Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------

-------

PHẠM THỊ BÍCH

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Phạm Thị Bích

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN CXCL12
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người
thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện luận văn này.
Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự
giúp đỡ của các anh chị và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh
học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein,
trường Đại học Khoa học tự nhiên. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Để thực hiện tốt luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của cán
bộ nhân viên thuộc khoa Trữ máu của Viện huyết học và Truyền máu Trung Ương;
khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh thuộc Bệnh viện K- Tam Hiệp, Hà Nội. Tôi xin
chân thành cảm ơn.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và
luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 03 năm 2012
Học Viên

Phạm Thị Bích


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................1
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................3
1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG..............................................3

1.1.1. Khái quát về ung thư ..........................................................................3
1.1.2. Ung thư đại trực tràng là gì ................................................................4
1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng..............................................4
1.1.4. Các hệ thống phân giai đoạn ung thư đại trực tràng ............................6
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG......................8
1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì .......................................................................8
1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng...............9
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN
BỆNH UNG THƯ…………………………………………………………………12
1.4.CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC

TRÀNG

……………………………………………………………………

16

1.4.1. Chemokine ..................................................................................................16
1.4.2. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4 ..........................................19
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở
BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ...................................................21
Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..............................................23
2.1. NGUYÊN LIỆU .............................................................................................23
2.1.2. Hóa chất...........................................................................................23
2.1.3. Thiết bị.............................................................................................24


2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................24
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô.........................................................24
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu .......................................................25

2.2.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR...........................27
2.2.4. Phân tích RFLP ................................................................................28
2.2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP .....29
2.2.6. Điện di kiểm tra sản phẩm................................................................32
2.2.7. Kỹ thuật nhuộm bạc .........................................................................33
2.2.8. Dự đoán vùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị
trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12......................................................34
2.2.9. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê...................................34
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................35
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP ............................................................35
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu ...............................................35
3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR ...........................36
3.1.3. Kết quả phân tích RFLP ...................................................................37
3.1.4. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê...................................41
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN CXCL12 ......47
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô..................................................47
3.2.2. Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên
mã của gen CXCL12 ..................................................................................48
3.2.3. Khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter
của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP .........................................................52


3.2.4. Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12
ở bênh ung thư đại trực tràng .....................................................................53
KẾT LUẬN...........................................................................................................62
KIẾN NGHỊ ..........................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................64
PHỤ LỤC 1..............................................................................................................i
PHỤ LỤC 2.............................................................................................................ii
PHỤ LỤC 3............................................................................................................iv

PHỤ LỤC 4............................................................................................................ix
PHỤ LỤC 5.............................................................................................................x


BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

AJCC

American Joint Committee on Cancer

APC

Adenomatous polyposis coli

APS

Ammonium persulfate

CEA

Carcinoembryonic antigen (kháng nguyên ung thư)

CIN

Chromosomal instability (sự bất ổn định nhiễm sắc thể)

CPG-CIMP

CpG island methylator phenotype

CRC

Colorectal cancer (ung thư đại trực tràng)

cs

Cộng sự

CXCL12

CXC ligand 12 (phối tử dạng CXC 12)

CXCR4

CXC receptor 4 (thụ thể dạng CXC 4)

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography

FAP

Familial adenomatous polyposis (hội chứng polyp u tuyến
theo dòng họ)

FOBT

Fecal occult blood test (xét nghiệm máu trong phân)

IUAC

International Union Against Cancer

HNPCC

Hereditary nonpolyposis colon cancer (ung thư ruột kết
không polyp di truyền)

LOI

Loss of imprinting (sự mất dấu ấn)

MAPK

Mitogen activated protein kinase

MSI

Microsatellite instability (sự bất ổn định vi vệ tinh)


MSP

Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng
chuỗi trùng hợp đặc hiệu methyl)

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PI3KCA

Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit

PCR- RFLP

Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length
Polymorphism

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn)

SSCP

Single strand conformation polymorphism

TBE

Tris borate EDTA

TE

Tris - EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

TGF β

Transforming growth factor β (yếu tố tăng trưởng chuyển
hóa β)

TNF

Tumor necrosis factor (Yếu tố gây hoại tử khối u)

TNM

Tumor- lymph node- metastases (khối u-hạch-di căn)

UTĐTT

Ung thư đại trực tràng

NST

Nhiễm sắc thể


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh học

Bảng 2

Các chemokine thuộc họ CXC

Bảng 3

Các thành phần của phản ứng PCR

Bảng 4

Các thành phần của phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme
FastDigest MspI

Bảng 5

Thành phần phản ứng PCR (với thể tích 12,5 µl)

Bảng 6

Thành phần bản gel polyacrylamide 10% (bản 7cm)

Bảng 7

Phân bố genotype giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng theo vị trí khối u

Bảng 8

Phân bố genotype theo giới tính của bệnh nhân

Bảng 9

So sánh phân bố genotype giữa nhóm người bệnh trên 70 tuổi và dưới
70 tuổi

Bảng 10

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu đối chứng và mẫu bệnh theo vị
trí khối u

Bảng 11

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo giới tính

Bảng 12

Tần xuất alen của gen CXCL12 của mẫu bệnh theo độ tuổi

Bảng 13

Tỷ lệ methyl hóa và không methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12
trên mô u và mô lân cận u

Bảng 14

Thống kê tỷ lệ methyl hóa trong vùng promoter của gen CXCL12 theo
các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1

Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi

Hình 2

Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

Hình 3

Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu

Hình 4

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12

Hình 5

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng
302bp, 202bp và 100bp

Hình 6

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 2 băng 202bp
và 100bp

Hình 7

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng
302bp, 202bp và 100bp (genotype dị hợp tử)

Hình 8

Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 1 băng 302bp

Hình 9

Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ mô

Hình 10 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer
Hình 11 Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot
Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12
Hình 13 Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u
Hình 14 Hình ảnh điện di sản phẩm MSP của gen CXCL12 của bệnh nhân ung thư
đại trực tràng


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

MỞ ĐẦU
Ung thư trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thư đường tiêu hóa, đứng
hàng thứ hai sau ung thư dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thư. Bệnh tiến
triển tương đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để
thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26]. Tuy nhiên bệnh thường được phát hiện ở
giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế.
Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 người được chẩn đoán mắc bệnh
ung thư đại trực tràng và có khoảng 150.000 người chết vì căn bệnh này, đây là loại
ung thư nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai
gây ra tử vong tại Mỹ. Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại

ung thư và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn
uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thư đại trực tràng
ngày càng phổ biến. Tuổi mắc căn bệnh chết người này ngày càng trẻ hóa, nhiều
trường hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đã mắc ung thư đại trực tràng
[30].
Trên thế giới ung thư đại trực tràng luôn được các nhà sinh y học quan tâm,
có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã được tiến hành. Mục
tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn
đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời. Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có
carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thường dùng cho chẩn đoán
bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhưng chi phí cho xét nghiệm còn
rất tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát
hiện chính xác giai đoạn ung thư là cần thiết. Genomics và proteomics là những lĩnh
vực nghiên cứu cho phép xác định các chỉ thị đặc trưng cho bệnh, phục vụ cho công
tác chẩn đoán, điều trị và tìm nguyên nhân bệnh.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi của gen
CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng”, nhằm mục tiêu:

1


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1. Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:
- Xác định được tính đa hình của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực
tràng, so sánh với các mẫu đối chứng.
- Đánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXCL12 với các đặc
điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở Việt Nam.

2. Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh
nhân ung thư đại trực tràng:
- Xác định được sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong
các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12.
- Xác định được tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter
của gen CXCL12.
- Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc
điểm bệnh học lâm sàng của ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc
thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.1.1. Khái quát về ung thư
Ung thư (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển
không bình thường của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lượng một cách
không kiểm soát được và tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển
của cơ thể [33]. Trong một số trường hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở
xa) (bảng 1).
Bảng 1. Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thư theo đặc điểm sinh bệnh học
U lành tính

- Tế bào biệt hóa cao
- Phân bào ít và chậm
- Không xâm lấn xung quanh
- Có vỏ bọc
- Không hoại tử
- Rất ít tái phát và ít ảnh hưởng tới cơ thể

U ác tính (ung thư)
- Tế bào ít biệt hóa
- Phân bào nhanh, không tuân theo sự kiểm
soát của chu trình tế bào
- Xâm lấn xung quanh
- Không có vỏ bọc
- Thường hoại tử
- Ảnh hưởng lớn tới cơ thể

Ung thư không phải là một bệnh. Bệnh này là một nhóm của hơn 100 bệnh
khác nhau.
Ung thư có thể có nguồn gốc từ bất cứ tế bào nào của cơ thể và có rất nhiều
loại khác nhau trong mỗi vùng của cơ thể. Hầu hết các bệnh ung thư được đặt tên
theo loại tế bào hoặc cơ quan nơi chúng phát sinh. Nếu một khối ung thư lan rộng ra
(di căn), thì khối u mới mang tên giống với tên của khối u nguồn gốc đầu tiên [33].

3


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1.1.2. Ung thư đại trực tràng là gì
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là căn bệnh phổ biến, đứng hàng đầu trong
ung thư đường tiêu hóa tại các nước Âu Mỹ. Tại Việt Nam và các nước châu Á,
UTĐTT đứng thứ hai trong ung thư đường tiêu hóa sau ung thư dạ dày. Ở nước ta,
mỗi năm có khoảng hơn 7.300 người mới mắc và hơn 4.100 người tử vong do ung
thư đại trực tràng [34]. Ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô phổ biến hiện nay,
bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình
chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống. Trực tràng là phần ruột thẳng nối
giữa đại tràng và hậu môn. Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực
tràng (hình 1). Ung thư đại tràng và ung thư trực tràng thường có liên hệ với nhau
và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau, vì thế
chúng được gọi chung là ung thư đại trực tràng [35].

Hình 1. Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi [35]

1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng
Các loại ung thư khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau. Trong ung thư
đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau
đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thư đại trực tràng:

4


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

• Polyp đại trực tràng là bệnh khá thường gặp, đây là những khối u lồi vào
trong lòng đại trực tràng, chúng được hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm
mạc đại trực tràng. Triệu chứng của bệnh thường nghèo nàn và không đặc hiệu.

Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những
polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp
trở thành ung thư.
• Tác nhân lối sống: Những người có thói quen hút thuốc, hoặc có chế độ
ăn uống giàu chất mỡ và ít trái cây, rau quả sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại
trực tràng cao hơn vì nó có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực
tràng, gây viêm loét đại tràng và từ đó có thể dẫn tới ung thư đại trực tràng.
• Bệnh Crohn hoặc chứng lở ruột già: Người bị chứng bệnh gây viêm đại
tràng (như chứng lở ruột già hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ mắc
bệnh cao.
• Bệnh sử ung thư cá nhân: Người từng bị ung thư đại trực tràng có thể sẽ
lại bị ung thư đại trực tràng lần thứ hai. Đồng thời, phụ nữ có tiền sử ung thư buồng
trứng, dạ con, hoặc ung thư vú, sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thư đại trực tràng cao
hơn.
• Bệnh sử ung thư trong gia đình: Trong khi phần lớn các trường hợp ung
thư đại trực tràng là các khối u rời rạc thì có rất ít các trường hợp xảy ra do đột biến
gen di truyền. Phổ biến nhất là hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ (familial
adenomatous polyposis - FAP) và hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền
(hereditary nonpolyposis colon cancer - HNPCC). Dạng ung thư này thường biểu
hiện từ rất sớm (trung bình dưới 45 tuổi) [20].
Khối u FAP chủ yếu nằm ở vùng ngoại biên (bên trái) trong khi HNPCC chủ
yếu nằm ở vùng đầu gần (bên phải) của đại tràng. Khi có thành viên trong gia đình
được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng thì nguy cơ các thành viên khác mắc
căn bệnh này cao gấp nhiều lần so với bình thường, phụ thuộc nhiều vào số thành

5


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh. Thực tế, các nghiên cứu cho thấy phải có tới 20
đến 25% các bệnh nhân ung thư đại trực tràng có tiền sử gia đình mắc căn bệnh này.
1.1.4. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng [39]
Phân loại Duke cho ung thư trực tràng
Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một bác sĩ giải phẫu bệnh ở bệnh viện
St.Mark, đã đưa ra một hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng.
Phân loại được chia làm 3 giai đoạn:
- Dukes A: khối u giới hạn ở thành trực tràng.
- Dukes B: những khối u đã vượt thành trực tràng đến những cơ quan cạnh
trực tràng.
- Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng.
Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis)
Phân loại này được đưa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint
Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên
những dữ kiện lâm sàng và bệnh học. Phân loại TNM thường dùng để dự báo tỉ lệ
sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thư trực tràng.
Phân loại TNM cho ung thư đại trực tràng
U nguyên phát (T):
Tx – không xác định được u.
T0 – không có bằng chứng của khối u.
Tis – u tại chỗ (niêm mạc).
T1 – u xâm lấn lớp dưới niêm mạc.
T2 – u xâm lấn thanh mạc.
T3 – u xuyên qua thanh mạc vào lớp dưới thanh mạc hoặc vào các mô xung quanh
đại tràng hay trực tràng.
T4 – U xâm lấn trực tiếp các cơ quan khác hoặc xuyên vào lớp phúc mạc tạng.

6

Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Hạch lympho vùng (N):
Nx – không xác định được hạch.
N0 – không có hạch di căn.
N1 – di căn 1-3 hạch xung quanh đại tràng hoặc trực tràng.
N2 – di căn từ 4 hạch trở lên.
N3 – di căn đến bất kì một hạch nào dọc theo mạch máu chính.
Di căn xa (M):
Mx – không xác định được di căn xa.
M0 – không di căn xa.
M1 – di căn xa.
Nói chung, ung thư đại trực tràng được chia làm các giai đoạn (hình 2):
• Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thường được tìm thấy trong
các lớp trong cùng của đại trực tràng. Những tế bào bất thường có thể trở thành ung
thư và lây lan vào các mô bình thường gần đó. Giai đoạn 0 cũng được gọi là ung thư
biểu mô tại chỗ.

Hình 2. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [28].

• Giai đoạn I: Ung thư đã bắt đầu lây lan, nhưng vẫn còn trong lớp lót bên
trong.

7

Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

• Giai đoạn II: Ung thư đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc
trực tràng nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết.
• Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến
những phần xa của cơ thể.
• Giai đoạn IV: Ung thư đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ
thống bạch huyết, được gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thư đại trực tràng
thường di căn đến là phổi và gan.
Tỉ lệ sống sót sau 5 năm của ung thư đại trực tràng: Giai đoạn I: 72%. Giai
đoạn II: 54% . Giai đoạn III: 39% . Giai đoạn IV: 7%.[39]
1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì
Chỉ thị sinh học (biomarker) là những phân tử chất được sử dụng như một
chỉ báo của một trạng thái sinh học. Đó là một đặc tính khách quan được đặc trưng
bởi các thông số như các chỉ số hóa sinh, miễn dịch… Do đó, nó được dùng để đánh
giá những quá trình sinh học bình thường, quá trình gây bệnh hoặc các phản ứng
dược của quá trình điều trị [18].
Trong ung thư, chỉ thị sinh học đóng một vai trò quan trọng, nó là công cụ
hữu hiệu, chỉ thị sinh học mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao sẽ giúp cho việc
kiểm soát ung thư tốt hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định nhanh chóng
các đáp ứng của khối u đối với liệu pháp điều trị mới. Ví dụ như đột biến dòng phôi
gen APC là một chỉ thị để chẩn đoán nguy cơ mắc polyp và sự phát triển tiếp theo
của ung thư biểu mô trực tràng, biểu hiện của β-catenin trong tế bào chất và nhân là
một chỉ thị để tiên lượng ung thư biểu mô thực quản. Tuy nhiên, rất ít các chỉ thị
phân tử hiện nay được ứng dụng thực tiễn trong lâm sàng vì sự hạn chế về độ nhạy
và tính đặc hiệu, do đó, cần phải phát triển nhiều hơn nữa các chỉ thị đáng tin cậy có

liên quan tới phần lớn các khối u để có thể sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và điều
trị ung thư.

8


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra các chỉ thị phân
tử trong chẩn đoán ung thư. Trong đó, nhiều nghiên cứu tập trung vào việc xem xét
mức biến đổi của ADN, các đột biến, đa hình của gen, ... Các nghiên cứu đã cho
thấy trong ung thư đại trực tràng, một số biến đổi về gen đóng vai trò quan trọng
trong sự phát sinh ung thư.
Đột biến gen APC (Adenomatous polyposis coli). APC là gen ức chế khối u
có vai trò điều hòa sự tăng sinh và bám dính tế bào. Sự biến đổi của gen này đóng
vai trò quan trọng, đánh dấu sự hình thành và phát triển của ung thư.
Đột biến gen APC là dạng đột biến phổ biến nhất trong ung thư đại trực tràng
được tìm thấy ở 60 - 80% ung thư đại trực tràng. Đột biến chủ yếu xảy ra trong khu
vực exon 15. Các cá thể sinh ra với một alen đột biến của gen này sẽ phát sinh hàng
trăm, thậm chí hàng nghìn polyp u tuyến ở đại tràng trong lứa tuổi 13 đến 20. Hội
chứng này gọi là hội chứng FAP. Protein APC khu trú trong bào tương, ở đây chúng
tương tác với nhiều protein nội bào khác, trong đó có β-catenin - một protein có thể
đi vào nhân tế bào, hoạt hoá việc phiên mã các gen. Chức năng quan trọng của
protein APC là duy trì mức độ thấp của β-catenin trong bào tương nhờ sự hình
thành phức hệ APC/β-catenin, phức này kích thích sự phân hủy của β-catenin. Sự
bất hoạt gen APC gây hậu quả mất protein APC, dẫn đến làm tăng β-catenin của tế
bào, chất này sẽ xâm nhập vào nhân tế bào và điều hòa tăng sinh tế bào. Hậu quả là

các khối u hình thành trong lớp biểu mô ruột và có thể tiến triển thành ung thư. Vì
vậy, APC là yếu tố điều hòa âm tính của việc truyền tín hiệu β-catenin.
Ngoài ra, những đột biến làm mất chức năng của APC cũng dẫn đến sự bất
ổn định nhiễm sắc thể do APC liên kết với các vi ống làm chúng bị sai lệch [21].
TP53 là một gen ức chế khối u cực kì quan trọng với một số chức năng chủ
yếu như khởi động quá trình apoptosis, sửa chữa ADN bị lỗi và điều khiển chu trình
tế bào. Đột biến gen này dẫn đến sự biểu hiện bất thường của protein p53. Do đó,
khi p53 mất chức năng thì các tế bào sẽ tiếp tục phân chia mang theo các sai hỏng

9


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

ADN, tích lũy qua mỗi chu trình tế bào và đến một lúc nào đó tế bào không kiểm
soát được hoạt động phân bào nữa và chuyển sang trạng thái ung thư.
Một số gen gây ung thư như RAS và BRAF cũng đóng vai trò quan trọng
trong việc phát triển căn bệnh ung thư trong đó có: Đột biến RAS xảy ra ở 37% các
trường hợp mắc ung thư đại trực tràng và 13% đối với BRAF. Các đột biến RAS mà
phần lớn là ở KRAS đã làm hoạt hóa GTPase, vốn có vai trò dẫn tín hiệu trực tiếp
đến RAF. Các đột biến BRAF ảnh hưởng tới enzyme MAPK (mitogen activated
protein kinase) vốn có vai trò điều hòa một số hoạt động của tế bào (như phân bào,
tăng sinh, biệt hóa tế bào, chết theo chu trình) và sau đó điều khiển các lớp tín hiệu
dẫn tới con đường tín hiệu này bị hạn chế từ đó ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào.
Các đột biến BRAF có thể phát hiện được ngay cả ở các polyp nhỏ và so với các đột
biến RAS thì chúng phổ biến hơn ở các polyp tăng sản, các u tuyến dạng khía và các
ung thư đại trực tràng phần đầu gần, và đặc biệt là ở các trường hợp ung thư có kiểu
hình methyl hóa đảo CpG - CIMP (CpG island methylator phenotype) [16]. Năm

2003, Shield và cộng sự khi nghiên cứu về gen KRAS (gen gây ung thư) cho thấy
đột biến này có vai trò chuyển ung thư đa u tuyến từ giai đoạn trung gian.
Sự methyl hóa ADN
Như đã biết, những biến đổi di truyền bao gồm các đột biến trong gen gây
ung thư, các gen gây ức chế khối u gây ung thư, tuy nhiên chỉ khoảng 10% bệnh
nhân thuộc kiểu genotype kiểu cổ điển này. Ngoài ra, sự phát sinh ung thư còn có
thể do cơ chế biến đổi ngoại di truyền gây ra.
Di truyền ngoại sinh (Epigenetics) là sự biến đổi trong biểu hiện gen mà sự
biến đổi này không phải do những biến đổi trình tự base trên ADN, bao gồm sự
methyl hóa ADN, biến đổi histone,…Trong đó, di truyền ngoại sinh được nghiên
cứu nhiều nhất là sự methyl hóa ADN.
Methyl hóa là sự gắn nhóm methyl vào vị trí C thứ 5 ở cytosine của vòng
pyrymidine nhờ enzyme methyl transferase. Có 3 dạng methyl hóa ADN khác nhau
được biết đến liên quan tới ung thư, đó là: sự giảm methyl hóa (hypomethylation),

10


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

tăng cường methyl hóa (hypermethylation) và sự mất đi dấu ấn gen (loss of
imprinting – LOI).
Bình thường có 3-6% cytosine bị methyl hóa trong tế bào bình thường ở
người. Cặp nucleotide CpG là vị trí trong vùng giàu CpG, còn được gọi là đảo CpG.
LOI là hiện tượng có sự mất biểu hiện hay hoạt hóa biểu hiện của các alen
bố mẹ trong các khối u. Sự giảm methyl hóa ADN xảy ra ở giai đoạn tiến triển của
bệnh, liên quan tới sự tăng cường phiên mã của gen (như các gen gây ung thư).
Trong khi đó thì sự tăng cường methyl hóa ADN lại xảy ra tại các vị trí điều hòa

đặc hiệu ở các vùng promoter, dẫn tới sự ngăn cản phiên mã từ đó gây bất hoạt gen
(như ở các gen ức chế khối u). Chính sự tăng cường methyl hóa ADN này đã trở
thành một lĩnh vực được quan tâm lớn trong nghiên cứu ung thư hiện nay [12].
Ngoài ra, sự methyl hóa ADN còn đóng vai trò trung tâm trong sự đánh dấu của
gen, sự phát triển của phôi, sự im lăng NST X và sự điều khiển chu trình tế bào.
Đã có những bằng chứng chứng tỏ rằng sự methyl hóa bất thường là một
hiện tượng phổ biến trong ung thư và đó có thể là sự thay đổi sớm nhất trong sự
phát sinh ung thư .
Năm 2010, Kim và cs thuộc trường đại học y John Hopkins, Hoa Kỳ qua
việc tổng hợp từ hơn 40 bài báo khác nhau đã đưa ra một bản tổng hợp về tình trạng
methyl hóa của 59 gen khác nhau trên mô đại trực tràng, 19 gen được phân tích từ
mẫu huyết tương, huyết thanh hoặc mẫu phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ
methyl hóa là: 76,2% ở CXCL12, 32% ở E-Cadherin, 100% như ở Cyclin
A1,…Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy có sự tăng cường methyl hóa cao ở
các gen của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, trong khi đó tỷ lệ này rất thấp và gần
như là 0% ở người bình thường, điều đó cho thấy tình trạng tăng cường methyl hóa
ADN có thể là yếu tố quan trọng góp phần vào sự phát sinh ung thư đại trực tràng
[12]. Sự methyl hóa ADN có thể được phát hiện trong các ADN bắt nguồn từ mẫu
mô, mẫu phân hoặc dịch cơ thể.

11


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Vì vậy, nếu các phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa ADN khi được tối
ưu hóa về độ nhạy và độ đặc hiệu của nó sẽ giúp xác định chính xác những khác
biệt trong tình trạng methyl hóa ADN giữa bệnh nhân ung thư và người bình

thường, cho thấy rằng đây có thể là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện sớm
bệnh và là một chỉ thị tầm soát mới cho ung thư đại trực tràng.
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN
QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƯ
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Đây là kĩ thuật truyền thống, được sử dụng để lập bản đồ gen, xác định đột
biến điểm. Kĩ thuật này được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu ung thư ở cấp độ
đột biến gen.
Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzyme giới
hạn, có thể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnh
nhỏ có chiều dài khác nhau. Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theo
chiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamide và
được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot. Trên màng có những
đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ sung với. đầu
dò RFLP xảy ra khi chiều dài của các đoạn giới hạn khác nhau ở những mẫu khác
nhau. Mỗi đoạn giới hạn đó được gọi là một alen và có thể dùng để phân tích di
truyền. Phân tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn
gen cần phân tích. Chính vì thế, kĩ thuật này thường được gọi là PCR-RFLP. Tùy
theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, người ta có thể thực
hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giản hóa hoặc
tiến hành cùng một số phương pháp khác.
SSCP (Single strand conformation polymorphism)
Một phương pháp đơn giản khác được sử dụng trong nghiên cứu đột biến
điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN. Cấu trúc

12


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môi
trường chứa chúng. Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi,
cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotide và bất cứ thay đổi nào
trong đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn. Khi điện di trên gel polyacrylamide
không biến tính, các cấu hình khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và phân
tách ra. Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợi đơn như nhiệt độ, pH, đệm
chạy có thể được sử dụng để tăng khả năng phân tách. Nhìn chung, nhiệt độ và pH
thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt được các phân tử ADN có trình tự
khác nhau.
DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)
Đây là phương pháp phân tích ADN dị sợi kép. Thay vì sử dụng gel và phân
tách ADN bằng điện di, ADN được phân tách bằng sắc ký HPLC. Các mạch ADN
được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau
và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử
dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường. DHPLC
là một kĩ thuật mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động. Với những tiến bộ
gần đây trong việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương
pháp này có độ nhạy cao và khả năng tái sử dụng tốt.
Real Time PCR
Trong sinh học phân tử, đây là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN
được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kĩ thuật này cho phép phát
hiện và định lượng tuyệt đối số lượng bản sao của một hay nhiều trình tự cụ thể của
một mẫu ADN. Hai phương pháp để định lượng là nhuộm huỳnh quang không đặc
hiệu với trình tự ADN kép và lai sản phẩm với một đầu dò ADN đặc hiệu có gắn
huỳnh quang. Qua mỗi chu kì của phản ứng, lượng sản phẩm tăng lên dẫn đến sự
gia tăng tỉ lệ phát huỳnh quang. Qua đó có thể dựa vào số đo huỳnh quang để định
lượng chính xác lượng sản phẩm. Đây được coi là hướng tiếp cận mới so với PCR

chuẩn, được sử dụng nhiều trong cả khoa học cơ bản và trong chẩn đoán.

13


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

Giải trình tự
Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu đột
biến điểm/SNPs. Để khẳng định chính xác đột biến hay biển đổi người ta phải giải
trình tự trực tiếp. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay
đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là
phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy) [3].
Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị
trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự
bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. Các mồi oligonucleotide được kéo dài nhờ
tác dụng của enzyme ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại
deoxynucleotide A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản
ứng kéo dài chuỗi.
Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gel
polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN. Ngày
nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí
nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên. Với sự phát
triển của các enzyme ADN polymerase và các hợp chất hóa học, phương pháp này
cho phép sàng lọc SNPs hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đã miêu tả
trên. Cho đến nay, nó đã được cải tiến thành giải trình tự tự động và sử dụng chất
huỳnh quang, cho phép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với
độ nhạy rất cao. Ưu điểm lớn nhất của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về

điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí, hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi
sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt
tiền.
Kỹ thuật phân tích ADN microarray
Đây là một trong những kỹ thuật được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu
genomics tìm các chỉ thị về gen. Phân tích ADN microarray có thể đo mức độ biểu
hiện ARN của hàng nghìn gen cùng một lúc, sự biểu hiện gen có thể được sử dụng

14


Luận văn cao học

Phạm Thị Bích – K18 Sinh học

để phân biệt các dạng khối u cũng như có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh. Điều này
đã được chứng minh với ung thư vú và trong ung thư bạch cầu ác tính. Các mảnh
ADN trên các tấm kính mỏng được lai với các mẫu cADN, chúng có thể được
nhuộm huỳnh quang đỏ và xanh. Phụ thuộc vào mối tương tác của mẫu phân tích,
mỗi điểm trên kính có thể phát ra tín hiệu màu đỏ hoặc xanh. Các gen có thể được
tập hợp lại thành nhóm và có thể so sánh giữa các mẫu.
Một số phương pháp trong nghiên cứu sự methyl hóa ADN
Sự methyl hóa ADN trong vùng promoter của các gen khác nhau có thể đóng
vai trò làm chỉ thị sinh học trong việc phát hiện sớm ung thư từ ADN có trong mẫu
phân và mẫu máu của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, giúp cho việc theo dõi và
điều trị bệnh hiệu quả hơn. Các nghiên cứu tình trạng methyl hóa ADN chủ yếu sử
dụng kỹ thuật PCR làm cơ sở do độ nhạy và khả năng ứng dụng cao của kỹ thuật
này. Sau đây là một số phương pháp phổ biến dùng để khảo sát tình trạng methyl
hóa ADN:
MSP (Methyl Specific PCR)

Hiện nay, kỹ thuật MSP được sử dụng phổ biến nhất do tính đơn giản, nhạy
và chi phí hợp lý của nó, chủ yếu để phát hiện sự tăng cường methyl hóa tại một
vùng promoter quan tâm của một số gen có chức năng quan trọng, liên quan tới sự
bất hoạt gen đó trong các bệnh ung thư ở người [9]. Đây là kỹ thuật nhanh chóng
phát hiện được sự methyl hóa của bất kỳ vị trí CpG nào trong một đảo CpG. Đầu
tiên, ADN được biến đổi với sodium bisulfite để chuyển hóa tất cả các cytosine
không bị methyl hóa thành uracil, sau đó, ADN này được khuếch đại lên qua phản
ứng PCR bằng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho đoạn trình tự bị methyl hóa và không
bị methyl hóa. Kỹ thuật MSP đòi hỏi lượng ADN rất ít, phát hiện nhạy tới 0,1% các
alen bị methyl hóa trên locus đảo CpG quan tâm và cũng có thể thực hiện được với
ADN tách chiết từ các mẫu đúc paraffin. Kỹ thuật MSP hạn chế được các kết quả
dương tính giả từ các nghiên cứu trước đó dựa trên PCR và sự phân cắt của enzyme
giới hạn để phân biệt giữa ADN bị methyl hóa và không bị methyl hóa.

15