THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Trường Đại học Công nghiệp
thực phẩm TP.HCM

THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ThS. Lê Thùy Linh

0


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

NỘI DUNG
Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli
1.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.2. Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN
1.3. Cách tiến hành thí nghiệm
1.4. Cách tính kết quả

Trang
2
2
3
4
10

Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus

10

2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản

2.2. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
2.3. Cách tiến hành và cách tính kết quả
Bài 3. Định tính Salmonella

10
10
11
14

3.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
3.2. Qui trình định tính Salmonella trong thực phẩm
Bài 4. Định lượng Bacillus cereus

14
14
20

4.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
4.2. Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc

20
20
24

5.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
5.2. Quy trình phân tích

24
26

Tài liệu tham khảo
1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ
phẩm, NXB Giáo dục, 2006
2.
3.
4.
5.

Biên soạn: Lê Thùy Linh

Page | 1


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli
1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Hình 1: phát hiện Coliforms và E.
coli trong thực phẩm hay nước
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc bằng môi trường CHROMagar
kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – ECC
1.1.1 Định nghĩa

48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của
chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị
khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:
E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa
đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I),
Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC.

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h
khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ khoảng
24h ở 440C trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++-- (Indol +,
Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -)
1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN)
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở
một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ
pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Quy trình thực hiện như sau:
Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha loãng
bậc 10 liên tiếp.
Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng
trưởng của vi sinh vật cần kiểm định
Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính
ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady
Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 2


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Chú ý:
Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch được sử dụng để
phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml cho
mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng
mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy số liệu của

bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha
loãng khi
1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích.
Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp theo cần
phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử dụng
1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng
độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy, trị số tra bảng MPN cần
nhân thêm hệ số pha loãng là 10.
1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ
pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh
LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ
Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL,
ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ
Số ống (+)(sinh hơi )ở
mỗi độ pha loãng

Cấy vào ống canh EC, ủ ở
44.50C ± 0.20C, 24 giờ
Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
Cấy lên thạch EMB, ủ ở 370C,
24 giờ

Coliforms

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Xem
tran
g
sau
Page | 3


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Tiế
p
the
o
Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim
xanh), cấy vào Trypton, MR-VP,
SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống canh EC (+) và
IMViC ++--, tra bảng MPN

E. coli
1.3 Cách tiến hành thí nghiệm
Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)
1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ
Bước 1: pha môi trường

Tên môi trường

Thành phần

Tổng thể tích Ghi chú

SPW
(Saline
Water)

NaCl : 42.5g

500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml

Pepton Pepton: 5g

Tryptose: 20g
LSB
(Lauryl Sulphate Lactose: 5g
Broth)
Sodium chloride: 5g
KH2PO4: 2.75g

cất

SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 1)

1000 ml nước Phân phối 90ml LSB cho
cất
pH 6.8 ± 0.2

mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 1)

K2HPO4: 2.75g
Lauryl sulphate: 0.1g
BGBL

Peptone: 10g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho
Page | 4


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

(Brilliant Green Lactose: 10g
Bile
Lactose Mật bò: 20g
Broth)
Brilliant green: 0.0133g
EC
(E.coli medium)

cất
pH 7.4

mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có
chứa ống Durham) trước khi
khử trùng. (buổi 1)

Trypticase or tryptose: 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho
20g
cất
mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có
chứa ống Durham) trước khi
Muối mật No.3: 1.5g
pH 6.9
khử trùng. (buổi 1)
Lactose: 5g
KH2PO4: 1.5g
K2HPO4: 4g
NaCl: 5g

Pancreatic digest
EMB
(Eosin Methylene gelatin: 10g
Lactose: 10g
Blue Agar)
K2HPO4: 2g

of 1000 ml nước Phân phối 100ml EMB cho
cất.
pH 7.1 ± 0.2

mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2)

Eosin Y: 0.4g
Methylene blue: 65mg
Agar: 15g
hoặc 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 20ml, phân
cất
phối 10ml/ống nghiệm.
pH 7.2 ± 0.2
(buổi 3)
1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân
MR-VP
Both Môi trường 1:
(Glucose
Buffered peptone-water cất.
phối 10ml/ống nghiệm.
powder: 7g
Kiểm tra lại môi trường cung
Phosphate)
pH 6.9 ± 0.2
cấp nào để pha môi trường.
Glucose: 5g
K2HPO4: 5g
(buổi 3)
Tryptone water

Tryptone
trypticase:10g

Môi trường 2:
Casein
Pancreatic

Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 5


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
Sodium citrate: 2g
SCA
(Simmons Citrate NaCl: 5g
K2HPO4: 1g
Agar)
NH4H2PO4: 1g
MgSO4: 0.2g
Bromothymol
0.08g
Agar: 15g

1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân
cất. Đun nóng phối 10ml/ống
nhẹ và thỉnh (buổi 3)
thoảng lắc.
Đun sôi 1-2
blue: phút cho đến
khi hòa tan
hết. pH 6.8 ±
0.2

nghiệm.

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
0
tiệt trùng ở 121 C trong 15 phút.
1.3.2 Cách tiến hành:
Bước 3: pha loãng mẫu

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

ống
mẫu

9ml
10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

10

-5

10

-6

Độ pha loãng

Hình 2: quy trình pha loãng mẫu
-1

-2

-3

Pha loãng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10 , 10 , 10 .
Biên soạn: Lê Thùy Linh

Homepage: ﾧ

Page | 6


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ.
Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng

10-1

10-2

10-3

Bước 5: Định lượng Coliform và E. coli

Định lượng Coliform

Định lượng E. coli

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu

từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa từ các ống LSB (+) sang môi trường canh
0

0

0

0

canh BGBL và ủ ở 37 C ± 1 C, 48 giờ
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với

EC, ủ ở 44.5 C ± 0.2 C, 24 giờ
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với

mỗi độ pha loãng

mỗi độ pha loãng

Tính kết quả (xem 1.4)

Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống
(+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa
0
EMB. Ủ ở 37 C, 24 giờ.
Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm
(tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh)
(xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC
0

0
Citrate, ủ ở 44.5 C ± 0.2 C, 24 giờ

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 7


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Hình 4: E.coli nuôi trên môi trường thạch
EMB cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo
Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers
University, Kamloops, BC, Canada)

Bước 6: thử nghiệm IMViC

Hình 5: Kết quả IMViC của
Escherichia coli sau 24giờ ủ ở
37°C. (Anne Hanson, University of
Maine, Orono)
Ống A: dương
tính thử
nghiệm indole trên môi trường tryptone. Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường sau
khi nhỏ thuốc thử Kovács.
Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red.
Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi
cho thuốc thử Barritt’s A và Barritt’s B.
Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc

trong ống nghiệm.
a. Thử nghiệm Indol (I):
Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme
tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản
ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên
một phức chất dạng quinone có màu đỏ.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước tryptone. Sinh
khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ
370C trong 24-48 giờ. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 8


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch
nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi
hữu cơ.
Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi
trường. (-) lớp màu vàng của thuốc thử. Đôi khi có sự xuất hiện của màu
cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa của indol, tạo ra.
b. Thử nghiệm Methyl Red (MR):
Hình 6: thử nghiệm Indol
Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi trường sau khi
vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH<4.4 đỏ; pH 5.0-5.8 màu cam; pH>6.0
màu vàng.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng Glucose
Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc trên môi trường MR-VP, ủ ở 370C
trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ

lệ 3:2, bảo
quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả
ngay.
Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử.
(-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường
có giống trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm.
Hình 7: thử nghiệm
MR
c. Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3)
d. Thử nghiệm Citrate (iC)
Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa môi trường. Mặt
khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có khả năng dùng muối
ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi
trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu
của chỉ thị pH trong môi
trường.
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 9


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng SCA. Dùng
que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên
môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C
trong khoảng 24-48 giờ.
Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang
màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi
trường giữ nguyên màu xanh lục.

1.4 Cách tính kết quả

Hình 8: thử nghiệm Citrate

Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN loạt 3 ống
nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị
số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.

Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus
2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram
dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) có
khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các
dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong
môi trường
chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm
Hình 9: S. aureus trên
tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào
BPA
thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện
với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá
trình chế biến.
2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp nhưng mật độ
vi sinh vật cạnh tranh cao.

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 10

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ
thập phân 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh
MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ

Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha loãng

Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen bóng,
có quầng trong và quầng sáng xung quanh
(đôi khi chỉ xuất hiện 1
trong 2 quầng))

Cấy vào TSA, ủ ở 370C ± 10C , 24 giờ

Thử nghiệm ngưng kết coagulase

Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi độ pha
loãng

Tra bảng MPN

Mật độ S.aureus
(MPN/g hoặc MPN/ml)

2.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 11


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 1: pha môi trường

Tên môi trường
SPW
(Saline
Water)
MSB
(Mannitol
Broth)

BPA
(Baird
Agar)

Thành phần

Tổng thể tích Ghi chú

NaCl : 42.5g
Pepton Pepton: 5g

500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml
cất
SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 2)

Cao thịt: 1g
Salt Polypeptone: 10g
NaCl: 75g
Mannitol: 10g
Phenol red: 0.025g

1000 ml nước Phân phối 90ml MSB cho
cất
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
pH 7.4 ± 0.2
trước khi khử trùng. (buổi 2)

Môi trường cơ bản
Parker Tryptone:10g
Cao thịt: 5g
Cao nấm men: 1g
Sodium pyruvate: 10g
Glycine: 12g
Lithium chloride.6H2O:

1000 ml nước Phân phối 100ml BPA cho
cất cho môi mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2)
trường cơ bản
pH 7.0 ± 0.2

5g
Agar: 20g
Môi trường hoàn chỉnh
5ml Bacto EY tellurite
0

enrichment
(45-50 C)
vào 95ml môi trường cơ
bản được làm nóng
chảy. Môi trường hoàn
chỉnh phải đục.
TSA
(Tryptone
Agar)

Trypticase peptone: 15g
Soya Phytone peptone: 5g
NaCl: 5g
Agar: 15g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

1000 ml nước Phân phối 50ml BGBL cho
cất
pH 7.3± 0.2

mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3)

Page | 12


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C
trong 15 phút.
Bước 3: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu
Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu bằng máy dập
mẫu khoảng 30 giây. Pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)
Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ
ở 370C, 48 giờ. (xem bài 1, mục 1.3.2). Chọn các ống (+) có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để
tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA
Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA
Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ. Chọn khuẩn
lạc đặc trưng :tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và
quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng (xem
hình 10).

Hình 10: hình dạng S. aureus trên
BPA

Chọn khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa coagulase
Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase
Nguyên tắc: các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi trường enzyme
coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các khối đông làm đông
huyết tương.
Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được dùng cho thử
nghiệm này. Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ không pha loãng, bổ sung 0.5ml dịch

nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV. Ủ ống thử
nghiệm ở 370C trong
4 giờ. Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến
24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ.
Đọc kết quả: (+) có sự kết tụ; (-) không có sự kết tụ, hỗn hợp vẫn đồng
nhất
Hình 11: thử nghiệm coagulase. Ống trên (+); ống dưới (-)

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 13


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bài 3. Định tính Salmonella
3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
Hình 12: Salmonella trên thạch
Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả XLD
năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid
nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, không
phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu
hết các chủng đều sinh H2S.
Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình gồm 4
bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng
định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với
một số lượng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae
có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
3.2 Quy trình định tính Salmonella trong thực phẩm
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh

BPW, ủ ở 370C, 18-24 giờ
Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ
ở 420C, 18-24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc đặc
biệt (XLD, HE, BS, SS…), ủ ở 370C, 24 giờ
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang
BHI hay TSA, ủ qua đêm
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không
- Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol
(+); Sorbitol (+)

Salmonella dương tính/
âm tính trong 25g mẫu
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 14


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
3.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: cá hoặc ruột cá, khối lượng 25g cho 1 lớp
Bước 1: pha môi trường

Tên môi trường

Thành phần

Pepton: 10g

BPW
(Buffered Pepton NaCl : 5g
Na2HPO4: 3.5g
Water)

Tổng thể tích Ghi chú
1000 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 20ml
cất
BPW trước khi khử trùng.
pH 7.2 ± 0.2
(buổi 2)

KH2PO4: 1.5g
Môi trường cơ bản
RV (RappaportVassiliadis Soya Tryptone:5g
Pepton)
NaCl: 8g

1110 ml

Phân phối 30ml RV cho mỗi

pH 5.5 ± 0.2

tổ (10ml/ống nghiệm) trước
khi khử trùng. (buổi 2)

KH2PO4: 1.6g
Nước cất: 1000 ml
Dung dịch MgCl2

MgCl2.6H2O: 400g
Nước cất: 1000 ml
Dung dịch Malachite
green oxalate
Malachite green oxalate:
0.4g
Nước cất: 100 ml
Môi trường hoàn chỉnh
Môi trường cơ bản:
1000ml
Dung dịch MgCl2:
100ml
Dung dịch Malachite
green oxalate: 10ml
Cao nấm men: 3g
XLD
(Xylose Lysine L-lysine: 5g
Xylose: 3.75g
Desoxycholate)
Lactose: 7.5g
Sucrose: 7.5g
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

1000 ml nước Phân phối 50ml XLD cho
cất
mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3)
pH 7.4 ± 0.2
Đun sôi môi
trường.

Page | 15


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Sodium deoxycholate:
2.5g
Ferric ammonium
citrate: 0.8g
Sodium thiosulfate: 6.8g
NaCl: 5g
Agar:15g
Phenol red: 0.08g
HE
(Hektoen
Agar)

Proteose Peptone: 12.0g
Entric Yeast Extract: 3.0g
Bile Salts No. 3: 9.0g
Lactose: 12.0g
Saccharose: 12.0g
Salicin: 2.0g

Không hấp.
Không
giữ
quá 1 ngày

1000 ml nước Phân phối 50ml HE cho mỗi

cất
tổ (25ml/petri) (buổi 3)
pH 7.5± 0.2
Đun sôi môi
trường.
Không hấp.

Sodium Chloride: 5.0g
Sodium Thiosulfate:
5.0g
Ferric Ammonium
Citrate : 1.5g
Agar: 14.0g
Bromthymol Blue:
65.0mg
Acid Fuchsin : 0.1g
TSA
(Tryptone
Agar)
KIA
(Kliger
Agar)

Trypticase peptone: 15g
Soya Phytone peptone: 5g
NaCl: 5g
Agar: 15g
Polypeptone peptone:
Iron 20g
Lactose: 20g

Dextrose: 1g
NaCl: 5g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

1000 ml nước Phân phối 50ml TSA cho
cất
pH 7.3± 0.2

mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 4)

1000 ml nước Phân phối 20ml KIA cho
cất
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
pH 7.4± 0.2
(buổi 5)

Page | 16


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Ferric ammonium
citrate: 0.5g
Sodium thiosulfate: 0.5g
Agar: 15g
Phenol red: 0.025g
MR-VP
Both Môi trường 1:

(Glucose
Buffered peptone-water
powder: 7g
Phosphate)
Glucose: 5g
K2HPO4: 5g

1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 40ml, phân
cất.
phối 10ml/ống nghiệm.
Kiểm tra lại môi trường cung
pH 6.9 ± 0.2
cấp nào để pha môi trường.
(buổi 5)

Môi trường 2:
Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
RSU
(Rustigian-Stuart

Urea Broth)

Dipotassium Phosphate:
9.5g
Yeast Extract: 0.1g
Urea: 20g
Monopotassium
Phosphate: 9.1g
Phenol Red: 0.01g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân
cất.
phối 3ml/ống nghiệm.
pH 6.8 ± 0.2
(buổi 5)

Page | 17


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng
ở 1210C trong 15 phút.
Bước 4: Tăng sinh
Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml
dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Đối với
một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô, các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia

vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc
hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK).
Bước 5: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh RV đã được ủ
ấm 420C. Ủ ở 420C, 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.
Bước 6: Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh
chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD và HE. Biểu hiện của
Salmonella trên từng môi trường như sau:
+ Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có
tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen
bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
Hình 14: khuẩn lạc Salmonella trên
HE

Hình 13: khuẩn lạc Salmonella trên
XLD

+ Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương
đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có
tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.

Bước 7: Khẳng định
Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi
trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử
dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 18

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
+ Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA được sử dụng để
thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S.
Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1% glucose. Khi
cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy ra đối với sự tăng trưởng
của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và lactose, không sử dụng cả hai đường
này. Salmonella chỉ lên men được đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có
màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ.
Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt
màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ
thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy
ống nghiệm.
Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: môi trường KIA không
có VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên
men lactose tốt (lên men glucose cũng tốt). Ống 3: có
sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ
trên phần thạch nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ
VSV chỉ lên men glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện
chứng tỏ có quá trình khử
lưu huỳnh và sinh
H2S.
+ Thử nghiệm urea (-): được thực hiện trên môi trường urea lỏng
RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu
từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy
lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi
trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48
giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi
pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên

màu vàng cam.
Hình 16: kết quả thử nghiệm
Urea
+ Thử nghiệm VP (-): môi trường được sử dụng là môi trường lỏng
Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống
môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24
giờ trên môi trường KIA. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống
môi trường. Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn
inh
Hình 17: kết quả
thử
Biên songạhiệm
n: Lê Thùy L
VP
Homepage: ﾧ

Page | 19


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung
dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm
VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt
môi trường.

Bài 4. Định lượng Bacillus cereus
4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên
men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong
khoảng nhiệt độ từ 50C – 500C, tối ưu ở 350C – 400C; pH dao động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử

nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn.
4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng nhất
bằng Stomacher, độ pha loãng 10-1
Pha loãng đến các độ pha loãng 10-2, 10-3

Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch
MYP, ủ ở 300C, 24 giờ
Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase dương
tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc)
cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 300C, 24 giờ

Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên
men glucose, thử nghiệm VP.

Kết luận B. cereus

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 20


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

4.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: tôm khô, khối lượng 50g cho 1 lớp
Bước 1: pha môi trường

Tên môi trường

Thành phần

Pepton: 10g
BPW
(Buffered Pepton NaCl : 5g
Na2HPO4: 3.5g
Water)

Tổng thể tích Ghi chú
1000 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 50ml
cất
BPW trước khi khử trùng.
pH 7.2 ± 0.2
(buổi 4)

KH2PO4: 1.5g
MYP (MannitolEgg YolkPolymycin)

Môi trường cơ bản
Cao thịt: 1g
Pepton: 10g
Mannitol: 10g
NaCl: 10g
Phenol red (1% trong
ethanol 90%): 2.5ml
Agar: 15g
Nước cất: 900 ml

Môi

trường Phân phối 100ml MYP cho

cơ bản đem mỗi tổ (12.5ml/petri). (buổi
khử trùng, để 4)
0

nguội 50 C.
Sau đó trộn
các
thành
phần còn lại

Dung dịch Polymixin
0.1%
Hòa tan 500 000 đơn vị
polymixin B sulfate
trong 50ml nước cất.
Lọc vô trùng và cất
0

trong tối 4 C cho đến
khi dùng.
Egg yolk emulsion 50%
(sản phẩm thương mại)
Môi trường cuối cùng
Môi trường cơ bản:
0
225ml (ở 50 C)
Dung dịch Polymixin B:

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 21


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

2.5ml
Egg yolk emulsion (lòng
đỏ trứng): 12.5ml
Proteose peptone No. 3: 1000 ml nước Phân phối 30ml PRG cho
PRG
(Phenol
Red 10 g
cất
mỗi tổ (3ml/ống nghiệm)
Glucose Broth)
NaCl: 5 g
pH 7.4 ± 0.2
(buổi 4)
Beef extract (optional):
1g
Dextrose: 5 g
Phenol red (7.2 ml of
0.25% solution): 0.018 g
1000ml nước
MR-VP
Both Môi trường 1:
(Glucose

Buffered peptone-water cất.
powder: 7g
Phosphate)
pH 6.9 ± 0.2
Glucose: 5g
K2HPO4: 5g

Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
Kiểm tra lại môi trường cung
cấp nào để pha môi trường.
(buổi 4)

Môi trường 2:
Casein
Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 22


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C
trong 15 phút.
Bước 3: Pha loãng mẫu
Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường BPW đồng nhất để có độ pha loãng 10-1,
đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục pha loãng thành 10-2,
10-3.
Bước 4: Phát hiện bằng môi trường chọn lọc
Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng trên môi trường thạch MYP, ủ ở
300C, 24 giờ. Do B. cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng
polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B. cereus có màu hồng eosin,
được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ lecithinase được tạo thành. Chọn
5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch
nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định.
Bước 5: Các thử nghiệm khẳng định
Hình 19: nhuộm gram B.
cereus

Hình 18: khuẩn lạc B. cereus trên
MYP

- Nhuộm Gram: nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính sạch; dùng que cấy
vòng lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt nước trên phiến kính, khuấy
nhẹ. Cố định vệt bôi trên phiến kính bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhỏ vài giọt methyl violet lên vệt bôi, giữ yên 20 giây. Rửa sạch phẩm

nhuộm bằng nước.

Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I2 lên vệt bôi, để yên 1 phút. Rửa
bằng cồn 95% đến vừa mất màu. Rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch safranin 30 giây. Rửa
sạch bằng nước. Thấm nước dư bằng giấy lọc. Quan sát vi khuẩn bằng vật kính 100X nhúng trong
dầu, Gram dương có màu xanh tía, Gram âm có màu đỏ hồng.
-

Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh PRG, ủ ở 350C, 24 giờ
trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống nghiệm thật mạnh và quan sát sự phát triển thông qua độ đục và
sự chuyển màu từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose trong điều kiện kỵ khí.

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 23


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Hình 20: thử nghiệm lên men glucose.
Ống a: đối chứng. Ống b: không lên
men glucose. Ống c: lên men yếu. Ống
d: lên men mạnh.
-

Thử nghiệm VP (xem bài 3)

Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc
5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxi
phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này
được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng
mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được
biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối
lượng thực phẩm.
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là những tế bào đơn
tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết
nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn
lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty.
Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm,
làm phát
sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm.

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: ﾧ

Page | 24