Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29

MUC LUC
DAT VAN DÊ....................................................................................................1
PHAN1: TONG QUAN..................................................................................2
1.1. Khâng sin h .............................................................................................2
1.1.1. Lich s ir..............................................................................................2
1.1.2. Dinh nghîa khâng sinh .....................................................................2
1.1.3. Don vi khâng sinh.............................................................................2
1.1.4. Phân loai khâng sinh ........................................................................2
1.1.5. ûng dung cüa khâng sinh.................................................................. 3
1.2. Dai cirong vê Streptom yces ................................................................... 3
1.3. Câi tao giong vi sinh v â t....................................................................... 5
1.3.1. Mucdich........................................................................................... 5
1.3.2. Phirong phâp câi tao giong............................................................... 5
1.4. Lên men sinh tong hop khâng s in h .....................................................6
1.4.1. Lên men bè mât.................................................................................6
1.4.2. Lên men chim....................................................................................7
1.5. Chiet tâch-Tinh che ..............................................................................9
1.5.1. Chiê^t xuât..........................................................................................9
1.5.2. Tinh chê' sân phâm.............................................................................9
1.6. Pho phân tuf......................................................................................... 10
1.6.1. Phd tü ngoai khâ kiên (UV-VIS)..................................................... 10
1.6.2. Ph6 hong ngoai (IR).........................................................................11
1.7. Mot so ket quâ moi trong nghiên curu khângsinh .............................11
1.7.1 Phân lâp khâng sinh moi alaremycin cocâu truc tircmg tu acid 5aminolevunic tùr Streptomyces sp. A012304....................................11
1.7.2. Kiêm soât sinh hoc nâm hoaisinh gô voi Streptomyces
violaceusninger XL-2..................................................................... 12


1.7.3. Chùm gen chiu trâch nhiêm sinh tong

hopvalidamycin trong

Streptomyces hygroscopicus subsp. jinggangensis 5008................ 13
PHAN 2. THITC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ................................................. 14
2.1. Nguyên lieu và phmmg phâp thuc nghiêm........................................ 14
2.1.1. Nguyên vât lieu............................................................................... 14
2.1.2. Phuofng phâp nghiên cïru................................................................. 17
2.2. Két quâ thuc nghiêm và nhân xét...................................................... 23
2.2.1. Két quâ chon loc ngâu nhiên...........................................................24
2.2.2. Két quâ dôt bién bàng ânh sâng U V ...............................................24
2.2.3. Két quâ sau dôt bién lân 2 bàng ânh sâng UV................................ 25
2.2.4. Két quâ sau dôt bién lân 3...............................................................26
2.2.5. Két quâ chiét khâng sinh bàng dmhc..............................................28
2.2.6. Két quâ sâc kÿ lôp mông.................................................................29
2.2.7. Két quâ cât cô bot khâng sinh thô................................................... 30
2.2.8. Két quâ thfr hoat tmh chông nâm .................................................... 31
2.2.9. Két quâ sâc kÿ côt........................................................................... 31
2.2.10. Két quâ tinh ché khâng sinh.......................................................... 33
2.2.11. Két quâ do pho hông ngoai (IR), ph6 tir ngoai-khâ kiêh (UV-VIS). 34
2.2.12. Két quâ do nhiêt dô nong chây bôt khâng sinh 35 A .................. 34
2.2.13. Hoat tmh khâng sinh 35A trên mot sô chung VSV kiëm dinh .... 34
2.2.14. Thü hoat tmh khâng sinh à câc nông dô pha loâng.....................35
2.2.15. Sa dô tong quât quy trinh lên men sân xuât, tinh ché khâng sinh 36
PHÂN 3. KÊT LUÂN VÀ DE XUÂT........................................................... 38
3.1. Két luân:............................................................................................... 38
3.2. De xuât:.................................................................................................39
TÀI LIEU THAM KHÂO
PHU LUC


CHU GIÂI CHÜ VIÊT TÂT

ADN

Acid deoxyribonucleic

ATTC^

American Type Culture Collection
(viên bâo tàng giông chuân cüa Mÿ)

CWI

Cell wall I (thành té bào kiëu I)

BV

bênh viên

D

Dufcfng kmh vông vô khuan (vô-nâm) trung bînh

D

Ducfng kmh vông vô khuanj^û-ûam)
dmhc

dung môi hûu co

DT

Dich tê

HPLC

High performance liquid chromatography
(sàc kÿ long hiêu nàng cao)

IR

Infrared (hong ngoai)

ISP

International Streptomyces Project
(chuong trînh Streptomyces quôc te)

L. DAP

L-Diaminopimelat

MT

môi truômg

MTdd

môi trucfng dung dich

NST

nhiêm sâc thé

s

sai sô chuln co hiêu chînh

STT

Sô thu* tu

UV

Utra Violet (tir ngoai)

V

thé tfch

VM

Viên mât

VSV

Vi sinh vât

—t

’T f

DT VAN DE


Tir khi khõng sinh duoc tợm ra v dira vo ỷng dung, nhiờu bờnh nhiờm
trựng tựng l nan y m con nguụi phi bõt lire, dõ duoc chợra tri. Nhimg viờc
lam dung thuoc khõng sinh dõn toi tợnh trang rat nguy hiởm l ngy cng co
nhiờu vi khuõn khõng lai cõc khõng sinh sn cụ. De trõnh hõu quõ co thộ
chỹng ta bi dua lai tợnh trang giong nhu khi chua phõt minh ra cõc thuoc
khõng sinh: nhỹng bờnh nhiờm trựng don giõn nhõt cỹng khụng thộ diốu tri
duoc voi bõt kù thuoc khõng sinh no, thi di kốm vụi viờc sir dung hop l
khõng sinh, con nguụi phi tim ra duoc nhỹng khõng sinh moi.
Cựng viờc tao ra khõng sinh bng con duụng tong hop hoc bõn tong
hop, tim ra cõc chõt khõng sinh moi cụ nguụn gục vi sinh võt võn giỹ mụt vi
tri vụ cựng quan trong. Trong tong sụ hon 10.000 chõt khõng sinh dõ duoc
phõt hiờn v cụng bụ, cụ toi 66% l do xa khuõn sinh ra. Chi Streptomyces
gụm nhiờu xa khuõn cụ khõ nng sinh tong hop khõng sinh da dang vờ cõu
truc v dc diờm khõng khuõn. Mụt sụ loi trong chi ny cụn sinh tong hop
cõc chõt chợra ung thu.
Streptomyces 35.29 l chỹng xa khuõn duoc phõn lõp tự dõt, bựn...
Viờt Nam, nghiờn cuu cho thõy cụ dc tinh di truyờn on dinh, khõ nng sinh
tong hop khõng sinh pho rụng, cụ nhiờu tiờm nng dộ tien hnh cõc nghiờn
cỹu tiộp theo.
Do dụ chỹng tụi chon dờ ti Nghiờn cỹu lờn men sinh tong hop
khõng sinh tự Streptomyces 35.29 vụi cõc mue tiờu:
1. Nng cao hiờu suõt sinh tong hỗfp khõng sinh cỹa chỹng Streptomyces
35.29 bng dụt biờn ci tao giụng kột hop vụi sng loc ngõu nhiờn.
2. Hon thiờn hon cụng doan tõch chiột v tinh chờ'.
3. Buục du du kiộn cõc nhụm chỹ'c co bõn cỹa sn phõm khõng sinh duoc
sinh tong hỗfp.

1


PHAN 1. TễNG QUAN
1.1. KHNG SINH [1], [2], [3], [9], [12], [16]
1.1.1. Lich sur [1], [12], [16]
Nõm 1929, Alexander Fleming phõt hiờn ra khõ nõng khõng S.aureus cua
nõm Pộnicillium notatum, mụ du cho k nguyờn nghiờn cỷu v sỷr dung khõng
sinh. Nõm 1938, Florey v Chain dõ thuc nghiờm penicilin trong diốu tri. Nõm
1941, penicilin duỗfc lờn men trờn quy mụ cụng nghiờp dộ phuc vu diờu tri
thuong binh. Nõm 1944, Waksman phõt hiờn ra streptomycin. Hiờn nay, dõ co
hon 10.000 chõt khõng sinh duoc tợm ra, trong do khong hon 150 chõt duoc
dua vo sur dung dõ gụp phõn nõng cao tuoi tho v chõt luong cuục sụng cỹa
con ngirụi.
1.1.2. Dinh nghla khõng sinh [1]
Co nhiờu dinh nghợa khõc nhau vờ khõng sinh, song cụ thộ nờu lờn mụt
dinh nghợa duoc coi l khõ hon chợnh:
Khõng sinh l nhỷng sn phõm dõc biờt nhõn duỗrc tựr VSV hay cõc
nguụn tu nhiờn khõc, cụ hoat tmh sinh hoc cao, cụ tõc dung kùm hõm hoõc tiờu
diờt mot cõch chon loc lờn mot nhụm VSV xõc dinh (vi khuõn, nõm, nguyờn
sinh dụng võt v.v...) hay tộ bo ung thu, nụng dụ thõp.
1.1.3. Don vi khõng sinh [7]
L luỗfng khõng sinh toi thiởu pha trong mot thộ tich quy uục dung dich
cụ khõ nõng ỹc chộ hon ton su phõt triởn cỹa chỹng VSV kiởm dinh dõ
chon.
Vi du: Penicilin G 1 don vi = 0,6 (ig (l luong penicilin toi thiởu ho tan
vo 50 ml canh thang cụ khõ nõng ỷc chộ su phõt triởn cỹa S. aureus 209 P).
1.1.4. Phõn loai khõng sinh [1], [2], [9]
Khõng sinh phõn loai theo tmh nhay cm cỹa vi khuõn vụi khõng sinh

(khõng sinh diờt khuõn, khõng sinh kim khuõn), theo nguụn gục (do xa khuõn,

2


vi khuõn, nam...) tao ra, theo co chộ tac dung (khõng sinh uc chộ tong hỗfp
võch tộ bo vi khuõn, khõng sinh ỹc chộ tong hỗfp acid nhõn...), theo cõu truc hoõ
hoc. Trong dụ phõn loai khõng sinh theo cõu truc hoõ hoc l khoa hoc nhõt.
Theo cõu truc hoõ hoc, khõng sinh duoc phõn loai thnh cõc nhụm:
> Nhụm beta-lactam: penicilin, cephalexin...
> Nhụm aminoglycosid (aminosid): streptomycin, gentamicin...
> Nhụm macrolid: erythromycin, spiramycin...
> Nhụm lincosamid: linomycin, clindamycin...
> Nhụm tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin...
> Nhụm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol...
> Nhụm peptid: vancomycin, polymycin...
> Nhụm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin... |
> ( Nhụm co-trimoxazol : co-trimoxaroùT^,

jk,<;

1.1.5. tJng dung cỷa khõng sinh [1]
Y hoc: khõng sinh duỗfc sir dung tợr 1941 de diờu tri cõc bờnh nhiờm
trựng hiởm nghốo, chỷa ung thu.
Nụngnghiờp:
-

Trễng trot: tri bờnh khụ van, vng rui lỹa, thụl rờ cõy cụ cỹ

(Griseofulvin, polyoxin, validamycin, blasticidin...), kfch thich nõy mm...

-

Chõn nuụi: diờu tri viờm phội, viờm vu trõu bụ, tu huyột trựng Ion,

kich thfch tõng trong, kich thfch tõng sn luỗfng trixng g vit (bacitraxin,
terravit-tetracyclin+vitamin B12, Biovit-Biomycin+B12.
Cụng nghiờp thuc phõm: khõng sinh dựng bo quõn thuc phõm dụng
hụp (nisin, subtilin...)1.2. DAI CĩONG Vấ STREPTOMYCES [5], [6], [8], [12]
Streptomyces l mụt chi thuục bụ Actinomycetales phõn bụ rõt rụng rõi
trong tu nhiờn. Trong mụi gam dõt trụng trot nụi chung thuụfng cụ trờn 1 triờu

3


xa khuân. Phân lôn xa khuân là câc té bào Gram (+), hiéu khf hoai sinh, co
câu tao dang soi (khuân ti) phân nhânh.
Phân loai:
Lôp xa khuân bao gôm bô Actinomycetales và câc VSV giông thé.
Bô Actinomycetales gôm câc ho: Actinomycetacea, Streptomycetaceae...
Ho Streptomycetaceae gôm câc chi: Streptomyces, Nocardia...
Dâc diém hinh thâi và sinh lÿ cüa xa khuân chi Streptomyces
Streptomyces cô câc dâc diëm chung vê hinh thâi và sinh lÿ cüa xa
khuân nhu sau:
- Ducmg kmh khuân ti xâ'p xî khoâng tù 0,2-1,0 (im dén 2 |nm.
- Thành té bào xa khuân dày khoâng 7,5-10,0 nm, không cô cellulose, kitin.
- Khuân lac:
+ Bê mât: thô râp, dang phân, không trong suôt, cô câc nép gâp lan toâ vi
vây môi cô tên là xa khuân.
+ Khuân lac cô chân vüng châc, khô tâch ra khôi môi truông nuôi cây.
- Khuân ti ca chât:

+ Moc sâu trong môi truông nuôi cây, không phân càt trong suôt quâ
trinh phât triën.
+ Bê mât nhàn hoâc sân sùi.
+ Khuân ti ca chât tiét ra môi truông môt s6 loai sâc tô, cô sâc tô' hoà tan
trong nuôc, cô sâc tô hoà tan trong dung môi htru co.
+ Màu sâc khuân ti phong phü: trâng, vàng, dô, lue, tfm, nâu, den...
- Khuân ti khi sinh:
+ Khuân ti ca chât phât triën môt thôi gian thî dài ra trong không khf
thành khuân ti khf sinh.
+ Cô duông kmh tir 1,0-1,4 (im.
- Chuôibàotü:

4


+ Hùnh thnh tỹr khuan ti khi sinh, cụ nhiờu hợnh dang khõc nhau: thang,
uụn cong, mục hoõc xon lo xo.
- Botir:
+ Co quan sinh sn chỹ yộu cua xa khuan l bo tir trõn.
+ Duoc hinh thnh trờn cac nhõnh phõn hoõ cua khuan ti khi sinh, tao
thnh chuụi bo tir.
+ Trờn mụi nhõnh cụ ttr 10-100 bo tur, bo tir cụ thộ l hợnh cu, hợnh
elip, hoc hợnh tru hai du trụn, nộỹ bo tur hợnh cu kich thuục tir 0,3-0,8 fim,
cụn bo tu hợnh tru kfch thuục l 0,7; 0,8; 1,0 |j.m.
+ Bờ mõt cỹa bo tir cụ thộ cụ cõc kiởu tron nhn, xự xợ, cụ gai...
Ngoi ra Streptomyces cụ dc diộm riờng:
- Thnh tộ bo kiởu CWI cụ chỹa L.DAP v glycin.
- Streptomyces cụ thộ phõt triởn nhiờt dụ 20-40C nhitngnhiờt dụ thich
hop l 26-32C v pH thfch hop l 6,8 -7,5.
- Khõ nõng tao sc tụ cỹa Streptomyces duoc chia thnh bon loai: sc tụ

ho tan, sõc tụ khuan ti co chõt, sc tụ melanoid, sc tụ khuan lac.
1.3.

CI TAO GIễNG VI SINH VT [1], [7], [9], [10], [11], [15], [16]

1.3.1. Mue dich
VSV sinh khõng sinh phõn lõp duoc tự co chõt thiờn nhiờn thucmg cụ hoat
trnh thõp. Vợ võy dộ thu duoc cõc chỹng cụ hoat trnh cao dua vo sõn xuõt dụi
hụi phõi cõi tao giụng bõng cõc biờn phõp khõc nhau v nghiờn cuu diờu kiờn
nuụi cõy thfch hỗfp.
1.3.2. Phirong phõp cõi tao giụng
I.3.2.I. Chon loc ngõu nhiờn
Cõc VSV cụ su biờn di tu nhiờn theo tn sụ khõc nhau trong ong giụng
thun khiột, cụ cõ thộ cụ hoat tmh khõng sinh manh gõp 1,1-1,2 lõn nhỷng cõ A-iU*
thộ khõc. Cn phõi chon lõy cõ thộ cụ hoat tmh cao nhõt dộ nghiờn cỹu tiộp.

5


I.3.2.2.
-

Dụt bien nhõn tao
Cho tac dung cỹa cõc tac nhõn gõy dụt biộn manh nhu õnh sõng UV, tia

X hay nhỹng hoõ chõt: yperit, ethylenimin, nitrosoguanidin..., hay tõc nhõn
sinh hoc, vụi lieu luong v thụi gian thfch hop sờ giờt chột da sụ cõc VSV.
Nhỹng cõ thộ sụng sot sờ cụ su bien doi ụ NST, lm thay doi cõc tfnh trang,
dõn tụi hoõc mõt khõ nõng tao ra khõng sinh (dụt bien õm tmh) hoõc lm tõng
hiờu suõt sinh tong hofp khõng sinh (dụt bien duong tmh).

- nh sõng UV cụ kh nõng dõm xuyờn kộm nhimg vụi nhỹng tộ bo VSV
cụ kfch thuục nhụ (0,3-3,0 |im) thi nụ cụ thở xuyờn thõu tụi nhõn. Vợ võy duoc
dựng pho bien trong cõi tao giụng.
- Cõc yờu tụ õnh hirụng dộn hiờu quõ gõy chột v tõn sụ' phõt sinh dụt biộn:
+ Lieu luong chiờu: duoc dõc tnmg bụi 3 yờu tụ: thụi gian chiờu, khoõng
cõch chiờu, dụ pha loõng bo tir. Liờu luỗmg chiờu cng cao thi sụ luong dụt
biờn cng lụn v cuụi cựng dat dộn mot giụi han nhõt dinh.
+ nh sõng: sau khi chiộu õnh sõng UV lờn tộ bo nộu dộ ngoi õnh sõng
thuụng thi xõy ra hiờn tuỗfng quang phuc hoat lm qỹa trinh dụt biộn khụng cụ y
nghợa.
- Hiờu quõ gõy chột: thuụng õp dung dụt biộn gõy chột tự 75-90%, trong
cụng nghiờp cụ thở dụt biộn gõy chột tụi 99%.
1.4. LấN MEN SINH TONG HOP KHNG SINH [1], [7], [9], [12], [13], [15]
Cụ hai kiởu lờn men chfnh l lờn men bờ mõt v lờn men chợm.
1.4.1. Lờn men bở mõt
- VSV duoc nuụi cõy trờn bờ mõt mụi truụng rõn (cõm, bụt ngụ...) hay
long (dung dich duụng vụi mụt sụ nguyờn tụ vi luong), VSV hõp thu cõc chõt
dinh duụng cỹa mụi truụng v sỹ dung oxy khụng khf dở hụ hõp trờn bờ mõt
mụi truụng. Vi võy yờu cu dở lờn men bờ mõt l: bờ mõt mụi truụng phõi dỹ
rụng v lụp mụi truụng khụng quõ sõu (5-10 cm).
- Ifu õiộm: don giõn, dở thuc hiờn, dõu tu trang thiột bi thõp.

6


- Nhuac õiộm : cõn co mõt bng lõn, hiờu suõt thõp, kho tu dụng v co gioi
hoõ, chi phi nhõn cụng cho mot don vi sn phõm cao.
Do dụ phucmg phõp ny chợ con õp dung nghiờn cỹu trong phụng thf
nghiờm.
1.4.2. Lờn men chợm

VSV duoc nuụi cõy phõt triộn trong ton bụ mụi truụmg long.
Giụng VSV dựng trong lờn men phi l cõc tộ bo sinh duụng dang
giai doan phõt triộn manh v co khõ nng dụng hoõ võt chõt cao nhõt. Vi võy,
truục khi lờn men phi co giai doan nhõn giụng (giụng cõp 1,11,III ):
- Giụng cõp I: nuụi cõy trong bùnh non 500 ml trờn mõy lõc.
- Giụng cõp H: nuụi cõy trong bợnh 501.
- Giụng cõp El: nuụi cõy trong bợnh tự 1,0-5,0 m3.
Tợ le giụng trong mụi truụmg lờn men tỹ 1,0-10,0%. Quy mụ giụng phu
thuục vo quy mụ cỹa bợnh lờn men.
Quõ trợnh lờn men cụ thộ lm thay dụi cõc diờu kiờn ban du cỹa mụi
truụmg: pH, nụng dụ cỹa cõc thnh phõn trong mụi truụmg, cụ cõc sn phõm trao
dụi chõt, tao bot trờn bờ mt mụi truụmg... De dõm bõo nhỹng diờu kiờn toi uu
cho su phõt triộn cỹa VSV trong quõ trợnh lờn men, nguụi ta dõ dua vo mụt sụ
bien phõp: dựng dờm chõt de ụn dinh pH, thờm chõt phõ bot, bụ sung dinh
duụng...
- Lfu õiộm: hiờu suõt sinh khõng sinh cao, mụi truụmg dinh duụng duoc sỹ
dung triờt dộ, tiột kiờm mõt bng sn xuõt, dộ co gioi hoõ, tu dụng hoõ, chi phi
cho mụt dom vi sõn phõm thõp, co thộ khai thõc trờn quy mụ lom. Do do,
phuomg phõp ny duoc lua chon cho cụng nghiờp sõn xuõt khõng sinh.
- Nhuỗfc õiộm: khụng thộ xỹ l eue bụ, yờu cõu phõi cụ thiột bi chuyờn
dựng (thiột bi chiu õp lue, diộu kiờn vụ trựng tuyờt dụi...), cõn cõn bụ chuyờn
mụn hoõ...nờn chi phi dõu tu lom.

7


❖ Phân loai:
- Lên men giân doan (lên men chu kÿ) :
Quâ trînh lên men giân doan duoc xem nhu là môt hê thông km. Trong
suot thcti gian lên men không co tac dông hay bô sung chât dinh duông vào môi

tnrcmg lên men trùr viêc cung câp khi oxy, chât phâ bot, dêm chât on dinh pH.
Câc giai doan phât triën cüa VSV: quâ trînh sinh tnrong cüa VSV diên
ra theo câc pha phât triën, bao gôm: pha tiêm phât, pha logarit, pha cân bâng,
pha suy vong.
LnX

►t
Hînh 1.1: Dàc diëm phât triën cüa VSV trong môi truông long
1: Pha tiêm phât, 2: pha logarit, 3: pha cân bàng, 4: pha suy vong,
X: sinh khôl khô VSV, t: thôiï gian lên men.
Trong công nghiêp, quâ trînh lên men két thüc phu thuôc vào diëm
dùng cüa sinh tong hop hoat chât hoâc khi viêc sinh tong hop hoat chât dâ bi
châm lai, nêu tiêp tue lên men sê không mang lai hiêu quâ kinh tê'.
- Lên men cô bo sung:
Nông dô ban dâu cao cüa mot so chât (glucose, câc hop chât nito,...) ûc
ché viêc tao ra sân phâm trao doi chât thû câp. Do dô dë nâng cao hiêu suât
lên men, khi bât dàu lên men, câc thành phân dô duoc dua vào voi nông dô
thâp và duoc bo sung vào hê thông trong quâ trînh lên men.

8


1.5.

CHIẫT TCH-TINH CHấ [1], [4], [7], [9], [11]
Khõng sinh l sn pham trao doi chõt thỷ cõp. Kột thỹc quõ trợnh lờn

men, khõng sinh cụ thộ nõm trong sinh khụi (vf du: gramicidin, nystatin...)
hoõc trong dich loc (vf du: penicilin, streptomycin...) tu theo dõc diởm cỹa
loi. Vi võy, khi chiột tõch dở lõy khõng sinh phõi lua chon phuong phõp thfch

hop. Viờc lua chon phuong phõp phu thuục vo bõn chõt cỹa khõng sinh.
Mot sụ phuong phõp tõch chiột hay duoc sỹ dung:
- Phuong phõp chiờt bng dung mụi hựu co.
- Phuong phõp kột tỹa.
- Dựng nhua trao doi ion.
1.5.1. Chiột xuõt
- Dinh nghùa: Chiột l phuong phõp dựng dung mụi (don hay hụn hop)
khụng dụng tan vụi hụn hop cõn chiột dở tõch lõy mot chõt hay mot nhụm chõt
tự hụn hop cõn nghiờn cỷu.
- Nguyờn tac: Dua trờn su phõn bụ cỹa chõt tan vo hai pha khụng dụng
tan voi nhau. Dụ l pha dung mụi chiột v dich loc dich lờn men hay sinh khụl
dở tõch riờng chõt khõng sinh (cụ thở l mụt chõt hay mot nhụm chõt).
1.5.2. Tinh chộ sõn phõm
- Dinh nghùa: l mụt nhụm cõc phuong phõp hoõ hoc, võt l v hoõ l
nhm di tir mụt hụn hop phrùc tap dờn mot hụn hop don gin v tự hụn hop don
giõn tõch riờng tựng chõt.
- Cõc phuỷng phõp tõch hụn hỗ/p dụng nhõt:
+ Phuong phõp chia ct pha: L phuong phõp di tự hụn

hopdụngnhõt

(mụt pha) tõch thnh hụn hop khụng dụng nhõt (hai pha).
+ Phuong phõp chuyởn pha: Chiột, thõm thõu, cõc phuong
+ Phuong phõp biờn dụi trang thõi: Cõt, thng hoa.

9

phõp sc k.

- Sõc k:
+ Sõc k l phucmg phõp tõch v phõn tfch dua vo su phõn bo cỹa hoat
chõt giỹa hai pha luụn tiộp xỹc v khụng ho tan lõn nhau: pha dụng v pha tợnh.
+ Theo bõn chõt hiờn tuong sõc k co thộ chia sõc k thnh bon loai: sõc
k hõp phu, sõc k phõn bụ, sõc k trao doi ion v sõc k trờn gel.
Khi chiột tõch v tinh chộ sõn phõm nguụi ta dựng kột hỗfp c hai phuong
phõp: phuong phõp chia cõt pha v phuong phõp chuyờn pha.
1.6. PHễ PHN Tĩ [4]
1.6.1. Pho tuf ngoai khõ kiờn (UV-VIS)
Nõng luỗmg cỹa mụt phõn tỹ E bao gụm nng luỗmg cỹa chuyờn dụng
tinh tiộn cỹa phõn tỹ Et, nng luỗmg cỹa diờn tỹ Ee, nng luỗmg cỹa chuyờn
dụng dao dụng Ev v nõng luỗmg cỹa chuyờn dụng quay Er:
Etộng= Et +Ee+ Ev + Er
trong dụ

Eeằ Ev ằ Er

Su hõp thu nõng luỗmg cõc bỷc xa tỹ ngoai v khõ kiộn lm thay doi
mue nng luỗmg cỹa diờn tỹ Ee.
- Cõc diờn tỹ tham gia vo su hõp thu:
+ Cõc diờn tỹ liờn kột: diờn tỹ a (trong Hydrocarbon no), diờn tỹ n (trong
Hydrocarbon chua no).
+ Cõc diờn tỹ phi liờn kột: diờn tỹ ns, np (vi du: O, N, Cl).
- Cõc nhụm chuc hoõ hoc tham gia vo su hõp thu õnh sõng:
+ Nhụm mang mu: cõc nhụm >C=0, -N=0 ...(hõp thu chỹ yộu bỹc xa
cụ buục sụng X = 300 4- 305 nm); cõc nhụm -N=N, >C= S-...(chỹ yộu hõp thu
bỹc xa cụ buục sụng X > 190 nm).
+ Nhụm tõng mu: cõc halogenua (CT; Br ; I' ); cõc alkyl (-CH3; -QHj),
cõc amin (-NH-)... chỹ yộu hõp thu bỹc xa cụ buục sụng ,< 200 nm.

10


1.6.2. Pho hụng ngoai (IR)
+ Dinh nghợa: dirdng cong biởu diởn su phu thuục cỹa ctfcmg dụ hõp thu
birc xa hụng ngoai cỹa mot chõt vo sụ sụng hoõc buục sụng l pho hõp thu
hụng ngoai, thuụng goi don giõn l pho hụng ngoai cỹa mot chõt.
+ Ca sa l thuyet: Ta cụ sụ sụng:v =

2 TTC y M R

Mr

goi l khụi luong rut gon phõn tỹ. Vori phõn tu cụ hai nguyờn tỹ A

va' D
B *ta co:

1
1
M , XM R
---= 1 +------->
MD= B
m r

m a

m b

r

m a+m b

Nhu võy khi M Rcng lụn thù v cng nhụ.
+ Nguyờn tac: trong phõn tỹ khi cụ nhom nguyờn tỹ no dụ hõp thu
nõng luỗmg v thay doi trang thõi dao dụng thù tao nờn mụt di hõp thu trờn
pho IR. Cụ mụi tuofng quan giợra nhom nguyờn tỹ v di hõp thu nờn cụ thở
dua vo su cụ mõt cỹa di hõp thu dở nhõn biột mot nhom chuc no dụ. Nhiờu
nhom chỷc cụ cõc di hõp thu dõc trung. Dõy l co sụr cỹa viờc phõn tfch cõu
truc bang phộ IR.
1.7. Mot so kột quõ moi trong nghiờn cỹru khõng sinh [18], [19], [20]
1.7.1 Phõn lõp khõng sinh mụi alaremycin cụ cõu truc tuong tu acid 5aminolevunic tựr Streptomyces sp. A012304
Alaremycin l khõng sinh mụi cụ cõu truc tuong tu acid 5-aminolevunic
(ALA)-tiờn chõt tong hop Hem. Phõn lõp tỹ MT lờn men chỹng xa khuõn
(phõn lõp tỹ mõu dõt Yokohama-Nhõt Bn). Ki hiờu Streptomyces sp.
AO12304.
MT nhõn giụng (glucose 4%, cao thit 1%, bot dõu tuong 0,3%, CaC03
0,3%, pH 7,0), trong bợnh lõc vụi toc dụ 300 vong/phỹt 30C trong 4 ngy. MT
lờn men (dextrin 6%, men khụ 2%, NaQ 0,3%, CaC030,3 %, cao thit 0,1% v
K2HP04 0,1% ), bợnh lờn men 30C vụi tục dụ quay 220 vụng/phỹt trong 4 ngy.

11


Xü lf dich lên men vcii Diaion HP-20, sau do chiêt bang ethylacetat pH
2. Lôp dmhc duoc chiét lai voi nuôc à pH 9. Lôp nuôc thu duoc dem sâc kÿ
trao dôi ion QMA. Chiét dich rua giài voi ethylacetat à pH 2. Bay hoi lop
dmhc dén cân. Tù 21 dich lên men thu duoc 150 mg bot trâng.
Câu truc hoâ hoc cüa alaremycin là acid 5-acetamido-4-oxo-5-hexenoic
(C8HuN 04) nhc* phép phân tfch phé khoi và công huông tù hat nhân. Câu truc

cüa Alaremycin gân giông khâng sinh khâng nam primocarcin phân lâp tù xa
khuan Norcadia fukayae.
Hoat lue khâng khuan cüa Alaremycin duoc tâng cudng khi cô mât
ALA (VSV kiëm dinh là E. Coli), mâc dù bân thân ALA không cô khà nâng
khâng khuan ngay cà à nông dô 1000 jug/ml. Chua xâc dinh duoc co ché tac
dung.
1.7.2. Kiém soât sinh hoc nam hoai sinh gô voi Streptomyces
violaceusninger XL-2
Chüng xa khuan duoc phân lâp tù vô cây rùng Dehradun-An Dô, duoc
nhân dang là Streptomyces violaceusninger, dâ cho thây cô su dôi khâng
manh më voi nhiêu loai nâm hoai sinh gô nhu: Phanerochaete chrysosporium,
Postia placenta, Coriolus versicolor, và Gloeophyllum trabeum. Nhùng
nghiên cüu cho thây hop chât hoat dông sinh hoc ngoai bào chiu trâch nhiêm
dôi khâng. Diêu kiên sàn xuât tâc nhân kiëm soât sinh hoc duoc toi uu hoâ
(Môi trucmg YCED chûa cao nâm men, acid casamino, và dextrose, bo sung
0,3 w/v kitin tinh khiét, pH 5,5 nhiêt dô 28°C, thdi gian 72h). Tinh ché bàng
hê thông sâc kÿ trao dôi anion sü dung côt DEAE-cellulose, thu duoc protein
don chât trong natri dodecyl sulfat - polyacrylamid gel 10%. Nhân dang
protein- tâc nhân chiu trâch nhiêm kiëm soât sinh hoc cüa Streptomyces
violaceusninger dôi voi nâm hoai sinh gô này là 28,259 kDa endochitinase.

12


1.7.3. Chựm gen chiu trõch nhiờm sinh tong hop validamycin trong
Streptomyces hygroscopicus subsp. jinggangensis 5008
Chựm gen chiu trõch nhiờm sinh tong hop validamycin, mot khõng sinh
aminocyclitol duoc sur dung rụng rõi trong kiởm soõt tõc nhõn gõy bờnh khụ
vn lỹa, nhõn duoc tựr Streptomyces hygroscopicus subsp. jinggangensis
5008, su dung thm do di thộ abcC-gen bao quõt su dụng vong Dsedoheptulose 7-phosphat thnh 2-epi-5-epi-\aliolone trong sinh tong hỗfp

acarbose tự Actinoplanes sp. chỹng SE50/110. Su mõt doan 30-kb ADN tỹ
chựm gen trong NST gõy hõu quõ mõt sõn xuõt validamycin, chỹng tụ su liờn
quan chrnh cỹa chựm gen trong sinh tong hop chõt bõo vờ thuc võt quan trong
ny. Doan 6-kb chợra valA (gen abcC dụng thộ mõ hoõ cyclase giõ dinh) nhu
hai khung doc mụ hon chợnh bd tro (valB v valC mõ hoõ lõn luot
adenyltransferase v kinase giõ dinh), duoc to chuc nhu mot operon. Chỹc
nõng cỹa ValA theo tiờu chuõn gen duoc chợ ra l thiột yộu cho su sõn xuõt
validamycin v vờ mõt sinh hoõ chiu trõch nhiờm riờng cho su dụng vong Dsedoheptulose 7-phosphat thnh 2-epi-5-episaliolone m trong thỹ nghiờm in
vitro dựng ValA di thộ sn xuõt du trong E. coli. Thụng tin thu duoc l co sụ
cho nghiờn cỹu phõn tfch chi tiột cõch thỷc sinh tong hop hon chợnh, dinh
huotig dộ hiởu dõy dỷ sinh tong hop validamycin.

13


PHÂN 2. THUC NGHIÊM VÀ KET QUÂ
2.1. NGUYÊN LIÊU VÀ PHUONG PHÂP THlTC NGHIÊM
2.1.1. Nguyên vât lieu
❖ Chüng xa khuân:
• Chüng xa khuân Streptomyces 35.29 do phông thi nghiêm vi sinh, bô
môn Vi sinh-Sinh hoc, Truông dai hoc Duoc Hà Nôi cung cap.
• Giông vi sinh vât kiëm dinh: giông vi sinh vât kiëm dinh do bô môn
Vi sinh -Sinh hoc, Trucmg dai hoc Duoc Hà Nôi cung câp.
Bâng 2.1: Câc chüng VSV kiëm dinh
Chüng VSV kiëm dinh

Viét tat

Escherichia coli

ATTC 25922

Proteus mirabilis

BV 108

Shigella flexneri
Salmonella typhi

E.coli
P. mirabilis
S.flexneri

DT 112
DT 220

S. typhi

Pseudomonas aeruginosa VM 201

P. aeruginosa

Staphylococcus aureus ATTC 1128

S. aureus

Bacillus pumïlus

ATTC 10241

B. pumilus

Bacillus subtilis

ATTC 6633

B. subtilis

Bacillus cereus

ATTC 9946

B. cereus

Sarcina lutea

ATTC 9341

S. lutea

Candida albicans

C. albicans

Moc xanh sp. 1
Moc den sp. 1

14

❖ Thành phân câc môi tnrdng sir dung duoc ghi trong bâng 2.2:
Bâng 2.2 : Thành phân câc môi truông sir dung

Thành phân
Tinh bot

MT2 MT2dd

MT

MT

canh

thach

thang thirông
2

2

KC1

0,05

0,05

NaN03

0,2

0,2

KH2P04

0,1

0,1

MgS04.7H20

0,05

0,05

NaCl

0,5

MT

MT

Sabouraud Sabouraud
long

dâc

2,0

2,0

1,0

1,0

0,5

Glucose
Pepton

0,5

0,5

Cao thit

0,3

0,3

Thach

2

0

0

1,6

0

1,8

Nuôc

100

100

100

100

100

100

pH

6,i3-7,2

7,0'-7,5

❖ Vât lieu dùng trong sàc kÿ:
- Bân mông sàc kÿ: silicagel 60 F254 Merck,
- Dung môi chay sàc kÿ: câc dung môi trong bâng 3,
- Binh chay sàc kÿ,
- Côt sàc kÿ: ducrng kfnh 1,6 cm, dài 70 cm,

- Hat silicagel 60 Merck (0,063-0,2 mm),
- Mao quân thfch hop.

15

6,0-6,5


❖ Câc dung môi dâ sir dung:
Bàng 2.3 : Câc dung môi sir dung
Dung môi

Khoi lirçmg

Nhiêt dô soi

riêng (g/cm3)

(°C)

Methanol

0,791-0,793

64,5

Ethylacetat

0,902

77

Ethanol

0,789-0,791

78,3

Cloroform

1,470-1,480

60-62

n-Butanol

0,81

117

Aceton

0,79

56

Triethylamin

0,726-0,728

90

Amoniac

0,91

Dimethylformamid (DMF)

0,946-0,950

153

❖ Tâc nhân gây dôt bién:
Ânh sâng UV (À,=254 nm) nguôn phât Toshiba 60W-220V.
♦♦♦ Mây môc, thiét bi khâc:
- Mây lâc Taitec Bio-Shaker BR 300 Lf,
- Tü âm Trung Quôc, Binder, Memmert 30°C, 37°C,
- Tü lanh, tü lanh sâu - 35°C Sanyo Biomédical Freerer,
- Cân kÿ thuât Précisa, Sartorius, cân phân tfch Sartorius BP

121 S,

- Tü cây Aura vf 48, Bassaire, Sanyo cleanbench,
- Tü sây Shallab model 1350 fx,
- Mây cât quay Buchi Waterbath B-480,
- Nôi hâp Hirayama Hiclave HEV-25, Hirayama Newclave Mole HL,
- Mây do quang pho hông ngoai FT-IR Spectrophometer 1650 Perkin
Elmer,
- Mây do quang pho tü ngoai UV-VIS Spectrophometer cary

16

ie-varian,


- May do nhiêt dô nông chây Gallen-Kamp,
- Patuyn, pipet, ong dong, coc cô mô, ong nghiêm, bînh non, dèn côn...
2.1.2. Phirong phâp nghiên cuta
A. Phirong phâp gây, giùr giông trong ong thach nghiêng:
Mue dich: Bào quàn câc chüng giông thuân khiê't dâ phân lâp, câc dang
chüng sau sâng loc ngâu nhiên, câc bién chüng sau dôt bién nhân tao... cho
câc nghiên crïu tiép theo.
Tien hành:
Chuân bi môi trucmg phân lâp (MT2): cân, pha, chînh pH, dun soi, khuây
trôn, phân dèu vào câc ô'ng nghiêm, môi ô'ng 5-6 ml, tiêt trùng à latm/20 phüt
roi dàt thach nghiêng. Khi môi tnrôrng dâ nguôi, dùng que cây vô trùng cây
zigzac câc té bào Strepstomyces 35.29 thuân khiê't lên bê mât thach nghiêng.
Dë phât triën à 30°C, sau 6 ngày xa khuân tao bào tü màu vàng, dem cât giù
trong tü lanh 2-4°C. Dinh kÿ cây truyên sau 3-6 thâng.
B. Dânh giâ hoat tînh khâng sinh bàng phirong phâp khuyéch tân:
Nguyên tac:
Mâu thü duoc dua lên lôp thach dinh duông dâ cây VSV kiëm dinh, khâng
sinh tù mâu thü khuyéch tân vào môi trucmg thach sê üc ché su phât triën cüa
VSV kiëm dinh tao thành vông vô khuân.
Tien hành:
- Chuân bi môi truôrng cây VSV kiëm dinh:
VSV kiëm dinh duoc cây vào môi trucmg canh thang (doi voi vi khuân); môi
trucmg Sabouraud long (doi vôi nâm men) hoâc dua vào dung dich tween 80
(hoâc dung dich xà phông) 0,1% (doi vôi nâm mô'c). Nuôi cây tao hôn dich
VSV kiëm dinh cô nông dô tù 107-108 té bào/ml bàng câch ü trong tü âm ô

nhiêt dô 37°C trong 18-24 giô (doi vôi vi khuân), à nhiêt dô 30°C trong 24-48
giô (dô'i vôi vi nâm). Dua hôn dich này vào môi truông thach thucmg (doivoirv
khuân), vào môi trucmg Sabouraud dâc (doi vôi vi nâm) à nhiêt dô 45^C -50°C
)5/./o/c


sau khi dâ hâp tiêt trùng à 1 atm/20 phüt voi tî lê Vgiông/Vthach thucmg
=5/200, lâc dë VSV kiëm dinh phân tan dêu trong môi tnrôfng, do vào hôp pétri
voi thë tfch 20 ml/hôp.
- Dira mâu thir vào hôp pétri co chiîa môi tnrdng VSV kiëm dinh: cô ba
câch dira mâu thir vào môi truôrng VSV kiëm dinh:
+ Khôl thach: dât khôl thach chura VSV sinh khâng sinh lên bê mât môi
trucmg VSV kiëm dinh.
+ Giéng thach: duc câc giêng trên môi trucmg chua VSV kiëm dinh ((j)=
7,0 mm), sau dô cho mâu thir dang dich loc vào, môi giéng 0,05 ml dich loc.
+ Khoanh giây loc: khoanh giây loc (ba lân dich chiêt dung môi hüu co cüa mâu thir, sây khô à t°C< 50°C, sau dô
dât lên bê mât môi trucmg VSV kiëm dinh.
+ Nuôi cây: câc hôp pétri cô mâu thir duoc ü trong tü âm à nhiêt dô 37°C
trong 18-24 giôr, (dôi voi vi khuan), à 30°C trong 24-48 gid (dôi voi vi nâm).
- Dânh giâ két quà: dua trên ducmg kfnh vong vô khuan (vô nâm) và duoc
dânh giâ theo công thiîc:
S a
D=—---

_

s=

n

± { n ,- D Î
Ï= 1

n- 1

D : ducmg kmh trung binh vong vô khuân (vô nâm),
Di : dudng kinh vong vô khuan (vô nâm) thu: i,
s: dô lêch thuc nghiêm chuân cô hiêu chinh,
n: sô thf nghiêm làm song song.
C. Phirong phâp câi tao và chon giông:
*t* Phirong phâp chon loc ngâu nhiên
Mue dich: Chon loc ngâu nhiên lây nhüng câ thë cô biên di tu nhiên cho
hoat tmh khâng sinh cao nhât so voi câc câ thë khâc tù ong giông thuân khiét.

18


Tien hành:
- Pha hôn dich bào tir: lây mot vong que cây bào tir Steptomyces 35.29
cho vào ong nghiêm chûa 10 ml nuôc cât vô trùng, làc cho bào tir phân tan dêu
thu duoc hôn dich bào tir à dô pha loâng 10'1 dinh uôc. Sau dô pha loâng tiép
dén nông dô 10‘6 bàng nuôc cât vô trùng.
- Cây bào tir: dùng pipet vô trùng hüt chmh xâc 0,1 ml hôn dich bào tü
ô câc dô pha loâng 10'4-10'6, nhô lên bê mât thach cüa môi truong 2 trong hôp
pétri. Dùng que trang vô trùng dàn dêu giot hôn dich bào tü trên bê mât thach.
Tién hành trên 3 hôp pétri cho môi nông dô pha loâng, cho câc hôp pétri vào
tü âm 30°C trong 6 ngày cho khuân lac phât triën.
- Phép chon loc ngâu nhiên: chon ngâu nhiên câc khuân lac phât triën
tôt, moc riêng rë sau 6 ngày, cây zigzac lên bê mât MT2 trong hôp pétri và

ong thach nghiêng-cùng môt khuân lac, ü à 30°C trong 6 ngày roi lây ra thü
hoat tinh khâng sinh bàng phuong phâp khôi thach. Dânh giâ két quâ, kra
chon 3-5 bién chüng tôt nhât dë tién hành câc nghiên cüu tiép theo.
❖ Phuong phâp dôt bién câi tao giông bàng ânh sâng UV:
Mue dich: Câi tao nhüng chüng cô hoat tinh cao sau sàng loc ngâu
nhiên nhàm nâng cao hiêu suât sinh khâng sinh.
Tién hành:
Pha hôn dich bào tü: lây môt vong que cây bào tü Streptomyces 35.29
cho vào 10 ml nuôc cât vô trùng, lâc dêu tao hôn dich bào tü à dô pha loâng
10'1 dinh uôc. Sau dô, dùng 1 ml hôn dich bào tü này pha loâng dén nông dô
10'6 làm mâu chüng, 9 ml con lai duoc dua vào hôp pétri vô trùng. Dôt bién
dudti tâc dung cüa ânh sâng UV: hôp pétri vô trùng cô chüa 9 ml hôn dich bào
tü à nông dô 10'1duoc chiéu ânh sâng tü ngoai voi câc thông sô sau:
+ Buôc sông: 254 nm,
+ Khoàng câch chiéu 1=60 cm,
+ Thôti gian chiéu t=5 phüt.

19


Hôn dich bào tir sau khi chiêu duçfc dua vào chô tôi 2-3 giôf, sau dô
dùng pipet vô trùng pha loâng dén nông dô 10 4, 10'5.
Cây câc bào tù sau dôt bién: dùng pipet vô trùng hüt chrnh xâc 0,1 ml
mâu chùng và 0,1 ml hôn dich bào tù dâ dôt bién à câc nông dô 10'4, 105, cho
vào hôp pétri cô chùa MT2, sau dô dùng que trang vô trùng dàn dêu giot hôn
dich bào tù trên bê mât thach, môi dô pha loâng làm 3 hôp song song, câc hôp
pétri sau khi dâ cây ü à nhiêt dô 30°C trong 6 ngày cho khuân lac phât triën.
Dém câc khuân lac, xâc dinh % dô sông sot theo công thùc:
% sông sô t= ^ -x 100
Nm: sô khuân lac trung bînh sau dôt bién.

N0 : sô khuân lac trung bînh trong mâu chùng.

Tién hành sàng loc vôi câc khuân lac sau dôt bién tuong tu nhu phuong
phâp chon loc ngâu nhiên.
Song song làm mâu chùng.
Thù hoat tmh, xâc dinh % bién doi hoat tmh theo công thùc:
% bién doi hoat tmh = = x 100
D0
D, : ducfng kmh vông vô khuân trung bînh cüa bién chüng thü i sau dôt
bién.
D0 : ducfng kmh vông vô khuân trung bînh cüa mâu chùng.
Sau khi tién hành dôt bién, dua vào két quâ thu duçfc lua chon ra câc
bién chüng cô % bién doi hoat tmh (+) cao nhât dë tién hành câc nghiên cùu
tiép theo.
D. Phirong phâp lên men giân doan:
Mue dich :
Chon duçfc chüng tôt nhât dinh huôfng cho quy mô sàn xuât công nghiêp.

20


Tien hành:
- Tao giông câp I: chûng giông Streptomyces 35.29 sau khi nuôi cây trên
thach nghiêng (MT2) du 6 ngày tuoi duoc cây vô trùng sang bînh non 500 ml
chüa 100 ml MT2 dung dich bàng 10 ml nuôc cât vô trùng, lâc trên mây lâc
trôn à nhiêt dô t°C = 30 + 0,1 °C, tâc dô quay 140 vông/phüt trong 48 h.
- Lên men: sau 48 h nhân giông, giông câp I duoc cây vô trùng vào binh
non chüa MT2dd voi tÿ le Vgiông:Vmôi truông=l: 10, câc bïnh lên men lâc à
t°C= 30 ± 0,1°C, toc dô quay 140 vông/phüt trong 120 h.
E. Phirong phâp chiét khâng sinh bàng dung môi hüru co:

❖ Chiét khâng sinh ngoai bào:
Dich lên men sau khi loc tâch sinh khôl, dich loc duoc chînh vê pH thfch
hop roi dùng dung môi hüu co dë chiét.
Phuong phâp chiét mot làn: dich loc và dung môi duoc cho làn luot vào
bïnh gan theo tî le Vdung môi: Vdich loc = 1: 5, lâc mot phüt, dë phân lop .
Sau dô gan riêng dung môi và dich loc.
Hoat tmh khâng sinh cüa dich chiét và dich loc sau môi làn chiét duoc
kiëm tra bâng phuong phâp khoanh giây loc và giéng thach.
❖ Chiét khâng sinh nôi bào:
Sinh khôl duoc rüa sach voi nuôc cât (3-5 làn), sây khô à nhiêt dô duoi 50°C.
Cân sinh khôi khô, cho vào nghiên cùng dmhc theo tÿ le 1 g sinh khôl khô: 5 ml
dmhc. Loc, thü hoat tmh dich chiét bàng phuong phâp khoanh giây loc.
F. Phuong phâp sâc kÿ lop mông:
Mue dich: Két quâ sâc kÿ lôp mông buée dàu cho ta biét mâu thü cô bao
nhiêu thành phân, dông thôi së chon duoc dung môi thfch hop dë tâch riêng câc
thành phân.
Tien hành:
-

Bân mông sâc kÿ cô kfch thuôc thfch hop, duoc hoat hoâ à 110°C trong

vong 30 phüt, dung môi duoc pha theo dung tî le cho vào bïnh sâc kÿ (chiêu

21


cao lụp dung mụi khụng quõ 1 cm), chõm dich chiột co chỹa hoat chõt cõn sõc
k lờn bõn mụng dõ hoat hoõ, cõch mộp duụi 1,5 cm. Sõy khụ bn mụng ụ 4050C, rụi cho vo binh chay sõc k. Khi dung mụi chay dộn 3/4 bõn mụng, bụ
ra dõnh dõu vột dung mụi chay, xõc dinh vột bng phuong phõp:
+ Soi dốn tir ngoai: bn mụng sõc k trõng sn dõ duoc trụn voi mot

chõt co hunh quang duoi õnh sõng tir ngoai, khi soi duoi buục sụng thfch
hofp, nộu cụ vột thir sở cho mõu thõm duụi dốn tỹ ngoai.
+ Phuong phõp hiờn mu hoõ hoc: phun thuoc thợr hiờn mu lờn bõn
mụng, sõy ụ 60C trong 10 phỹt dộ phõt hiờn vột.
+ Phuong phõp hiờn hùnh VSV: dõt bõn mụng vo hụp pộtri vụ trựng, do
mụi trucmg thach dõ tiờt trựng cụ chỹa VSV kiởm dinh, u ụ 37C trong 24 giụf.
Vột khõng sinh duỗfc xõc dinh bng su xuõt hiờn vong vụ khuõn.
Tinh Rf:

Rf= A,
Aim

Dv: khong cõch tự diộm xuõt phõt dộn tõm cỹa vột.
Dm: khong cõch dung mụi chay.
G. Phuong phõp cõt quay:
Mue dich: Thu bot khõng sinh thụ (hoõc tinh) tự dich chiột dmhc (hoc
dich tinh chộ), dộ tiộn hnh cõc thuc nghiờm tiộp theo.
Tiộn hnh: cõt quay dich chiột dmhc trong diờu kiờn õp suõt giõm v nhiờt
dụ duụi 80C. Sõy khụ cõn ụ t < 50C, cõn chmh xõc, ghi kột quõ v cõt giỷ bụt
khõng sinh thu duỗfc trong tỹ lanh. Dung mụi thu hụi giỹ lai dộ sỹ dung.
H. Phuong phõp sac k cụt:
Mue dich: Nhm tinh chộ v tõch riờng cõc thnh phõn trong bụt khõng
sinh thụ.
Tiộn hnh:
-

Chuõn bi cụt: cụt sõc k duụng krnh 1,6 cm, di 70 cm, chiờu cao lụp

chõt nhụi 15 cm. Chõt nhụi duỗfc dựng l silicagel 60 Merck (0,063-0,2mm).

22