SÀNG LỌC MỘT SỐ VỊ THUỐC, BÀI THUỐC NHẰM ĐIỀU CHẾ THUỐC ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN MẠN DO SIÊU VI B

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

SÀNG LỌC MỘT SỐ VỊ THUỐC, BÀI THUỐC NHẰM ĐIỀU CHẾ
THUỐC ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN MẠN DO SIÊU VI B
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Bùi Thị Bằng
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu

7412
22/6/2009

Năm 2008


Những chữ viết tắt
AASLD

Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Mỹ

ALT

Alanine aminotransaminase

AST

Aspartate aminotransaminase

CCl4

Carbon tetraclorid

EtOAc

Ethyl acetat

FDA

Cục Dược và Thực phẩm Hoa Kỳ

GOT

Glutamic oxaloacetate transaminase

GPT

Glutamic pyruvic transaminase

HBsAg

Kháng nguyên bề mặt của virút VGB

MDA

malonyl dialdehyd

NCKH

Nghiên cứu khoa học

SKLCA

Sắc ký lỏng cao áp

VDL

Viện Dược liệu

VGB

Viêm gan B

VGMHĐ

VGB mạn hoạt động

WHO

Tổ chức Y tế thế giới

YHCT

Y học cổ truyền


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài:
Viêm gan siêu vi B (viêm gan B) là bệnh nhiễm trùng gan nặng do virút viêm gan
B gây ra. Bệnh viêm gan B (VGB) nằm trong danh mục 10 bệnh dịch gây tử vong cao
nhất trên thế giới. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) hiện có khoảng 400
triệu người trên toàn cầu nhiễm virút viêm gan B, hơn nửa triệu người chết mỗi năm do

ung thư gan nguyên phát thì có đến 80% là do VGB. Viêm gan B mạn tính nếu không
được điều trị có thể dẫn đến suy gan, xơ gan, ung thư gan và tử vong. Suy gan và ung thư
gan do VGB mạn tính làm chết nhiều người tại châu Á, từ 350.000-400.000 người/năm.
Tại VN các số liệu điều tra về dịch tễ học cũng cho biết có khoảng 15% dân số,
tương đương 12 triệu người đang bị nhiễm virút VGB, cao gấp 40 đến 50 lần số người
nhiễm HIV. Theo Hội Ung thư toàn cầu, Việt Nam đang đứng thứ 2 về ung thư gan và
90% căn bệnh nguy hiểm này do viêm gan B gây ra, 20,5% mắc phải ở người lớn và tỷ
lệ nam thường cao hơn 5 lần phụ nữ [simci.org].
Theo hướng dẫn mới của Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Mỹ (AASLD) được công
bố tại hội nghị APASL 2007 ở châu Á, mục tiêu cơ bản của điều trị VGB mạn là đạt
được sự ức chế duy trì đối với sự sao chép của virút VGB và đẩy lùi bệnh gan. Mục tiêu
tối hậu là ngăn chặn xơ gan, suy gan và ung thư gan.
Thuốc uống điều trị VGB mạn tính có 4 loại đã được cơ quan Dược và Thực phẩm
Hoa Kỳ (FDA) cho sử dụng trong điều trị là Lamivudine, Adefovir, Entecavir và
Telbivudine.
Các thuốc tân dược thường có nhiều tác dụng phụ và giá thành đắt. Vì vậy, các
thuốc có nguồn gốc thảo mộc đang được khuyến khích nghiên cứu, đặc biệt là các vị
thuốc Đông dược đã được dùng theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa các bệnh về gan. Số
thuốc thảo mộc đưa vào sử dụng chưa nhiều nhưng bước đầu cho thấy có triển vọng tốt
trong hỗ trợ điều trị VGB mạn nói chung và VGB mạn hoạt động (VGMHĐ) nói riêng.
Các thuốc thảo mộc thường có tác dụng bảo vệ tế bào gan, giảm viêm gan, phục hồi
chức năng gan, ức chế xơ gan. Một số thuốc thảo mộc còn có tác dụng ức chế sự nhân

1


lên của virút VGB, tăng sản xuất kháng thể chống lại kháng nguyên HBsAg của virút
VGB. Khi dùng phối hợp với các thuốc tân dược, các thuốc thảo mộc có tác dụng rút
ngắn thời gian điều trị và giảm liều điều trị của thuốc tân dược.
Theo kinh nghiệm dân gian và kết quả nghiên cứu của một số công trình nghiên

cứu khoa học (NCKH) gần đây cho thấy có nhiều cây thuốc được dùng điều trị viêm gan
có tác dụng tốt, như: Diệp hạ châu, ngũ vị, dứa gai, cam thảo dây, hạ khô thảo nam,
khúng khéng, muồng trâu, vọng cách, cốt khí, mã đề, dành dành, nọc sởi, ban tròn,
trạch tả, nhó đông, cải trời, cà gai leo, cúc gai ... [11, 5, 33, 56, 13, 23, 41, 57]. Trong đó,
mã đề, chi tử, hạ khô thảo nam đã được Bộ Y tế xếp vào Danh mục cây thuốc Nam điều
trị VGB.
Kế thừa và phát virút triển những kinh nghiệm sử dụng thảo dược để bào chế thuốc
điều trị VGB mạn, chúng tôi đã được phép thực hiện đề tài: “Sàng lọc một số vị thuốc,
bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B”.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

•

•

Đề tài nhằm 2 mục tiêu:

1.

Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc có tác dụng bảo vệ gan.

2.

Điều chế một loại thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B.

Nội dung nghiên cứu:
1. Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan bằng
CCl4 các dịch chiết từ 2 bài thuốc và 10 cây thuốc. Chọn 5 sản phẩm có tác dụng
tốt nhất.
2. Nghiên cứu thành phần hóa học của 5 dịch chiết. Xác định hàm lượng các nhóm

chất có tác dụng bảo vệ gan. Chọn 3 sản phẩm có hàm lượng hoạt chất cao, nguyên
liệu dễ khai thác hoặc dễ trồng để tiếp tục nghiên cứu tác dụng dược lý.

2


3. So sánh các tác dụng lý sau đây của 3 sản phẩm chọn được: Tác dụng chống oxy
hoá, ức chế xơ gan, giảm enzym GPT, GOT; tác dụng chống viêm mạn và tác
dụng lợi mật.
Chọn 1 sản phẩm có tác dụng tốt nhất để nghiên cứu độc tính:
i. Thử độc tính cấp
ii. Độc tính bán mạn .
4. Nghiên cứu quy trình chiết xuất sản phẩm quy mô pilot.
5. Nghiên cứu dạng bào chế và quy trình sản xuất thuốc trị VGM do siêu vi B.
6. Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, bán sản phẩm và thuốc mới.

3


I- TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số thông tin chung về 10 cây thuốc - đối tượng nghiên cứu của đề tài:
• Cây Ban tròn (Hypericum patulum Thunb. ex Murr.):
Cây ban tròn (họ Ban -Hyperaceae) mọc rất phổ biến ở vùng thượng du miền Bắc và
miền Trung nước ta [24]. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi (thuộc Đề tài KC10-07)
cho thấy cao nước của lá ban tròn có tác dụng bảo vệ gan, giảm enzym GPT, giảm
bilirubin trên mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl4 [13]. Cao nước của lá ban tròn còn có
tác dụng giảm hàm lượng colagen và malonyl dialdehyd (MDA) trong gan chuột bị gây
viêm gan mạn bằng CCl4 [25, 26].
Vi phẫu lá ban tròn đã được nghiên cứu có những đặc điểm sau:
- Gân lá: Gân phía trên hơi lõm, phía dưới lồi nhiều. Biểu bì trên là một hàng tế bào hình

chữ nhật có kích thước lớn hơn tế bào biểu bì dưới. Mô dày nằm sát biểu bì, thường có 23 lớp tế bào có thành rất dày. Mô mềm cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng, hình đa giác,
có kích thước nhỏ hơn tế bào mô dày. Bó libe gỗ -lớn, hình gần như tròn, với phần libe rất
phát triển ở phía dưới bó gỗ. Gỗ cấu tạo bởi các mạch gỗ xếp thành hàng có hình cung.
-Phiến lá: Biểu bì trên là một hàng tế bào hình chữ nhật có kích thước lớn, xếp đều đặn,
tế bào biểu bì phía dưới có kích thước nhỏ hơn. Mô dậu là một hàng tế bào hình chữ nhật
dài xếp vuông góc với tế bào biểu bì trên. Mô mềm khuyết là những tế bào có kích thước
nhỏ, thành mỏng [26].
Bột lá Ban tròn có màu nâu sẫm, mùi thơm nhẹ, vị hơi chát. Soi dưới kính hiển vi
thấy: Mảnh biểu bì phiến lá là những tế bào hình ngũ giác hoặc đa giác xếp đều đặn, màu
vàng nhạt hoặc lục nhạt. Mảnh phiến lá có tế bào mô dậu hình chữ nhật hình que khá dài,
xếp đều đặn thành một hàng. Mảnh mạch xoắn có 3 đến 4 hàng xếp liền nhau với những
tế bào xếp đều đặn, màu vàng tươi. Mảnh phiến lá màu lục xen vàng nhạt, mang tế bào lỗ
khí hình tròn hoặc hạt đậu. Mảnh biểu bì của cuống lá có những tế bào màu lục hoặc vàng
sẫm xếp thành những hàng dài [26].
Gần đây ở Ấn Độ đã nghiên cứu tác dụng của cao methanol từ lá ban tròn trên khả
năng tái tạo tế bào và làm lành vết thương trên chuột. Cao methanol bào chế dưới dạng
thuốc mỡ nồng độ 5 và 10 % đều thể hiện tác dụng làm lành vết thương có ý nghĩa thống

4


kê so với nhóm chứng. Dịch chiết chloroform và dịch chiết methanol của lá và thân cây
ban tròn có phổ kháng nấm khá rộng [58, 59].
Dịch chiết của lá cây ban tròn có tác dụng làm giảm có ý nghĩa thống kế thời gian
ngủ do pentobarbitone gây ra [60].
Thử tác dụng kháng ung bướu của cao chiết methanol cây ban tròn cho thấy IC50 trên
tế bào ung thư gan HEP-2 là 1,71µg/ml, trên dòng RD là 1,53µg/ml và trên dòng Vero là
2,23µg/ml, Nếu thử với nồng độ 100 - 200 µg/ml thì cao methanol ức chế hoàn toàn dòng
ung thư HEP-2 [60].
• Cam thảo dây (Abrus precatorius L.), Họ đậu (Fabaceae):

Cây mọc hoang ở vùng rừng núi, nhiều nhất ở vùng ven biển. Bộ phận sử dụng: Rễ,
dây, lá, thu hái vào mùa thu đông, tốt nhất khi cây mới ra hoa.
Công dụng: Chữa ho, cảm sốt, hoàng đản do viêm gan siêu vi trùng, giải độc, vị ngọt
nên dùng trong các đơn thuốc cho dễ uống. Ngày dùng 8-16g sắc uống [28].
Cam thảo dây còn chưa được nghiên cứu đối với bệnh viêm gan, chủ yếu được dùng
theo kinh nghiệm của nhân dân.
Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá cam thảo dây: kháng Staphylococcus
aureus với gía trị MIC of 8 ug/ml [30]. Abruquinone có tác dụng kháng virut và độc tính
tế bào, abruquinone B có tác dụng kháng virut, kháng vi trùng lao và vi trùng sốt rét
[50].
Thành phần hóa học của lá và dây cam thảo: Trong thành phần hóa học của lá cam
thảo dây có các isoflavanquinone, abruquinone B, abruquinone G [50]; saponin
triterpenoid [48] và các glycosid triterpenic abrusoside A - D - là các chất ngọt tương tự
như glycyrrhizin có độ ngọt gấp 30 - 100 lần đường sucrose [36]. Các saponin
triterpenoid có tác dụng kháng viêm.
• Diệp hạ châu (chó đẻ răng cưa) (Phyllanthus urinaria L.):
Nhân dân dùng cây diệp hạ châu để chữa bệnh gan từ lâu đời. Kết quả nghiên cứu
của một số tác giả cho rằng diệp hạ châu có tác dụng kháng sự nhân lên của nhiều loại

5


virut: Virut viêm gan B, Epstein-Bar virut, retrovirut, hespes simplex virut (HSV), cải
thiện enzym gan, chuyển đổi các dấu ấn của virút VGB trên lâm sàng ở bệnh nhân viêm
gan B mạn tính [68].
Gần đây, các tác giả Hàn Quốc phát hiện ellagic acid chiết tách từ diệp hạ châu có
tác dụng phóng bế virut VGB giải phóng HBeAg (kháng nguyên e) trong các tế bào gan
(IC50 = 0,07 microg/ml) [64].
Thành phần hoạt chất của diệp hạ châu là các lignan (phyllanthin, hypophyllanthin,
phyltetralin và niranthin) và các flavonoid ellagic acid, gallic acid, geraniin [73].

Ở Việt Nam diệp hạ châu thường được dùng phối hợp với các vị thuốc đông dược
khác trong một số bài thuốc điều trị bệnh gan.
• Dứa gai (Pandanus odoratissimus L.):
Nhân dân thường dùng quả để chữa bệnh gan, đầy bụng, khó tiêu, hoàng đản.
Thành phần hoá học và tác dụng sinh học của quả dứa gai còn ít được nghiên cứu.
Năm 2002 trong khuôn khổ của đề tài cấp Viện Dược liệu (do TS. Phạm Thanh Trúc làm
chủ nhiệm) chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng quả dứa gai thu hái
tại tỉnh Kiên Giang. Kết quả cho thấy cao lỏng của quả dứa gai có tác dụng bảo vệ gan,
chống oxy hoá trên chuột gây viêm gan cấp và mạn tính bằng CCl4.
• Cốt khí (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc.):
Thành phần hoá học của rễ cốt khí: có stilbene glycoside, piceid (2.23%),
resveratrol; anthranoid (emodin, chrysophanol, physcion); quinon; phenol...
Người Dao thường dùng rễ cây cốt khí làm thuốc chữa bệnh gan.
Gần đây ở Đài Loan đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế virut VGB của
dịch chiết nước và dịch chiết cồn của cốt khí củ. Dịch chiết cồn ức chế sự nhân lên của
virút VGB với nồng độ tối thiểu 10 microg/ml ( P < 0,0001). Cao nước ức chế sự nhân lên
của virút VGB với nồng độ cao hơn 30 microg/ml (P < 0,05) [34].
• Khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.):
Thành phần hoá học: có 8 hợp chất phenolic (1-8): vanillic acid (1), ferulic acid (2),
3,5-dihydroxystilbene (3), (+)-aromadendrin (4), methyl vanillate (5), (-)-catechin (6),

6


2,3,4-trihydrobenzoic acid (7), and (+)-afzelechin (8) [51]; flavonoid: dihydrokaempferol
(I), quercetin (II), (+)-3,3',5',5,7-pentahydroflavanone (III) and (+)-dihydromyricetin.
Người dân ở Cao bằng, Lạng Sơn dùng quả cây khúng khéng chữa ngộ độc thức ăn,
ngộ độc do rượu.
Một số tài liệu của Trung Quốc thông báo về tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây
tổn thương gan do CCl4/D-galactosamine gây ra [46]; ức chế xơ gan trên chuột gây xơ

gan bằng CCl4 [52]; giải độc của rượu, thúc đẩy sự chuyển hoá của rượu ở gan [35].
• Muồng trâu (Cassia alata L.):
Ở Việt Nam cây muồng trâu mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi, nhiều nhất ở
miền Nam, miền Trung và một số tỉnh miền Bắc (Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh) [5, 20].
Thành phần hoá học: Lá chứa anthraglucosid (3-4%), acid chrysophanic, rhein.
Công dụng: Chữa táo bón, phù thũng, đau gan, vàng da: Lá dùng dưới dạng chè.
Chữa hắc lào, bệnh tôkêlô, ecpét loang vòng, ghẻ, lở loét ở súc vật: Lá tươi giã nát xát,
hoặc vắt nước bôi vào nơi bị bệnh. Dùng nhuận tràng: Ngày 4 - 8g bột thân lá; tẩy: 15 20g sắc uống [9].
Nghiên cứu gần đây cho thấy lá muồng trâu có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn,
vì vậy có triển vọng làm thuốc điều trị nhiễm trùng cơ hội cho bênh nhân AIDS [39].
Cho đến nay chưa tìm thấy tài liệu nghiên cứu về tác dụng của lá muồng trâu đối với
bệnh VGB trên thực nghiệm cũng như trên lâm sàng.
• Ngũ vị Hoa Nam (Schisandra sphenanthera Rehder & E.H. Wilson):
Ở Việt Nam cây ngũ vị hoa nam đã được TS. Nguyễn Bá Hoạt và CS. của VDL
phát hiện tại vùng núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh Kong Tum và Quảng Nam [12]. Kết quả
điều tra sơ bộ cho thấy trữ lượng quả khá cao tại 3 xã Ngọc Lây, Tê Xăng và Măng Ri : ~
4 – 5 tấn quả khô/năm. Viện Dược liệu đã nghiên cứu thăm dò tác dụng bảo vệ gan của
quả ngũ vị hoa nam thu hái taị núi Ngọc Linh so sánh với ngũ vị Trung Quốc. Kết qủa
cho thấy cao ngũ vị tử hoa nam với liều thử 67mg/kg có tác dụng giảm men gan, giảm
bilirubin và giảm hàm lượng malonyldialdehyd (MDA) trên mô hình gây viêm gan cấp

7


bằng CCl4 và bằng ethanol, so với lô chứng bệnh lý kết quả có ý nghĩa thống kê. Cao ngũ
vị tử hoa nam còn làm gỉam thời gian ngủ của pentobarbital bị kéo dài do tiêm CCl4. Kết
quả nghiên cứu thăm dò trên đây cho thấy quả ngũ vị hoa nam rất có triển vọng trong điều
chế thuốc trị viêm gan mạn [Nguyễn Bá Hoạt, 2005].
• Nọc sởi (Hypericum japonicum Thunb.ex Murr.):
Cây nọc sởi, còn có tên là điền cơ hoàng, châm hương. Bộ phận sử dụng: Toàn cây

(thân, cành mang lá, hoa, rễ). Thành phần hoá học: Cây nọc sởi thu hái tại Việt Nam đã
được phân tích sơ bộ thành phần hoá học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM).
Kết quả cho thấy trong phần trên mặt đất của cây có flavonoid, acid amin, acid hữu cơ
[26].
Tại Nhật Bản các tác giả đã chứng minh trong cây nọc sởi có các dẫn xuất
phloroglucinol: saroaspidin A, B và C; các sarothralen A, B, C và D; sarothralin và
sarothralin G. Gần đây các bisxanthones jacarelhyperol A và B đã được phân lập từ cây
nọc sởi ở Nhật Bản.
Cây nọc sởi còn là một vị thuốc dùng trong dân gian. Tính chất: Theo Đông y cây nọc
sởi có vị đắng, ngọt, tính bình, không độc vào 2 kinh can và tỳ. Có tác dụng thanh thấp
nhiệt, tiêu thũng trướng, khử tích tiêu thực (chữa tiêu hoá kem, đầy) dùng chữa cam tích,
thấp nhiệt hoàng đản. Dùng ngoài chữa rắn cắn, bị thương, sưng đau. Chữa hoàng đản:
cây nọc sởi khô: 40 – 60 g sắc uống [11, 20].
Theo kết quả nghiên cứu của các nước, cây nọc sởi có tác dụng kháng vi rút mạnh
(HSV-II, HIV) và kháng khuẩn. Tại Trung Quốc cây nọc sởi được dùng chữa viêm gan
cấp hoặc mạn tính [5, 11]. Gần đây cây nọc sởi được chứng minh có tác dụng chống ô xy
hóa lipid mạnh. Các tác giả cho rằng tác dụng này có liên quan đến tác dụng bảo vệ gan
của dược liệu [33].
• Vọng cách (Premna corymbosa Rootl. ex Willd.), họ Cỏ roi ngựa
(Verbenaceae):

8


Cây vọng cách mọc hoang và được trồng ở đồng bằng và vùng núi để lấy lá làm gia
vị ăn gỏi cá. Nhân dân thường dùng lá vọng cách làm thuốc chữa kiết lỵ, tiêu hoá kém,
tiểu tiện khó, trị phù do gan, xơ gan [5, 11, 20]. Người Mường Hoà Bình dùng lá vọng
cách chữa bệnh gan. Ngày dùng 8-12g lá.
Thành phần hoá học của lá vọng cách: Lá có mùi thơm hắc. Trong lá có verbacosid
iridoid glucosid là bremcoryosid, alcaloid premnazol [5].

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá vọng cách cho thấy trong lá vọng
cách có các thành phần: alcaloid, flavonoid, coumarin, saponin và đường khử. Đã xác
định chỉ số bọt của saponin trong lá là 125, chỉ số phá huyết đối với máu dê là 400. Độc
tính cấp: không xác định được LD50 khi cho chuột uống với liều ~ 50g dược liệu/kg chuột
[21].
Tác dụng chống oxy hóa của cao lỏng lá vọng cách với liều tương đương ~10g dl./kg
chuột có tác dụng làm giảm 7,86% hàm lượng MDA ở chuột bị gây tăng oxy hóa bằng
CCl4. Cao lỏng còn có tác dụng giảm hoạt tính của GPT từ 154,95 xuống còn 119,11(U/l)
và giảm hàm lượng bilirubin từ 2,78 xuống 2,09 (µmol/l) trong huyết thanh chuột bị gây
viêm gan cấp bằng CCl4 [21].
* Nhận xét chung:
-Những thông tin trên đây cho thấy 10 cây thuốc liệt kê ở trên là những cây thuốc đã
được sử dụng trong điều trị một số bệnh về gan theo kinh nghiệm của nhân dân, trong đó
một số cây đã được nghiên cứu sơ bộ ở trong và ngoài nước về tác dụng bảo vệ gan, ức
chế xơ gan. Vì vậy các dược liệu từ các cây thuốc này rất có triển vọng trong nghiên cứu
sàng lọc để tìm các vị thuốc có tác dụng bảo vệ gan tốt nhất, làm cơ sở cho nghiên cứu
bào chế một loại thuốc điều trị viêm gan B mạn.
-Việc lựa chọn các cây thuốc này làm đối tượng nghiên cứu sàng lọc vị thuốc có tác
dụng bảo vệ gan sẽ rút ngắn thời gian nghiên cứu và bảo đảm tính khả thi của đề tài.

9


-Kết quả thử nghiệm đồng thời trên cùng một mô hình nghiên cứu sẽ cho phép lựa
chọn sản phẩm chiết xuất có tác dụng bảo vệ gan tốt nhất để bào chế một loại thuốc điều
trị viêm gan B mạn - là mục tiêu chính của đề tài.
1.2. Một số bài thuốc điều trị viêm gan:
Trong nhân dân đã lưu truyền và đang được sử dụng một số bài thuốc trị các bệnh về
gan, trong đó có VGB, xơ gan cổ chướng, hoàng đản, suy giảm chức năng gan…:
1) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vi khuẩn thể cấp tính [27]: Hạ khô thảo (30 g), ý dĩ (20

g), gừng khô (3 lát), dành dành (12 g), Hoài sơn (20 g), thổ phục linh (12 g), sâm bố chính
(20 g), mã đề (10 g), trần bì (6 g). Sắc uống ngày 1 thang.
2) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vi khuẩn thể mạn tính [ 27]: Hạ khô thảo (40 g); thổ
phục linh (12 g), nghệ vàng (10 g), mã đề (40 g), rau má (40 g). Sắc uống ngày 1 thang.
3) Bài thuốc chữa viêm gan nhiễm trùng: bạch truật (9 g), Nhân trần (30 g), trạch tả (9 g),
dành dành (9 g), thổ phục linh (12 g), nước 450 ml. sắc còn 200 ml chia 3 lần uống trong
ngày.
4) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vi trùng (theo phương pháp chữa thanh nhiệt, lợi thấp)
[27]: Nhân trần (30 g), dành dành (12 g), vỏ đại (10 g) (hoặc chất chiết 8 g). Sắc uống
ngày 1 thang, uống trong 5 – 7 ngày.
5) Xirô nhân trần: Chữa vàng da, vằng mắt, viêm gan [20]: Nhân trần (24 g), chi tử (12
g), nước 600 ml, sắc còn 100 ml, thêm đường cho đủ thành xirô. Chia 3 lần uống trong
ngày.
6) Bài thuốc LIV-94: Diệp hạ châu đắng, chua ngút, cỏ nhọ nồi. Đây là bài thuốc nghiên
cứu trong khuôn khổ đề tài cấp thành phố : “Đánh giá tác dụng của thuốc LIV-94 làm
giảm và sạch HBsAg trên bệnh nhân viêm gan mạn tính” do BS Nguyễn Bá Kinh(Giám
đốc bệnh viện Thanh nhàn) làm chủ nhiệm kết hợp với Viện quân Y 103. Các vị thuốc
trong bài thuốc này đều là các vị thuốc chỉ huyết lương, có tác dụng cầm máu, lợi mật, hạ
men gan, làm giảm và sạch HBsAg- kháng nguyên bề mặt của viêm gan B. Bệnh nhân bị
viêm gan mạn tính sau khi dùng thuốc LIV-94 từ 50 đến 97% số bệnh nhân được phục hồi

10


men gan transaminase, từ 67 – 100% số bệnh nhân (tuỳ theo bệnh lý ban đầu) giảm
bilirubin toàn phần trở về bình thường.
7) Xirô Hebevera – bài thuốc gia truyền của Lương Y Trần Xuân Thiện: Bài thuốc gồm 3
vị: Diệp hạ châu đắng, xuyên tâm liên và chi tử. Bài thuốc này đã được lương y Trần
Xuân Thiện dùng điều trị cho nhiều thanh niên tình nguyện có HBsAg(+) sau thời gian
điều trị có HBsAg (-). Kết qủa nghiên cứu đã được công bố. Bài thuóc có 2 tác dụng:

+Chuyển HBsAg (+) trở về âm tính HBsAg(-) là 26,5% (26/98 người).
+Tác động lên hệ miễn dịch, kích thích sản xuất ra kháng thể chống kháng nguyên
HBsAg là 62% trường hợp (59/98 người).
+Thuốc không có tác dụng phụ.
Sau này DS. Trần Dũng Sỹ cùng PGS. Hà Văn Ngạc (Viện Quân Y 103) tiếp tục nghiên
cứu dưới dạng xirô Hebevera.
8) Bài thuốc VG 99: Bài thuốc gồm 7 vị: Diệp hạ châu đắng, nhân trần, sa tiền, rau má,
ngũ vị tử, uất kim, đại hoàng. Thuốc được bào chế dưới dạng cao lỏng chiết xuất theo quy
trình của Khoa dược, Viện Y học cổ truyền (YHCT) Việt Nam. Thuốc đã được dùng điều
trị cho 18 bệnh nhân VGB tại Bệnh viện Đống đa và Viện YHCT với liều dùng 50
ml/ngày trong 2 tháng. Kết quả thuốc VG 99 có tác dụng cải thiện tốt các triệu chứng lâm
sàng, làm giảm trasaminase máu, giảm hoạt động viêm trên mô học ở bệnh nhân VGB
mạn tính. Tại Sơn La từ lâu bài thuốc này cũng được nhiều người sử dụng để chữa VGB.
9) Bài thuốc bổ gan – thông mật: Thành phần có 3 vị: Cao actisô, cao khô biển súc (rau
đắng), bột hạt bìm bìm. Bài thuốc này được một số công ty Dược trong nước sản xuất.
10) Bài thuốc tiêu phong nhuận gan số 40: Là thuốc do Cơ sở Đông Nam Dược Ngọc liên
Mỹ tho, Cần thơ sản xuất. Thành phần gồm 20 vị: Muồng trâu, rau má, xuyên tâm liên,
rau đắng biển, dâu tằm, hoàng đằng, nghệ, dứa gai, bèo cái, actisô, lạc tiên, vông nem, cỏ
mần trầu, cỏ mực, móp gai, ô rô, quau nước, chi tử, hương phụ và kim ngân hoa. Thuốc
có tác dụng nhuận gan, lợi mật, kháng viêm, giải độc, nhuận tràng. Trị viêm gan mạn, mệt
mỏi, kém ăn, đầy bụng, đau vùng gan.
Trên đây là một số trong số rất nhiều bài thuốc được sử dụng trong nhân dân để điều
trị viêm gan, rối loạn chức năng gan, viêm gan mạn tính.... Trong số này cũng có những

11


bài thuốc đã được chứng minh trên lâm sàng. Nhận xét chung: Các bài thuốc thường có ít
nhất 3 vị , nhiều nhất đến 20 vị. Một số dược liệu có tần suất sử dụng nhiều trong các bài
thuốc là: Diệp hạ châu đắng, dành dành, mã đề, rau má, nhân trần, actisô, rau đắng. Thành

phần các bài thuốc thường gồm các vị thanh nhiệt, lương huyết. Theo y học hiện đại các
vị thuốc có tác dụng chống ô xy hoá là có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan do đó có
tác dụng giảm các enzym gan và chống hoại tử tế bào gan. Một số vị có tác dụng kích
thích sản xuất kháng thể chống kháng nguyên HBsAg, ức chế sự nhân lên của vi rút VGB
nhờ vậy làm chuyển HBsAg (+) về âm tính và giảm số lượng vi rút VGB.

1.3. Một số hoạt chất có tác dụng trong điều trị viêm gan:
Việc tìm kiếm các chất bảo vệ gan thường được bắt đầu từ các cây thuốc đã được sử
dụng theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa các bệnh liên quan đến gan. Trong số các cây
được chú ý nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất có thể kể đến: cúc gai (Silybum marianum
), actisô (Cynara scolymus ), ngũ vị tử (Schizandra chinensis), diệp hạ châu (Phyllanthus
urinaria ), nghệ (Curcuma longa), sài hồ (Buplerum chinensis)… Nhiều chất đã được
phân lập và được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan. Các chất đó thuộc nhiều nhóm
chất: nhóm hợp chất phenol (flavonolignan, flavonoid, lignan, coumarin, xanthon, tanin,
acid phenolic…), terpenoid, alcaloid và các chất khác.
Trong đó, các hợp chất flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu chứng minh
có tác dụng bảo vệ gan thông qua các tác dụng: dập tắt gốc tự do, tác dụng chống oxy
hoá, bảo vệ tế bào, chống lão hoá tế bào, tăng tiết dịch mật, giải độc gan, bảo vệ chức
năng gan, lợi tiểu, chống viêm, giảm đau trên thực nghiệm. Hoạt tính của flavonoid chủ
yếu là nhờ trong cấu trúc hoá học của chúng có vòng thơm, hệ nối đôi liên hợp, nhóm
carbonyl, nhóm OH phenol. Có 49 chất thuộc nhóm flavonoid đã được chứng minh có tác
dụng bảo vệ gan [15, 29, 38, 40, 44, 65..].
Catechin (cyanidanol-3) là một bioflavonoid đã được nghiên cứu chứng minh tác
dụng trên các mô hình gây viêm gan ở động vật và trên lâm sàng. Biệt dược Catergen

12


chứa (+)-catechin đơn chất đã được đưa vào sử dụng trong điều trị viêm gan từ 1976,
[71]. Hợp chất này thể hiện tác dụng kích thích miễn dịch, bảo vệ chức năng gan ở bệnh

nhân viêm gan B. Khi dùng phối hợp với alpha-interferon nó làm tăng tác dụng chống
virút VGB của alpha-interferon. Các dẫn chất của catechin như gallocatechin,
epigallocatechin cũng có tác dụng bảo vệ gan trên các mô hình gây tổn thương gan bởi Dgalactosamin và lipopolysaccharid ở chuột nhắt [70, 72]. Các chất này có trong chè xanh
Camellia sinensis và thường gặp trong nhiều cây khác. Các flavonoid: ellagic acid, gallic
acid, geraniin trong diệp hạ châu đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan [73]...
Tuy nhiên trong nhiều trường hợp các chất này chỉ là chất chỉ định được dùng để
kiểm soát chất lượng của các thuốc thảo mộc. Trên thực tế chúng chiếm một hàm lượng
thấp trong nước sắc của các bài thuốc hoặc các dạng bào chế. Đa số các bài thuốc có
thành phần phức tạp cùng với sự phối chế tinh sảo của thiên nhiên làm nên những tổ hợp
các chất trong các sản phảm chiết xuất từ dược liệu mà chúng ta chưa biết hết. Vì vậy việc
dự đoán thành phần hoạt chất trong các bài thuốc chỉ là tương đối. Điểm quan trọng là
thuốc có tác dụng làm giảm các triệu chứng của bệnh và cải thiện các xét nghiệm enzym
gan, bilirubin, giảm viêm, chuyển đảo huyết thanh, xuất hiện anti-HBeAg và làm giảm số
lượng vi rút VGB, ức chế xơ gan.

13


II- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu:
Vật liệu nghiên cứu là 10 vị thuốc (bảng 2.1) và 2 bài thuốc điều trị viêm gan siêu vi cấp
và mạn tính.
Bảng 2.1: Danh sách các vị thuốc nghiên cứu
STT

Tên vị thuốc

Tên khoa học của cây

Nơi thu hái mẫu

thuốc
1
2

Quả cây ngũ vị tử hoa Schisandra sphenanthera Đắc Tô, Kon Tum
nam

Rehder & E.H. Wilson

Lá cây ban tròn

Hypericum patulum

Sapa, Lào Cai

Thunb. ex Murray
3

Nọc sởi

Hypericum japonicum

Hà Nội

Thunb. ex Murray
4

Quả dứa gai

Pandanus odoratissmus Quảng Ninh
L.

5

Rễ cốt khí

Polygonum

cuspidatum Lào Cai

Sieb et Zucc.
6

Diệp hạ châu (chó đẻ

Phyllanthus urinaria L.

Thanh Trì, Hà Nội

răng cưa)
7

Cam thảo dây

Abrus precatorius

Thanh Trì, Hà Nội

8

Quả khúng khéng

Hovenia dulcis Thunb.

Thị xã Cao Bằng

9

Lá muồng trâu

Cassia elata L.

Thanh Trì, Hà Nội

10

Lá vọng cách

Premna corymbosa

Thanh Trì, Hà Nội

*Hai bài thuốc chữa viêm gan siêu vi mạn tính đã được nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo
vệ gan [27]:

14


-Bài số 1: Thành phần có: Hạ khô thảo (30g), ý dĩ (20 g), gừng khô (3 lát), dành dành (12

g), hoài sơn (20 g), thổ phục linh (12g), sâm bố chính (20g), mã đề (10g), trần bì (6g). Sắc
uống ngày 1 thang dùng điều trị viêm gan siêu vi cấp tính..
- Bài số 2: Thành phần có: Hạ khô thảo (40 g), mã đề (40 g), thổ phục linh (12 g), nghệ
vàng (10g) và rau má (40g). Sắc uống ngày 1 thang dùng điều trị viêm gan siêu vi mạn
tính..

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hoá học và chiết xuất:
2.2.1.1. Định tính các nhóm chất trong dược liệu: Các dược liệu chưa biết thành phần
hoá học được phân tích sơ bộ bằng các phản ứng hóa học.
2.2.1.2. Phương pháp định lượng:

• Phương pháp định lượng astilbin và quercitrin trong bột Hypatin và thuốc
Hypatin bằng sắc ký lỏng cao áp (SKLCA) [26].
Điều kiện sắc ký:
Máy HPLC Hewlett- Packard 1100
Cột Lichrosorb Rp 18 10µm (250×4mm)
Pha động : Acetonitril: Dung dịch acid acetic 0,25M (25:75) (có thể điều chỉnh tỉ lệ)
Detector Diod Array G1315A : 284nm
Tốc độ dòng : 1ml/phút
Thể tích tiêm: 20µ
+ Hoá chất, dung môi:
-

Acetonitril

tinh khiết ( Merck)

-

Acid acetic glacial

tinh khiết ( Merck)

-

Methanol

tinh khiết ( Merck)

+ Mẫu đối chiếu:
Mẫu đối chiếu Astilbin: Viện Dược liệu điều chế, hàm lượng 92% (định lượng bằng
SKLCA).

15


Mẫu đối chiếu Quercitrin: của hãng Chromadex Inc, hàm lượng 98,6% (định lượng
bằng SKLCA - theo phiếu kiểm nghiệm của hãng Chromadex).
*Tiến hành:
* Dung dịch đối chiếu Astilbin: Cân chính xác khoảng 50mg Astilbin đối chiếu vào
bình định mức 100ml, thêm 70ml Methanol lắc siêu âm để hoà tan, sau thêm Methanol
đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
*Dung dịch đối chiếu Quercitrin: Cân chính xác khoảng 50mg Quercitrin đối chiếu
vào bình định mức 100ml, thêm 70ml Methanol lắc siêu âm để hoà tan, sau thêm
Methanol đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
*Dung dịch thử của viên Hypatin: Cân chính xác một lượng bột viên khoảng 490mg
vào bình định mức 50ml, thêm 40ml Methanol lắc siêu âm để hoà tan, sau thêm Methanol
đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
*Dung dịch thử của bột Hypatin: Cân chính xác một lượng bột khoảng 280mg vào

bình định mức 50ml, thêm 40ml Methanol lắc siêu âm để hoà tan, sau thêm Methanol đến
vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
Tiêm các dung của mẫu đối chiếu và mẫu thử của viên Hypatin vào hệ thống sắc ký,
ghi sắc ký đồ. Từ diện tích hoặc chiều cao của các píc Astilbin, Quercitrin đối chiếu và
của dung thử tương ứng, lượng cân của mẫu đối chiếu và mẫu thử, độ pha loãng của mẫu
đối chiếu và mẫu thử, khối lượng trung bình viên ta tính được hàm lương (mg) của
Astilbin và Quercitrin trong viên
Tiêm các dung dịch đối chiếu và dung dịch thử của bột Hypatin vào hệ thống sắc
ký, ghi sắc ký đồ. Từ diện tích hoặc chiều cao của các píc Astilbin, Quercitrin đối chiếu
và của dung dịch thử tương ứng, lượng cân của mẫu đối chiếu và mẫu thử, độ pha loãng
của mẫu đối chiếu và mẫu thử ta tính được hàm lương (%) của Astilbin và Quercitrin
trong bột Hypatin.
Thời gian lưu của pic Astilbin đối chiếu : 5,782 phút
Thời gian lưu của pic Quercitrin đối chiếu : 7,856 phút

• Định lượng flavonoid toàn phần trong lá ban tròn và quả dứa gai:

16


Cân chính xác khoảng 4 g dược liệu lá Ban tròn đã xay nhỏ. Tiến hành chiết siêu âm
với 200 ml methanol trong 30 phút. Cân trọng lượng bình cùng dung môi trước và sau khi
chiết. Bổ sung dung môi cho đến trọng lượng ban đầu. Lọc lấy 100 ml dịch lọc (tương
đương 2 g dược liệu). Cô cạn trên bếp cách thủy đến cắn. Hòa cắn trong 20 ml nước nóng,
lọc qua giấy lọc, tráng giấy lọc bằng 5 ml nước nóng x 2 lần, gộp vào dịch lọc.
Chuyển dịch lọc vào bình lắng gạn. Tráng bình bằng 30 ml ethyl acetat. Chuyển dịch
ethyl acetat vào bình lắng gạn. Lắc hỗn hợp trong 5 phút, để tách lớp. Gạn lớp ethyl acetat
vào cốc đã sấy đến trọng lượng không đổi. Tiếp tục làm như vậy đến khi dịch ethyl acetat
không màu. Cô dịch ethyl acetat trên bếp cách thủy đến cắn. Sấy cốc cùng cắn trong tủ
sấy ở 1050C trong 3 giờ. Để cốc trong bình hút ẩm 30 phút và cân nhanh. Tính trọng

lượng của cắn (a gam).
Hàm lượng (%) flavonoid toàn phần tính theo hàm lượng chất chiết được bằng ethyl
acetat được tính theo công thức:
a x 100 x 100
X(%) = -----------------P (100 - B)
Trong đó: X : Hàm lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu (%)
P : Khối lượng bột dược liệu đã cân để định lượng (g)
a : Trọng lượng của cắn (g)
B : Độ ẩm của dược liệu (%)

• Định lượng flavonoid toàn phần trong các chế phẩm chiết xuất từ lá ban tròn
bằng phương pháp quang phổ tử ngoại:
Hàm lượng flavonoid toàn phần trong các chế phẩm chiết xuất từ lá ban tròn được
tính theo astilbin.
-Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,05g chế phẩm cho vào bình định mức 50ml, thêm
30ml methanol. Siêu âm 15 phút cho tan hoàn toàn, thêm methanol vừa đủ. Lắc đều. Lọc
qua giấy lọc, lấy chính xác 1ml dịch lọc cho vào bình định mức 50ml thêm methanol vừa
đủ được dung dịch thử.

17


-Mẫu đối chiếu: Cân chính xác 10mg Astilbin, hoà tan với methanol trong bình định mức
dung tích 100ml. Lắc đều, được dung dịch A. Lấy chính xác 1ml dung dịch A vào bình
định mức dung tích 10ml. Thêm methanol đến vạch, lắc đều, được mẫu đối chiếu có nồng
độ 10µg/ml.
Đo độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu đối chiếu ở bước sóng 290nm.
Hàm lượng (%) flavonoid toàn phần tính theo astilbin được tính theo công thức:
Dx x 10 x 2500 x 100
X% = ----------------------------Dc x 104 x m

Trong đó: Dc- Mật độ quang của mẫu đối chiếu
Dx- Mật quang của mẫu thử
m-Khối lượng mẫu thử đã cân (g)

• Định lượng saponin toàn phần trong dược liệu:
Hàm lượng saponin toàn phần trong các dược liệu được định lượng bằng phương pháp
cân [9].
Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (đã xác định độ ẩm). Cho vào túi lọc rồi chiết
soxhlet với 300 ml methanol cho tới khi dịch chiết trong suốt và không cho phản ứng với
H2SO4 đặc. Dịch chiết methanol được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất
quay cho tới khi còn khoảng 40 ml. Để nguội, lọc qua giấy lọc. Tráng giấy lọc bằng 10 ml
methanol. Cô còn khoảng 30 ml. Rót từ từ vào 300 ml aceton. Để cốc phản ứng vào tủ
lạnh qua đêm. Gạn lấy tủa. Tủa được để ngoài không khí cho bay hết hơi aceton, hoà lại
trong 20 ml methanol, đun cách thuỷ. Để nguội, lọc, tráng giấy lọc bằng 10 ml methanol.
Rót từ từ vào 300 ml aceton, để lạnh qua đêm. Gạn lấy tủa. Tủa Saponin toàn phần được
sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 600C dến khối lượng không đổi. Cân và tính hàm
lượng saponin toàn phần.
Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức:
a x 100 x 100
X(%) = -----------------P (100 - B)
Trong đó: a: Khối lượng cắn khô saponin toàn phần (g).

18


P: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g).
B: Độ ẩm của dược liệu (%).

• Định lượng lignan toàn phần trong quả ngũ vị:
Phương pháp: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng kết hợp với phương pháp đo quang. Hàm lượng

lignan toàn phần được tính theo chất chuẩn Gomisin C.
Tiến hành:
-

Chuẩn bị mẫu: 1g bột dược liệu được chiết với 25 ml MeOH theo tỷ lệ 1 : 25

(10

x 10 x 5ml) bằng siêu âm ở 400C, lọc, cô dịch chiết đến cắn trên bếp cách thủy ở 600C,
hòa tan cắn bằng CHCl3 và định mức chính xác 20 ml. Hút 0,2 ml dịch CHCl3 tiến hành
sắc ký lớp mỏng chế hóa (bản silicagel tráng sẵn GF254) với hệ dung môi hexan - aceton
(65:53), phát hiện bằng cách soi UV 254nm, cạo vùng hấp thu tương ứng với nhóm hợp
chất lignan và dùng MeOH giải hấp phụ. Cô dịch MeOH đến cắn trên bếp cách thủy ở
600C. Hòa tan cắn bằng CHCl3, lọc và quy vào bình định mức 50 ml, tiến hành đo mật độ
quang.
-

Đo độ hấp thụ: dịch CHCl3 được đo bằng cuvette thạch anh 1cm, bước sóng 242

nm. Tiến hành định lượng 3 lần. Trị số OD thu được đối chiếu với đường chuẩn Gomisin
C và suy ra hàm lượng lignan toàn phần có trong mẫu.

• Định lượng Anthranoid trong lá muồng trâu được thực hiện theo phương pháp
ghi trong DĐVN III, chuyên luận “Muồng trâu”: Hàm lượng anthranoid được xác định
bằng phương pháp quang phổ tử ngoại tính theo anthraquinon [9].
2.2.1.3- Phương pháp điều chế các mẫu cao toàn phần và chiết tách các chất tinh khiết
cho thử sàng lọc tác dụng bảo vệ gan:
*Điều chế cao toàn phần: Các vị thuốc được chiết với 3 dung môi khác nhau: n-hexan,
ethanol 80% và nước trên bếp cách thuỷ có ống sinh hàn ngược đến hết màu của dịch
chiết. Lọc các dịch chiết. Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao đặc dùng để

nghiên cứu.

19


*Chiết tách các chất tinh khiết Astilbin và quercitrin từ lá ban tròn: Các chất tinh khiết
được tách từ hỗn hợp flavonoid của lá ban tròn bằng phương pháp sắc ký cột pha thường
và pha đảo với các hệ dung môi rửa giải thích hợp, kết tinh nhiều lần, thu được các chất
tinh khiết. Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLCA và SKLM.
*Chiết tách và nhận dạng các chất tinh khiết từ quả ngũ vị: Bột quả NVT (100 g) khô
được chiết với methanol bằng thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 500C. Sau khi thu hồi dung môi
dưới áp suất giảm thu được 8 gam cao đặc.
Bổ sung 700 ml nước cất vào cao đặc, lắc đều, sau đó chiết lần lượt bằng n-hexan,
cloroform, ethyl acetat và n-butanol. Bốc hơi dung môi, thu được các phân đoạn n-hexan
(1,2g), cloroform (4,1g), ethyl acetat (0,7g) và n-butanol. (0,6g).
4,1 g cao cloroform được tiến hành phân lập bằng các phương pháp sắc ký cột với
các dung môi rửa giải khác nhau. Các phân đoạn thu được tiếp tục tinh chế bằng sắc ký
lớp mỏng (SKLM) điều chế. Kết tinh trong các dung môi thích hợp, thu được 6 chất tinh
khiết ký hiệu: NVT1A1, NVT1A2, NVT1A3, NVT1A4, NVT1A6 và NVT1A7. Cấu trúc
hóa học được xác định dựa trên các đặc trưng lý, hóa học và các dữ liệu phổ cộng hưởng
từ hạt nhân 13C-NMR, 1H-NMR, phổ DEPT.
2.2.1.4- Phương pháp nghiên cứu quy trình chiết xuất bán thành phẩm (bột Hypatin):

• Nghiên cứu phương pháp chiết xuất bán thành phẩm ở phòng thí nghiệm:
Thiết kế nghiên cứu phòng thí nghiệm:
Xác định hàm lượng flavonoid trong dược liệu ban tròn.
Khảo sát các yếu tô ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm:
Các điều kiện đã được khảo sát gồm:
-

Dung môi chiết xuất: Ethanol 70%, 80% và nước.

-

Nhiệt độ chiết xuất: nhiệt độ phòng; nhiệt độ 80 - 950C (tùy theo dung môi)

-

Tỷ lệ dược liệu/ dung môi: 1/10.

-

Thời gian chiết: ở nhiệt độ phòng: ngâm trong 48 giờ, lọc dịch chiết; ngâm tiếp 24

giờ x 3 lần. Chiết ở 80-950C: Chiết hồi lưu trên cách thủy: 1,5 giờ x 3-4 lần.

20


-

Kích thước nguyên liệu: xay nhỏ qua rây 1 mm để chiết bằng ethanol; xay thô để

chiết với nước.
-Các dịch chiết nước được cô, dịch chiết cồn được thu hồi cồn đến cao lỏng, chiết tách
flavonoid toàn phần từ cao lỏng bằng EtOAc, sau đó sấy trong tủ sấy chân không đến
khô và cân.
-Đánh giá phương pháp chiết xuất thông qua: Hiệu suất chiết flavonoid và hàm lượng
flavonoid toàn phần trong chế phẩm.

• Phương pháp nghiên cứu quy trình chiết xuất bán thành phẩm ở quy mô pilot:
Áp dụng các điều kiện chiết xuất tối ưu đã chọn được cho quy trình chiết xuất
phòng thí nghiệm để xây dựng quy trình chiết xuất quy mô pilot. Thiết bị chiết xuất là
máy chiết đa năng của hãng Tourner, lắp đặt tại khoa Công nghệ chiết xuất - VDL.
*Dây chuyền thiết bị chiết xuất cao dược liệu ở quy mô pilot bao gồm:
1.

Thiết bị chiết 2 vỏ 250lít gia nhiệt bằng hơi nước bão hòa
- Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306
- Nước SX: Pháp.
- Bơm dung môi 500w

2.

Thiết bị cô áp suất giảm 2 vỏ 250lít gia nhiệt bằng hơi nước bão hòa
-Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306
- Nước SX : Pháp
-Bơm chân không vòng nước 2,2kw

3.

Thiết bị sấy áp suất giảm 2m3
- Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306
- Nước SX: Pháp
-Bơm chân không vòng nước 2,2kw
4. Thùng lọc áp suất giảm 50lít
-Vật liệu chế tạo Inox SUS 304

*Mô tả qui trình chiết xuất:
-Dược liệu sau khi thu hái được xử lý :phơi khô hoặc sấy đạt độ ẩm < 12%

21


-Dược liệu xay thô (1 -1,5cm) nhằm mục đích cho dung môi thấm nhanh, đều và sử dụng
lượng dung môi tối thiểu, có thể tích rỗng nhỏ nâng cao công suất thiết bị chiết nhưng
không bị quá nát trong khi chiết xuất, dễ dàng lọc dịch chiết.
-Nạp dược liệu vào nồi chiết, sau khi đã nạp đủ dược liệu, đóng nắp kiểm tra độ kín của
thiết bị.
- Bơm dung môi chiết theo tỉ lệ 1 dược liệu : 10 dung môi.
-Gia nhiệt đến nhiệt độ 85-900C. Duy trì nhiệt độ trong suốt thời gian chiết.
-Kết thúc quá trình chiết xuất dịch chiết được rút ra, lọc bằng thiết bị lọc chân không và
chuyển vào thiết bị cô áp suất giảm.
- Kiểm tra độ kín của nồi cô, rồi cho các thiết bị trao đổi nhiệt hoạt động, sau đó mở van
cấp hơi từ từ, kiểm tra nhiệt độ ra của dung môi và điều chỉnh van cấp hơi,van chân
không và van cấp tác nhân lạnh trung gian cho các thiết bị trao đổi nhiệt hoạt động thích
hợp .
- Dịch chiết được thu hồi áp suất giảm đến cao lỏng (1 : 1).
-Khóa van cấp hơi, mở chân không, mở van đáy thu hồi dịch chiết đặc (cao lỏng).
*Chiết tách và tinh chế flavonoid:
-Để nguội cao lỏng. Lắc cao lỏng với Ethyl acetat trong thiết bị có cánh khuấy trong vòng
30 phút, để yên tách lớp 30 phút. Rút lớp Ethyl acetat ra thùng có nắp. Cho tiếp Ethyl
acetat để lắc lần 2. Gộp 2 dịch Ethylacetat vào, cất chân không.
-Cô chân không đến cạn còn 1L. Tháo cao lỏng ethylacetat ra. Tráng thiết bị bằng 0,5l
nước. Gộp vào đem sấy chân không đến khô.

22


2.2.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý và độc tính

2.2.2.1-Thử tác dụng bảo vệ gan:
-Nguyên liệu nghiên cứu
Các mẫu cao chiết xuất bằng n-hexan, cồn 80% và nước từ 10 vị thuốc, cao chiết bằng
nước từ 2 bài thuốc và một số chế phẩm khác từ lá ban tròn (flavonoid toàn phần, astilbin,
quercitrin) đã được thử tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl4.
-Súc vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 23 g ± 2
g) được cung cấp bởi Viện Pasteur Tp. HCM và được để ổn định ít nhất 1 tuần trước khi
thử nghiệm. Thể tích cho uống hoặc tiêm phúc mô là 10 ml/kg thể trọng.
-Phương pháp nghiên cứu
+ Thực nghiệm gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng CCl4:
Các mẫu thử nghiệm được cho uống trong 8 ngày. CCl4 được hòa trong dầu oliu và được
tiêm phúc mô ở liều 1 g/kg một giờ sau khi uống mẫu thử nghiệm vào ngày thứ 1, thứ 3
và ngày thứ 5 của thực nghiệm. Một giờ sau lần cho uống thứ 8, tiến hành lấy máu đuôI
chuột, ly tâm trích huyết thanh và định lượng transaminase GPT và bilirubin tòan phần.
Các lô thử nghiệm được bố trí như sau:
-

Lô 1: uống nước cất, không tiêm CCl4 (-) (lô chứng sinh học).

-

Lô 2: uống nước cất và tiêm phúc mô tetraclorua carbon liều 1 g/kg (lô chứng bệnh

lý).
-

Lô 3: uống thuốc tham chiếu silymarin (liều 0,1 g/kg x 8 ngày) và tiêm phúc mô

CCl4 liều 1 g/kg.

-

Các lô thử: uống mẫu cao thử (liều tương đương với 10 g dược liệu/kg thể trọng x

8 ngày) và tiêm phúc mô CCl4 liều 1 g/kg.
+ Định lượng transaminase GPT (ALT) trong huyết thanh [65].
Nguyên tắc:
2-oxoglutarate + L-alanine ⇔ L-glutamate + pyruvate
pyruvate + NADH + H+

⇔

L-lactate + NAD+

23