Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây có múi đặc sản tại tỉnh hòa bình

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN
NỘI SINH TRÊN CÂY CÓ MÚI ĐẶC SẢN TẠI TỈNH HÒA BÌNH

Giáo viên hƣớng dẫn : Ts. Nguyễn Văn Hiếu
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Thu Hà

Ngành

: Công Nghệ Sinh Học

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Hiếu – Phòng Vi sinh
vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, người đã hướng dẫn, định hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ em trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn tới TS. Phan Thị Hồng Thảo - Trưởng
phòng Vi sinh vật Đất, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở, vật chất, thiết bị và tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực tập.
Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Công

nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội, những người đã trực tiếp giảng dạy,
truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.
Em cũng xin được cám ơn sự hỗ trợ kính phí thực hiện từ đề tài “Nghiên
cứu sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trên cây có múi đặc sản ở miền Bắc Việt Nam
và tiềm năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn và kích thích tăng trưởng thực vật
của chúng” Mã số đề tài: VAST.ĐLT.12/15-16 thuộc cấp quản lý Viện Hàn lâm
KHCNVN và điều kiện làm việc của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,
Viện Công nghệ sinh học.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người luôn động
viên giúp đỡ tạo mọi điều kiện giúp em hoàn thành bài khóa luận này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Sinh Viên


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Tên đây đủ

Chữ viết tắt

1

DNA

Deoxyribosenucleoic Acid

2

RNA

Ribonucleic acid

3

rDNA

Ribosomal Deoxyribosenucleoic Acid

4

rRNA

Ribosomal Ribonucleic acid

4

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

5

KTKK

Khuẩn ty khí sinh

6

ISP

Internationl Streptomyces Project

7

IAA

Indol acetic acid

8

VSV

Vi sinh vật

9

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

10

CFU

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

11

PCR

Polymerase Chain Reaction: Phản ứng
khuếch đại gen


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Bảng 2.1
Bảng 2.2

Trang
Vị trí tọa độ các mẫu thu thập
Danh mục các thiết bị sử dụng

25
26

Bảng 2.3

Kết quả giá trị mật độ quang (OD 530nm) ở các nồng độ
IAA khác nhau

32

Bảng 2.4

Trình tự đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

khuếch đại gen 16S rDNA của xạ khuẩn

34

Bảng 2.5

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

34

Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6

Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 3.9
Bảng 3.10

Bảng 3.11

Bảng 3.12

Số lượng một số nhóm VSV trong các mẫu cam thu nhận tại
vùng đất Cao Phong, Hòa Bình
Lượng và sự phân bố của các chủng xạ khuẩn phân lập theo
nhóm màu

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 21 chủng xạ
khuẩn
Số lượng và tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng
sinh với các vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn phân bố theo nhóm màu
Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng sinh của 7 chủng xạ khuẩn
lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường dịch thể ISP 1 sau 7
ngày
Khả năng sinh IAA của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trên
môi trường ISP2
Đặc điểm nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn
Đặc điểm cáu tạo bào tử của các chủng xạ khuẩn sau 7 ngày
nuôi trên môi trường thạch đĩa ISP 2 ở nhiệt độ 28C
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 7 chủng xạ khuẩn
tuyển chọn sau 14 ngày nuôi ở nhiệt độ 28C
Ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường ban đầu đến
khả năng sinh trưởng và phát triển của 7 chủng xạ khuẩn
tuyển chọn
Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của 7 chủng xạ khuẩn tuyển chọn

37
38
41
42
43
44

46
48

51
52

54

55


Bảng 3.13
Bảng 3.14

Bảng 3.15

Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh trưởng
và phát triển của 7 chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các chủng xạ
khuẩn sau 4 ngày nuôi cấy.
Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng
HBC4-2với gen tương ứng của các chủng xạ khuẩn được

55
57

59

đăng ký trên GenBank

Bảng 3.16

So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn

60


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Trang

Hình 2.1

Đồ thị phương trình đường chuẩn

33

Hình 3.1

Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh các mẩu

36

rễ, cành và lá cam Cao Phong- Hòa Bình…
Hình 3.2

Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân bố theo nhóm màu

39

Hình 3.3

Các chủng xạ khuẩn phân lập được

39

Hình 3.4

Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển trọn

40

Hình 3.5

Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có HTKS phân theo nhóm màu

43

Hình 3.6

Hoạt tính kháng sinh dịch lên men của các chủng xạ khuẩn

45

Hình 3.7

Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn HBL2-1 được nuôi

50

trên 8 môi trường khác nhau sau 7 ngày nuôi ở nhiệt độ
28C

Hình 3.8

Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn HBC2-4 được nuôi

50

trên 8 môi trường khác nhau sau 7 ngày nuôi ở nhiệt độ
28oC

Hình 3.9

Cuống sinh bào tử và bào tử của chủng HBR10-2

51

Hình 3.10 Cuống sinh bào tử và bào tử của chủng HBC4-2

51

Hình 3.11 Cuống sinh bào tử và bào tử của chủng HBL2-1

52

Hình 3.12 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn

53

Hình 3.13 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng phát triển

56

của 7 chủng xạ khuẩn khi nuôi trên môi trường lỏng

Hình 3.14 Khả năng sinh enzym phân giải cơ chất của các chủng xạ

57

khuẩn tuyển chọn trên môi ISP2

Hình 3.15 Điện di đồ DNA tổng số của chủng xạ khuẩn HBC4-2 trên

58

gel agarose 1,0 %

Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi sử dụng 27F và

58

1492R trên gel agarose 1,0 %

Hình 3.17 Trình tự gen 16S rRNA của chủng xạ khuẩn HBC4-2

59


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
PHẦN I. TỔNG QUAN……………………………………………………………2
1.1.Giới thiệu cây có múi .......................................................................................2
1.1.1.

Đặc điểm chung ......................................................................................2

1.1.2.

Một số bệnh trên cây có múi...................................................................4

1.1.3.

Giá trị kinh tế của cây có múi .................................................................5

1.2.Xạ khuẩn ...........................................................................................................6
1.2.1.

Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật .....................................................6

1.2.2.

Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh ...............................8

1.2.3.

Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội cộng sinh ......................................9

1.2.4.

Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn cộng sinh .............................12

1.2.5.

Phân loại xạ khuẩn nội cộng sinh .........................................................13

1.2.6.

Sự đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trên một số cây có múi .................14

1.2.7.

Vai trò của xạ khuẩn đối với cây có múi và trong đời sống con người 15

1.2.7.1.

Cơ chế cộng sinh giữa xạ khuẩn và cây có múi ................................15

1.2.7.2. Vai trò của xạ khuẩn với cây có múi .....................................................16
1.2.7.3.Vai trò của xạ khuẩn đối với con người .................................................18
1.2.7.4. Vai trò của xạ khuẩn đối với hệ sinh thái..............................................19
1.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây có múi có hoạt
tính kháng sinh .....................................................................................................20
1.3.1.

Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh từ cây có múi .......20

1.3.2.

Phân loại và định tên xạ khuẩn .............................................................20

1.3.2.1.

Phương pháp phân loại truyền thống.................................................20

1.3.2.2.

Phương pháp phân loại sinh học phân tử ..........................................21

1.3.2.3.

Phân loại số (Numerical taconomy) ..................................................21

1.3.3.

Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp truyền thống............................22


1.3.3.1.

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy ..........................................22

1.3.3.2.

Đặc điểm sinh lí - sinh hóa ................................................................23

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................25
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................25
2.1.1. Vật liệu .....................................................................................................25

2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................26
2.1.3. Thiết bị .....................................................................................................26
2.1.4. Môi trường ................................................................................................27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................28
2.2.1. Phân lập xạ khuẩn từ cành, lá, rễ cây có múi ...........................................28
2.2.2. Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch.......................28
2.2.3. Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống ...........................................29
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh ............................................29
2.2.5. Phương pháp lên men xạ khuẩn ...............................................................30
2.2.6. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn .......................31
2.2.7. Dựng đường chuẩn dựa trên mối tương quan giữa mật độ quang (OD
530nm) và nồng độ IAA .....................................................................................32
2.3. Phân loại xạ khuẩn bằng giải trình tự gen 16S rDNA ..............................33
2.3.1. Tách DNA tổng số của xạ khuẩn .............................................................33
2.3.2. Khuếch đại gen 16S rDNA .......................................................................33
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................36
3.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các mẫu cam thu thập ở vùng Cao Phong
-Hòa Bình .................................................................................................................36
3.1.1. Phân lâp xạ khuẩn.....................................................................................36
3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn phân lập được theo nhóm màu ................................38
3.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học .............................40
3.2.1.Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập được ..........40
3.2.2. Tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao trên môi trường lỏng .....44
3.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh IAA ..........................45
3.3. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn ...........................47


3.3.1. Đặc điểm nuôi cấy ....................................................................................47
3.3.2. Đặc điểm bào tử........................................................................................50
3.3.3. Khả năng sử dụng nguồn cacbon .............................................................52

3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng phát triển của xạ
khuẩn ..................................................................................................................54
3.3.5. Hoạt tính enzyme......................................................................................56
3.4. Kết quả phân loại xạ khuẩn .........................................................................58
3.4. 1. Phân tích trình tự gen 16S rDNA ............................................................58
3.4.2. Phân loại dựa trên đặc điểm sinh lý và sinh hóa ......................................60
KẾT LUẬN ...............................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................62


MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, đây là
điều kiện rất thuận lợi cho nhiều loại vi sinh vật phát triển từ các nhóm vi sinh vật
gây bệnh trên động vật cũng như thực vật, đến các nhóm vi sinh vật hữu ích có khả
năng ức chế các nhóm vi sinh vật này đối với cây ăn quả, hoặc rau màu để bảo vệ
khỏi sự tấn công gây hại của ví sinh vật. việc sử dụng hóa chất trong bảo vệ thực vật
từ lâu đã trở nên phổ biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật
thường là độc hại, do sử dụng với liều lượng lớn và liên tục đã tạo ra nhữngdư trong
đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây ô
nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái. Để giải quyết các vấn đề trên thì một
trong những hướng nghiên cứu hàng đầu hiện nay sử dụng các tác nhân sinh học là
các nhóm vi sinh vật hữu ích để hạn chế các quần thể vi sinh vật gây bệnh. Xạ
khuẩn cộng sinh là một trong những nhóm vi sinh vật rất có ích có có thể được phân
lập từ bên trong trên các bộ phận của cây. Xạ khuẩn cộng sinh có nhiều ích lợi, giúp
thúc đẩy sự phát triển cây trồng lớn bằng cách sinh ra các chất kích thích sinh
trưởng, cố định nitơ trong không khí và là một nguồn tiềm năng trong việc sản xuất
các hợp chất thiên nhiên mới dùng trong y học, nông nghiệp và công nghiệp.
Hòa Bình là tỉnh giàu tiềm năng về nông nghiệp. Trong đó các loại cây có
múi như cam, chanh, bưởi… đang là loại cây rất phát triển đem lại thu nhập cao
giúp ổn định đời sống vật chất cũng như tinh thần nhân dân ở Hòa Bình. Do đời

sống ngày càng được nâng lên, việc sử dụng các sản phẩm hưu cơ trở thành một
nhu cầu cấp thiết, chính vì vậy đòi hỏi các sản phẩm phục vụ cho sản xuất nông
nghiệp cần thực sự an toàn hạn chế các chất độc hại. Việc tìm kiếm các chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh hợp chất sinh học chống bệnh thực vật có tầm quan trọng
đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ cây có múi và xây dựng nền nông nghiệp hữu
cơ. Xuất phát từ những lí do trên, để khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú
ở Việt Nam nói chung và tỉnh Hòa Bình nói riêng, chúng tôi thực hiện nghiên cứu
đề tài: “ Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây có
múi đặc sản tại Hòa Bình”

1


PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu cây có múi

1.1.1. Đặc điểm chung
Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi... Cùng họ
Rutaceae - là loại cây ăn quả quan trọng của nhiều nước trên thế giới và được sản
xuất với khối lượng lớn nhất trong các loại cây ăn quả (khoảng 100 triệu tấn/năm)
[38].
Cây có múi là nhóm cây có bộ rễ chùm có thể sống và phát triển được trong
khoảng nhiệt độ từ 13 - 38oC, thích hợp nhất là 23 – 29oC. Dưới 13oC và trên 42oC
thì sự sinh trưởng bị ngừng lại. Loại cây này không thích ánh sáng trực tiếp nhưng
giai đoạn kiến thiết cây cần nhiều ánh sáng để phát triển thân lá. Giai đoạn cho trái
nếu cường độ ánh sáng cao làm cho trái dễ bị nám, ảnh hưởng đến giá trị thương
phẩm của trái. Cây bưởi chịu được ánh sáng cao tốt hơn cây cam và cây quýt. Trong
giai đoạn ra hoa, mang trái cây không chịu được úng. Độ ẩm đất thích hợp nhất là

70 - 80 %, ẩm độ không khí là 75 %, lượng mưa là 1.000 - 2.000 mm/năm. Đất phù
sa, tơi xốp, thoát nước tốt, thích hợp với cây có múi, tầng canh tác dầy tối thiểu 0,5
m, pH: 5,5 - 7, hàm lượng hữu cơ trên 3 %. Không nên trồng cây có múi trên đất sét
nặng, đất phèn, đất nhiều cát, tầng canh tác mỏng, mực nước ngầm dưới 80cm [38].
Một số giống cây có múi đặc sản ở Việt Nam [38].
 Cam Sành: Là giống quýt (King mandarin), dân ta quen gọi là cam, tuỳ vùng
trồng lâu đời mà có các tên gọi sau:
Cam Sành Bố Hạ: Trồng ở Bố Hạ, huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang. Cam
Sành Bố Hạ ưa đất phù sa cổ, khí hậu mát ẩm. Hiện nay vùng cam này đã bị
xoá sổ do bệnh vàng lá greening.
Cam Sành Hà Giang - Tuyên Quang - Yên Bái: Là vùng cam chủ yếu của
các tỉnh phía Bắc. Cây cao trung bình, thích nghi rộng, năng suất cao. Cam
Sành thu quả vào dịp Tết, khối lượng quả trung bình 150 – 250 g, ngon thơm
ngọt đậm.

2


 Cam Xã Đoài: Nguồn gốc từ vùng Xã Đoài, huyện Nghi Lộc, Nghệ An. Đưa
lên vùng núi cao, mã quả đẹp hơn. Cây cao trung bình, tán lá hơi xoè, thích
nghi rộng. Năng suất cao, khối lượng quả trung bình 200 - 250 g/quả, có 18 22 hạt/quả, ngon thơm, thu hoạch vào tháng 12 - 1.
 Cam Valencia: Nhập vào Việt Nam từ năm 1971. Quả to hơn cam Hamlin,
trung bình 250 g/quả. Khi chín vỏ quả có màu vàng, ruột màu vàng da cam.
Hạt 0 - 3 hạt/quả. Chín muộn vào dịp Tết âm lịch.
 Cam Ham Lin: Là giống của Mỹ, (Hamlin là tên ông chủ vườn ở Mỹ), được
đưa vào Việt Nam từ năm 1971 thông qua Cu Ba. Hamlin là giống chín sớm
vào tháng 9 - 10, vỏ quả mỏng, khối lượng quả trung bình 200 g/quả, ngọt
đậm, 0 - 5 hạt/quả.
 Cam Sông Con: Nguồn gốc chọn từ cây gieo hạt ở Nông trường Sông Con,
Nghệ An. Cây cao trung bình, tán gọn, không có gai trên cành, thích nghi

rộng. Năng suất trung bình, khối lượng quả trung bình 200 - 250 g/quả, có 3
- 5 hạt/quả, ngon thơm, thu hoạch vào tháng 10 - 11.
 Cam Vân Du: Được chọn lọc từ những cây gieo hạt của giống cam Sunkist ở
Trại nghiên cứu cam Vân Du (Thanh Hoá), trồng nhiều ở các nông trường
vùng Thanh - Nghệ - Tĩnh trong những năm 70 - 80. Cây cao trung bình, tán
gọn có gai trên cành, thích nghi rộng. Năng suất cao, khối lượng quả trung
bình 180 - 200 g/quả, có 10 - 15 hạt/quả, ngon thơm, thu hoạch vào tháng
10- 11.
 Cam Bù Hà Tĩnh: Là giống quýt được trồng nhiều ở Nghệ An - Hà Tĩnh. Cây
cao trung bình, khối lượng quả 180 - 220 g, có 3 - 12 hạt/quả, ngọt đậm. Quả
chín vào tháng 12 - 1.


Quýt chum: Được trồng nhiều ở Bắc Quang - Hà Giang. Cây cao trung bình,
quả chín màu vàng đỏ, nặng 100 - 150 g/quả, có 3 - 5 hạt/quả, chín muộn vào
tháng 12 - 1, ngọt mát, năng suất cao.

3




Cam Canh: Là giống quýt đường (Citrus Reticulata Blanco), được trồng
nhiều ở vùng Từ Liêm - Hà Nội và Hoài Đức - Hà Tây. Hiện nay đã được
trồng ở nhiều nơi như Châu Giang - Hưng Yên, vẫn cho sản phẩm chất lượng
tốt. Cây cao trung bình 3 - 3,5 m, đường kính tán 3 - 4 m, phân cành thấp, lá
không có eo, màu xanh đậm, tán cây có hình dù rộng. Ra hoa tháng 2 - 3.
Thu hoạch vào tháng 11 - 12. Quả có hình cầu dẹt, khối lượng trung bình 100
- 140 g/quả. Quả khi chín có màu đỏ, vỏ mỏng, ruột vàng, ngọt đậm.



Bưởi Đoan Hùng: Là giống bưởi ngọt được trồng lâu đời ở Đoan Hùng Phú Thọ. Cây sinh trưởng khoẻ, cao trung bình 4 - 5 m, đường kính tán trung
bình 4 - 6m, lá xanh vàng. Ra hoa tháng 2 - 3, quả chín vào tháng 10 - 11.
Quả tròn, khối lượng trung bình 0,8 - 1,2 kg/quả. Vỏ quả mỏng khi chín có
màu vàng, tép quả màu hung vàng, ăn có vị ngọt, thơm mát.



Bưởi Diễn: Có nguồn gốc từ giống bưởi ngọt Đoan Hùng, được trồng lâu
đời ở xã Phú Diễn - Từ Liêm - Hà Nội song chín muộn hơn, mã quả đẹp hơn
và trở thành giống đặc sản của địa phương. Cây sinh trưởng khoẻ, cao trung
bình 3 - 5m, đường kính tán trung bình 4 - 6 m, lá xanh vàng, eo lá hình tim
bầu, đỉnh lá chia thuỳ rõ. Ra hoa tháng 2 - 3, quả chín vào tháng 11 - 12. Quả
tròn hơi dẹt, khối lượng trung bình 0,8 - 1,2 kg/quả. Vỏ quả mỏng khi chín
có màu vàng, tép quả màu hung vàng, khô, ăn có vị ngọt, thơm mát.

 Bưởi Phúc Trạch: Trồng lâu đời ở huyện Hương Khê - Hà Tĩnh. Cây sinh
trường khoẻ, cao trung bình 3 - 5 m, đường kính tán trung bình 4 - 6 m. Ra
hoa tháng 2 - 3, quả chín vào tháng 9 - 10. Quả tròn, khối lượng trung bình
1,0 - 1,5 kg/quả. Vỏ quả mỏng khi chín có màu vàng, tép quả màu hung
vàng, khô, ăn có vị ngọt, thơm mát.
1.1.2. Một số bệnh trên cây có múi
Từ những năm 60 của thế kỷ 20, Viện Bảo vệ thực vật đã điều tra phát hiện
trên cây có múi có tới 19 loại bệnh do nấm, 2 loại bệnh do vi rút, 2 loại do bệnh vi
khuẩn, 2 loại bệnh tuyến trùng, 4 loại do thực vật thượng đẳng và 4 loại bệnh sinh
lý [39]. Trong đó, bệnh vàng lá greening, tristeza, loét, chảy gôm, phấn trắng được

4

xem như những loại bệnh hại nguy hiểm trên cây có múi. Đối với sâu hại đã phát
hiện 169 loài côn trùng gây hại, trong đó đáng chú ý là rầy chổng cánh và rệp là 2
đối tượng làm môi giới truyền bệnh greening và tristeza. Hiện nay, hầu hết các vùng
trồng cam quýt ở nước ta đều bị nhiễm bệnh vàng lá greening và tristeza, các bệnh
do nấm Phytophthora (bệnh chảy gôm), Capnodium citri (bệnh nấm muội đen) và
vi khuẩn Xanthomonas (bệnh loét) vv… Các nghiên cứu đều cho thấy bệnh vàng lá
greening và tristeza đã tàn phá nhiều vùng trồng cam, quýt. Bệnh là nguyên nhân
chính làm giảm sức sống vườn cây nhanh chóng, thậm chí phải hủy bỏ trước thời
gian cây cho quả bói. Có thể nói sâu, bệnh luôn là vấn đề cản trở lớn nhất đối với
sản xuất cây có múi không chỉ ở trong nước mà với tất cả các nước trồng cây có
múi. Do vậy thành công của phát triển cây có múi ngoài việc có giống tốt, kỹ thuật,
công nghệ cao thì việc phòng chống sâu, bệnh phá hoại cần phải được coi là nhiệm
vụ hàng đầu.
1.1.3. Giá trị kinh tế của cây có múi
Việt Nam cây có múi được coi là một loại cây ăn quả quan trọng, chủ lực
để phát triển một nền nông nghiệp hàng hóa. Diện tích cây ăn quả có múi nước ta
hiện nay (theo Tổng cục thống kê năm 2011) khoảng 138.000 ha với sản lượng
hàng năm khoảng 1.350.000 tấn, tập trung chủ yếu ở miền Nam, chiếm 70%,
khoảng 91.250 ha và sản lượng 1.010.000 tấn miền Bắc chỉ có 47.000 ha và sản
lượng 340.000 tấn. Trong số 47.000 ha cây có múi ở miền Bắc, các tỉnh miền núi
phía Bắc (gồm Đông Bắc và Tây bắc) chiếm 18.625 ha, trong đó các tỉnh có diện
tích lớn là: Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Yên Bái và Lạng Sơn [37].
Nắm bắt được thị trường và hiệu quả kinh tế của cây có múi, nhiều địa
phương đã có bước phát triển chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ những cây nông
nghiệp truyền thống có giá trị kinh tế thấp sang giống cây có múi mang lại hiệu quả
kinh tế cao. Theo so sánh của một số địa phương trồng cây truyền thống ví dụ như
Lục Ngạn - Bắc giang từ một vùng đất nổi tiếng trồng cây vải thiều sau khi chuyển
đổi cơ cấu cây trồng nhận thấy 1ha đất trồng cam đường canh cao hơn 22,6 lần so
với cây lúa, cao hơn 6,8 lần so với cây vải [37]. 1ha đất trổng bưởi diễn cũng cao

hơn rất nhiều lần so với cây lúa và vải, đem lại thu nhập hàng tỷ đồng mỗi năm cho
5


người dân. Hay ở Cao Phong- Hòa Bình 1ha đất trồng cam, chanh đào cũng đem lại
thu nhập từ 400-700 triệu đồng mỗi năm cho người dân [39].
Cùng với nền kinh tế tăng trưởng nhanh, tiêu thụ quả có múi, nhất là cam,
bưởi ở nước ta tăng mạnh, một số vùng cam đang phát triển mạnh mẽ với việc triển
khai các giống mới năng suất cao, không hạt. Tuy vậy, bình quân tiêu thụ quả có
múi trên đầu người mỗi năm ở nước ta còn rất thấp, chỉ đạt khoảng hơn 7,0
kg/người năm, quá thấp so với tiêu thụ bình quân khoảng 16,0 - 18,0 kg/người trên
thế giới và trên 40 kg/người ở Tây Âu và Bắc Mỹ. Mỗi năm nước ta vẫn phải nhập
một lượng lớn quả tươi và nước cam từ nước ngoài. Để đạt mức tiêu thụ quả có múi
trung bình trên thế giới trong 10 năm tới, nước ta phải sản xuất thêm khoảng
800.000 - 900.000 tấn quả mỗi năm, hay phải mở rộng thêm khoảng 40.000 ha
trồng mới cây ăn quả có múi, trong đó chủ yếu là cam, bưởi với năng suất trung
bình phải đạt trên 20 tấn/ha. Muốn mở rộng diện tích ở quy mô trên, sản xuất cần
khoảng 20 triệu cây giống tốt, sạch bệnh. Hiện tại quả có múi của Việt Nam nói
chung mới chỉ cung cấp được 1/3 nhu cầu thị trường, còn 2/3 vẫn phải nhập khẩu từ
nước ngoài mà chủ yếu từ Trung Quốc. Có thể nói tiềm năng phát triển cây ăn quả
của cả nước còn rất lớn và rộng mở đối với cây ăn quả có múi hiện nay [37].
1.2.

Xạ khuẩn

1.2.1. Xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật
Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm Prokaryote, thuộc
giới monera trong 5 giới của Whittaken, còn theo hệ thống phân loại chia sinh giới
thành 7 giới thì xạ khuẩn thuộc giới Prokaryote. Xạ khuẩn có mặt chủ yếu trong đất,
trong nước ao hồ, trong bùn và trong chất hữu cơ khác, thậm trí trong cả cơ chất mà

các vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được [1,3,8,9,15,33].
Xạ khuẩn có cấu tạo như nấm mốc, nhưng kích thước tương tự như vi khuẩn.
Thành tế bào của xạ khuẩn không chữa cenlulose hay kitin. Cấu trúc khuẩn lạc trên
môi trường thạch, tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC) và khuẩn ty khí sinh (KTKS).
KTCC cắm sâu vào môi trường để lấy thức ăn còn KTKS phát triển ra ngoài không
khí và phần cuối của khuẩn ty biến thành cuống sinh bào tử. Đường kính của khuẩn

6


ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 - 1,0 µm đến 2 3 µm. Khuẩn ty xạ khuẩn không có
vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc ở khuẩn ty biến đổi một cách rất phong
phú, có thể bắt gặp các màu trắng, vàng, da cam, đỏ lục, lam, tím, nâu và đen.
KTCC có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước và có
sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. Thời gian nhân đôi tế bào ở xạ khuẩn trong
môi trường lỏng khoảng 90 phút. Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc chồi phân
nhánh vào khoảng 30 µmp được sắp xếp đều đặn trên chiều dài khuẩn ty
[1,3,8,9,15,33].
Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí. Tùy theo nguồn gốc
phân lập mà chúng có thể ưa nhiệt có loài phát triển được ở những nhiệt độ bằng
hoặc cao hơn 50oC. Tuy nhiên hầu hết các xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn ưa ấm
phát triển tốt ở dải nhiệt độ từ 25 - 37oC. Xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường trung
tính và hơi kiềm, phát triển chậm hoặc không phát triển khi pH của môi trường quá
axit hoặc kiềm [1,3,8,9,15,33].
Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh được Smith và cộng sự (1975) đã đưa lần
đầu tiên khi phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế
nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh [30].
Từ đó, đã có nhiều định nghĩa khác nhau về xạ khuẩn nội cộng sinh nhưng định
nghĩa của Bacon và White (2000): “Vi sinh vật (VSV) nội cộng sinh bao gồm cả xạ
khuẩn là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra hiệu ứng

xấu tới cây chủ” đã được các nhà VSV học thừa nhận [18]. Theo định nghĩa này
hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội cộng sinh không những không gây ảnh
hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch
cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất… [18, 21, 31].
Trong số các VSV nội cộng sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi hơn 70 % các
chủng xạ khuẩn đã biết có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có thể ức chế nhiều
nhóm VSV gây bệnh. Cho tới nay hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới
thì có tới 80 % là do xạ khuẩn sinh ra [1,2,3,8,9,15,33]. Với tác dụng dược lý thu
nhận từ xạ khuẩn nội cộng sinh, một số nhà sinh học đã nghiên cứu sử dụng xạ
khuẩn nội công sinh như một yếu tố kiểm soát sinh học (Biocontrol) trong suốt hai
7


thập kỷ qua [11, 12, 15,18]. Khi sử dụng trong kiểm soát sinh học, vai trò xạ khuẩn
đã được chứng minh giúp tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy
cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều
kiện khác nhau.
1.2.2. Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh
Xạ khuẩn cộng sinh cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng bởi các yếu tố
môi trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng
mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ… Thêm vào đó, mật độ xạ
khuẩn nội cộng sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thực
vật.
Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội
cộng sinh cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Vì
vậy, phải khử trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử
trùng trước khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác
nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt. Ngoài ra, mẫu thực vật
vật có thể được ngâm trong ethanol nồng độ 70 – 90 % trong thời gian 1 - 5 phút,
sau đó được ngâm trong dung dịch NaOCl nồng độ 1 – 5 % trong khoảng thời gian

3 - 20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl
còn dư. Ngoài ra, hydroperoxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất
khử trùng bề mặt hiệu quả. Năm 1992, Sardi và cộng sự công bố sử dụng hơi của
propylene oxit để khử trùng bề mặt thay vì hóa chất khủ trùng dạng lỏng. Qua nhiều
nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ với Ethanol không hiệu quả với
quá trình phân lập VSV nội cộng sinh. Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bước khử
trùng bề mặt bằng hỗn hợp Ethanol và một số chất khử trùng khác không phân lập
được xạ khuẩn nội sinh. Hiệu quả khử trùng khác không phân lập được xạ khuẩn
nội sinh. Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất
hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của cơ
chất khử trùng với bề mặt thực vật [17, 18, 19, 20, 21,23,26,30].

8


Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi
cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25 - 30oC. Trong quá trình phân lập, các nhà nghiên cứu
thường gặp phải VSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên vi khuẩn hoặc nấm
tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và
nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loại xạ khuẩn mới, một số môi trường
chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường humic acid - vitamin, môi trường thạch
casein tinh bột, cao nấm men,… Ngoài ra, bổ sung thêm các hợp chất kháng sinh
như nystatin hoặc cycloheximide - ampicilin, acid nalodixic và trimethoprim… Để
ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ
khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm [17, 18, 19, 20, 21,
23, 26,30].
1.2.3. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội cộng sinh
* Cấu tạo tế bào xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G (+), toàn bộ cơ thể chỉ
là một tế bào bao gồm các thành phần chính: Thành tế bào, màng sinh chất, nguyên

sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng
lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào.
Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120A0, khi già có thể đạt
tới 150 ÷ 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0.
Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl
glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - β glucozit. Thành
tế bào XK không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá
trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [1, 2, 3, 8, 9,
15, 33].
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào XK được chia thành 4 nhóm
chính. Bao gồm:
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic
(L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.

9


Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6
diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi :
Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella…
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các chi : Dermatophilus, Geodermatophilus,
Frankia…
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi:
Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…[1, 2, 3, 8, 9, 15, 33].
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo
chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt
quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của XK.
Tế bào chất của XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm
các hạt poliphotphat và polixacarit. Nhân của tế bào XK không có cấu trúc điển
hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ

có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty
[1, 2, 3, 8, 9, 15, 33].
* Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn
Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn
(trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi XK có đường kính thay đổi trong
khoảng 0,2 ÷ 1 µm đến 2 ÷ 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm. XK phát triển
theo kiểu mọc chồi, phân nhánh theo kiểu 30 µm một nhánh. Độ dài khuẩn ty XK
trong giai đoạn phát triển là 11µm [1, 2, 3, 8, 9, 15, 33].
Khuẩn ty XK bắt màu gram (+), hiếu khí, hoại sinh, không hình thành nha
bào, không có lông và giáp mô, đa hình thái như dạng hình chùy, dạng phân nhánh
hay dạng sợi dài, dạng phân nhánh thành chùm, thành bó gọi là khuẩn ty
(mycelium). Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường không ổn định và phụ thuộc
vào từng loại điều kiện nuôi cấy [1, 2, 3, 8, 9, 15, 33]. Hệ sợi của XK có màu sắc rất
đa dạng: xanh, đỏ, trắng, vàng, lục, lam, tím, hồng… Các khuẩn ty non và các
10


khuẩn ty có mang bào tử thường lớn hơn các khuẩn ty già và khuẩn ty không mang
bào tử. Các loài XK khác nhau đều có cùng một kiểu cấu tạo hệ sợi, chỉ khác nhau ở
chỗ có loài có hệ sợi dài, thẳng hay làn sóng hoặc rất ít phân nhánh, có loài lại có hệ
sợi ngắn, thường phân nhánh, thẳng hoặc xoắn [1, 2, 3, 8, 9, 15, 33].
Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại. Một
loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất - substrate
mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch
gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là
sinh sản. Một số XK không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, làm cho bề mặt
XK nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ
tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường [1, 2, 3, 8, 9, 15, 33].
Hệ sợi của XK phát triển rất mạnh tạo thành các khuẩn lạc. Hình thái của
khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng có thể thay đổi phụ

thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy như: thành phần môi trường, nhiệt độ,
độ ẩm… Khuẩn lạc thường có đường kính 0,5 ÷ 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có
đường kính đạt tới 1 cm hoặc lớn hơn nữa. Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, không
trơn ướt như của vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thô ráp, không trong
suốt, xù xì, có dạng vôi, dạng nhung tơ hay màng dẻo… Với nhiều màu sắc khác
nhau: Đỏ, da cam, vàng, trắng, xanh…, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và
bám sâu vào thạch. Khuẩn lạc thường có cấu tạo 3 lớp: Lớp vỏ ngoài có dạng sợi
bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Các sản phẩm
trong quá trình trao đổi chất như chất kháng sinh (CKS), độc tố, enzym… Có thể
được tích lũy trong sinh khối tế bào XK hay được tiết ra môi trường lên men. Hệ sợi
cơ chất có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng,
nâu, đen… có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [1,
2, 3, 8, 9, 15, 33].
* Bào tử của xạ khuẩn
Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh
(gọi là cuống sinh bào tử). Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho XK. Trên mỗi
cuống sinh bào tử mang từ 30 ÷ 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử,
11


nhưng cũng có khi chỉ mang một bào tử hoặc hai bào tử. Sự hình thành bào tử ở XK
có thể xảy ra do sự kết đoạn (fragmenlation) hoặc do sự cắt khúc (segmentation)
của cuống sinh bào tử.
Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, ovan, hình
cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm. Kích
thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong loài thậm chí ngay
trên cùng một chuỗi bào tử. Bề mặt bào tử XK có thể nhẵn (Sm - Smooth), có gai
(Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair
like [29, 33].
Bào tử XK được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ

dày khoảng 300 ÷ 400 Ao gồm có 3 lớp, các lớp này giúp cho bào tử tránh được
những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm, pH… Hình dạng,
kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay đổi khi nuôi cấy trên
những môi trường có nguồn nitơ khác nhau [29, 33].
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ,
lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitrat, muối
amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên khả năng hấp thụ các
chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau.
Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích
hợp cho sự sinh trưởng là 25 – 30oC. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp
CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 – 28oC. Độ ẩm thích hợp đối với XK dao
động trong khoảng 40 – 50 %, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5. XK có khả năng
sinh tổng hợp nhiều loại enzym và các CKS nên được ứng dụng vào trong nhiều
lĩnh vực của đời sống [29, 33].
1.2.4. Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn cộng sinh
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng hình thành
CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ XK
[2, 16].
12


Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và
từ XK nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm
VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc XK đều có phổ kháng khuẩn rộng. Khả
năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại XK.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS, nhưng có hai
giả thuyết được ủng hộ hơn cả là:
- Việc tổng hợp CKS nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho
chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát

triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó.
- Việc tổng hợp CKS là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống
sót cao của chủng sinh ra CKS trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử [24].
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng,
nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định.
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như
chloramphenicol, các kháng sinh thuộc nhóm nucleoside.
- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau như
lincomycin, novobiocin.
- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổi bậc
một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có
cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ
thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp CKS,
còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor [31].
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn nội cộng sinh
Ba phương pháp phân loại xạ khuẩn thường dùng hiện nay là phương pháp
phân loại truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy), phương
pháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử (lai AND, ARN và phân tích rADN 16S) và
phân loại số (dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh
13


vật theo một độ lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh
hóa. Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một).
1.2.6. Sự đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trên một số cây có múi
Xạ khuẩn sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt)
của cây chủ và chủ yếu cứ trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào. Đáng
chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loại thực vật là nơi cư trú
của rất nhiều xạ khuẩn nội cộng sinh tạo nên sự đa dạng sinh học. Tuy nhiên, chỉ có

một phần nhỏ thực vật liên quan đến xạ khuẩn nội cộng sinh đã được nghiên cứu
nên cơ hội để tìm ra các loài mới và sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự
nhiên là rất lớn. Những nghiên cứu gần đây đã khẳng định sự đa dạng và phong phú
của xạ khuẩn nội cộng sinh và các hợp chất có hoạt tính sinh học. Xạ khuẩn nội
cộng sinh đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về tiềm năng
ứng dụng trong lính vực y học, nông nghiệp và công nghiệp [31].
Hiện nay, xạ khuẩn nội cộng sinh được phân lập từ nhiều loài cây trồng như
lúa mì, gạo, khoai tây, cà rốt, cà chua, cây gỗ, nho, rêu và dương xỉ… Cũng như xạ
khuẩn phân lập từ đất, tỷ lệ xạ khuẩn nội cộng sinh thuộc chi Streptomyces chiếm
hơn 50%, tiếp theo là các chi Microbispora, Micromonospora, Nocardioide,
Nocardia và Streptosporangium.
Các nghiên cứu về đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh được phân bố bởi các
nhóm nghiên cứu khác nhau từ Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ… Tan và cộng sự
(2006) đã phân lập được 619 chủng xạ khuẩn từ các loại cây cà chua khác nhau và
tất cả các chủng đó đều thuộc chi Streptomyces. Từ 36 cây dược liệu ở Thái Lan,
nhóm nghiên cứu của Taechowisan đã phân lập được 330 chủng xạ khuẩn thuộc 4
chi khác nhau (Streptomyces, Microbispora, Nocardia, Micromonospora). Hơn nữa
Verma và cộng sự (2009) cho thấy Streptomyces sp. có chiếm khoảng 50 % trong
tổng số 55 chủng thu nhận từ cây sầu đâu ( Azadirachta indica A.Juss) tại Ấn Độ.
Tổng hợp các nghiên cứu trên cho thấy Streptomyces sp. có khả năng thích ứng,
phát triển mạnh hơn so với xạ khuẩn thuộc chi khác [17, 18, 19, 20, 21, 23, 26, 31].

14


Trái với kết quả trên, nhóm nghiên cứu của giáo sư Li thuộc Viện vi sinh vật
học Vân Nam, Trung Quốc đã kết luận Microbispora chiếm 67 % trên tổng số 81
chủng xạ khuẩn từ rễ cây bắp cải Trung Quốc (Brassica rapa), tiếp theo là
Streptomyces spp. (12,0 %) và Micromonospora spp. (11,0 %). Takahashi và
Omura (2003) phân lập 33 chủng Microbispora, 32 chủng Streptomyces và 10 xạ

khuẩn hiếm khác từ lá rụng thuộc chi thực vật bậc cao. Theo Kizuka và cộng sự
(1998), tỷ lệ phân lập Microbispora từ thực vật cao hơn đất nhiều lần. Như vậy, chi
Streptomyces và Microbispora dường như sinh trưởng trên môi trường đất và nội
cộng sinh mặc dù chỉ có một số lượng hạn chế các loài có thể tồn tại theo cả hai
phương thức này. Phần lớn tỷ lệ phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh từ rễ cao hơn các
bộ phận khác trong cây. El-Tarabily và cộng sự (2006) ước tính mật độ xạ khuẩn
nuôi cấy được trong dưa chuột (Cucummis sativus) và rễ của cây họ đậu (và rễ của
cây họ đậu (Glycine max) đạt 105 CFU/g khối lượng củ/rễ tươi. Tian và cộng sự
(2007) đã phân tích 45 gen 16S rDNA và 33 mẫu gen tách dòng từ xạ khuẩn phân
lập trên rễ và thân cây, thu được 9 chi xạ khuẩn khác nhau từ rễ và 4 chi xạ khuẩn
từ thân. So với thân và lá, tập hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ nhìn chung đa
dạng hơn [17, 18, 19, 20, 21, 23, 26, 31].
Cho đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã được tìm thấy bằng nhiều
phương pháp phân lập và phân loại khác nhau, bao gồm 4 chi mới thuộc nhóm
Plantactinospora, Actinophytocola, Phytohabitans và Jishengella. Tình hình phân
lập các chủng xạ khuẩn mới trên cây có múi ở Việt Nam còn rất hạn chế, chưa có
một nghiên cứu nào được chính thức công khai về số lượng xạ khuẩn ở các loại cây
như cam, chanh, bưởi…
1.2.7. Vai trò của xạ khuẩn đối với cây có múi và trong đời sống con ngƣời
1.2.7.1.

Cơ chế cộng sinh giữa xạ khuẩn và cây có múi

Quan hệ cộng sinh là quan hệ hợp tác chặt chẽ giữa hai hay nhiều loài trong
đó tất cả các loài đều có lợi. Trong cộng sinh, mỗi loài chỉ có thể sống, phát triển,
sinh sản… hiệu quả dựa vào sự hợp tác của bên kia. Quan hệ giữa cây và xạ khuẩn
là một mối quan hệ như vậy. Xạ khuẩn có mặt trong các bộ phận của cây như rễ,
thân, lá, trong vùng đất quanh rễ cây tạo khả năng chống chịu cho cây chủ. Đối với
15

cây trồng, vùng rễ cây là vùng phát triển mạnh nhất so với vùng không có rễ. Sở dĩ
như thế vì rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi [22, 31]. Khi
còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất dinh dưỡng giúp xạ
khuẩn sinh trưởng và phát triển. Rễ cây còn làm đất thoáng khí, giữ độ ẩm, làm số
lượng xạ khuẩn vùng rễ phát triển mạnh mẽ hơn những bộ phận khác của cây như
thân, cành, lá. Ngược lại, xạ khuẩn lại có khả năng tiết ra các hợp chất Herbicidal,
cố định nitơ khí quyển, bảo vệ rễ chống nhiễm nấm [22, 31].
Ví dụ như xạ khuẩn Frankia thuộc chi Actinomyces cộng sinh với một số họ
thực vật, đặc biệt là họ phi lao Casuarinaceae, hình thành nốt sần ở rễ thực vật.
Chúng có khả năng cố định đạm không khí, giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển
tốt trên các vùng đất nghèo chất dinh dưỡng như các vùng đất cát ven biển nước ta.
Một số dạng cộng sinh giữa xạ khuẩn và cây có múi:
- Nội cộng sinh: Là dạng xạ khuẩn sống cộng sinh bên trong các bộ phận của
cây như rễ, thân, cành, lá.
- Ngoại cộng sinh: Xạ khuẩn phát triển trên bề mặt các bộ phận của cây.
1.2.7.2. Vai trò của xạ khuẩn với cây có múi
Kiểm soát sinh học: Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội cộng sinh đã
thu hút mọi sự chú ý của các nhà VSV bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với
mầm bệnh do đặc tính cộng sinh và tổng hợp sẳn phẩm trao đổi chất kháng VSV
gây bệnh. Nhiều nghiên cứu chứng minh đặc tính bảo vệ cây chủ của xa khuẩn nội
cộng sinh chống lại các VSV gây bệnh từ đất như Rhizoctonia solani, Verticillium
dahliae, Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, F.
oxysporum, Pythium aphanidermatum và Colletotrichum orbiculare.
Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi chất
như kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormones… Ngoài ra, các chủng xạ
khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kích thích các thụ
thể tế bào. Ví dụ như chủng S. galbus R - 5 khổng chỉ sinh celluase, pectinase mà
còn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin giúp tăng cường sức đề kháng trong

16