Đánh giá phương pháp định lượng bilirubin trên máy phân tích khí máu GEM 4000

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
……..***……..

TRẦN THANH KHOA

§¸NH GI¸ PH¦¥NG PH¸P §ÞNH L¦îNG BILIRUBIN
TR£N M¸Y PH¢N TÝCH KHÝ M¸U GEM 4000

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2009-2013

Hướng dẫn khoa học:
TS. Trần Thị Chi Mai

Hà Nội-2013


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý
đào tạo đại học trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS-Trần Thị Chi Mai – Trưởng
khoa xét nghiệm Sinh Hóa – Bệnh viện Nhi Trung Ương, người cô đã hết lòng
hướng dẫn em trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh chị trong khoa xét nghiệm
Sinh Hóa – Bệnh viện Nhi Trung Ương đã giúp đỡ em rất nhiệt tình, tạo mọi

thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, những người đã sinh
thành và nuôi dạy tôi, cùng với những người thân trong gia đình, anh em bè
bạn đã chia sẻ động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2013
Sinh viên

Trần Thanh Khoa


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cả các
số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất
cứ công trình nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2013
Sinh viên
Trần Thanh Khoa


NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

Hb

HPLC

NCCLS

POCT

PXN

SDS

Hemoglobin
High-performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
National Committee on Clinical Laboratory Standards
Point-of-Care Testing
(Xét nghiệm tại chỗ chăm sóc bệnh nhân)
Phòng xét nghiệm
Sodium dodecyl sulfate


MỤC LỤC
MỤC LỤC HÌNH...................................................................................................................6
MỤC LỤC BẢNG..................................................................................................................6
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................................1
1.1. HEMOGLOBIN..........................................................................................................4
1.2. CHUYỂN HÓA HEMOGLOBIN VÀ CHUYỂN HÓA BILIRUBIN.......................5
1.4. THIẾT BỊ XÉT NGHIỆM TẠI CHỖ (point of care testing)....................................23
1.5. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP VỀ MẶT KĨ THUẬT (ANLYTICAL
EVALUATION OF METHODS)....................................................................................26
CHƯƠNG 2..........................................................................................................................31
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................31
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU....................................................................................31
2.2 KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TOÀN PHẦN........................................31
Bảng 2.1. Cách pha các mẫu dùng cho thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính........................33
Bảng 2.2. Độ chính xác ngắn hạn.........................................................................................34

Bảng 2.3. Độ chính xác dài hạn............................................................................................34
Hình 3.2. Đồ thị đánh giá độ tuyến tính của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần
trên máy AU 2700................................................................................................................37
Bảng 3.1: Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy Gem 4000..38
Bảng 3.2. Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy AU 2700....38
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ chính xác ngắn hạn của phương pháp định lượng bilirubin
toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700.........................................................................39
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ chính xác dài hạn của phương pháp định lượng bilirubin
toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700.........................................................................40
Hình 3.3. Đồ thị so sánh kết quả định lượng bilirubin toàn phần trên máy Gem 4000 và
máy AU 2700.......................................................................................................................42
.1 Phương pháp định lượng bilirubin trên máy GEM 4000 có độ chính xác và xác thực
tương tự như phương pháp tham chiếu sử dụng tại phòng xét nghiệm............................48
.2 Có thể sử dụng phương pháp định lượng bilirubin trên máy GEM 4000 cho việc chẩn
đoán, theo dõi điều trị vàng da sơ sinh một cách kịp thời ở cả những cơ sở y tế tuyến
dưới...................................................................................................................................48


MỤC LỤC HÌNH

Hình 3.2. Đồ thị đánh giá độ tuyến tính của phương pháp định lượng bilirubin toàn phần
trên máy AU 2700................................................................................................................37
Hình 3.3. Đồ thị so sánh kết quả định lượng bilirubin toàn phần trên máy Gem 4000 và
máy AU 2700.......................................................................................................................42

MỤC LỤC BẢNG

MỤC LỤC BẢNG..................................................................................................................6
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................................1
Bảng 2.1. Cách pha các mẫu dùng cho thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính........................33

Bảng 2.2. Độ chính xác ngắn hạn.........................................................................................34
Bảng 2.3. Độ chính xác dài hạn............................................................................................34
Bảng 3.1: Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy Gem 4000..38
Bảng 3.2. Độ lệch và phần trăm sai số trong đánh giá độ tuyến tính trên máy AU 2700....38
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ chính xác ngắn hạn của phương pháp định lượng bilirubin
toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700.........................................................................39
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ chính xác dài hạn của phương pháp định lượng bilirubin
toàn phần trên máy GEM 4000 và AU2700.........................................................................40


ĐẶT VẤN ĐỀ

Vàng da sơ sinh là một trong các tình trạng bệnh lý phổ biến nhất cần
sự chăm sóc y tế ở trẻ sơ sinh. Khoảng 60% trẻ sơ sinh đủ tháng và 80% trẻ
sơ sinh non tháng xuất hiện vàng da trong 2 - 4 ngày đầu của cuộc sống [17].
Với phần lớn trẻ sơ sinh, vàng da không do bất kỳ bệnh lý nào mà do sự giảm
bài tiết bilirubin (vàng da sinh lý). Vàng da sinh lý không gây hại và tự mất đi
ở phần lớn trẻ sơ sinh. Tuy nhiên nồng độ bilirubin tự do cao có thể gây tổn
thương não không hồi phục nếu không điều trị. Các di chứng bao gồm chứng
bại não, giảm thính lực và các vấn đề chuyển động của mắt. Điều quan trọng
là mức độ bilirubin tăng cao trong máu của trẻ sơ sinh phải được xác định
nhanh chóng và điều trị kịp thời.
Vàng da sơ sinh là tình trạng phổ biến ở Việt Nam nhưng chưa được
nhận biết và đánh giá đúng bởi mức gia đình trẻ, do vậy làm chậm đưa trẻ đi
khám và các bác sĩ ít kinh nghiệm thường chậm trễ trong chẩn đoán và chậm
chuyển trẻ đến cơ sở điều trị thích hợp. Có rất ít các thiết bị xét nghiệm và các
biện pháp điều trị vàng da cho trẻ em ở các cơ sở y tế tuyến dưới tại Việt
Nam. Ở các nước phát triển, trẻ sơ sinh vàng da được lấy máu gót chân để
định lượng bilirubin, việc này do điều dưỡng hoặc nhân viên xét nghiệm được
tập huấn thực hiện. Dựa vào kết quả định lượng bilirubin để chẩn đoán xác

định và bác sĩ sẽ đưa ra quyết định liệu pháp ánh sáng có cần thiết không, kết
quả bilirubin cũng là thông số theo dõi kết quả điều trị. Tuy nhiên, ở Việt
Nam các thiết bị phân tích bilirubin cần một lượng máu nhỏ chỉ có ở một số
bệnh viện chuyên khoa nhi. Đứng trước sự nghiêm trọng của bệnh vàng da sơ
sinh, một yêu cầu đặt ra đối với các bác sỹ lâm sàng và các nhà hóa sinh là
làm sao để chẩn đoán sớm, chính xác đối với bệnh này. Việc chẩn đoán sớm

1111


có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong điều trị, tiên lượng tình trạng bệnh đối
với bệnh nhân nhi.
Bilirubin toàn phần bao gồm bilirubin liên hợp (trực tiếp) và bilirubin
tự do (gián tiếp). Các phương pháp truyền thống phân tích định lượng
bilirubin sử dụng thuốc thử diazo của Ehrlich và hiện nay phương pháp diazo
cải tiến thường được dùng định lượng bilirubin toàn phần (muối diazo và
thuốc thử caffein). Bilirubin trực tiếp hay bilirubin liên hợp được định lượng
bằng thuốc thử diazo không có caffein. Bilirubin tự do hay bilirubin gián tiếp
được tính bằng hiệu của bilirubin toàn phần và bilirubin liên hợp. Dạng
bilirubin tự do khi tăng cao trong máu có thể qua hàng rào máu não gây tổn
thương thần kinh.
Ở trẻ sơ sinh, bilirubin tự do chiếm phần lớn bilirubin huyết thanh, có
thể được tính toán từ bilirubin toàn phần và bilirubin liên hợp hoặc đơn giản
là định lượng bilirubin toàn phần do xem như bilirubin liên hợp là không đáng
kể. Bilirubin toàn phần có thể định lượng bằng phương pháp Diazo trên máy
hóa sinh tự động Beckman Coulter tại Khoa Sinh Hóa, Bệnh viện Nhi trung
ương. Phương pháp này đã được thiết lập cho phần lớn các máy hóa sinh tự
động và kết quả có thể truy nguyên với các phương pháp tham chiếu do vậy
có thể so sánh với kết quả của các phòng xét nghiệm khác.
Người ta đã phát triển kỹ thuật phân tích bilirubin cho các thiết bị xét

nghiệm tại chỗ (point of care testing devices). Các thiết bị này được thiết kế
để định lượng bilirubin ngay tại nơi chăm sóc bệnh nhân, tức là không phải tại
phòng xét nghiệm trung tâm của bệnh viện. Thuận lợi của các thiết bị xét
nghiệm tại chỗ là thời gian trả kết quả nhanh, lượng mẫu cần cho phân tích ít
(dùng ống mao quản) nên tránh được việc thoái hóa bilirubin do chậm phân
tích và tránh thiếu máu do thầy thuốc vì phải lấy máu nhiều lần với lượng lớn

2


để làm xét nghiệm. Tuy nhiên, các thiết bị xét nghiệm tại chỗ trước đây sử
dụng bệnh phẩm là huyết thanh nên đòi hỏi nhân viên của khoa lâm sàng phải
ly tâm mẫu máu trước khi phân tích. Máy phân tích khí máu GEM 4000 tích
hợp kỹ thuật phân tích bilirubin toàn phần đã xuất hiện trên thị trường gần
đây. Việc định lượng bilirubin trên máy GEM 4000 sử dụng mẫu máu toàn
phần do vậy không đòi hỏi ly tâm trước khi phân tích. Loại máy này có khả
năng áp dụng cho các bệnh nhân sơ sinh và khắc phục được nhược điểm của
các thiết bị định lượng bilirubin tại chỗ trước đây.
Hiện khoa sơ sinh bệnh viện Nhi trung ương đã được trang bị máy đo
khí GEM 4000. Thời gian trả kết quả nhanh và việc chỉ cần một lượng máu
nhỏ làm cho thiết bị này có thể rất thích hợp cho việc chẩn đoán, theo dõi điều
trị vàng da sơ sinh một cách kịp thời ở cả những cơ sở y tế tuyến dưới. Việc
định lượng bilirubin tại phòng xét nghiệm trên máy phân tích hóa sinh tự
động đòi hỏi lấy máu tĩnh mạch, việc bảo quản và vận chuyển không đúng sẽ
làm bilirubin thoái hóa, gây kết quả thấp giả tạo và thời gian trả kết quả phải
tính bằng giờ. Thay vì phải gửi mẫu máu tĩnh mạch đến phòng xét nghiệm để
định lượng bilirubin, chúng ta có thể chỉ cần một mẫu máu mao mạch và thời
gian trả kết quả chỉ tính bằng phút khi tiến hành định lượng bilirubin trên máy
GEM 4000. Tuy nhiên, để kết quả phân tích bilirubin trên máy GEM 4000 có
thể được sử dụng để đưa ra các quyết định chẩn đoán và điều trị vàng da sơ

sinh, cần phải đánh giá xem phương pháp này có độ chính xác và xác thực
tương tự như phương pháp tham chiếu sử dụng tại phòng xét nghiệm hay
không. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá phương pháp định
lượng bilirubin trên máy phân tích khí máu GEM 4000” nhằm mục tiêu:
Thẩm định phương pháp định lượng bilirubin toàn phần bằng phương
pháp quang phổ trực tiếp trên máy GEM 4000.

3


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1.

HEMOGLOBIN

1.1.1. Chức năng hemoglobin
Hemoglobin (Hb) là một protein phức tạp có nhóm ngoại là hem. Hb
đảm nhận chức năng kết hợp với oxy ở phổi, vận chuyển và giải phóng oxy ở
tổ chức, nhận CO2 từ tổ chức đưa về phổi. Ngoài ra Hb còn là một trong các
hệ đệm quan trọng của cơ thể.
1.1.2. Cấu tạo phân tử Hb
Hb là đại phân tử có 4 tiểu đơn vị. Mỗi tiểu đơn vị là một globin kết
hợp với nhân Hem. Hem là một sắc tố chứa sắt hóa trị II. Chính nhờ ion sắt
mà Hb có thể gắn và giải phóng oxy. Globin là một chuỗi polypeptid. Có
nhiều loại globin thuộc hai họ α và họ không α. Tùy theo sự kết hợp các chuỗi
mà có các Hb khác nhau.
- Hai chuỗi α kết hợp hai chuỗi β (α2β2) tạo thành Hb A
- Hai chuỗi α kết hợp hai chuỗi γ (α2γ2) tạo thành Hb F

- Hai chuỗi α kết hợp hai chuỗi δ (α2δ2) tạo thành Hb A2
Ở người lớn bình thường chủ yếu là Hb A, ngoài ra còn:
- Hb A2 chiếm tỉ lệ 2-3.5%. Kí hiệu α2δ2 hay αδ/αδ
- Hb F (còn gọi là huyết sắc tố bào thai vì chiếm tỉ lệ rất cao ở giai đoạn
cuối của thai nhi và sơ sinh). Kí hiệu α2γ2 hay αγ/αγ
- Một số huyết sắc tố ở thời kì phôi thai và thời kì đầu của bào thai.

4


+ Huyết sắc tố Gower I gồm 2 chuỗi ξ và 2 chuỗi ε
+ Huyết sắc tố Gower II gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi ε
+ Huyết sắc tố Porland gồm 2 chuỗi ξ và 2 chuỗi γ
Ở trẻ sơ sinh sẽ có tỉ lệ Hb F rất cao và tỉ lệ này sẽ giảm dần khi lớn
lên. Sự khác biệt về cấu trúc giúp ái lực của Hb F với oxy cao hơn so với Hb
A. Do đó bào thai có Hb F giúp lấy được oxy từ máu của mẹ vì bào thai chưa
thể tự hô hấp. Khi đẻ ra thì trẻ tự hô hấp bằng phổi nên Hb F được thay thế
bằng Hb A, do Hb A liên kết với oxy lỏng lẻo hơn nên khả năng liên kết và
phân ly là rất linh hoạt, đảm bảo sự vận chuyển và trao đổi khí hiệu quả.
1.2. CHUYỂN HÓA HEMOGLOBIN VÀ CHUYỂN HÓA BILIRUBIN
1.2.1.

Sự thoái hóa hemoglobin, chuyển hóa bilirubin [1]

 Sự thoái hóa hemoglobin và chuyển hóa của bilirubin
Hồng cầu già bị phá hủy trong lách giải phóng Hb và Hb được thoái hóa.
Bình thường có khoảng 90% lượng Hb được thoái hóa trong tổ chức liên võng,
ngoài hệ thống tuần hoàn. Hb thủy phân giải phóng globin và hem. Globin là
protein nên thủy phân thành các acid amin. Những acid amin này chủ yếu được
tái sử dụng để tổng hợp protein. Những acid amin không được tái sử dụng sẽ bị

thoái hóa. Còn hem được mở vòng ở vị trí carbon alpha với sự tham gia của
enzym hemoxygenase. Enzym này của microsom gắn với cytocrom P-450 có
coenzym là NADPH và cần một phân tử oxy, giải phóng ra CO và ion sắt III.
Ion sắt được vận chuyển đến transferrin. Sản phẩm tạo thành của phản ứng này
là biliverdin có màu xanh. Ở người và một số động vật khác biliverdin tiếp tục
bị khử thành bilirubin nhờ enzym biliverdin reductase.

5


Hb
Globin

aa (tái sử dụng hoặc
thoái hóa)

Hem
Fe 3+
CO

O2
NADPHH+
NADP+

Biliverdin

NADPHH+
NADP+
Máu

Bilirubin tự do
2UDP glucoronat
Glucuronyl transferase

Chu
trình
Thận
urobilinogen

Nước tiểu
urobilin

2 UDP
Bilirubin liên hợp

Gan
Ruộtgan
Ruột

2 glucuronat
8 H+
Urobilinogen

Stercobilinogen

Urobilin (phân)

Stercobilin (phân)

Hình1.1 Sự thoái hóa của hemoglobin và chuyển hóa của bilirubin

Bilirubin tạo thành không tan trong nước có ái lực cao với lipid và
albumin của huyết thanh. Bilirubin được vận chuyển vào máu và kết hợp với
với albumin của huyết thanh. Tới gan, bilirubin nhanh chóng được tách ra
khỏi albumin huyết thanh. Bilirubin đi vào tế bào gan. Trong tế bào gan
bilirubin kết hợp với acid glucoronic dưới dạng UDP glucuronat tạo thành
bilirubin liên hợp. Enzym xúc tác cho phản ứng liên hợp là glucoronyl
transferase. Bilirubin liên hợp được bài tiết vào đường dẫn mật về túi mật và
là thành phần chính của sắc tố mật. Bilirubin liên hợp phản ứng trực tiếp với

6


muối diazo tạo thành chất màu azo gọi là phản ứng Van der Bergh.
Bilirubin glucuronid từ túi mật xuống ruột, nhờ các enzym của vi
khuẩn đường ruột thủy phân tách glucoronat và bilirubin bị oxy hóa thành
urobilinogen. Urobilinogen tiếp tục oxy hóa thành stecobilinogen. Hai sắc tố
này đào thải ra phân và bị khử thành urobilin và stecobilin tương ứng. Ở phân
người bình thường urobilin và stercobilin tạo cho phân có màu vàng. Khoảng
20% urobilinogen và stercobilinogen được tái hấp thu vào tĩnh mạch cửa về
gan tái tạo lại sắc tố mật. Quá trình này gọi là chu trình gan-ruột. Một phần
sắc tố mật bị lọc qua thận và đào thải qua nước tiểu và bị khử thành urobilin
và srecobilin. Hai chất này cũng tạo ra màu của nước tiểu người bình thường.
Trẻ sơ sinh những ngày đầu sau khi sinh do thiếu các enzym của vi khuẩn
đường ruột bilirubin không bị khử ở ruột mà tự oxy hóa thành biliverdin.
1.2.2. Ý nghĩa lâm sàng [1]
Lượng bilirubin trong huyết thanh là kết quả của sự cân bằng giữa hình
thành bilirubin do thoái hóa Hb và khả năng liên hợp bilirubin của gan. Người
bình thường bilirubin toàn phần dưới 1 mg%, trong đó tự do là 0.8 mg% và
liên hợp chỉ dưới 0.2 mg%. Sự tăng bilirubin toàn phần trong huyết tương gây
ra vàng da. Vàng da có thể chia làm 3 nhóm nguyên nhân chính: Vàng da

trước gan, vàng da tại gan và vàng da sau gan.
 Vàng da trước gan.
Nguyên nhân gây vàng da trước gan hay gặp nhất là do tan máu. Tan
máu có thể do di truyền hoặc tan máu mắc phải. Tan máu mắc phải hay gặp
do truyền nhầm nhóm máu, nhiễm trùng huyết, sốt rét, do hóa chất, do một
vài loại ung thư hoặc do dùng thuốc có gây tan máu.
Tan máu di truyền do bất thường về màng hồng cầu, huyết sắc tố hoặc

7


enzyme trong hồng cầu.
Vàng da trước gan còn do tăng phá hủy các thành phần hem không phải
của Hb ở gan và một số mô khác. Hầu hết các trường hợp vàng da trước gan
chức năng gan bình thường.
Vàng da ở trẻ sơ sinh: Loại này có lượng bilirubin toàn phần huyết
thanh trên 15 mg% xuất hiện vài ngày sau sinh hoặc trên mức trên 10 mg%
sau khi sinh hai tuần. Những nguyên nhân chính của loại vàng da này do: Tan
máu sau khi sinh, gan của trẻ chưa hoàn thiện nên các enzym của gan chưa đủ
về số lượng cũng như chức năng gây thiếu hụt tạm thời enzym
glucoronyltransferase. Những đứa trẻ bình thường bilirubin tăng cao hai, ba
ngày sau sinh, rồi giảm nhanh, trở về trạng thái bình thường. Khi nồng độ
bilirubin cao kéo dài trên hai tuần hoặc tiếp tục tăng trên 15 mg% có thể là
vàng da bệnh lý.
 Vàng da tại gan
Vàng da do thiếu hụt hoàn toàn enzyme liên hợp bilirubin ở tế bào gan
gặp trong hội chứng Crigler-Najar và thiếu hụt một phần enzyme liên hợp gặp
trong hội chứng Gilberts. Trong vàng da do các bệnh bẩm sinh di truyền này,
bilirubin tự do tăng cao.
Vàng da xuất hiện khi tế bào gan bị hủy hoại hoặc do sự bài tiết sản

phẩm từ tế bào bị tổn thương. Trong vàng da này bilirubin liên hợp tăng nhiều
hơn. Hay gặp do viêm gan bởi các nguyên nhân do virus, do nhiễm độc.
 Vàng da sau gan
Còn gọi vàng da do tắc mật, gây cản trở mật xuống ruột. Những nguyên
nhân gây tắc mật phổ biến nhất là do sỏi đường mật, u đầu tụy hoặc u các cơ
quan khác chèn vào đường mật. Vàng da sau gan tăng bilirubin liên hợp là

8


chủ yếu. Lượng bilirubin tới ruột giảm nên phân bạc màu nhưng có nhiều
bilirubin ra nước tiểu, nên nước tiểu có màu vàng đậm. Trong những trường
hợp tắc mật kéo dài, gan có thể bị tổn thương, khả năng liên hợp giảm. Nên
những trường hợp này bilirubin liên hợp có thể tăng nhưng không cao như
trong những trường hợp vàng da sau gan với chức năng gan bình thường.
1.2.3. Vàng da ở trẻ sơ sinh
Rối loạn gây ra bệnh vàng da ở trẻ sơ sinh được phân loại dựa vào sự
tăng bilirubin tự do hoặc bilirubin liên hợp trong máu.
1.2.3.1. Tăng bilirubin tự do trong máu
Nguyên nhân của việc tăng bilirubin tự do ở trẻ sơ sinh là do vàng da
sinh lý ở trẻ sơ sinh, bệnh tan máu và hội chứng tăng bilirubin ở trẻ bú mẹ.
 Vàng da sinh lý ở trẻ sơ sinh.
Trẻ thường bị vàng da trong vòng vài ngày sau khi sinh, tình trạng này
được gọi là vàng da sinh lý của trẻ sơ sinh. Bilirubin cao nhất trong 3-5 ngày
sau khi sinh và vẫn còn cao trong 2 tuần tiếp theo. Bilirubin thường là thấp
hơn 5 mg/dL, với 90% bilirubin tự do. Yếu tố gây vàng da sinh lý là do tăng
tạo bilirubin ở trẻ sơ sinh vì các tế bào hồng cầu có đời sống ngắn hơn, sự
xuất hiện của "shunt bilirubin”, đó là bilirubin có nguồn gốc từ các nguồn
không phải hồng cầu, giảm bilirubin liên hợp do thiếu hụt enzym glucuronyl
transferase trong vài ngày đầu tiên sau khi sinh, do tăng sự hấp thụ của

bilirubin tự do trong ruột do β-glucoronidase hoặc khi trẻ sơ sinh bú mẹ,
pregnanediol, các axit béo tự do và các chất ức chế khác của quá trình liên
hợp bilirubin có trong sữa mẹ [5, 18, 19].

9


 Bệnh tan máu
Bệnh tan máu ở trẻ sơ sinh là do bất đồng nhóm máu hệ Rh của mẹ và
con. Nhóm máu của mẹ là Rh âm trở nên nhạy cảm với thai nhi Rh dương từ
lần mang thai trước hoặc truyền máu Rh dương. Trẻ bị vàng da với trong
ngày đầu tiên hoặc ngày thứ hai sau khi sinh và dễ bị vàng da nhân. Chẩn
đoán xác định bằng xét nghiệm Coombs ở trẻ sơ sinh, nhóm máu Rh dương ở
trẻ sơ sinh và máu Rh âm ở người mẹ. Các bệnh thiếu máu tán máu đi truyền
hiếm gặp khác, chẳng hạn như thiếu hụt glucose-6-photphate (G6PD), cũng
có thể dẫn đến tăng bilirubin tự do trong máu [5, 18].
 Hội chứng bilirubin máu tăng cao liên quan đến sữa mẹ (Breast
Milk Hyperbilirubin)
Đây là loại tăng bilirubin gặp khoảng 30% ở trẻ sơ sinh bú sữa mẹ. Đó là
do α-glucuronidase trong sữa mẹ, thủy phân bilirubin liên hợp trong ruột.
Bilirubin tự do ưa mỡ hơn, sẽ được hấp thu một cách thụ động. Bệnh kéo dài
trong một vài tuần và được xử lý bằng cách ngừng cho con bú [5, 18].
1.2.3.2. Tăng bilirubin liên hợp
Hội chứng này được đặc trưng bởi tăng bilirubin máu trong đó bilirubin
liên hợp vượt quá 1.5 mg/dL (24 µmol/L). Thường gặp nhất là viêm gan
không rõ nguyên nhân ở trẻ sơ sinh và hẹp đường mật. Bệnh sử gia đình có
thể hữu ích trong chẩn đoán thiếu α-antitrypsin, xơ hóa nang, galactosemia,
không dung nạp fructose di truyền và tyrosinosis. Nên định lượng nồng độ
tyrosine huyết thanh và α-antitrypsin. Nên tìm các chất khử không phải
glucose trong nước tiểu nếu nghi ngờ galactosemia, chẩn đoán xác định bởi

sự vắng mặt của enzym UDP galactose-1-phosphate uridyl transferase trong
tế bào và mô, như tế bào hồng cầu và gan. Thử nghiệm huyết thanh học có thể
cần thiết cho chuẩn đoán bệnh viêm gan A, B, C do adenovirus, coxsackie

10


virus, cytomegalovirus, herpes simplex, rubella, và do toxoplasma. Có thể
thực hiện sinh thiết gan, nhưng hình ảnh giải phẫu bệnh trong cả hai bệnh
viêm gan và hẹp đường mật với các tế bào gan khổng lồ và tế bào tạo máu
ngoài tủy là tương tự nhau [5, 16].
 Viêm gan nguyên phát ở trẻ sơ sinh
Khoảng 75% trường hợp viêm gan ở trẻ sơ sinh là viêm gan tế bào
khổng lồ vô căn, một rối loạn không rõ nguyên nhân đặc trưng bởi vàng da ứ
mật. Có xu hướng gia đình có thể phản ánh qua di truyền lặn NST thường.
Vàng da xuất hiện trong vòng 2 tuần đầu tiên. Đứa trẻ ra đời khỏe mạnh, lên
cân tốt. Gan và lách sau đó trở nên to và phân trở nên nhạt màu,
aminotransferase huyết thanh thường >400 U/L, thời gian prothrombin kéo
dài. Ứ mật là vấn đề nổi bật. Điều quan trọng phải loại trừ tắc mật ngoài gan
như hẹp đường mật bằng phương pháp scan HIDA [5, 15].
 Hẹp đường mật
Hẹp đường mật là một nhóm các rối loạn mắc phải đa dạng liên quan
đến đường dấn mật ngoài gan hoặc ống dẫn mật trong gan. Nguyên nhân gây
bệnh có thể do cytomegalovirus, reovirus III, Epstein-Barr virus, rubella,
thiếu α-antitrypsin, hội chứng Down và trisomy 17 hoặc 18 [5].
Hẹp đường mật ngoài gan có thể bao gồm tất cả hoặc một phần của
đường mật ngoài gan. Tần suất bệnh là 1 trên 10000 trẻ sơ sinh sinh, nữ
thường thường gặp nhiều hơn so với nam. Vàng da và ngứa thường xuất hiện
trong tuần đầu tiên. Phân và nước tiểu có màu nước chè. Nếu vàng da kéo dài
hơn 14 ngày tuổi, cần định lượng bilirubin và kiểm tra màu sắc phân, nếu màu

sắc không phải là màu xanh lá cây hoặc màu vàng, nhiều khả năng là hẹp
đường mật. Xác định sớm tình trạng này là điều cần thiết để những trẻ sơ sinh
này được thực hiện phẫu thuật mở thông ruột chủ phẫu thuật cần được thực

11


hiện sớm trước 60 ngày sau khi sinh. Nếu phẫu thuật không thành công, có
thể lựa chọn ghép gan để điều trị. Trẻ mắc bệnh này khó có thể sống hơn 3
năm trừ khi tổn thương được phẫu thuật thành công [5].
Vàng da thường xuất hiện trong vài ngày đầu tiên sau khi sinh.
Bilirubin huyết thanh cao và cholesterol trong huyết thanh có thể rất cao và
dẫn đến sự hình thành của u vàng (xanthomas). Tổn thương mô bệnh học của
gan không đặc hiệu, ít đường mật, tế bào khổng lồ, viêm và xơ hóa. Trẻ
thường sống đến tuổi thiếu niên nhưng thường phát triển chậm [19].
1.3.
1.3.1.

CÁC KĨ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN
Phương pháp định lượng bilirubin toàn phần.
 Phương pháp thuốc thử Diazo
Hiện tại, phương pháp định lượng bilirubin thường được sử dụng tại các

phòng xét nghiệm hóa sinh lâm sàng là phương pháp dựa trên phản ứng diazo.
Trong phản ứng này, bilirubin phản ứng với acid diazo sulfanilic (thuốc thử
diazo) để tạo thành sản phẩm màu. Acid diazo sulfanilic phản ứng ở cacbon
methylen trung tâm của bilirubin để phân chia các phân tử, tạo thành một hỗn
hợp hai chất đồng phân của azodipyrroles (azobilirubin). Phản ứng này có thể
xảy ra ở pH khác nhau. Phương pháp ban đầu của Malloy-Evelyn được thực
hiện ở pH 1-2. Tại pH này azobilirubin có màu tím đỏ có độ hấp thụ cực đại tại

bước sóng 560 nm. Tốc độ phản ứng của thuốc thử diazo với các loại bilirubin
khác nhau cũng khác nhau. Bilirubin liên hợp phản ứng rất nhanh và δ-bilirubin
phản ứng chậm hơn. Tốc độ phản ứng của bilirubin tự do phụ thuộc vào pH. Để
tăng tốc độ phản ứng ở pH = 6, người ta thường thêm vào một chất được gọi là
chất gia tốc. Trong phương pháp Malloy-Evelyn, methanol được sử dụng làm
dung môi của bilirubin tự do, nhưng hiện nay nhiều hóa chất khác được sử
dụng, chẳng hạn như dimethyl sulfoxide và chất tẩy không chứa ion. Phương

12


pháp Malloy-Evelyn hiện ít được sử dụng bởi vì một số vấn đề như các hiệu
ứng của chất nền, lượng lớn protein tủa bởi methanol (gây ra độ đục), ảnh
hưởng của Hb và thời gian phản ứng tương đối dài. Các hợp chất khác được sử
dụng làm chất gia tốc bao gồm sodium benzoate caffeine, dyphylline, natri
sulfat dodecyl và chất xúc tác bề mặt [7, 12].
Phương pháp Jedrassik- Grof được thực hiện ở pH gần 6,5 nhưng độ
hấp thụ của phản ứng được đo sau khi kiềm hóa hỗn hợp phản ứng, phổ hấp
thụ của azobilirubin được chuyển sang một màu xanh mạnh hơn, đo tại 600
nm. Phương pháp Jendrassik- Grof ban đầu sử dụng natri benzoat caffein để
hòa tan bilirubin tự do, từ đó định lượng bilirubin toàn phần [11].
Phương pháp thuốc thử Diazo đã được tự động hóa. Tuy nhiên, phương
pháp Jendrassik-Grof sử dụng 4 thuốc thử riêng biệt, trong khi các phương
pháp phân tích được sử dụng phổ biến nhất hiện nay được thiết kế chỉ sử dụng
hai thuốc thử. Hơn nữa, acid azosulfanilic và các thuốc thử acid ascorbic chỉ ổn
định một thời gian ngắn trong ngày. Để cải thiện hydroxylamine đã được thay
thế cho acid ascorbic. Mặt khác các thuốc thử diazo khác như dichlorophenyl2,4 hoặc muối 2,5-diazonium dichlorophenyl đã được sử dụng trong các hệ
máy tự động. Một loại muối diazo khác thường được sử dụng nhiều trong máy
phân tích tự động là 2,5-dichlorophenyldiazonium tetrafuoroborat (DPD), phản
ứng rất nhanh với bilirubin trong môi trường acid. Trong hệ máy của Roche,

DPD trong môi trường axit mạnh được sử dụng cùng với một tác nhân hòa tan
để tăng tốc độ phản ứng và tránh kết tủa protein. Hệ thống của Abbot sử dụng
2,4-dichloroaniline làm thuốc thử diazo [7].
 Phương pháp quang phổ trực tiếp
Phương pháp này áp dụng cho các mẫu của trẻ sơ sinh dưới 3 tháng
tuổi, vì ở trẻ lớn và người lớn có carotenoid trong máu cũng hấp thụ ánh sáng

13


tại bước sóng 454 nm. Tuy nhiên cần phải phân biệt sự hiện diện của
oxyhemoglobin, bởi vì oxyhemoglobin cũng hấp thụ ở 454 nm. Điều này
được loại bỏ bằng cách trừ đi độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm, bởi
oxyhemoglobin hấp thụ như nhau ở hai bước sóng này. Phương pháp này cần
phải có quang phổ quang kế có khả năng đo tại bước sóng 454 nm và 540 nm.
Phương pháp quang phổ trực tiếp có thể thực hiện ngay cả khi có pha loãng
hay không pha loãng huyết thanh với dung dịch đệm phù hợp. Khi sử dụng
phương pháp này, người ta giả định rằng chỉ có bilirubin tự do trong mẫu thử
và chất gây nhiễu duy nhất là Hb [17].
Phương pháp quang phổ trực tiếp hiện đã được đưa vào máy phân tích
khí máu để đo bilirubin trong máu toàn phần. Trong máy phân tích khí máu
Radiometer ABL735, nhiều phép đo hấp thụ được thực hiện trên máu toàn
phần trong khoảng trên 128 bước sóng (từ 478 nm đến 672 nm). Các tế bào
hồng cầu bị phá vỡ nhờ rung động siêu âm và độ hấp thụ của dịch huyết tán
được đo một cách chính xác. Bởi vì hồng cầu không có bilirubin, bilirubin
huyết tương được tính toán bằng cách sử dụng hệ số pha loãng dựa trên
hematocrit để tính sự pha loãng huyết tương bởi dịch trong hồng cầu. Nồng
độ bilirubin sau đó được hiệu chuẩn bằng cách loại bỏ sự hấp thụ ánh sáng
của Hb. Máy phân tích có khả năng hiệu chỉnh cả Hb người lớn và trẻ em, hai
loại Hb có phổ hấp thụ khác nhau. Gần đây một đánh giá đa trung tâm cho

thấy thiết bị này có sự tương đồng tốt với phương pháp định lượng của phòng
thí nghiệm. Phương pháp này cũng cho kết quả chấp nhận được đối với mẫu
bệnh phẩm của người lớn. Phương pháp quang phổ trực tiếp nhanh chóng và
thuận tiện khi sử dụng trong các thiết bị xét nghiệm tại chỗ (POCT) [20].
Máy đo bilirubin xuyên qua da cũng sử dụng nguyên tắc quang phổ trực
tiếp. Đây là thiết bị không xâm lấn để đo bilirubin ở trẻ sơ sinh. Ban đầu các
thiết bị đo bilirubin qua da đo độ vàng của da bằng cách đo mật độ quang học

14


của ánh sáng màu xanh và màu xanh lá cây phản xạ từ da. Phương pháp này bị
ảnh hưởng bởi sắc tố da. BiliCheck meter và JM103 meter là hai loại thiết bị đã
có mặt trên thị trường. Với BiliCheck meter, ánh sáng trắng được truyền lên da,
và ánh sáng phản xạ được phân tích. Độ hấp thụ từ các chất ảnh hưởng (Hb,
melanin và độ dày của da) được loại bỏ bằng tính toán độ hấp thụ ánh sáng bởi
bilirubin trong mao mạch. Nhiều nghiên cứu chứng minh thiết bị đo bilirubin
qua da cho kết quả là chính xác, tương đồng với kết quả trong phòng thí
nghiệm, đặc biệt là khi nồng độ bilirubin thấp hơn 240 μmol/L (14 mg/dL).
Tuy nhiên, các thiết bị này không thể thay thế phương pháp đo lường bilirubin
huyết thanh tại phòng thí nghiệm trong việc quyết định lựa chọn điều trị, nhưng
có thể dùng để định lượng bilirubin huyết thanh của trẻ sơ sinh [17].
 Phương pháp enzyme [10]
Phương pháp enzym để xác định bilirubin đã được phát triển bằng cách
sử dụng bilirubin oxidase được cô lập từ Myrothecium verucaria MT-1.
Enzym xúc tác quá trình oxy hóa bilirubin thành biliverdin. Phản ứng này
được theo dõi bằng cách đo độ giảm hấp thụ quang ở bước sóng 405 hoặc 460
nm. Sodium dodecyl sulfate hoặc natri cholate được đưa vào trong xét nghiệm
định lượng bilirubin toàn phần để phân tách bilirubin ra khỏi albumin và đẩy
nhanh tốc độ phản ứng.

Phương pháp enzym đã được tự động hóa và các kết quả của phương
pháp enzym tương đồng với kết quả của phương pháp Jendrassik-Grof. Tuy
nhiên sự khác biệt đã được quan sát thấy trong các mẫu với nồng độ bilirubin
liên hợp cao và điều này có thể khắc phục bằng cách đo ở bước sóng 425 nm
thay vì 465 nm.
Ban đầu Hb được cho là nguyên nhân gây nhiễu âm tính, nhưng thêm
EDTA vào thuốc thử làm giảm ảnh hưởng này.

15


 Các phương pháp khác
Phương pháp dựa trên sự oxy hóa của bilirubin thành biliverdin bởi
potassium ferricyanide được mô tả bởi O’leary và cộng sự. Phương pháp này
đã được sử dụng cho máy phân tích tự động. Phương pháp này không bị ảnh
hưởng bởi tán huyết, thuốc thử ổn định. Gần 25% các phòng xét nghiệm ở
Anh sử dụng phương pháp này.
Một số phương pháp khác để đo bilirubin toàn phần đã được mô tả.
Phương pháp huỳnh quang dựa trên sự phát huỳnh quang của bilirubin khi
gắn với protein hoặc chất tẩy, phương pháp điện hóa và phương pháp hóa
phát quang dựa trên phản ứng của bilirubin và peroxinitrite cũng được mô tả.
Tuy nhiên không phương nào trong số này tiện lợi trong thực hành thường
quy tại phòng xét nghiệm [10].
1.3.2.

Định lượng các thành phần của bilirubin
 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [13, 14]
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được phát triển để phân tách

và định lượng bốn thành phần bilirubin, bao gồm α-bilirubin (bilirubin tự do),

β-bilirubin (bilirubin liên hợp một gốc glucuronat), γ-bilirubin (bilirubin liên
hợp hai gốc glucuronat) và δ-bilirubin (bilirubin gắn chặt với protein). Những
phương pháp này cũng có khả năng phát hiện photoisomers được tạo ra trong
quá trị liệu trình ánh sáng (phototherapy). Phương pháp này cho thấy trong
huyết thanh của bệnh nhân vàng da ứ mật phần lớn là δ-bilirubin và γ-bilirubin
và β-bilirubin tương ứng là 24% và 13%. Phần còn lại 27% là bilirubin tự do.
Độ chính xác và xác thực của phương pháp HPLC không đủ để xem chúng là
phương pháp tham chiếu. Việc hiệu chuẩn HPLC là một vấn đề.

16


 Phương pháp quang phổ
Bilirubin tự do và liên hợp cũng có thể được ước tính bằng kỹ thuật
quang phổ màng khô. Trong các phương pháp sử dụng hệ thống hóa học khô,
bilirubin tự do và liên hợp được đo đồng thời. Các mẫu được xử lý bằng
caffeine benzoat natri và chất hoạt động bề mặt phân tách bilirubin tự do ra
khỏi albumin. Bilirubin tự do và bilirubin liên hợp sau đó liên kết với một
polymer cation được gọi là sự nhuộm màu. Sự tương tác này của bilirubin với
thuốc gắn màu gây ra một sự thay đổi phổ hấp thụ làm cả hai dạng bilirubin
có độ hấp thụ phân tử tương tự nhau tại 400 nm, nhưng ở 460 nm bilirubin tự
do có một độ hấp thụ phân tử cao hơn. Nồng độ bilirubin liên hợp và tự do
được xác định bằng cách đo phản xạ tại hai bước sóng này. Nồng độ của δbilirubin được tính từ sự khác biệt giữa bilirubin toàn phần (theo phương pháp
màng khô diazo) và tổng số của bilirubin liên hợp và bilirubin tự do đo bằng
phương pháp dịch chuyển phổ hấp thụ [17].
 Phương pháp enzym
Các phương pháp enzym sử dụng bilirubin oxidase cũng đã được sử
dụng để đo lường các loại bilirubin. Bilirubin trực tiếp phản ứng ở pH 3,7 và
bilirubin toàn phần phản ứng ở pH 7,2. Trong trường hợp không có các chất
tẩy rửa, bilirubin liên hợp và δ-bilirubin bị oxy hóa bởi bilirubin oxidase ở pH

acid và bilirubin tự do bị oxy hóa ở pH kiềm. Bằng cách thay đổi pH và bổ
sung các chất tẩy, ta có thể đo được tất cả ba loại. Bilirubin toàn phần được
đo ở pH 10,0 trong sự có mặt của SDS, bilirubin trực tiếp được đo ở pH 3,7
và bilirubin tự do được đo ở pH 10 khi không có SDS. Phương pháp này có
kết quả tương đồng với phương pháp HPLC. Trong cách tiếp cận khác để đo
bilirubin liên hợp, phản ứng của bilirubin oxidase với δ-bilirubin và bilirubin
tự do được giảm bằng cách cho thêm vào natri florua và N-acetycystein.

17


Morimoto và cộng sự đo độ giảm hấp thụ quang ở bước sóng 450 nm do quá
trình oxy hóa của bilirubin liên hợp bởi bilirubin oxidase trong sự có mặt của
acid

methylene

phosphonic,

EDTA

và

4-hydroxy-2,2,6,6-

tetramethylpiperidine-1-oxyl. Có đến 5% bilirubin tự do có thể bị oxy hóa
trong phương pháp [10].
 Phương pháp Diazo
Khi không có chất gia tốc (VD: thuốc thử caffeine), các loại bilirubin
không phải bilirubin tự do phản ứng với thuốc thử diazo. Bilirubin loại này

phản ứng này gọi là bilirubin trực tiếp. Tuy nhiên, hiện giờ người ta đã biết
rằng một lượng bilirubin tự do và δ-bilirubin cũng phản ứng trong điều kiện
này. Ngay cả ở pH thấp, một tỷ lệ nhỏ bilirubin tự do sẽ phản ứng với thuốc
thử diazo, đặc biệt là nếu nồng độ natri nitrit cao. Ủ huyết thanh với HCl đã
được khuyến cáo để làm giảm phản ứng của bilirubin tự do. Tuy nhiên điều
này cũng làm giảm phản ứng của các loại bilirubin liên hợp và δ-bilirubin.
Bằng cách cẩn thận lựa chọn các điều kiện phản ứng, có thể đo bilirubin trực
tiếp và phương pháp tương quan tốt với phương pháp HPLC [7].
 Phương pháp khác
Phương pháp sắc kí lớp mỏng và phương pháp điện di mao quản dùng
phân tách và định lượng các loại bilirubin cũng đã được mô tả. Tuy nhiên,
không phương pháp nào trong số này có ích trên lâm sàng, bởi vì việc xác
định tất cả các loại bilirubin không cung cấp thêm giá trị chuẩn đoán nào.
 Free unconjugated bilirubin
Phần bilirubin tự do không gắn với albumin là không đáng kể ở người lớn,
nhưng có thể cao ở trẻ sơ sinh. Phần này liên quan đến sinh bệnh học của chứng
vàng da nhân. Dựa trên nguyên tắc “free unconjugated bilirubin” nhanh chóng bị
oxi hóa bởi horseradish peroxidase, trong khi phần bilirubin gắn albumin được

18


bảo vệ khỏi phản ứng này. Hai loại máy phân tích “free unconjugated bilirubin”
đã có trên thị trường, đây là máy UB và FloPro. Với máy UB, mẫu phải pha
loãng 42 lần, máy FloPro mẫu chỉ cần pha loãng 2 lần [10].
1.3.3.

Phương pháp tham chiếu [6, 8]
Phương pháp Jendrassick-Grof sử dụng cafein benzoate để hòa tan các

loại bilirubin có độ lặp tốt được khuyến cáo như phương pháp tham chiếu. Vì
tính đặc hiệu của phương pháp định lượng bilirubin trực tiếp và toàn phần
không cao, nồng độ đúng của bilirubin trực tiếp và gián tiếp của trong huyết
thanh không được khẳng định chắc chắn. Phương pháp HPLC có thể phân
tách và định lượng các loại bilirubin, giúp chúng ta hiểu biết rõ hơn về thành
phần bilirubin trong máu. Kết quả của phương pháp HPLC cho thấy trong
máu người khỏe mạnh dưới 5% bilirubin là loại liên hợp và có rất ít δbilirubin. So với HPLC, phần lớn các phương pháp diazo cho kết quả
bilirubin liên hợp cao hơn nồng độ thực của nó. Hơn nữa, phương pháp HPLC
còn cho thấy có cả những chất không phải là bilirubin trong máu cũng phản
ứng với thuốc thử diazo. Một số chất có trong nước tiểu như mesobilifuscin,
uroerythrin có ảnh hưởng đến phản ứng phân tích bilirubin trong nước tiểu và
người ta cho rằng có thể các chất này hoặc những hợp chất tương tự có thể có
trong huyết tương.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các phương pháp hóa học cho kết quả
bilirubin trực tiếp dưới 15% bilirubin toàn phần ở người khỏe mạnh có thể là
các phương pháp có kết quả xác thực nhất. Với phương pháp diazo, lượng
bilirubin trực tiếp có trong huyết thanh người khỏe mạnh tham gia phản ứng
phụ thuộc vào thời gian và nhiệt độ phản ứng.
Thuận lợi hàng đầu của phương pháp Jendrassick-Grof là độ nhạy và
độ chính xác cao do hệ số hấp thụ phân tử của azobilirubin cao hơn trong môi

19