuôi cấy. Ví dụ, định lợng coliform.
I.3. Phơng pháp FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) (15,16).
ở các sinh vật đa bào, tất cả tế bào đều giống nhau về DNA nhng protein thì lại
rất khác nhau. Do đó, sẽ rất hữu ích nếu chúng ta có thể tách những tế bào có
kiểu hình khác nhau ra. Ngoài ra, việc biết có bao nhiêu tế bào biểu hiện protein
và mức độ biểu hiện protein của tế bào cũng đợc quan tâm. FACS là một phơng
pháp có thể đạt đợc tất cả những mục đích trên.
Nguyên lý:
FACS là phơng pháp xác định đặc tính và phân biệt các tế bào trong quần thể
không đồng nhất dựa trên sự phát xạ ánh sáng đặc hiệu và những đặc tính phát
quang của mỗi tế bào)
Tiến hành:
- Đầu tiên, các tế bào đợc đa vào khuôn và đẩy để cho 1 tế bào có thể đi qua một
lỗ nhỏ. Tế bào di chuyển xuống dới lỗ trong trạng thái đợc làm rung ở điều kiện
tối u để tạo thành các giọt ở một khoảng cách cố định so với lỗ. Khi các tế bào
chảy xuống theo dòng của chất lỏng, chúng đợc quét tia lase (ánh sáng xanh).
Một vài tia lase bị phân tán bởi tế bào (tạo thành hình nón đỏ từ tế bào đỏ) và nó
đợc sử dụng để đếm tế bào. Những tia bị phân tán này còn có thể đợc sử dụng để
đo kích thớc của tế bào.

- Nếu muốn tách các tế bào của từng quần thể, thì có thể thực hiện bằng cách
gắn những tế bào quan tâm vào kháng thể gắn huỳnh quang. Kháng thể chỉ đợc
liên kết với những protein đợc biểu hiện trong tế bào cần tách. Tia lase kích thích
thuốc nhuộm phát ra màu của ánh sáng đợc phát hiện bởi bộ thu quang, hoặc
thiết bị dò ánh sáng (dectector). Bằng cách thu thập thông tin từ ánh sáng (bị tán
sắc và phát huỳnh quang), máy tính có thể xác định những tế bào nào cần phải
tách rời và thu thập.

CNSH 2006-2008

9


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Hình I.6. Sơ đồ máy FACS
(Các tế bào đợc đánh dấu với kháng thể huỳnh quang màu đỏ hoặc xanh)
- Bớc cuối cùng là phân loại các tế bào đã đợc tích điện. Máy tính xác định làm
thế nào mà các tế bào sẽ đợc phân loại trớc khi hình thành giọt ở cuối dòng chảy.
Khi đã giọt hình thành, một dòng điện sẽ đợc đa vào dòng chảy và giọt mới
mang điện sẽ đợc hình thành. Các giọt mang điện này đợc cho di chuyển lệch
sang phải hoặc trái bởi điện cực tích điện và đi vào trong các ống thu mẫu. Các
giọt không chứa tế bào đợc chuyển đến ống chứa dịch thải. Kết quả cuối cùng có
3 ống với những tế bào dới quần thể (loài) thuần khiết. Số lợng tế bào trong mỗi
CNSH 2006-2008

10

Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

ống có thể xác định đợc và mức độ phát huỳnh quang cũng đợc ghi lại cho mỗi
loại tế bào.
- Số liệu FACS đợc ghi lại bởi máy tính có thể đợc hiển thị bằng 2 cách:
Cách 1 (Hình I.7.A): Có thể thấy cờng độ huỳnh quang xanh hoặc đỏ đợc thể
hiện trên trục X và số lợng tế bào của mỗi một mức độ huỳnh quang đợc thể hiện
trên trục Y. Trong VD này, các tế bào màu đỏ đợc phân loại gấp 2 lần tế bào màu
xanh hoặc tế bào không màu nhng cờng độ ánh sáng của tế bào xanh lại lớn hơn
của tế bào đỏ. Phơng pháp này là tốt nhất khi tất cả các tế bào đều màu xanh, đỏ
hoặc không màu và không tế bào nào có cả 2 màu.
Cách 2 (Hình I.7.B): Ngoài cách biểu diễn số liệu nh trên, có một cách khác
nhau để xử lý số liệu thu đợc. Trục X biểu thị cờng độ của huỳnh quang xanh
trong khi trục Y lại biểu hiện cờng độ của huỳnh quang đỏ. Những chấm đen
nhỏ miêu tả các cá thể tế bào và chúng ta không thể đếm đợc hết những chấm
đen đó nhng có thể quan sát mức mật độ tơng đối của chấm đen ở các góc khác.
Từ đồ thị này, có thể thấy không tế bào nào có cả màu xanh và đỏ (trên cùng bên
phải) và rất nhiều tế bào không màu (dới cùng bên trái). Số lợng tế bào màu xanh
(dới cùng bên phải) tơng đơng với số lợng tế bào không màu nhng số lợng của tế
bào màu đỏ (trên cùng bên trái) gấp 2 lần hai tế bào màu xanh và không màu.
Mặt khác, chúng ta có thể thấy mức độ phát huỳnh quang của tế bào màu xanh
cao hơn so với tế bào màu đỏ. Phơng pháp vẽ đồ thị số liệu này đợc sử dụng khi
các tế bào có mặt có cả màu đỏ và xanh.

A

CNSH 2006-2008

11


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

B
Hình I.7. Biểu đồ biểu diễn số liệu FACS thu đợc
(Cờng độ ánh sáng phát ra tằng theo chiều mũi tên)
Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:
FACS đợc sử dụng để phân biệt tế bào sống với tế bào chết, phân biệt các dạng
khác nhau của tế bào, phân lập các tế bào sử dụng cho tách dòng hoặc PCR, tách
cá tế bào tinh trùng phục vụ cho phân loại hoặc cho việc nhận dạng các tế bào
apopototic. Ngoài ra, có thể tách đợc tế bào sống ra khỏi tế bào chết bằng FACS.
Các tế bào chết có khả năng thấm ethidium monoazide (EMA), 1 loại hóa chất
có thể xâm nhập vào tế bào và liên kết với DNA dới đèn huỳnh quang. Khi FACS
hoạt động, các tế bào có chứa EMA (các tế bào chết) đợc tách riêng (15).
I.4. Phơng pháp FCM (Flow Cytometry) (17,20,21)
Cytometry là việc xác định các đặc tính lý học và/ hoặc hóa học của tế bào hoặc
của các hạt sinh học khác.
Flow cytometry (FCM) là một quá trình trong đó việc xác định đó đợc thực hiện
trong khi các tế bào và các hạt trải qua một loạt các thiết bị đo trong một
dòng chảy. Sự phân loại dòng bằng cách sử dụng các công cụ điện và cơ
học để chuyển và thu nhận những tế bào với một hoặc nhiều đặc tính đo đợc tạo thành một hoặc một loạt các giá trị do ngời sử dụng cài đặt (21).
Nguyên lý: FCM dựa trên nguyên lý tán sắc ánh sáng, kích thích ánh sáng, và
phát xạ ánh sáng của các phân tử thuốc nhuộm fluorochrome phát huỳnh quang
để tạo ra những thông số đặc hiệu từ những hạt và những tế bào có kích thớc từ
0,5 đến 40m. Các tế bào đợc tập trung thủy động học trong một ống chứa PBS

trớc khi bị chặn bởi một nguồn sáng thích hợp. ánh sáng lase thờng đợc sử dụng
làm nguồn sáng trong FCM (17).

CNSH 2006-2008

12


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Hình I.8. Sơ đồ thiết bị FCM.
Thiết bị sử dụng nguyên lý thủy động học tập trung vào việc trình diện các tế
bào trớc tia lase (hoặc bất cứ một nguồn sáng kích thích nào). Mẫu đợc đa vào
giữa ống. Dòng kết hợp này sẽ đợc thu nhỏ và đẩy tế bào vào trung tâm của dòng
chảy. Khi tế bào hoặc các hạt quan tâm chặn nguồn sáng, chúng tán sắc ánh sáng
và thuốc nhuộm fluorochrome phát huỳnh quang sẽ phân cắt chúng tạo thành các
trạng thái năng lợng cao hơn. Năng lợng này đợc giải phóng là một photon ánh
sáng với đặc tính quang phổ đặc hiệu duy nhất với những thuốc nhuộm
fluorochrome phát huỳnh quang khác nhau (Bảng I.1).

CNSH 2006-2008

13


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Bảng I.1. Phổ huỳnh quang của những fluorochromes thờng đợc sử dụng
Phổ kích thích đợc biểu diễn bằng màu xám trong khi phổ phát xạ đợc biểu diễn
bằng màu đen. Phần cuối của bảng tóm tắt bớc sóng phát xạ của những nguồn
sáng khác nhau sử dụng trong Flow cytometry. Bớc sóng 488nm của tia ion
argon xuất hiện ở các phổ (From Practical Flow Cytometry, Third Edition,
Howard M. Shapiro. P. 245.
ánh sáng đợc tán sắc và phát ra từ các tế bào và các hạt đợc chuyển thành xung
điện bằng các detector thích hợp. ánh sáng đợc thu lại bằng thấu kính cùng tiêu
điểm tập trung ở điểm giao giữa tế bào và nguồn sáng. ánh sáng đợc chuyển đến
CNSH 2006-2008

14


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

những detector khác nhau sử dụng những tấm lọc ánh sáng quang học. Ví dụ, dải
ánh sáng 525nm qua tấm lọc đặt trong luồng sáng trớc detector sẽ cho phép ánh
sáng xanh đi vào detector. Detector sử dụng phổ biến nhất trong FCM là bộ nhân
quang (PMT).

Hình I.9. Mô hình sắp xếp các bộ phận quang học trong FCM
Các xung điện xuất phát từ ánh sáng đợc phát hiện bởi PMT đi qua một loạt các
bộ khuếch đại. Sự khuếch đại loga thờng đợc sử dụng để đo sự phát quang trong
tế bào. Loại khuếch đại này mở rộng phạm vi đối với các tín hiệu yếu và thu hẹp
phạm vi đối với những tín hiệu phát huỳnh quang đặc hiệu và mạnh.
Sau khi các tín hiệu khác nhau hoặc các xung khác nhau đợc khuếch đại, chúng

tiếp tục đợc chuyển đổi thành tín hiệu điện tử cho phép vẽ đợc đồ thị số liệu và
đợc lu giữ trong máy tính.
Xây dựng biểu đồ:
Biểu đồ có thể tạo thành bởi một thông số hoặc 2 thông số.
Biểu đồ một thông số:
Biểu đồ một thông số là biểu đồ đếm tế bào trên trục Y và thông số đo trên trục
X. Tất cả các biểu đồ một thông số đều có 1024 vạch. Những vạch này tơng ứng
với hiệu điện thế phát sinh từ luồng ánh sáng đặc hiệu phát hiện bởi PMT
detector. Bên cạnh đó, ADC chia vạch dựa trên kích thớc xung trong mỗi trờng

CNSH 2006-2008

15


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

hợp. Do đó, sự phát màu huỳnh quang sáng hơn sẽ thu đợc xung lớn hơn và do
đó số kênh sẽ lớn hơn khi biểu hiện trên biểu đồ.
Biểu đồ hai thông số:
Đây là loại biểu đồ biểu diễn 2 thông số cần đo trên trục X và trục Y và số lợng
tế bào đếm đợc với mật độ khác nhau. Nó tơng tự nh bản đồ địa hình. Có thể lựa
chọn 64 hoặc 256 vạch trên mỗi trục của biểu đồ 2 thông số. Số lợng hạt đếm đợc đợc thể hiện bằng mật độ chấm hoặc bằng đờng viền biểu diễn.

Hình I.10. Biểu diễn số liệu FCM
Biểu đồ 1 thông số (A)
Biểu đồ 2 thông số (B) ( FL1-FITC trên trục X và FL2-PE trên trục Y)
Phân tích và phân loại bằng FCM:

Phân tích dịch huyền phù tế bào thu đợc nhiều thông số liên quan tới Forward
Light Scatter (FLS), 90 Light Scatter (90LS), và FL1-FL4. Những thông tin này
cho phép nhận dạng và xác định tính chất của nhiều dới quần thể khác nhau của
tế bào. Quá trình phân tách các tế bào sử dụng các số liệu FCM là quá trình phân
loại.

CNSH 2006-2008

16


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Hình I.11. Sơ đồ thiết bị phân loại
Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:
Ưu điểm:
FCM có thể đo đợc sự phát huỳnh quang trên mỗi tế bào và mỗi hạt. Điều
này ngợc với phơng pháp đo quang phổ vì ở đó, sự hấp thụ và truyền
những bớc sóng đặc hiệu của ánh sáng đợc đo cho một thể tích lớn mẫu.
Có thể phân biệt đợc tế bào sống và tế bào chết.
FCM có thể tinh sạch một lợng dới quần thể rất nhỏ (1 tế bào trong 10 5),
hoặc 1 dới quần thể đợc xác định bởi kích cỡ chuẩn và đặc tính phát
huỳnh quang.
Khi nghiên cứu các quần thể tế bào không đồng nhất, FCM thực sự rất
hiệu quả. Trong một vài phút, FCM có thể đa ra các số liệu về các dới
quần thể trong một mẫu. Nó không chỉ đa ra phần trăm các té bào đỏ và
xanh mà còn cả phần trăm các tế bào mang 2 màu đỏ và xanh và các tế
bào không phải đỏ cũng không phải xanh. Tuy nhiên, dới quần thể có màu

xanh sáng và màu xanh mờ... Không một phơng pháp nào có thể cho phép
phân tích nhanh, định lợng đợc các dới quần thể đó.
Nhợc điểm:
CNSH 2006-2008

17


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Đối với 1 dới quần thể chiếm 20% quần thể ban đầu, máy phân loại tốc độ
cao sẽ thu đợc ít hơn 106 tế bào/h. Nhiều thí nghiệm cần nhiều tế bào hơn
thế.
Nếu có 2 tế bào quá gần nhau thì chúng có thể bị cùng loại bỏ.
Ngoài ra, một vấn đề phát sinh khi các tế bào đã đợc phân loại cần phải
giữ trong điều kiện vô trùng. Các máy phân loại có thể đợc giữ trong điều
kiện vô trùng nhng sẽ làm phức tạp thêm quá trình. Việc giữ sạch tế bào sẽ
thực hiện dễ dàng hơn khi sử dụng loại máy phân loại chậm, tuy nhiên tốc
độ chỉ bằng 1/10.
ứng dụng (17):
ứng dụng trong y học lâm sàng:
FCM đợc sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện để nghiên cứu lâm sàng và chẩn
đoán. FCM có khả năng phân biệt các dạng tế bào trong máu và phân biệt đợc
nhiều loại tế bào ung th máu (leukemias và lymphomas). FCM có thể định lợng
sự mất lympho T trong quá trình đàn áp miễn dịch để ngăn chặn sự đào thải các
mô ghép hoặc sự mất tế bào T hỗ trợ CD4 ở ngời bị AIDS. FCM có thể ứng dụng
đợc trong việc nghiên cứu các tế bào ung th lấy ra trong phẫu thuật và mẫu sinh
thiết vì sự phân bố của tế bào/ DNA thể hiện giai đoạn của tiến trình bệnh. Các

kết quả FCM rất quan trọng cho việc chẩn đoán, dự đoán và tối u liệu pháp điều
trị.
ứng dụng trong nghiên cứu vi sinh vật học:
FCM rất thích hợp để nghiên cứu về vi sinh vật. Ngời ta có thể vừa phân loại vi
sinh vật vừa phát hiện tính kháng kháng sinh của chúng trong một vài giờ ở trong
cùng một thiết bị FCM. Tuy nhiên, FCM không đợc ứng dụng rộng rãi vì nó đợc
cho là không kinh tế. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu về động học vi sinh vật đã đợc
thực hiện sử dụng FCM, bao gồm lập đờng cong sinh trởng, các nghiên cứu tái
sản xuất và nhu cầu trao đổi chất.
ứng dụng trong nghiên cứu tế bào:
ứng dụng sớm nhất của FCM trong nghiên cứu tế bào là khảo sát chức năng của
bạch cầu trung tính bằng cách đo sự thực bào của vi sinh vật.
Có nhiều nghiên cứu sử dụng FCM để nghiên cứu đặc tính của tế bào mà không
một công nghệ nào có thể thực hiện đợc. Ví dụ, nghiên cứu sự sản xuất oxy của
sinh vật đơn bào. Ngoài ra, FCM còn đợc sử dụng để xác định kích cỡ, cấu trúc
và các thụ thể đặc hiệu của các tế bào riêng lẻ.
ứng dụng trong nghiên cứu thực vật:

CNSH 2006-2008

18


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

FCM đợc sử dụng hiệu quả trong việc xác định các gen biểu hiện ở cây thuốc lá
chuyển gen.
I.5. Phơng pháp phân tích dựa trên các đặc tính sinh hóa (17)

I.5.1. Kĩ thuật đo phát xạ huỳnh quang ATP (Adenosine Triphosphat)
Nguyên lý: Tất cả các vi sinh vật sống và chỉ có những sinh vật sống mới có
chứa hợp chất ATP nh 1 phần trong quá trình trao đổi năng lợng cho sự sống.
ATP đợc giải phóng và phát hiện đợc bằng phản ứng phát huỳnh quang chuẩn.
ATP phản ứng nhanh khi có mặt enzym luciferase, lucifin và oxy để tạo ra các
photon ánh sáng màu vàng xanh vàng.

Hình 1.12. Cơ chế phản ứng phát huỳnh quang ATP
Một thiết bị đo ánh sáng tự động đa những tác nhân cần thiết vào mẫu và phát
hiện ánh sáng phát ra với độ nhạy cao.
Ưu điểm:
Có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều loại mẫu khác nhau để sàng
lọc các vi sinh vật.
Rất nhạy.
Nhợc điểm:
Mặc dù kĩ thuật đo sự phát quang sinh học ATP rất nhạy nhng trên thực tế
nó cũng hạn chế bởi vì nó phát hiện những sản phẩm trao đổi chất (ATP) mà một
vi sinh vật thì chỉ chứa một lợng ATP có hạn.
ứng dụng (18):
Đây là phơng pháp đợc áp dụng từ lâu và hiện vẫn còn co giá trị. Ngời ta đã áp
dụng phơng pháp này để định lợng vi khuẩn trong mẫu nớc biển. Việc định lợng
sinh khối của các tế bào phát triển dị dỡng có ý nghĩa vì nó có liên quan đến sự
phân bố của vật chất hữu cơ trong biển. Xác định sinh khối bằng định lợng ATP
phụ thuộc vào nguyên tắc rằng tất cả các tế bào, kể cả động vật hoặc thực vật đều
CNSH 2006-2008

19


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

có chứa ATP và giả định rằng 1) không có ATP liên kết với vật chất không sống
2) tỉ lệ ATP trên tế bào C sẽ khá ổn định. Xác định lợng ATP trong các mẫu từ nớc biển kết hợp với tài liệu khác cho thấy lợng ATP chứa trong nhiều VSV biển,
và do đó cho phép ớc lợng sự phân bố của tế bào sống tại bất kì một vùng biển
sâu nào.
Nghiên cứu này đa ra kết luận về việc xác định ATP dới độ sâu 1025m tại bờ
biển califonia và còn cung cấp t liệu thí nghiệm về nồng độ ATP trong nhiều loại
VK và tảo biển khác nhau. Ví dụ, hàm lợng ATP ở Vibrio sp. là 0,5-4,0.10-9g/tế
bào, lợng ATP tất cả các loài vi khuẩn biển khoảng 1,5. 4,0.10-9g/tế bào.
I.5.2. Kĩ thuật đo phát xạ huỳnh quang AK (Adenylate Kinase)
Nguyên lý: Tất cả các vi sinh vật đều có chứa (AK) đây là một phần trong quá
trình trao đổi năng lợng của sự sống. Bởi vì đây là 1 enzym nên có thể sử dụng
AK để tạo ra những lợng sản phẩm không hạn chế, trong đó có ATP. Do đó có
thể định lợng đợc bằng phản ứng phát quang sinh học. Phản ứng trên càng kéo
dài thì càng nhiều ATP đợc tạo thành và thu đợc càng nhiều tín hiệu phát quang
sinh học.
Phản ứng xúc tác bởi AK diễn ra nh sau:

Hình 1.13. Cơ chế phản ứng phát huỳnh quang AK
Lợng AK trong tế bào vi sinh vật cũng giống nh ATP, rất khác nhau ở mỗi loài và
bị khống chế chủ yếu do kích thớc tế bào. Các vi sinh vật có kích thớc càng lớn
thì càng chứa nhiều AK. Enzym AK trong vi khuẩn có khả năng xúc tác tổng hợp
ATP gấp 40 lần so với lợng ATP của bản thân vi khuẩn đó trong 1 phút. Nếu
CNSH 2006-2008

20

Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

phản ứng vẫn diễn ra trong 25 phút, lợng ATP có thể đạt gấp 1000 lần so với lợng
ATP của vi khuẩn ban đầu.
Trong thực tế hiện nay, công nghệ AK dựa trên sự khuếch đại ATP vi sinh vật. Từ
khi có công nghệ AK, phơng pháp này đã đợc sử dụng để phát hiện nhạy hơn
trong việc kiểm tra sự nhiễm tạp nhiều hơn là đo sự phát quang sinh học (18).
Ưu nhợc điểm và phạm vi ứng dụng:
Ưu điểm:
Rất nhanh.
Rất nhạy.
Rút ngắn thời gian chi kết quả.
Nhợc điểm:
Thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối
I.6. Phơng pháp ELISA bắt giữ kháng nguyên
Nguyên lý:
Kĩ thuật ELISA bắt giữ kháng nguyên dựa vào phản ứng đặc hiệu kháng nguyên
và kháng thể. Đây là kĩ thuật ELISA sử dụng để phát hiện và định lợng kháng
nguyên cần nghiên cứu. Đầu tiên, vi giếng đợc phủ bằng kháng thể kháng thể
đơn dòng kháng kháng nguyên. Nu cú s hin din ca khỏng nguyờn mc tiờu
trong mu khỏng nguyờn ny s đc trong giếng. Cỏc khỏng nguyờn ny s đợc phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể 2 gn vi enzym nh horseradish
peroxydase hay ankaline phosphatase.
Tiến hành:
Trớc tiên, kháng thể 1 kháng đợc gắn vào giá rắn. Tiếp theo, thêm dung dịch
nghiên cứu (có thể chứa kháng nguyên để liên kết với kháng thể đặc hiệu). Sau
đó, kháng thể 2 đặc hiệu kháng kháng nguyên, có gắn enzym đợc bổ sung vào
kháng nguyên vừa đợc bắt giữ. Sau khi bổ sung cơ chất đặc hiệu với enzym,
enzym thủy phân cơ chất làm thay đổi màu dung dịch và đợc đo ở bớc sóng thích

hợp. Tốc độ thủy phân của enzym tỷ lệ thuận với lợng kháng thể đã gắn enzym,
cũng có nghĩa là tỷ lệ thuận với lợng kháng nguyên cần nghiên cứu.

CNSH 2006-2008

21


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Hình 1.14. Mô hình ELISA định lợng kháng nguyên
Ưu điểm:
Phơng pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Nhợc điểm:
Phải tăng sinh trớc khi áp dụng
Độ nhạy phát hiện của phơng pháp này thấp, khoảng 106 CFU/ml.
Sử dụng phơng pháp này khi đã biết trớc quần thể cần nghiên cứu.
ứng dụng:
Hiện nay, có rất nhiều ứng dụng của kĩ thuật này ở Việt Nam. Ví dụ, kĩ thuật này
đợc sử dụng trong chẩn đoán và định lợng virus rota gây bệnh tiêu chảy. Kĩ thuật
dựa trên sự phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên vỏ virus rota và kháng thể
kháng virus rota. Sử dụng 2 loại kháng thể là cộng hợp kháng thể kháng virus
rota gắn peroxidase và kháng thể dê kháng virus rota. Các mẫu máu nghiên cứu
đợc phát hiện có sự xuất hiện của virus rota nhờ sự thay đổi do phản ứng enzyme
tạo ra. Đo màu ở bớc sóng thích hợp sẽ xác định đợc lợng kháng nguyên virus
rota có mặt trong mẫu nghiên cứu.
II. phát hiện và định lợng vi khuẩn tổng số trong sữa
bằng Phơng pháp flow cytometry (FCM)

CNSH 2006-2008

22


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Thành phần vi sinh vật trong sữa nguyên liệu ảnh hởng đến chất lợng sữa thành
phẩm và các sản phẩm sữa khác. Có một vài phơng pháp đã đợc đa ra để phát
hiện và định lợng đợc các vi sinh vật trong sữa nguyên liệu và sữa đã qua chế
biến. Phơng pháp nuôi cấy là phơng pháp phổ biến nhất, nhng bất lợi lớn nhất
của phơng pháp này là cần nhiều thời gian để đa ra kết quả (11). Một bất lợi khác
của phơng pháp nuôi cấy truyền thống là có thể phát hiện ra những vi sinh vật
sống nhng không có khả năng nuôi cấy đợc (2). Mặt khác, phơng pháp đếm trên
kính hiển vi là phơng pháp tơng đối nhanh nhng sự hạn chế của phơng pháp này
là tốn sức lao động và không có khả năng phân biệt đợc tế bào sống và tế bào
chết. Để giảm bớt những hạn chế dựa trên việc nuôi cấy và sử dụng kính hiển vi,
các phơng pháp khác đã ra đời. Các phơng pháp này bao gồm: Phơng pháp đo
màu dựa trên sự giải phóng của thuốc nhuộm khỏi cơ chất bởi enzym, test khử
thuốc nhuộm và sự phát huỳnh quang ATP (5, 7, 12). Mặc dù các phơng pháp
dựa trên đặc tính sinh hóa và sinh lý học rất nhanh nhng chúng thiếu tính đặc
hiệu tuyệt đối. Do đó, ngời ta nghi ngờ liệu phơng pháp không nuôi cấy này có
đem lại những đảm bảo về chất lợng và tính an toàn không.
Có nhiều phơng pháp nhanh và tự động hóa đã đợc ứng dụng trong nghiên cứu vi
sinh vật trong thực phẩm trong thời gian vừa qua. Tuy nhiên, các phơng pháp này
cha đem lại hiệu quả. Flow cytometry là một phơng pháp thích hợp, đáp ứng yêu
cầu đa dạng và đặc hiệu trong việc phân tích vi sinh vật trong sữa và các sản
phẩm sữa trong cùng một thiết bị (6,7). FCM có độ đặc hiệu rất cao, tránh đợc

việc nuôi cấy hoặc việc làm giàu và có thể vừa định tính lại vừa định lợng đợc
các vi sinh vật có trong sữa. Sử dụng kết hợp thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc cơ
chất flogenic kết hợp với FCM sẽ cho phép phát hiện và phân biệt các vi sinh vật
có và không có khả năng nuôi cấy, các vi sinh vật không sống. Hơn nữa, có
những tế bào vi sinh vật dù chiếm số lợng rất lớn hoặc rất ít cũng có thể phát
hiện và phân biệt đợc với các loài tế bào vi khuẩn hoặc các hạt không phải vi
khuẩn khác bằng cách kết hợp với FCM và các kháng thể đánh dấu huỳnh quang
đặc hiệu hoặc các mẫu dò oligonucleotide.
II.1. Đặc điểm của hệ vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa bằng FCM (
Thông thờng với điều kiện vệ sinh tốt thì trong sữa vẫn luôn chứa một lợng lớn tế
bào (khoảng từ 100.000 200.000 tế bào/ml sữa) và có một hệ vi sinh vật đa
dạng gồm nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong các đối tợng trên, thì
vi khuẩn đợc quan tâm nhiều hơn cả vì trong sữa chúng thờng phát triển vợt trội.
Vi khuẩn trong sữa hay gặp nhất là nhóm vi khuẩn lactic nh Streptococus lactic,
S. diaxetylatic, S. paracitrovorus, lactobacillus bulgariym, L. lactic, L.
acidophilum, L. hevelticum.
CNSH 2006-2008

23


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

Nếu loài nhiễm tạp là những vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc thì chúng
không những làm giảm chất lợng sữa mà còn rất nguy hiểm cho ngời sử dụng.
Một số loài vi sinh vật có khả năng lây nhiễm vào sữa nh: Bacillus cereus,
Brucella abortus, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Salmonella,
Mycobacterium bovis, Shigella, Sataphylococus aureus, Streptococus, Listeria

monocytogenes, Yersinia enterocolitica.
II.2. Nghiên cứu phát hiện và định lợng vi khuẩn trong sữa
II.2.1. Phát hiện vi khuẩn trong sữa bằng FCM
Thí nghiệm đợc tiến hành với 6 mẫu:
A. E. coli trong PBS
B. S. aureus trong PBS
C. Sữa tiệt trùng không bổ sung E. coli
D. Sữa bổ sung E. coli và loại chất béo
E. Sữa bổ sung E. coli, loại béo và xử lý protease
F. Sữa bổ sung S. aureus, loại béo và xử lý protease
Trong đó, quần thể E. coli và S. areus là hai quần thể đại diện cho 2 nhóm: Hình
que, gram dơng và hình cầu, Gram âm. Sau khi nuôi lắc ở 28 0C trong 16h, chúng
đợc nhiễm nhân tạo vào sữa nhằm nghiên cứu sử dụng FCM.
Kết quả cho thấy, FCM có thể dễ dàng phát hiện ra 2 quần thể E. coli và S. areus
trong mẫu A, B (Hình II.1.A, B).
ở mẫu C, khi sữa đã tiệt trùng và không nhiễm E. coli, FCM không phát hiện ra
đợc bất cứ quần thể nào. Điều này có thể là do sự xuất hiện của các hạt protein
và lipid không có khả năng bám đặc hiệu vào thuốc nhuộm huỳnh quang và gây
cản trở cho việc nhuộm và phát hiện vi khuẩn (Hình II.1.C).
Trong mẫu D (Hình II.1.D), sữa đã đợc ly tâm loại bỏ lipid mà không xử lý với
protease cũng không thích hợp để phát hiện ra vi khuẩn. Do đó, cản trỏ chính đối
với việc phân tích FCM của sữa là do sự xuất hiện của các phân tử protein. Do
đó, nghiên cứu đã xử dụng enzyme protease để xử lý loại bỏ protein và do đó cho
phép phân biệt đợc các vi khuẩn bằng FCM (Hình II.1.E, F).
II.2.2. Nhuộm nhuộm huỳnh quang và FCM
Các tế bào vi khuẩn trong các mẫu sữa đã đợc xử lý đợc nhuộm với SYTO BC
(kích thích và phát xạ ở bớc sóng 480 500nm).
SYTO BC là loại thuốc nhuộm có ái lực cao với acid nucleic. Nó thấm qua cả
thành tế bào vi khuẩn Gram dơng và Gram âm và tạo tín hiệu huỳnh quang màu
xanh lá cây.

SYTO BC đợc pha loãng 1 : 20 lần trong dimethylsulfoxide và đợc trộn với dịch
chứa tế bào (1 : 50), sau đó ủ ở 37 0C trong 5 10 phút. Khả năng sống sót của
CNSH 2006-2008

24


Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật

Phạm Kiều Thúy

canh trờng vi khuẩn đợcxác định bằng cách nhuộm mẫu với propidium iodide
(PI) (1mg/ml trong dimethyl sulfoxide) and SYTO BC. PI bị ngăn bởi màng
plasma, do đó chỉ có những tế bào chết mới hấp thụ PI (hỳnh quang màu vàng
hoặc đỏ)
Các mẫu đã nhuộm đợc phân tích sử dụng FACScan flow cytometer (chỉ phân
tích) hoặc FACSCalibur flow cytometer (Phân loại tế bào) (BectonDickinson,
Sydney, Australia). Cả 2 thiết bị đều đợc trang bị đèn argon 15mV phát xạ ánh
sáng ở bớc sóng 488nm. dịch trong thiết bị là Osmosol (LabAids Pty. Ltd.,
Sydney, Australia). Ngoài ra còn có thiết bị khúc xạ ánh sáng trớc (>150), thiết bị
khúc xạ ánh sáng bên (<150) và 3 detector: FL1 (515 -565nm), FL2 (565
605nm) và FL3 (>605nm). Ngỡng phát hiện đợc điều chỉnh cho FL1 để loại bỏ
các phân tử phát xạ huỳnh quang màu xanh ở dới tin cậy mà vi khuẩn hòa trong
PBS và đợc nhuộm SYTO. Sự bù đợc thiết lập để loại sự phát quang FL2 khỏi
kênh FL1 và FL1 khỏi FL2. Việc cài đặt này đợc sử dụng thờng xuyên trong
phân tích E. coli và S. aureus bằng FACScan FCM trong mẫu sữa UHT và vi
khuẩn tổng số trong mẫu sữa nguyên liệu sử dụng FACSCalibur đợc đa ra ở bảng
1. Đếm vi khuẩn bằng FCM đã thu đợc bằng cách chuẩn hóa số trờng hợp xảy ra
trong những vùng chấm, nó xác định những quần thể trong mẫu đợc phân tích.
Dữ liệu thu đợc từ FCM đợc chuyển đổi từ Hewlett Packard thành dạng PC sử

dụng chơng trình computer HP Reader và đợc phân tích bằng chơng trình
Windows Multiple Document Interface FCM application.
Bảng II.1. Cài đặt FCM cho việc phát hiện quần thể trong mẫu sữa
Mẫu

FL1

Cài đặt detector

% bù

FSC

SSC

FL1

FL2

FL3

FR1-FL2

FL2-FL1

E. coli

416

E02

326

770

770

770

88.8

24.5

S. aureus

436

E02

333

755

763

777

75.3

24.5

Sữa nliệu

357

E02

505

638

590

646

78.1

24.7

CNSH 2006-2008

25